專利名稱：手霉素的新用途的制作方法
技術領域：
本發明屬于醫藥新用途，具體地說是用手霉素的新用途。
手霉素是1987年由Axel，Zeevk等發現的具有抗真菌活性的化合物。1993年Hara M等發現手霉素具有抑制Ras法尼基轉移酶的作用。Ras基因被認為是人類癌細胞中的主要原癌基因，Ras主要是通過癌蛋白在質膜的錨定而起作用，在此過程中Ras法尼基轉移酶起著至關重要的作用，因此通過抑制該酶的活性來抑制人類癌基因的Ras活性，從而達到治療癌癥的作用。最近研究結果表明手霉素具抑制IL-1β轉化酶(ICE)活性，在抑制細胞凋亡過程中起重要作用，ICE成為研制治療增殖性疾病的重要藥物靶點。手霉素的許多重要的生理活性，使之已經成為藥物研究的熱點。
本發明的目的就是提供一種手霉素的新用途，以拓展其的應用范圍。
本發明的目的是怎樣實現的將手霉素用于制備治療阿爾茨海默氏病的藥物。
阿爾茨海默氏病的病因之一是乙酰膽堿酯酶活性過高，膽堿能功能降低而造成的記憶識別功能障礙。我們通過研究發現手霉素對乙酰膽堿酯酶(AchE)有很強的抑制活性，故可在用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物中得到應用。
手霉素用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物的應用時，其手霉素手霉素的分子式C31H39N2O7，分子量550結構式
手霉素對乙酰膽堿酯酶(AchE)的抑制作用及量效關系通過下述試驗得到證實。
試驗材料反應底物丁酰硫代膽堿顯色劑二硫硝基苯甲酸藥物及配制實驗樣品取手霉素(Sigma公司，貨號M6418)適量，用50％乙醇溶解，使成0.8mg/ml溶液。
對照品取他克林(Sigma公司，貨號A3773)適量，用50％乙醇溶解，使其成為0.8mg/ml溶液。
實驗方法(1)測定原理以丁酰硫代膽堿為底物，二硫硝基苯甲酸為顯色劑，丁酰硫代膽堿在乙酰膽堿酯酶(AchE)的作用下，丁酰硫代膽堿可被水解為丁酸和巰基膽堿，巰基膽堿與顯色劑二硫硝基苯甲酸反應生成2-硝基-5-巰基苯甲酸，2-硝基-5-巰基苯甲酸在410nm處具有特征吸收，以此間接測定乙酰膽堿酯酶(AchE)的活性。
(2)乙酰膽堿酯酶的酶反應曲線繪制乙酰膽堿酯酶儲備液配制取乙酰膽堿酯酶0.1mg(369U)溶于150ml的0.02mol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.7)中，加甘油150ml，白蛋白30mg，混勻，終濃度為1230 U/L，于-20℃冰箱內保存。
乙酰膽堿酯酶稀釋液配制取乙酰膽堿酯酶儲備液1ml，用磷酸鹽緩沖液(pH＝7.7)稀釋到10ml，使成123U/L。
依次取0ul、25ul、50ul、75ul、100ul和125ul的乙酰膽堿酯酶稀釋液于96孔板中，依次加入磷酸鹽緩沖液(pH7.7)125ul、100ul、75ul、50ul、25ul、和0ul，30℃保溫15分鐘，再加入丁酰硫代膽堿液使終濃度為6mmol/L和0.25mmol/L的二硫硝基苯甲酸75ul后，30℃保溫2小時后，在410nm測定吸收度A，以酶含量為橫坐標，A值為縱坐標繪圖，得到乙酰膽堿酯酶的酶反應曲線(見
圖1)。
當乙酰膽堿酯酶的濃度在061.5U/L范圍內，與反應物吸光度之間可呈現出良好的線性關系，其相關系數r＝0.9997。
手霉素對乙酰膽堿酯酶抑制活性測定方法樣品孔中加入樣品25ul，乙酰膽堿酯酶稀釋液75ul；對照孔加入50％乙醇25ul，乙酰膽堿酯酶稀釋液75ul；空白孔加入50％乙醇25ul，磷酸鹽緩沖液(pH7.7)75ul；用酶聯免疫檢測儀在410nm測定每孔吸收度為A本底，30℃保溫15分鐘后，向每孔中分別加入底物和顯色劑，使在每孔中的終濃度分別達到6mmol/L和0.25mmol/L，30℃保溫2小時，用酶聯免疫檢測儀在410nm測定每孔吸收度為A，樣品孔、對照孔、空白孔的吸收度分別為A樣品、A對照、A空白，樣品對乙酰膽堿酯酶抑制率計算公式如下
手霉素對乙酰膽堿酯酶的IC50測定以他克林為對照測定手霉素與他克林對乙酰膽堿酯酶的IC50值。
實驗樣品取手霉素適量，用50％乙醇溶解，使成0.8mg/ml溶液。然后再逐級稀釋成0.24mg/ml、0.08mg/ml、0.024mg/ml、0.008mg/ml、0.0024mg/ml的樣品溶液。
對照品稱取他克林適量，用50％乙醇溶解，使其成為0.8mg/ml溶液。然后再逐級稀釋成0.24mg/ml、0.08mg/ml、0.024mg/ml、0.008mg/ml、0.0024mg/ml的對照品溶液。
測定方法同手霉素對乙酰膽堿酯酶抑制活性測定方法。
結果表明手霉素對乙酰膽堿酯酶抑制活性與手霉素的濃度成線性關系(見表1)。
表1手霉素和他克林對乙酰膽堿酯酶活性的抑制作用
手霉素IC50＝6.88∫g/ml(12.5μmol/L) 他克林IC50＝2.6∫g/ml(13μmol/L)
本發明用于制備制備治療阿爾茨海默氏病藥物具有毒副作用小的優點。它從以下試驗中得到了證明。
手霉素對丁酰膽堿酯酶的IC50測定丁酰膽堿酯酶的配制取丁酰膽堿酯酶0.3mg溶于200ml 0.02mol/L的磷酸緩沖液(pH7.7)中，加入200ml甘油與30mg白蛋白，混勻，于-20℃冰箱內保存，用前稀釋10倍。
實驗樣品、對照品及測定方法同手霉素對乙酰膽堿酯酶的IC50測定。實驗結果見表2。
表2手霉素和他克林對丁酰膽堿酯酶活性的抑制作用
手霉素IC50＝17.05∫g/ml(31umol/L)他克林IC50＝0.024∝g/ml(0.12umol/L)試驗表明手霉素A和他克林對乙酰膽堿酯酶和丁酰膽堿酯酶活性抑制的倍數分別為2.48倍和0.0092倍(以摩爾濃度計)。
丁酰膽堿酯酶和膽堿能傳遞沒有直接關系，主要分布在血漿、肝臟及腸粘膜上參與體內生理活動，當乙酰膽堿酯酶抑制劑對丁酰膽堿酯酶活性抑制較強時，可破壞丁酰膽堿酯酶的生理功能，而引起其功能紊亂，產生毒副反應。
手霉素在用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物的應用中，手霉素的活性位點為其結構中的環氧乙烷環。
手霉素抑制膽堿酯酶的活性位點測定取手霉素22mg溶于5ml甲醇中，加入6.1mg硼氫化鈉，反應15分鐘后，向反應液中加水150ml，用0.5mol/L草酸調pH至3.0，用氯仿進行分次抽提，合并提取液，蒸去氯仿后得到氫化手霉素粗品，用制備高效液相色譜儀進一步純化，用75％甲醇-水與0.1％磷酸混合液進行洗脫，得到開環的氫化手霉素。測定手霉素和氫化手霉素對乙酰膽堿酯酶的抑制活性。在藥物濃度為1mg/ml時，氫化手霉素未顯示對乙酰膽堿酯酶的抑制活性，而手霉素的抑制率高達97.5％，手霉素抑制膽堿酯酶的活性位點為其結構中的環氧乙烷環。氫化手霉素結構式如下 本發明提供了手霉素用于治療阿爾茨海默氏病的新用途，拓展了手霉素的應用范圍。同時還公開了手霉素對乙酰膽堿酯酶抑制活性的量效關系以及手霉素在該用途中的活性位點。
圖1是乙酰膽堿酯酶反應曲線圖。
實施例1手霉素粉25克加labrafil M 1944 Cs 300克、無水乙醇120克溶解后，橄欖油加至1000ml，制備成用于治療阿爾茨海默氏病的藥用口服制劑，分裝成5ml/支。
實施例2用手霉素粉25克，聚氧乙烯蓖麻油EL35 650克，無水乙醇330克，制備成用于治療阿爾茨海默氏病的藥用注射劑，25mg/1ml。
權利要求
1.手霉素用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物的應用。
2.根據權利要求1所述的手霉素用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物的應用，其特征在于手霉素的濃度與藥物的效果呈線性關系。
3.根據權利要求1所述的手霉素用于制備治療阿爾茨海默氏病藥物的應用，其特征在于手霉素的活性位點為其結構中的環氧乙烷環。
全文摘要
本發明公開了手霉素用于治療阿爾茨海默氏病的新用途，拓展了手霉素的應用范圍。同時還公開了手霉素對乙酰膽堿酯酶抑制活性的量效關系以及手霉素在該用途中的活性位點。
文檔編號A61P25/00GK1473564SQ0212541
公開日2004年2月11日 申請日期2002年8月6日 優先權日2002年8月6日
發明者呂渭川, 張華 , 董悅生, 鄭智慧, 路新華, 任曉, 舒薇, 馬瑛, 單越琦, 李韶菁, 林潔, 楊健, 張謙, 穆亞妹 申請人:華北制藥集團有限責任公司