專利名稱：赤芝孢子的抗突變效果的制作方法
技術領域：
本發明涉及萌發活化(germination activated)的赤芝(Ganoderma lucidum)孢子的粉末在胎兒保護中的用途。具體地，本發明涉及通過給懷孕的哺乳動物給藥萌發活化的赤芝孢子的粉末以防止胎兒損傷的方法。
尤其，GASP已被用于、或被推薦用于免疫疾病、肝炎、AIDS、癌癥、糖尿病、防止自由基氧化、抑制肝毒性的活性、以及用于治療心血管疾病、細菌或病毒感染等等。但是，到目前為止還沒有GASP在懷孕中或對發育的胎兒的效果的報道。
因此，本發明的目的在于提供一種保護胎兒的方法，其包括對懷孕的哺乳動物給藥有效保護量的GASP。在優選的實施方案中，對懷孕的人給藥GASP。
但是，該方法一般對哺乳動物都有效，包括大鼠、小鼠、犬、貓、兔、牛、羊等，包括更高級的非人靈長類。尤其是，本發明的目的在于提供一種保護胎兒不發生突變的方法，該突變包括染色體畸變，其可能是由于環境中的有毒的物質引起，或由于紫外或電離輻射引起。
“致畸”是指增加先天性的或發育的畸形的發生率。致畸劑可以是化學化合物，胎兒或懷孕婦女的遺傳基因座(genetic locus)(參見美國專利6,210,950，其在本文中引用作為參考)，或環境中的物理力，如紫外或電離輻射，電磁輻射等等。
盡管GASP活性的確切機理還未知，但本發明的發明者已證明對懷孕的雌性哺乳動物給藥GASP能減少由任何來源引起的發育畸形、胎兒死亡和先天缺陷的發生率。
“突變”是指引起染色體或基因的結構改變。
本發明的一個目的在于提供一種保護胎兒免受懷孕婦女可能接觸的致突變化合物，以及保護胎兒免受這些化合物的致畸作用的方法。這些致突變化合物的實例包括，但不限于環磷酰胺、砷、黃曲霉毒素B1、氯乙烯、乙酰氨基芴、黃樟素、二甲亞硝胺、苯甲酸安替比林(benzo(a)pyrine)、二苯蒽、氮芥、β-丙酸內酯、乙基甲磺酸酯(ethylmethane sulfonate)、甲基亞硝基脲、和硫酸二甲酯。很多致突變化合物是本領域普通技術人員所熟悉的，并且可以通過本領域普通技術人員已知的檢測方法鑒別。盡管懷孕的哺乳動物，尤其是人，通常不是故意暴露于這些化合物，但是在環境中可能存在可以影響胎兒的少量的這些或其它的化合物。
本發明的另一個目的在于提供減少哺乳動物，尤其是人的發育和先天缺陷的方法。
通過對懷孕的雌性哺乳動物，尤其是人給藥GASP，能實現本發明的這些和其它目的。
對于人，GASP的優選給藥劑量是每人0.5g/天至50g/天，更優選在每人1至25g/天，通常推薦的劑量是4.8g/天。認為為了最佳的益處，GASP應該在整個懷孕期間使用。
對于諸如獸醫目的的對其它哺乳動物給藥，預期有效劑量按照接受動物的單位體重的給藥量是大致相等的，并且本領域普通技術人員可以通過常規實驗測定該有效劑量。
按照本發明的方法給藥GASP能預防或減少胎兒中的胎兒死亡、突變損傷和發育或先天缺陷的發生率或可能性。
發明詳述在本發明優選實施方案的描述中，為清楚起見使用了具體的術語。但是，本發明不限制于所選擇的具體術語。應理解，每個具體的要素包括按照類似方式完成類似目的的所有技術等價物。
使用的測試為改進的小鼠骨髓細胞小核測試，其在中國衛生部的一份文件，“關于‘健康食品功能評價程序和測試方法’的修訂的項目的發布的公告”中具體說明，其在本文引用作為參考。
批號No.2000118的萌發活化的赤芝孢子的粉末從中山大學生命科學學院的廣州綠色食品工程公司和瑞典和香港的綠色能源健康產品國際有限公司商業購買。
90只NIH小鼠，雌雄各半，體重18-20g，從廣東省醫學實驗動物中心獲得，其合格證書編號為200A025。
GASP的推薦臨床劑量為4.8g/天/人，其按照人和小鼠的各自體重換算。其等價于小鼠的劑量為0.61g/kg(4.8g÷7.9＝0.61g/kg)。GASP的推薦臨床劑量的大約10倍量不會引起人和小鼠的副作用。如果高劑量組給藥每日劑量的10倍量，則三個小鼠劑量組分別給藥6.10g/kg、3.10g/kg和0.61g/kg，其等同于人臨床劑量的10、5、和1倍量。
將小鼠按體重隨機分為9組，每組分別雄性5只和雌性5只。每組動物進行下列治療第1組接受6.1g/kg GASP和50mg/kg環磷酰胺(“CP”)。
第2組接受3.1g/kg GASP和50mg/kg CP。
第3組接受0.6g/kg GASP和50mg/kg CP。
第4組接受0g/kg GASP和50mg/kg CP。
第5組接受6.1g/kg GASP和40mg/kg CP。
第6組接受3.1g/kg GASP和40mg/kg CP。
第7組接受0.6g/kg GASP和40mg/kg CP。
第8組接受0g/kg GASP和40mg/kg CP。
第9組接受0g/kg GASP和0mg/kg CP。
將每組的雄性和雌性分別在不同的籠中喂養。進行實驗的時間為30天。在這段時間，嚴密監控動物的食物消耗和異常表現，每3-7天紀錄動物的體重變化。
將藥物制備成在蒸餾水中的所需濃度的混懸液，以0.2mL/10g體重的單個劑量通過管口服給藥。陰性對照組每天一次，連續30天通過管施用等體積的蒸餾水。在該測試的第30天，受試藥物組和陽性對照組分別口服給藥CP40和50mg/kg一次。給藥CP后1小時，受試藥物組和陰性對照組再給藥受試藥物和蒸餾水一次，最后一次給藥后24小時處死小鼠。在處死小鼠4小時前，給其施用秋水仙堿，按照常規方法提取骨髓以制備染色體樣品。
觀察每組的樣品。觀察每個小鼠100個分裂中期細胞，紀錄染色體結構和畸變數量。應用Windows8.0的SPSS(t-檢驗)，對各個劑量組和陽性組的實驗數據進行比較分析，檢驗以發現各組內的雄性和雌性間是否存在顯著性差異。
在30天的測試期中各組小鼠的重量如表1所示。數據表明各測試組和陰性對照組動物的體重沒有顯著性差異(p＞0.05)。該結果表明GASP的各個劑量對小鼠的體重增加沒有影響。表1.在給藥萌發活化的赤芝孢子的粉末期間小鼠體重的變化(X±S，g)組 測試藥CP 動 性別 0天 4天 8天 15天 22天 29天 凈體重增物劑量 劑量物 加(g/kg) (mg/kg) 數1 6.1 50 5 M 20.5±0.7 20.0±1.8 25.0±1.4 25.0±2.9 26.3±2.628.1±3.17.6±2.86.1 50 5 F 18.1±0.1 19.9±1.3 22.3±1.7 22.5±1.7 23.6±1.225.5±1.07.4±1.02 3.1 50 5 M 20.2±1.2 22.1±1.3 24.2±1.7 26.2±2.6 29.6±3.831.0±3.610.8±4.13.1 50 5 F 18.4±0.5 19.9±1.1 22.3±1.5 23.6±2.3 24.7±2.026.2±1.27.8±1.13 0.6 50 5 M 18.7±1.6 21.1±0.5 24.1±2.7 26.1±3328.9±3.029.6±2.510.4±3.40.6 50 5 F 18.3±0.4 19.3±0.9 20.9±1.3 22.0±0.5 22.9±0.725.2±0.46.9±0.54 0 50 5 M 19.8±1.5 21.0±1.7 24.8±3.2 25.1±4.6 26.3±1.627.9±1.68.1±1.80 50 5 F 18.2±0.4 19.3±2.0 21.8±1.9 23.2±1.8 24.3±2.125.9±1.07.6±0.95 6.1 40 5 M 19.4±1.2 21.8±1.1 24.4±0.5 24.5±2.1 28.2±3.128.9±2.28.8±2.96.1 40 5 F 18.1±0.9 19.8±1.8 21.9±2.1 23.6±2.1 24.6±2.425.9±1.37.9±1.36 3.1 40 5 M 20.5±1.0 21.3±1.3 23.3±3.4 25.4±3.2 27.5±2.829.3±3.08.7±2.43.1 40 5 F 18.4±0.3 19.7±0.8 20.9±0.9 22.2±0.8 23.7±1.425.7±1.67.2±1.87 0.6 40 5 M 20.3±1.0 23.0±1.2 25.7±1.2 27.7±1.9 31.3±3.333.2±3.812.8±3.90.6 40 5 F 18.3±0.3 21.1±0.7 23.6±0.6 25.0±0.4 26.8±1.426.8±0.48.4±0.48 0 40 5 M 19.4±1.3 22.8±1.3 26.0±1.3 28.1±1.3 32.4±1.833.2±2.013.7±1.80 40 5 F 18.2±0.2 19.6±1.2 22.9±1.0 24.8±0.6 27.1±2.327.5±2.19.3±1.89 0 0 5 M 19.7±1.3 22.8±0.9 25.4±1.1 26.6±1.4 29.0±3.830.1±3.610.4±4.50 0 5 F 18.0±0.2 20.6±0.5 22.8±0.4 24.2±1.5 25.7±0.526.3±1.08.3±1.0各個GASP劑量組(第1，2和3組)中的被50mg/kg CP誘導的骨髓細胞染色體畸變率顯著低于陽性對照組，如表2所示。各個劑量組和陽性對照組間的差異是顯著的(p＜0.01)。GASP對CP誘導的小鼠染色體畸變的抑制率平均超過50％。結果還表明GASP劑量增加與染色體畸變抑制效果增加之間的劑量依賴關系。表2.萌發活化的赤芝孢子的粉末對50mg/kg CP誘導的小鼠骨髓細胞染色體畸變的抑制效果
1ctg染色單體間隙2csg染色體間隙3ctb染色單體斷裂4csb染色體斷裂5f染色體斷片(fragment)6tr三相交換體(triradial)7r環狀染色體8dmin二微體(dimicrobody)9del缺對染色體抑制率＝(陽性組細胞畸變率-GASP組細胞畸變率)/陽性組細胞畸變率*p＜0.05與陽性組相比**p＜0.013與陽性組相比如表3所示，各個GASP劑量組(即用GASP治療)被40mg/kg CP誘導的骨髓細胞染色體畸變率顯著低于陽性對照組。各個劑量組和陽性對照組間的差異是顯著的(p＜0.01)。各個GASP劑量組對CP誘導的小鼠染色體畸變的抑制率超過30％，但是沒有明顯的劑量-效果依賴關系。結果表明GASP對CP誘導的小鼠骨髓細胞染色體損傷有抑制效果。表3.萌發活化的赤芝孢子的粉末對40mg/kg CP誘導的小鼠骨髓細胞染色體畸變的抑制效果
1ctg染色單體間隙2csg染色體間隙3ctb染色單體斷裂4csb染色體斷裂5f染色體斷片6tr三相交換體7r環狀染色體8dmin二微體(dimicrobody)9del缺對染色體抑制率＝(陽性組細胞畸變率-GASP組細胞畸變率)/陽性組細胞畸變率*p＜0.05與陽性組相比**p＜0.013與陽性組相比結果表明小鼠給藥6.1、3.1和0.61g/kg GASP(相當于推薦臨床劑量的10，5，和1倍)后30天，對40或50mg/kg CP誘導的小鼠骨髓細胞染色體畸變有抑制效果，其中最高劑量組(6.1g/kg)對50mg/kg CP誘導的小鼠骨髓細胞染色體畸變的抑制率可以達到67.8％。這表明GASP對環磷酰胺誘導的小鼠染色體損傷有保護作用。
給大鼠喂食廣東省醫用動物中心提供的標準小球狀食物。選擇體重在200-250g間的健康SD大鼠，以雌雄2∶1的比例一起喂養過夜。第二天開始，每天早晨檢查陰道涂片，當發現精液的那天被認為是懷孕的0天。
將懷孕的大鼠隨機分為5組，每組18只大鼠。按照急性毒性測試，SD大鼠的LD50大于21.5g/kg。人的臨床劑量為每劑量4個膠囊(每膠囊含有0.3g GSAP)，每天4次。設計實驗使低劑量組為428.6mg/kg，中劑量組為2143mg/kg，高劑量組為4286mg/kg(當按照大鼠和人各自的體表面積計算時，分別相當于人臨床劑量的1，5，和10倍)。在懷孕的第6-15天，通過管飼法以1.5ml/100g的體積對各劑量組大鼠口服給藥GASP。陽性對照組在懷孕的第10-12天通過胃管以1.0ml/100g的體積口服給藥阿司匹林(250mg/kg)，而陰性對照組通過管飼法口服給予等量的蒸餾水。
所有懷孕的大鼠每3天稱重一次，以調節劑量。在懷孕的第20天，通過脊椎脫臼處死動物，進行剖腹產術得到胎兒大鼠，以檢測多種指標，進行統計分析。對懷孕大鼠體重增加的影響懷孕大鼠在20天測試期中的體重增加如表4所示。結果表明給藥阿司匹林的動物組的凈體重增加明顯低于陰性對照組(p＜0.05)。各個GASP劑量組與陰性對照組的統計比較顯示凈體重增加無顯著性差異(p＞0.05)，表明本實驗中的GASP劑量對懷孕大鼠的體重增加沒有影響。表4.通過萌發活化的赤芝孢子的粉末對懷孕大鼠體重增加的影響(g，x±s)
*p＜0.05.對早期胚胎發育的影響表5顯示了三個GASP劑量組與陰性對照組進行對比的研究。結果顯示GASP治療組和陰性對照組間在每同窩仔(litter)的胎兒存活率、吸收率(absorption rate)和胎兒死亡率上沒有顯著性差異(p＞0.05)。這明顯不同于阿司匹林組(陽性對照組)和陰性對照組間的研究，其顯示出統計學上顯著的差異(p＜0.01)。結果表明GASP對早期胚胎發育沒有任何顯著的影響。表5.赤芝孢子的粉末對早期胚胎發育的影響
*p＜0.05與陰性對照組相比**p＜0.01與陰性對照組相比對胎兒大鼠發育水平的影響表6顯示了各個GASP劑量組與陰性對照組在胎兒大鼠各個指標上的比較。結果顯示在GASP組和陰性對照組間沒有顯著性差異(p＞0.05)。但是，當阿司匹林陽性對照組與陰性對照組進行比較時，觀察到在胎兒大鼠的外觀上有顯著性差別，阿司匹林陽性對照組的外觀異常率為42.9％。阿司匹林陽性對照組的胎兒大鼠外觀較小，具有短的肢體和尾部，以及臍疝等。表6.通過萌發活化的赤芝孢子的粉末對胎兒大鼠發育水平的影響(x±s)
*p＜0.05與陰性對照組相比**p＜0.01與陰性對照組相比對胎兒大鼠骨骼發育的影響用茜素紅染色后，在顯微鏡下觀察胎兒大鼠，結果表明各個GASP劑量組與陰性對照組在骨骼發育上沒有顯著性差異(p＞0.05)，而阿司匹林陽性對照組顯示出變形如骨骼發育不全、肋骨融合、二頭肋和脊椎變形。結果顯示GASP在當前劑量下不會影響胎兒大鼠的骨骼發育(結果如表7所示)。表7.赤芝孢子的粉末對胎兒大鼠骨骼發育水平的影響
*p＜0.05與陰性對照組相比**p＜0.01與陰性對照組相比對胎兒大鼠器官形成的影響將每同窩仔大約1/3的胎兒大鼠取出，用Bouins溶液固定，手工切片各個內臟器官，然后在解剖顯微鏡下觀察。結果顯示阿司匹林陽性組檢測的17個胎兒大鼠中，2個為腦積水。但是在陰性對照組(40個)、低劑量組(39個)、中劑量組(53個)和高劑量組(56個)檢測的胎兒大鼠中，沒有發現大腦、頜、舌、唇、眼、脊髓、心、肺、腎、肝、膀胱和生殖器發育的任何異常。
這些結果表明GASP的測試劑量對各種指標，諸如懷孕大鼠的體重增加、早期胚胎形成、胎兒生長和發育、胎兒大鼠的骨骼發育和內臟發育沒有任何顯著的影響。因此可得出結論在目前測試條件下，根據“中藥和新藥研究指南(Guide to Researches on Traditional Chinese Medicines和New Drugs)”中的毒理測試方法，GASP對大鼠沒有致畸作用。
使用廣東省醫學實驗動物中心提供的重量22-25g的雄性NIH小鼠。使用的劑量根據小鼠的百分之五十致死量(LD50)，其大于21.5g/kg(數據由暨南大學醫學院(Medical College of Jinan University)提供)。在該測試中，選擇1/2 LD50、1/10 LD50和1/50 LD50作為實驗劑量，即10000mg/kg、2000mg/kg和400mg/kg。還使用了陰性對照組和陽性對照組(40mg/kg環磷酰胺)。每組包括5個小鼠。各個劑量都是連續三天每天通過管飼法口服給藥一次。
稱重GASP，加入適量的蒸餾水，在研缽內研磨。然后加入蒸餾水調節混懸液至所需濃度。通過管飼法以0.4ml/10g體重的劑量口服給藥該化合物。陰性對照組給予等量的蒸餾水，而陽性對照組通過管飼法以40mg/kg(單次給藥)的劑量口服給藥環磷酰胺(“CP”)。末次給藥24小時后，通過頸椎骨脫臼處死動物。取出股骨，剝離肌肉，應用磷酸鹽緩沖液沖洗骨髓，離心，hyponotically固定，應用本領域常規方法制備染色體樣品。然后應用10％Giemsa染料(pH6.8)染色10分鐘。
選擇充分分散的分裂中期細胞在油浸鏡頭下觀察。每個動物觀察100個分裂中期細胞，記錄染色體畸變細胞數，并計算染色體畸變率。應用Windows8.0的SPSS統計學計算分析得到的結果(t-檢驗)。
各個GASP劑量組(應用GASP膠囊)和陰性對照組間的染色體畸變率間的比較沒有顯著性差異(p＞0.05)，而CP組的染色體畸變率顯著高于陰性對照組(p＜0.01)。(結果如表8所示)表8.通過萌發活化的赤芝孢子的粉末對小鼠骨髓細胞的染色體畸變率的影響
b表示染色體斷裂(chromosomal breakage)I表示染色體斷片(chromosomal fragmentation)f表示染色體融臺(chromosal fusion)*p＜0.01上述結果表明當GASP以最高劑量(10000mg/kg)給藥時，不會引起小鼠骨髓細胞的染色體畸變率的增加。這又證明當以最高劑量給藥時不會引起突變率的增加。
在本說明書中舉例說明和討論的實施方案只是為了教導本領域普通技術人員據發明人所知的制備和應用本發明的最佳方式。這些說明書中的內容不應被認為是限制本發明的范圍。本領域普通技術人員根據上述教導可以理解對本發明的上述實施方案進行修改或改變，要素添加或刪減，而不偏離本發明的范圍。因此，可以理解本發明除上面具體描述外，在權利要求及其等同物的范圍內可以以其它的方式實施。
權利要求
1.一種預防或減少哺乳動物胎兒突變損傷的方法，所述方法包括對懷孕的雌性給藥有效量的萌發活化的赤芝孢子粉末(GASP)。
2.按照權利要求1的方法，其中所述突變損傷包括染色體畸變。
3.按照權利要求1的方法，其中所述的突變損傷是通過暴露于毒性物質而引起。
4.按照權利要求1的方法，其中所述突變損傷是通過紫外或電離輻射而引起。
5.按照權利要求1的方法，其中所述懷孕的雌性是人。
6.按照權利要求5的方法，其中所述有效保護量在每天0.5至50g之間。
7.按照權利要求6的方法，其中所述有效保護量在每天1至25g之間。
8.一種預防哺乳動物胎兒死亡的方法，所述方法包括對懷孕的雌性給藥有效保護量的萌發活化的赤芝孢子粉末(GASP)。
9.按照權利要求8的方法，其中所述懷孕的雌生是人。
10.按照權利要求9的方法，其中所述有效保護量在每天0.5至50g之間。
11.按照權利要求10的方法，其中所述有效保護量在每天1至25g之間。
12.一種預防或減少哺乳動物發育或先天缺陷的方法，所述方法包括對懷孕的雌性給藥有效保護量的萌發活化的赤芝孢子粉末(GASP)。
13.按照權利要求12的方法，其中所述懷孕的雌性是人。
14.按照權利要求13的方法，其中所述有效保護量在每天0.5至50g之間。
15.按照權利要求15的方法，其中所述有效保護量在每天1至25g之間。
全文摘要
本發明提供了一種通過給懷孕的哺乳動物口服給藥萌發活化的赤芝孢子粉末(“GASP”)用于胎兒保護的方法。證明GASP對懷孕的哺乳動物，尤其是人的胎兒損傷有預防作用。
文檔編號A61P43/00GK1466991SQ0214250
公開日2004年1月14日 申請日期2002年9月23日 優先權日2002年7月5日
發明者鐘志強, 唐筱勤 申請人:鐘志強, 唐筱勤