專利名稱：氨基胍對難愈創面的防治作用的制作方法
技術領域：
本發明涉及醫學和藥物學領域，更具體地涉及氨基胍對難愈創面的防治作用及其在制備治療難愈創面的藥物方面的應用。
背景技術：
組織愈合或修復是指外傷或其他疾病過程造成組織缺損(如燒傷創面、撕脫傷創面等)或斷裂(如切割傷等)后，局部組織通過再生或增生方式來進行修補的一系列病理生理過程。創面愈合的本質是生物體在長期進化過程中所獲得的一種自我保護與組織更新方式的具體表現，是機體對外傷維持自身穩定的一種基本反應過程，是一個涉及凝血、止血、炎癥反應、基質合成和沉積、血管生成、纖維組織形成、上皮形成及傷口收縮和重塑等病理生理步驟的復雜過程。當愈合過程在外源性或內源性因素干擾下不能以可以預見的生物學步驟，按時相規律有序地進行組織學修復，引起創面愈合延遲或經久不愈，從而形成難愈創面。
代表性的難愈創面的類型包括(a)糖尿病并發的潰瘍；(b)慢性靜脈性潰瘍；(c)慢性感染創面；(d)高劑量射線照射所致的創面；(e)褥瘡；(f)化療藥外滲所致的創面等。
影響創面愈合的主要因素就全身因素而言，患者營養缺乏、嚴重貧血、年老或患有全身疾病，如糖尿病、動脈粥樣硬化等，不僅延緩愈合過程，而且某些疾病還會成為局部慢性難愈創面形成的真正誘因，如糖尿病并發的潰瘍。類固醇類藥物可通過抑制炎癥反應和促進蛋白質分解來抑制修復過程。近來，隨著腫瘤治療的進程，高劑量射線照射和一些抗腫瘤藥物，如阿霉素類應用后對修復的影響也已引起人們的重視。此外，創傷后神經內分泌失調和免疫功能紊亂對修復的不利影響也是人們關注的重點。
就局部因素而言，反復損傷、缺血、感染、異物等是造成傷口慢性化的主要原因。因此，為了力求降低傷口慢性化原因的發生率，使創傷組織能在最佳條件下迅速再生或修復，應從各個角度，保證傷口順利愈合，除了必要的傷口處理外，還包括顧及全身的營養和免疫狀態，全身和局部的組織灌注和氧供，防止或減少感染機會，保護組織勿使重復受傷。
長久以來，人們一直希望能找到某種方法或藥物來“促進”或“加速”這些慢性難愈創面修復。對“難愈”創面的研究分析表明某些難愈創面，如老年患者和糖尿病患者的創面，難愈與體內蛋白非酶糖基化終末產物(AGEs)和脂氧化終末產物(ALEs)形成增多有關；某些難愈創面，如慢性感染、慢性靜脈性潰瘍以及糖尿病潰瘍創面，則與創面中NO含量增加有關。抑制AGEs和ALEs形成，降低創面中NO含量，有利于這類創面的愈合。
研究發現，某些難愈創面，在形成創面之前就存在一些基礎病變，如糖尿病患者皮膚菲薄，是糖尿病易發生自發性潰瘍，并導致創面難愈的病理基礎。
氨基胍是一種具有親核作用的肼化合物，能與缺乏電子的羰基基團起反應。肼能夠使多種氧化還原酶失活，例如大鼠肝細胞色素P450、過氧化氫酶、辣根過氧化物酶、醛糖還原酶(aldose reductase，AR)、多巴胺-β-羥化酶和單胺氧化酶等。然而，迄今為止尚沒有將氨基胍用于治療難愈創面的報道。
因此，本領域迫切需要開發新的促進難愈創面愈合的藥物。
發明內容
本發明的目的就是提供一種有效防治難愈創面愈合的藥物。
在本發明的第一方面，提供了一種氨基胍的用途，它用于制備治療難愈創面的組合物，其中所述的難愈創面選自下組(a)糖尿病誘發的潰瘍；(b)慢性靜脈性潰瘍；(c)慢性感染創面；(d)射線照射所致的創面；(e)褥瘡；(f)化療藥外滲所致的創面。
在另一優選例中，所述組合物含有占組合物總重量0.01％-99％的氨基胍，更佳地含有占組合物總重量0.1％-90％的氨基胍。
在另一優選例中，所述組合物還含有占組合物總重量0.1％-90％的精氨酸。
在另一優選例中，所述組合物還含有適量的(通常小于20wt％)選自下組的物質胰島素、生長因子、生長激素、氨基酸、微量元素、維生素。
在另一優選例中，所述組合物用量為每天0.01-10mg/kg體重，按氨基胍計。
在另一優選例中，所述組合物用量為每天0.1-5mg/kg體重，按氨基胍計。
在另一優選例中，所述組合物為保健品。
在另一優選例中，所述組合物為藥物組合物。
在另一優選例中，所述組合物為片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、乳濁劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑、或酏劑。
在本發明的第二方面，提供了一種糖尿病保健品，含有1-900mg/g(更佳地10-900mg/g)的氨基胍和可接受的載體或稀釋劑。更佳地，所述保健品還含有含有1-900mg/g(更佳地10-900mg/g)的精氨酸。
在本發明的第三方面，提供了一種藥物組合物，它含有0.1-99wt％的氨基胍、0.1-99wt％的精氨酸和藥學上可接受的載體。該藥物組合物可更有效地防治難愈創面，尤其是改善糖尿病患者皮膚組織變薄的狀況，有利于防止糖尿病自發性潰瘍的發生。
圖1顯示了糖尿病皮膚組織變薄，氨基胍導致糖尿病皮膚的厚度回復至接近正常水平。
圖2顯示了施用氨基胍能明顯增加單位面積羥脯氨酸含量，從而提高糖尿病皮膚中的膠原含量。
具體實施例方式
本發明人經過多年深入而廣泛的研究發現，氨基胍能抑制AGEs和ALEs形成。氨基胍可抑制誘導型一氧化氮合成酶(iNOS)活性；氨基胍可選擇性抑制iNOS活性，有效降低創面中NO含量，促進難愈創面愈合；氨基胍還可抑制對半卡巴肼敏感的胺氧化酶活性，從而減少自由基形成、抑制血管硬化，改善創面血液供應，有利于創面愈合。因此，氨基胍能夠顯著改善治療難愈創面，促使傷口愈合。在此基礎上完成了本發明。
如本文所用，“難愈創面”指當愈合過程在外源性或內源性因素干擾下不能以可以預見的生物學步驟，按時相規律有序地進行組織學修復，從而引起創面愈合延遲或經久不愈。通常指在不施用任何藥物的情況下，創面愈合時間超過10天或更長(如12、14、16、18天的創面)。代表性的難愈創面例子包括(但并不限于)(a)糖尿病誘發的潰瘍；(b)慢性靜脈性潰瘍；(c)慢性感染創面；(d)高劑量射線照射所致的創面。
(e)褥瘡；(f)化療藥外滲所致的創面。
本發明人的研究發現某些疾病(如糖尿病、慢性靜脈性潰瘍等)，潰瘍發生前，其皮膚菲薄，易于發生潰瘍。此類病變皮膚的變化，是創面“難愈”發生的病理基礎，暫稱之為皮膚的“隱性損害”。氨基胍可改善某些疾病皮膚的“隱性損害”，從而有效預防自發性潰瘍的發生和治療自發性潰瘍。
本發明研究表明，氨基胍促進難愈創面的機理如下所述。應理解，本發明的保護范圍并不受該機理的限制。
以氨基胍促進糖尿病難愈創面愈合為例，糖尿病并發癥的成因之一為多元醇代謝活性亢進的滲透壓學說，認為在一般組織中葡萄糖透入細胞內的過程是非胰島素依賴性的，由于細胞內外的濃度差而被攝入細胞內的葡萄糖通常代謝成己糖，但如超過一定數量而形成高血糖時，由于醛糖還原酶(AR)活化而使山梨醇的形成亢進，其蓄集一方面會引起滲透壓上升，產生組織(血管、神經、腎、視網膜、晶狀體等)水腫，進展至基質變化而發生并發癥；另一方面，可使其他具有滲透活性的物質如肌醇等代償性耗竭，致使神經傳遞速度下降，同時減少還原型輔酶(NADPH)等輔助因子，影響谷胱甘肽還原酶、一氧化氮合成酶以及前列腺素氫過氧化酶等的活性。動物實驗表明，抑制AR，可恢復神經傳導速度，防止視網膜組織中蛋白異常滲透，減輕腎輸入小動脈擴張，使腎小球濾過率恢復正常。氨基胍可抑制AR活性，減輕組織水腫，有利于創面修復。
高血糖時，糖與蛋白質結合而發生交聯反應，使蛋白質發生不可逆變化，最后形成AGE，糖尿病患者體內各組織的AGE含量較正常人高5～50倍。糖與血紅蛋白結合，可形成糖化血紅蛋白，使其攜氧能力下降；創面中某些生長因子(如堿性成纖維細胞生長因子(bFGF))，某些受體(如表皮細胞生長因子受體(EGFR)等)，也可發生糖基化，導致其生理功能減弱；細胞外基質的糖基化則可使其可塑性降低，從而使得創面愈合過程中所必須的血管形成過程受阻；AGEs還可通過與其受體結合，導致血管過度收縮，局部血栓形成，引起微血管及修復細胞損害和局部炎癥反應；過量的ALEs可血管壁損傷，導致動脈粥樣硬化發生。所以這些都嚴重影響了創面愈合的自然進程，參與“難愈”創面的形成。而氨基胍可顯著抑制AGEs、ALEs形成，減輕其對修復過程中生長因子及基質蛋白等成分的毒害作用，招募免疫細胞，改善修復細胞功能及其作用環境，加快血管和肉芽組織形成，從而促進糖尿病難愈創面愈合。
氨基胍還可選擇性iNOS活性，可防止創面中生成過量NO對修復細胞產生毒性作用，有利于創面愈合。
本發明提供了用于治療難愈創面(尤其是糖尿病造成的難愈創面)的藥物，其中含有安全有效量的氨基胍以及藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。
本發明還提供了用于改善糖尿病人難愈創面的保健品，其中含有為10-900mg/克氨基胍。
A.劑量在本發明中，對氨基胍的劑量沒有特別限制，可用任何合適的劑量。載體的類型以及數量也可以很不相同，這取決于溫血動物或人的種類、體重、和待治療的難愈創面程度等。一般，合適的含量是氨基胍占藥物組合物總重量的0.01％-99％，較佳地0.1-90％。作為藥物治療或作為保健品保養時，氨基胍的有效劑量范圍通常為0.01-800毫克/千克·天或更高，較佳地為0.1-500毫克/千克·天，更佳地為0.5-200毫克/千克·天。
劑量單元包括一種氨基胍化合物，或者該氨基胍化合物與其他糖尿病治療劑所形成的混合物。劑量單元還可含有稀釋劑、填充劑、載體等。劑量單位是固體或凝膠形式，如丸劑、片劑、膠囊等，或者是液體形式，它們適合口服給藥、直腸給藥、局部給藥或腸胃外給藥、或者靜脈內給藥。
一種特別優選的組合物同時含有氨基胍和精氨酸。通常，氨基胍和精氨酸的總重量百分比為1-99％或更高，按組合物總重量計。其中氨基胍和精氨酸的兩者的重量比為50∶1-1∶50，更佳地為10∶1-1∶10。就每日用量而言，通常氨基胍50-200mg/kg/d，精氨酸100-400mg/kg/d范圍內的組合較佳。
氨基胍和精氨酸聯用可獲得更顯著效果的可能機理如下所述。應理解，本發明范圍并不受該機理的限制。
精氨酸是NO合成的唯一底物，體內催化NO產生的NOS有兩種iNOS和cNOS。CNOS催化產生的NO對維持血管等的基礎功能發揮重要作用，而iNOS產生的NO則對修復細胞的趨化，產生自由基發揮殺菌等作用十分重要，但如果iNOS活性過強，產生的NO過量，則可加重創面組織的損傷，導致創面愈合延遲或不愈。而此時與氨基胍合用，則可選擇性抑制iNOS活性，防止產生過量NO，抑制創面進行性損害，有利于創面愈合。
B.劑型本發明的經口給藥的固體組合物可采用片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、滴劑等形式。這些固體組合物中混合了1種或1種以上的活性物質和至少1種惰性稀釋劑，例如，乳糖、甘露糖醇、葡萄糖、羥丙基纖維素、微晶纖維素、淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、果膠、硅鋁酸鎂、鋁酸鎂。還可按照常用方法使組合物中含有除了惰性稀釋劑之外的添加劑，例如，硬脂酸鎂等潤滑劑、纖維素乙醇酸鈣等崩解劑、乳糖等穩定劑、谷氨酸或天冬氨酸等助溶劑。如是片劑或丸劑，還可根據需要，在其外部包裹上蔗糖、明膠、羥丙基纖維素、羥丙基甲基纖維素鄰苯二甲酸酯等糖衣或胃溶性、腸溶性薄膜。
經口給藥的液體組合物包括藥劑上允許的乳濁劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑、酏劑等，通常使用的惰性稀釋劑包括精制水、乙醇。該組合物中除了惰性稀釋劑之外，還可包含濕潤劑、懸浮劑等助劑，甜味劑、矯味劑、芳香劑和防腐劑。
非經口給藥的注射劑包括無菌水性或非水性溶液劑、懸浮劑和乳濁劑。水性溶液劑和懸浮劑中包含注射劑用蒸餾水及生理鹽水。非水溶性溶液劑和懸浮劑中包含丙二醇，聚乙二醇，可可脂、橄欖油、蓖麻油等植物油，乙醇等醇類，阿拉伯膠、吐溫80(商品名)等。這些組合物中還可包含等滲劑、防腐劑、濕潤劑、乳化劑、分散劑、穩定劑(例如乳糖)、助溶劑(例如，谷氨酸、天冬氨酸)。用濾菌膜過濾上述組合物，再配合使用滅菌劑就可達到無菌的目的。然后，利用上述組合物制得無菌的固體組合物，在使用前用水或無菌注射用溶劑溶解就可加以利用。
用于制造本發明的有用劑型的技術和組合物，在下列文獻中有描述7種現代制劑(7 Modern Pharmaceutics).第9和10章(Banker & Rhodes編輯，1979)；Lieberman等人，藥物劑型片劑(Pharmaceutical Dosage FormsTablets)(1981)；和Ansel，藥物劑型導論(Introduction to PharmaceuticalDosage Forms)2版(1976)。
C.給藥方法配制好的藥物組合物可以通過常規途徑進行給藥，其中包括(但并不限于)肌內、腹膜內、靜脈內、皮下、皮內、口服、或局部給藥。此外，氨基胍還可與其他治療糖尿病及其并發癥的治療劑(如胰島素等)一起使用。
現階段，我國有各種難愈創面患者。例如糖尿病患者約880萬，預計在到2025年將達到3,800萬，其中有相當部分病人并發有難愈創面。因此氨基胍具有廣泛的市場前景。本發明的主要優點在于(1)氨基胍可有效防治難愈創面愈合。
(2)氨基胍可與其它治療糖尿病藥物(如精氨酸等)合并使用，并可經常規途徑給藥，使用方便。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1氨基胍對糖尿病難愈創面的治療效果方法SPF級雄性SD大鼠(購自復旦大學上海醫學院動物實驗中心)，體重200～250g。隨機分為3組，A正常對照組(n＝30)，B糖尿病對照組(n＝30)、C氨基胍干預組(n＝30)。B、C組禁食24小時后給予65mg/kg體重鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ，Sigma公司)腹腔單劑量注射。注射前及注射后每周經尾靜脈采血測定隨機血糖，同時對誘導后大鼠的體重進行觀測。若誘導前血糖水平＜8.9mmol/L，誘導后血糖水平≥11.2mmol/L，體重明顯下降，即可視為糖尿病模型誘導成功。B、C組大鼠根據血糖水平腹腔注射魚精蛋白鋅胰島素1-4μ/d，既保證血糖維持在11.2mmol/L以上，又降低酮癥的發生率，從而減少動物死亡率。模型成功后，C組大鼠予氨基胍灌胃，劑量為100mg/kg/d，每天一次，直至取材。
糖尿病模型誘導成功8周后，對三組大鼠行深II度燙傷(約占總體表面積20％)。以糖尿病模型誘導成功8周為0時相點，各組于第0及傷后3、7、14、21天時相點處死大鼠，取全層皮膚標本。部分標本于10％緩沖福爾馬林溶液中固定后制成石蠟塊保存。
測定方法A.創面愈合面積百分比的計算以透明方格紙，于傷后24小時第一次測量創面面積為燙傷面積，于取材時測量各時相點創面面積。計算公式為愈合面積＝燙傷面積-各時相點面積；創面愈合面積百分比＝(愈合面積/燙傷面積)×100％采用Adobe photoshop 7.0(Adobe公司)進行面積計算。
B、組織中羥脯氨酸(OHP)含量檢測創面組織準確稱重后，加9倍生理鹽水制成10％的勻漿，離心，將上清稀釋成2％的濃度后，按羥脯氨酸含量測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)說明進行測定。
將0時相點石蠟標本制成5μm厚的切片，常規HE染色，光鏡下測量表皮厚度。
結果A、氨基胍對創面愈合面積百分比的影響氨基胍治療組與正常對照組相比，在傷后7天創面愈合面積百分比顯著增加(P＜0.01)，14、21天則無顯著性差異；與糖尿病對照組相比，氨基胍治療組在傷后7、14、21天創面愈合面積百分比增加，均有顯著性增加(P＜0.01)(如表1所示)。
表1創面愈合面積百分比
注與正常對照組相比，*p＜0.01，與糖尿病對照組相比，&p＜0.01氨基胍對0時相點表皮厚度的影響結果如圖1所示，其中糖尿病對照組與正常對照組相比，p＜0.05，氨基胍治療組與正常對照組相比，p＞0.05，氨基胍治療組與糖尿病對照組相比，p＞0.05。
與正常對照組相比，糖尿病組表皮厚度顯著變薄，而氨基胍治療后，表皮厚度增加，雖然這種增加與糖尿病對照組相比，未達到統計學差異，但可表明應用氨基胍后，可糾正糖尿病表皮菲薄的狀態。
氨基胍對0時相點單位面積羥脯氨酸含量的影響結果如圖2所示。其中糖尿病對照組與正常對照組相比，p＜0.05，氨基胍治療組與正常對照組相比，p＞0.05，氨基胍治療組與糖尿病對照組相比，p＜0.01。
與正常對照組相比，糖尿病組單位面積羥脯氨酸含量顯著降低，氨基胍治療后，羥脯氨酸含量顯著增加，與糖尿病對照組相比，p＜0.01，而與正常組之間無統計學差異。應用氨基胍，能明顯增加糖尿病皮膚膠原含量。
實施例2氨基胍治療其他難愈創面重復實施例1的方法，不同點在于慢性靜脈性潰瘍模型大鼠替換糖尿病難愈創面模型大鼠，觀察創面愈合情況。
結果表明，施用氨基胍組大鼠的愈合情況優于對照組。這表明，應用氨基胍可促進慢性靜脈性潰瘍的創面愈合。
研究表明慢性靜脈性潰瘍創面難愈的一個可能原因是與創面中過量的NO有關。過量的NO與OH-結合產生亞硝酸鹽，后者可加劇組織破壞，不利于創面愈合。氨基胍可顯著抑制iNOS活性，減少NO的產生，有利于創面愈合。
實施例3含氨基胍的藥物組合物在本實施例中，將下表中的各組合按常規方法混合，制成用于口服的含氨基胍的藥物組合物，劑型為顆粒劑。
口服顆粒劑的配方
實施例4含氨基胍和其他糖尿病治療劑的藥物組合物在本實施例中，在磺脲類、雙胍類藥物、胰島素藥物的片劑配方中，分別添加5wt％含量的氨基胍，制得含氨基胍和其他糖尿病并發癥治療劑的口服片劑。
實施例5氨基胍和精氨酸合用可更顯著促進難愈創面愈合。
重復實施例1的方法，不同點僅在于增加了聯用氨基胍和精氨酸的試驗組D(氨基胍100mg/kg/d+精氨酸200mg/kg/d)。
結果，聯合用藥組D的創面愈合時間顯著縮短，優于正常對照組A、糖尿病對照組B和氨基胍治療組C。
實施例6
含氨基胍和精氨酸的藥物組合物在本實施例中，將下表中的各組合按常規方法混合，制成用于口服的含氨基胍和精氨酸的藥物組合物，劑型為片劑。
口服片劑的配方
討論難愈創面的原因非常復雜。以糖尿病難愈創面為例，主要的原因可能與高血糖有關。
氨基胍是一種具有親核作用的肼化合物，能與缺乏電子的羰基基團起反應。肼能夠使多種氧化還原酶失活，例如大鼠肝細胞色素P450、過氧化氫酶、辣根過氧化物酶、醛糖還原酶、多巴胺-β-羥化酶和單胺氧化酶等。
氨基胍抑制蛋白非酶糖基化終末產物(AGEs)和脂氧化終末產物(ALEs)形成慢性高血糖可引起機體的AGEs和ALEs大量堆積，從而引起許多蛋白、脂類分子的結構功能改變，可能是糖尿病創面難愈發生的眾多原因之一。
含有醛基或酮基的還原性糖類在某些氧化基團的作用下，可與氨基酸或核酸的氨基發生非酶化反應，稱為Maillard反應，生成可逆性Schiff堿結構并異構成更穩定的Amadori型早期糖基化產物。后者經過一系列緩慢而復雜的化學反應，最終形成一類不可逆的糖基化產物，即AGEs(Yasotha Duraisamy，JohnGaffney，Mark Slevin，et al.Aminosalicylic acid reduces theantiproliferativeeffect of hyperglycaemia，advancedglycationendproducts and glycated basic fibroblast growthfactor incultured bovine aortic endothelial cellsComparison with aminoguanidine.Mol Cell Biochem，2003，246143-153.)。
除還原性糖類以外，某些脂類物質也可與蛋白質發生非酶化反應，它們主要是多不飽和脂肪酸的氧化產物，如丙二酸二醛(MDA)等，這一類可修飾蛋白質的脂質過氧化物被稱為ALEs。糖尿病患者血漿中，AGEs和ALEs水平是相伴升高的，表明二者在產生和蓄積的機制方面具有同源性。AGEs、ALEs可由體內的一類含有羰基的小分子化合物與蛋白質的氨基反應生成，這一類羰基化合物被稱為反應性羰基化合物(RCO)。在糖尿病異常代謝狀態下，機體的糖類、脂類和蛋白質在氧化基團的作用下大量生成RCO，進而導致了AGEs、ALEs在體內的蓄積(Miyata T，Van Y，Kurokawa，et al.Alterations innon-enzymatic biochemistry in uremiaOrigin and significance of“carbonyl stress”in long-term uremic complication.Kidney Int，1999，55389-399；Miyata T，Fu M X，Kurokawa，et al.Autoxidation productsof both carbohydrates and lipid are increased in uremic plasmaIsthere oxidative stress in uremia？.Kidney Int，1998，427381-385；Suzuki D，Miyata T.Carbonyl stress in the pathogensis of diabeticnephropathy.Intern Med，1999，38309-314)。
AGEs形成可改變創面愈合過程中某些蛋白質分子和關鍵性成分的結構、功能，使其結合力下降，信號轉導受阻，細胞增殖抑制，從而導致創面愈合延遲。如，創面中堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，在高糖環境中可發生糖基化，糖基化bFGF的促增殖能力顯著下降；某些生長因子受體，如表皮生長因子受體(EGFR)，也可發生糖基化，從而使其介導的信號轉導途徑受阻，細胞增殖抑制。細胞外基質中的蛋白成分在高糖環境中也可發生糖基化，導致其結合力下降；而且糖基化還能使細胞外長壽基質蛋白發生交聯，使其能對抗蛋白水解酶，從而使新血管形成過程中所必須的降解、重塑過程發生障礙，導致創面愈合過程中血管形成不良。總之，創面愈合過程中調節細胞遷移、增生和重塑過程所必須的生長因子、基質蛋白成分的糖基化，可導致糖尿病創面愈合延遲，甚至不愈。(Francesco F，Lentini A，Fogliano V，et al.Sugar-inducedmodification of fibroblast growth factor 2 reduces its angiogenicactivity in vivo.Am J Pathol，2002，161531-541；Manuel Portero-Otin，Reinald Pamplona，Maria Josep Bellmunt，et al.Advanced glycation endproduct precursors impair epidermal growth factor receptor signaling.Diabetes，2002，511535-1542；Tamarat R，Silvestre JS，Huijberts M，etal.Blockade of advanced glycation end-product formation restoresischemia-induced angiogenesis in diabetic mice.Proc Natl Acad Sci，2003，1008555-8560.)AGEs還可與其受體(RAGEs)結合產生效應 RAGEs是一種免疫球蛋白，存在于多種細胞表面。免疫細胞可通過表面特異性RAGEs識別、結合AGEs修飾蛋白，促使單核細胞向AGEs沉積處聚集，從而清除AGEs修飾蛋白。可見AGEs通過適當的細胞因子介導，可促使其沉積處的衰老組織清除和新組織重建。然而，由于糖尿病患者AGEs和ALEs過度沉積，打破了AGEs、ALEs沉積和清除的平衡，產生一系列病理變化。AGEs與內皮細胞上RAGEs結合后，激活凝血因子IX和X與VIIa結合，同時使血栓調節素活性快速下降，抑制抗血凝蛋白激酶C通路的活化，造成血管過度收縮和局部血栓形成。另外，AGEs與內皮細胞上RAGEs結合，還能誘導內皮素-1(ET-1)的產生增加，組織因子(例如前凝血質)活性增加，增加轉錄調節蛋白AP-1DNA結合位點和活化轉錄因子NF-κB，進一步使血管細胞粘附分子(VCAM-1)增加，VCAM-1通過與CD11/CD18復合物結合介導中性粒細胞的粘附，釋放各種酶和自由基，增加血管通透性并損傷內皮細胞。此外，免疫細胞與AGEs結合后還可分泌腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-1(IL-1)等細胞因子，加劇組織損傷，并刺激內皮細胞粘附蛋白的表達增加，形成惡性循環。AGEs與成纖維細胞表面的RAGEs結合，可導致其功能減退，膠原合成減少。AGEs與RAGEs結合，還可誘導細胞的靶部位發生氧化應激，攻擊DNA和核蛋白，影響基質成分mRNA的表達，導致基因突變和基因表達錯誤，從細胞內水平來改變細胞的結構和功能。因此，通過與RAGEs結合，AGEs可造成血管過度收縮、局部血栓形成，引起微血管及修復細胞損害和局部炎癥反應，參與形成糖尿病創面難愈。(Mouza T.Goova，Jun Li，Thomas Kislinger，et al.Blockade of receptor foradvanced glycation end-products restores effective wound healing indiabetic mice.Am J Patho，2001，159513-525；Hofmann MA，Drury S，Fu C，et al.RAGE mediates a novel proinflammatory axisa centralcell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides.Cell，1999，97889-901；Owen Jr WF，Hou FF，Stuart RO，et al.β2-Microglobulinmodified with advanced glycation end products modulates collagensynthesis by human fibroblasts.Kidney Int，1998，531365-1373)
在糖尿病患者微循環中，游離的葡萄糖和Amadori產物經過金屬轉移催化發生自然氧化，產生大量自由基，造成體內大量富含活性醛基物質的過度堆積。這些活性醛基可以與載脂蛋白的賴氨酸殘基相結合，阻止低密度脂蛋白(LDL)的清除過程。同時，過度LDL的氧化修飾使LDL抗原決定簇發生改變，從而不被LDL受體所識別，而位于血管基質中的巨噬細胞攝取LDL增加，泡沫細胞形成增加，導致LDL沉積在血管壁周圍，造成血管硬化、血管閉塞等，加劇糖尿病創面難愈(Schmidt A M，Yan S D，Wautier，et al.Activationof receptor for advanced glycation end products-A mechanism forchronic vascular dysfunction in diabetic vasculopathy andatherosclerosis.Cir Res，1999，84489-497)。
氨基胍上的氨基酸通過與早期糖化產物(Amadori產物)及3-脫氧葡萄糖酮等含有活性羰基的Amadori降解產物發生反應，形成無活性的Amadori產物替代物，阻斷早期糖化產物進一步重排脫氫形成AGEs。從而抑制AGEs和膠原蛋白、白蛋白等蛋白糖化后的交聯形成。不僅如此，氨基胍還能抑制早期糖化產物的形成。葡萄糖可以開放鏈的形式與氨基胍縮合，導致游離葡萄糖濃度的減少，從而抑制了糖化蛋白質的產生。氨基胍與游離葡萄糖的這種親和力很弱，其抑制早期糖化產物形成最終AGEs的作用要遠遠大于其抑制早期糖化產物形成的作用。
氨基胍與糖尿病微循環中的醛基結合，還可抑制LDL氧化修飾，加速血管內LDL清除，改善血管結構和功能，有利于創面愈合。
可見，氨基胍可顯著抑制AGEs、ALEs形成，減輕其對修復過程中生長因子及基質蛋白等成分的毒害作用，招募免疫細胞，改善修復細胞功能及其作用環境，加快血管和肉芽組織形成，從而促進糖尿病難愈創面愈合。
氨基胍抑制一氧化氮合成酶(NOS)活性一氧化氮(NO)是一種強有力的內源性擴血管物質，可增加血流和血管通透性。NO又是一種氧化劑，可與H2O2反應生成過(氧化)亞硝酸鹽(ONOO-)，后者也是一種強氧化劑，這兩種氧化劑可氧化生物分子導致細胞損傷和死亡。NO這種細胞毒性作用可在吞噬細胞殺滅病原菌的免疫反應中發揮作用，但也可對機體細胞產生毒性，不利于創面的修復。(N.E.Flynn，C.J.Meininger，T.E.Haynes et al.The metabolic basis of arginine nutrition andpharmacotherapy.Biomed Pharmacother，2002，56427-438；Fang YZ，Yang S，Wu G.Free radicals，antioxidants，and nutrition.Nutrition，2002，18872-879.)NO主要由NOS催化合成，體內NOS有三種誘導型(iNOS)、神經型(nNOS)、內皮型(eNOS)。后兩者可統稱為結構型NOS(cNOS)。正常情況下，機體需要的基礎性NO由cNOS產生，應激情況下，NO主要由iNOS產生。幾乎所有的細胞在炎癥因子和脂多糖作用下都可表達iNOS，因此大量的NO主要由iNOS產生。
氨基胍具有選擇性抑制iNOS的作用。氨基胍在結構上與NO的合成底物L-精氨酸相似，在NO的合成過程中作為競爭性抑制劑。氨基胍在BH4的輔助下，生成反應性中間產物(自殺產物)與精氨酸的結合位點和血紅素殘基結合，從而抑制NOS。氨基胍與N-單甲基-L-精氨酸(L-NMMA，一種非選擇性NOS競爭性抑制劑)均能抑制內毒素引起的巨噬細胞釋放iNOS。所不同的是氨基胍對iNOS的抑制作用比L-NMMA強7倍，而對cNOS只產生輕微的影響，僅是L-NMMA的1/15。氨基胍這種選擇性抑制iNOS活性的作用主要是因為(1)氨基胍與iNOS的親和力是cNOS的50～500倍；(2)內皮細胞cNOS與精氨酸的結合力是氨基胍的1000倍，氨基胍不能起到競爭性抑制的作用，相反精氨酸則可以防止氨基胍誘導的cNOS失活；(3)cNOS在細胞內常處于未激活狀態，只有在特殊的刺激條件下才激活，并釋放少量的NO。氨基胍抑制cNOS的過程中需要Ca2+、CaM、NADPH、BH4和氧分子同時參與，這個過程很短暫，只能產生少量的自殺產物來抑制cNOS。而氨基胍抑制iNOS不受這么多條件的限制，一旦iNOS激活，就能持續催化生成大量的NO。氨基胍對iNOS的抑制作用也是持續的，而且可以生成大量的自殺產物來抑制iNOS。
氨基胍選擇性iNOS活性，可防止生成過量NO對修復細胞產生毒性作用，有利于創面愈合。但適量的NO對創面愈合是必須的，因此氨基胍通過這一途徑促進創面愈合的作用是相對的。
氨基胍抑制對半卡巴肼敏感的胺氧化酶活性氨基胍通過抑制AGEs、ALEs阻止結構蛋白和功能蛋白以及膠原的交聯，其中有一部分是通過抑制對半卡巴肼敏感的胺氧化酶(SSAO)活性來實現的。SSAO是在6-羥基多巴代謝過程中作為輔助因子的催化酶，是Cu2+依賴性的，它對肼敏感。SSAO主要分布在人體的血管平滑肌細胞、軟骨、視網膜和血液中，在糖尿病和肝病患者體內都發現了血清中SSAO的水平升高，糖尿病大鼠和綿羊的血清中也發現SSAO的升高，而且SSAO活性和血漿糖化血紅蛋白的水平有密切的聯系。SSAO催化甲胺脫氨生成甲醛和過氧化氫，SSAO介導的脫氨作用在AGEs形成過程中起到了一定的作用甲胺脫氨形成的大量甲醛在蛋白之間形成支架，誘導蛋白交聯和重要結構蛋白和功能蛋白的修飾，甲醛還參與血管的硬化過程，在糖尿病微血管并發癥的發生發展中起到了重要作用。另外，脫氨作用促使體內生成過氧化氫、氧自由基的速度加快，從而脂質過氧化、丙二醛、共軛雙烯烴的水平也相應升高。體內體外實驗證明氨基胍能夠不可逆地抑制SSAO的活性。像其他肼復合物一樣，氨基胍通過與6-羥基多巴苯環上3-酮基共價結合生成腙產物，干擾6-羥基多巴的代謝過程，抑制AGEs形成和血管硬化，改善創面血液供應，減少自由基生成，有利于創面愈合。
綜上所述，糖尿病創面難愈的原因是多方面、多層次的，而氨基胍阻斷高血糖病理作用，促進創面愈合的環節也是多方面、多層次的。目前還沒有發現氨基胍有明顯的毒性作用，因此氨基胍有廣闊的應用前景。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種氨基胍的用途，其特征在于，用于制備治療難愈創面的組合物，其中所述的難愈創面選自下組(a)糖尿病誘發的潰瘍；(b)慢性靜脈性潰瘍；(c)慢性感染創面；(d)射線照射所致的創面；(e)褥瘡；(f)化療藥外滲所致的創面。
2.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述組合物含有占組合物總重量0.01％-99％的氨基胍。
3.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述組合物還含有占組合物總重量0.1％-90％的精氨酸。
4.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述組合物還含有選自下組的物質胰島素、生長因子、生長激素、氨基酸、微量元素、維生素。
5.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述組合物用量為每天0.01-10mg/kg體重，按氨基胍計。
6.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述組合物為保健品。
7.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述組合物為藥物組合物。
8.如權利要求1所述的用途，其特征在于，所述組合物為片劑、丸劑、膠囊劑、散劑、顆粒劑、乳濁劑、溶液劑、懸浮劑、糖漿劑、或酏劑。
9.一種糖尿病保健品，其特征在于，含有1-900mg/g的氨基胍和可接受的載體或稀釋劑。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有0.1-99wt％的氨基胍，0.1-99wt％的精氨酸和藥學上可接受的載體。
全文摘要
本發明公開了一種氨基胍的用途，它用于制備治療難愈創面的組合物，其中所述的難愈創面包括(a)糖尿病并發的潰瘍；(b)慢性靜脈性潰瘍；(c)慢性感染創面；(d)高劑量射線照射所致的創面；(e)褥瘡；(f)化療藥外滲所致的創面等。氨基胍能夠顯著治療難愈創面，促使傷口愈合。
文檔編號A61P3/00GK1626070SQ20031010931
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月12日 優先權日2003年12月12日
發明者陸樹良, 葛奎, 謝挺 申請人:上海第二醫科大學附屬瑞金醫院