肽,其抗體,以及它們在中樞神經系統損傷的治療中的用途的制作方法

專利名稱：肽,其抗體,以及它們在中樞神經系統損傷的治療中的用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及可用于CNS損傷例如脊髓損傷或卒中的治療或開發所述治療的物質和方法。
背景身體內的許多組織，諸如皮膚，肝和外周神經，具有顯著的損傷后自我修復的能力。反之，中樞神經系統(CNS)-包括腦和脊髓，幾乎沒有先天性修復能力。當軸突連接在成年人的腦或脊髓中被破壞時，它們顯示極其有限的再生能力，但軸突可在胚胎CNS中以及成年人外周神經系統中生長并有效再生。導致CNS軸突不能再生的因素可分成兩組導致其不能再生的CNS神經元內在性質；以及可抑制軸突延伸的CNS環境中的外部因素。
CNS環境中的因素可阻止再生的觀點來自20世紀早期。Ramon yCajal觀察到成人CNS神經元的軸突突起延伸不能可通過給予它們外周神經的容許性環境而克服。約20年以后，David和Aguayo顯示，視網膜神經元可在外周神經移植物中形成長的突出。隨后，Schwab發現，培養物中的背根神經元可延伸其軸突穿過雪旺細胞，但避開寡突細胞以及富含脂肪的髓鞘(Schwab et al 1993)。
這些結果顯示，再生不能不僅僅是CNS神經元的先天缺陷，CNS環境中的抑制因子也起重要作用。這些抑制因子主要位于白質束中損傷區處、由形成軸突的鞘的髓磷脂形成的膠質疤痕中。
CNS損傷后，壞死的中央區由膠質細胞和其它非神經元細胞浸潤，并形成纖維疤痕。軸突不延伸通過疤痕，并且它們的生長似乎由疤痕抑制。有助于該抑制活性的分子成分包括細胞外基質糖蛋白腱生蛋白-R(TN-R)以及髓磷脂相關的神經突生長抑制物(myelin-associated neuriteoutgrowth inhibitor)髓磷脂相關的糖蛋白(MAG)和Nogo。
TN-RTN-R見于多種細胞基質相互作用，其參與CNS發育和再生過程中的軸突引導的分子控制和神經細胞遷移(reviewed by Erickson，1993；Chiquet-Ehrismann et al.，1994；Pesheva et al.，2000；2001)。TN-R是腱生蛋白家族的最小成員，并由四種結構基序組成N末端的富半胱氨酸片段，然后是4.5EGF-樣重復。該區后面是9個連續的III型纖連蛋白-樣結構域，并且在C末端TN-R與纖維蛋白原的β鏈和γ鏈相關。
TN-R主要由寡突細胞在髓磷脂形成開始和早期表達，并且在成年人中仍由一些寡突細胞表達。TN-R也在脊髓、視網膜、小腦和海馬的一些神經元以及中間神經元中表達(Fuss et al.，1991；1993)。TN-R與其它膠質細胞來源的分子(即髓磷脂相關的糖蛋白和phosphacan-相關的分子)以高密度在CNS有髓軸突的郎維耶結(Ranvier node)中共定位(Xiaoet al.，1997Yang et al，1999)。
TN-R可抑制或促進神經突生長，有賴于神經元細胞類型以及其存在的環境。當提供TN-R，作為明確的底物界限，背根神經節(DRG)，小腦和視網膜神經節神經元生長錐避免在這些分子上生長，但不會經誘導而受到破壞(collapse)。另一方面，當在與層粘連蛋白(強烈促進胚胎和成人軸突生長)的混合物(作為均一基質)中提供TN-R時，DRG生長錐顯示受破壞的形態，并能夠以比利用單獨的層粘連蛋白時更快的速度前進。
利用與腱生蛋白分子上的不同表位結合的數種單克隆抗體，表皮生長因子樣(EGF-L)重復和III型纖連蛋白同源性重復4-5被鑒定為導致生長錐排斥(growth cone repulsion)。
在體外，胚胎和成人視網膜神經節細胞軸突自小鼠視網膜外植體的生長在腱生蛋白-R或細菌表達的含EGF-L結構域的腱生蛋白-R片段的均質底物上明顯減少。當兩種分子都存在時，作為明確的底物界限，再生長的成人軸突不穿入含有腱生蛋白-R或EGF-L的區域。所有體外試驗都是在層粘連蛋白存在的條件下進行的，提示腱生蛋白-R和EGF-L活躍地抑制軸突生長。神經突和生長錐在由含TN-R的GFG-L(氨基末端富半胱胺酸結構域加上EGF-樣重復)，FN(纖連蛋白)1-2，FN3-5和FG(纖維蛋白原)結構域的片段包被的區域中受到排斥，并且EGF-L阻止海馬神經元的神經突生長。
TN-R還通過EGF-L結構域在體外誘導軸突解束(Taylor et al.，1993；Xiao et al.，1996，1997，1998；Becker et al，1999；Becker et al，2000)。
成人大鼠橄欖小腦系統的3-乙酰吡啶誘導的損傷之后，含TN-R轉錄物的細胞密度在下橄欖核以及小腦皮質的白質中明顯增加。免疫組織化學研究證實了這些在蛋白質水平的觀察。
大鼠脊髓機械損傷以后，TN-R mRNA也發生上調(Wintergerst at al，1997；Deckner et al，2000)。
這些發現提示TN-R在受損CNS中的持續過表達可能導致成人軸突在體內的再生不能。
腱生蛋白-R是腱生蛋白家族成員，其在發育的神經系統中對細胞相互作用起重要作用，諸如神經元遷移，神經突生成(neutritognensis)，以及神經元再生。腱生蛋白-R主要由寡突細胞在髓磷脂形成開始以及早期表達，并在成人中繼續由一些寡突細胞表達(Pesheva et.al.，1989；Fuss et al.，1991，1993；Wintergerst et.al.，1993；Ajemian A.et.al.，1994)。TN-R是多功能分子(Lochter和Schachner，1993；Pesheva et.al.，1993；Taylor et.al.，1993；Xiao et.al.，1996，1997，1998)，并且提示其為髓磷脂提取物的抑制成分。Xiao發現，TN-R的EGF-L結構域可抑制神經突生長。
MAGMAG是免疫球蛋白超家族的跨膜蛋白，其由中樞和外周神經系統的成髓鞘膠質細胞表達，其中MAG分別占總髓磷脂蛋白的1和0.1％(Heape at al，1999)。MAG是軸突再生的有效抑制物，并且還可根據神經元的年齡和類型促進軸突生長。MAG抑制所有出生后年齡的視網膜神經元，上頸部神經節(superior cervical ganglion)神經元，脊神經元，以及海馬神經元和背根神經節(DRG)神經元的神經突生長，但可促進胚胎脊髓神經元和新生兒DRG神經元的神經突生長(DeBellard at al，1996；Turnley et al，1998；Shen et al，1998；Yang et al，1999)。
MAG也可誘導生長錐萎陷(collapse)。60％的生后1天海馬神經元的軸突生長錐在遭遇包被的重組MAG(rMAG)時萎陷。所述萎陷不能在用變性的rMAG時觀察到(Li et al，1996)。可溶性dMAG(MAG細胞外結構域的蛋白水解片段，其從髓磷脂大量釋放并可在體內發現)，以及嵌合的MAG-Fc可有效抑制神經突從P6DRG神經元的生長。這種抑制在MAG單克隆抗體被包括時受到阻斷。
這些結果表明，在體內檢測到的可溶性dMAG可導致受損后的哺乳動物CNS中的再生缺乏(Tang et al，1997；2001)。
MAG具有兩個神經元識別位點，R118的唾液酸結合位點以及自前三個Ig結構域缺失的獨特抑制位點(Tang et al，1997)。
MAG是免疫球蛋白基因超家族的確定成員，并且其顯示對青年人小腦神經元以及成人背根神經節(DRG)神經元的神經突生長的穩定抑制作用(Mukhopadhyay et al.，1994)。MAG是具有626氨基酸的膜蛋白。已有報道稱可溶性MAG(由胞外結構域組成)具有對神經突生長的抑制作用(Mckerracher et.al.，1994)。MAG的結構域由5個Ig-樣結構域組成，并且證實前兩個Ig-樣結構域對于MAG與神經元膜之間的相互作用是重要的，而其它三個Ig-樣結構域可能參與抑制作用(Collins et al.，1997)。
NogoNogo是定位于CNS髓磷脂的高分子量整合膜蛋白，但不定位于PNS髓磷脂。Nogo具有三種同種型，命名為Nogo-A，-B和-C，其是通過可選拼接產生的。NI-250和NI-35首先被鑒定，并命名為Nogo的兩種同種型；現在確定NI-250是Nogo-A，NI-35是Nogo-B。Nogo由CNS白質中的寡突細胞表達，并見于髓磷脂內片(leaflet)、外片以及內質網中。
Nogo的體外定性證實了其作為軸突延長的有效抑制物的功能。Nogo活性的體內中和導致軸突再生增強，CNS損傷后的功能恢復以及未受損CNS纖維中的可塑性增加。當將單克隆抗體mAb IN-1用于脊髓損傷的成年大鼠時，可促進體內的長距離再生以及功能恢復(Chen et al，2000；GrandPre et al；Merkler et al)。
這些發現提示，Nogo可作為導致CNS環境的非容許性質的主要因素。鑒定了Nogo的兩種不同的抑制性結構域Nogo-A的細胞內氨基末端結構域(NogoN)以及位于三種同種型Nogo-A，Nogo-B和Nogo-C的兩個疏水結構域之間的短66殘基區(Chen et al，2000；GrandPre et al，2000；Fournier et al，2001；Filbin，2003)，這些結構域顯示在Science，Vol297(5584)，16 Aug 2002，p.1132-1134中。
Nogo-A由寡突細胞而非雪旺(schwann)細胞表達。其可抑制軸突延伸并破壞背根神經節生長錐(GrandPre et.al.，2000)。Nogo的神經突生長抑制活性可通過單克隆抗體IN-中和，所述抗體允許脊髓損傷以后的軸突再生以及功能性恢復(Chen et.al.，2000)。Nogo是具有1163個氨基酸的膜蛋白。C末端尾含有兩個疏水跨膜結構域，所述兩個結構域由66-殘基疏水性細胞外結構域分離。該66殘基細胞外結構域可抑制軸突生長(Fournier et.al.，2001)。
Huang等(1999)公開了刺激成人脊髓中的軸突再生的治療性疫苗方法。
本發明的目的是提供通過克服髓磷脂對軸突再生的抑制效應對CNS損傷例如脊髓損傷的治療或開發所述治療的所用物質和方法。

發明內容
第一個總體方面，本發明人建議利用與主要髓磷脂蛋白的抑制性結構域相互作用的分子作為CNS損傷治療的輔助治療，以及用于開發進一步的治療。
第二個總體方面，本發明人建議利用主要髓磷脂蛋白的抑制性結構域免疫受試者作為CNS損傷的輔助治療。
用髓磷脂抗原免疫受試者而言似乎不可行，這是由于該方法誘導自身免疫性脫髓鞘疾病，導致不可接受的副作用。此外，一些髓磷脂抗體促進髓鞘再生(Rodriguez et al.，1987)，這對于軸突再生過程不利。但發明人的方法是，將主要髓磷脂蛋白的特異性抑制部分而不是整個髓磷脂蛋白作為疫苗的基礎。針對所述抑制性部分激發的抗體將阻斷髓磷脂對軸突再生的抑制效應。
第一方面因此，本發明提供一種肽，其氨基酸序列由選自下組的氨基酸序列組成YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或QLPLMPR(SEQ ID NO.7).
這些序列每一個都代表數種肽的推定的氨基酸序列，所述肽已經由噬菌體展示鑒定為可與一或多種神經元生長抑制分子Nogo(具體地，Nogo-66結構域)，MAG和TN-R(具體地，TNR-EGFL)結合。
SEQ ID NO.1代表能與Nogo66結合的43種相同肽的序列，以及能與MAG結合的19種相同肽的序列。
SEQ ID NO.2代表能與Nogo66結合的8種相同肽的序列。
SEQ ID NO.3代表能與TNR-EGFL結合的18種相同肽的序列。
SEQ ID NO.4代表能與TNR-EGFL結合的3種相同肽的序列。
SEQ ID NO.5代表能與TNR-EGFL結合的1種相同肽的序列。
SEQ ID NO.6代表能與TNR-EGFL結合的1種相同肽的序列。
SEQ ID NO.7代表能與MAG結合的5種相同肽的序列。
其中，SEQ ID NO.1已經由噬菌體顯示，其可在體外試驗中結合Nog66和MAG以阻斷Nog66和MAG對神經元細胞粘附的抑制效應。類似地，SEQ ID NO.3已經顯示阻斷TNR-EGFL的抑制效應。因此，優選的多肽由SEQ ID NO.1構成；另一優選的多肽由SEQ ID NO.3構成。
本發明提供了可多至60個氨基酸長的肽，其包含選自下組的氨基酸序列YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或QLPLMPR(SEQ ID NO.7)，其中所述肽能夠與Nogo(優選Nogo-66)，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)結合。
優選，所述肽的長度多至50個氨基酸，更優選多至40，多至30，多至25，多至20，多至19，多至18，多至17，多至16，多至15，多至14，多至13，多至12，多至11，多至10，多至9，或多至8個氨基酸。
優選的肽包含SEQ ID NO.1；另一優選的肽包含SEQ ID NO.3。
本發明還提供了長度多至60個氨基酸的肽，其包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少5個與選自下組的氨基酸序列中的相應殘基相同的殘基YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或QLPLMPR(SEQ ID NO.7)，其中，所述肽能夠與Nogo(優選Nogo-66)，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)結合。
所述肽的優選大小如前所述。優選這樣的肽，其具有至少5個與SEQ ID NO.1的相應殘基相同的殘基，或至少5個與SEQ ID NO.3的相應殘基相同的殘基。
優選相同殘基的最小數目是6。
本發明還提供了組合物，其包含本發明的一或多種肽以及一或多種可藥用的成分。
優選所述組合物配制成用于體內注射，優選用于直接注射入CNS。
本發明還提供了本發明的肽，其用于治療方法中。所述應用可以用于CNS損傷，具體是脊髓損傷或卒中的治療中。
本發明還提供了本發明的多肽在制備用于治療CNS損傷，具體是脊髓損傷或卒中的藥物中的用途。
本發明還提供了治療CNS損傷的方法，所述方法包括將本發明的肽給藥到患者中的CNS損傷處或其附近。具體地，本發明提供了治療SCI或卒中的方法，所述方法包括給藥患者具有氨基酸序列SEQ ID NO.1或3的肽，所述給藥通過直接注入患者體內的SCI或卒中損傷位點進行。
本發明還提供了本發明的肽和/或其計算機生成的模型在設計能夠與一或多種神經元生長抑制分子Nogo(優選Nogo-66)，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)結合的模擬物中的用途。
類似地，本發明提供設計本發明肽的模擬物的方法，所述模擬物可與一或多種神經元生長抑制分子Nogo(優選Nogo-66)，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)結合，所述方法包括(i)分析能與一或多種神經元生長抑制分子Nogo(優選Nogo-66)，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)結合的本發明的肽，確定對于定義藥效基團的活性而言必不可少且重要的氨基酸殘基；和(ii)模擬(model)所述藥效基團以設計和/或篩選具有所述生物活性的候選模擬物。
優選所述方法和/或用途包括體外測定候選模擬物與Nogo(優選Nogo-66)，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)的結合。在鑒定了能夠進行所述體外結合的候選模擬物以后，優化候選模擬物用于體外應用。所述優化后，將所述優化的模擬物與一或多種可藥用的成分配制在一起。
本發明還提供了表達由肽和噬菌體外殼蛋白組成的融合蛋白的噬菌體，使得所述肽顯示在噬菌體病毒粒的表面，其中所述肽長度多至60個氨基酸，并包含這樣的氨基酸序列，其具有至少4個與選自下組的氨基酸序列中的相應殘基相同的殘基YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；和QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。
優選本發明的肽的長度多至50氨基酸，更優選多至40，多至30，多至25，多至20，或多至15氨基酸。更優選，本發明的肽的長度多至8-12氨基酸，更優選6-10。優選相同殘基的最小數目為5或6。
本發明還提供了篩選能夠與Nogo(優選Nogo-66)，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)結合的肽的方法，包括以下步驟提供本發明的噬菌體，其分別表達不同的肽；和篩選具有與Nogo，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)結合的能力的噬菌體。
可隨后在體外試驗中篩選被鑒定為能夠與Nogo，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)結合的噬菌體，或者它們顯示的多肽阻斷Nogo，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)對神經元細胞粘附(adhesion)的抑制效應的能力。鑒定能夠在體外試驗中阻斷Nogo，MAG和/或TN-R(優選TNR-EGFL)對神經元細胞粘附的抑制效應的肽以后，所述肽優選與一或多種可藥用的成分配制在一起用于體內給藥。
本發明還提供了搜索很可能減少TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的因素的方法，所述方法包括詢問數據庫以鑒定多肽，或者編碼多肽的核酸，所述多肽包括這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少5個與選自下組的氨基酸序列中的對應殘基相同的殘基YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；
HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或QLPLMPR(SEQ ID NO.7).
所述數據庫優選是cDNA數據庫。其可為EST數據庫。優選它是在哺乳動物CNS中表達的序列的數據庫。特異性較低的數據庫可以使用，但其產生較多的假陽性結果。
本發明還提供了搜索很可能減少TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的因素的方法，所述方法利用能在嚴謹條件下與一種核酸序列雜交的寡核苷酸探針搜索cDNA文庫，所述核酸序列編碼具有至少5個與選自下組的氨基酸序列中的對應殘基相同的殘基YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；和QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。
所述cDNA文庫優選哺乳動物文庫，更優選人文庫。所述文庫優選來自CNS組織。
前兩種方法中的每一種優選還包括這樣的步驟，在鑒定了候選多肽或編碼該候選多肽的核酸以后，檢測所述多肽降低TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的能力。
第二方面該方面，本發明提供了核酸載體，其包含編碼選自下組的一或多種結構域的核酸(a)Nogo-A的N-末端(NogoN)結構域；(b)Nogo-B的細胞外環(Nogo66)(也存在于Nogo-A和Nogo-C中)；(c)MAG的第三到第五個免疫球蛋白樣重復；和(d)TN-R的EGF-樣結構域。
TN-R EGF-L結構域已經在Xiao et al.(1996)中鑒定為能夠抑制神經元細胞系和原代神經元的神經突體外生長。
所述載體包括所述核酸在哺乳動物細胞中表達所需的控制序列。優選所述載體是可購得的疫苗載體，其中插入了所述核酸。適宜且優選的可購得的疫苗載體包括pcDNA 3.1載體家族，具體是pcDNA 3.1+，以及pVAX 1(all from Invitrogen，San Diego，California，US)。
通常所述核酸將是DNA。
優選所述核酸編碼至少兩種結構域，更優選至少三種結構域，更優選它編碼所有四種結構域。所述核酸可編碼一或多個所述結構域的多個拷貝。
如果所述核酸編碼一個以上的結構域，所述結構域優選作為融合多肽表達。優選所述結構域通過柔性接頭(優選聚-Ala接頭，例如Ala3接頭)相互分離，從而促進所述結構域的正確折疊。
對于Nogo A，Nogo B，TN-R和/或MAG(和/或優選Nogo-C)蛋白，所述載體優選基本上僅能夠表達所述的結構域。NogoN是Nogo A同種型的結構域.Nogo 66所有三種同種型Nogo-A，Nogo-B和Nogo-C中的結構域。具體地，所述載體優選不能表達該蛋白質的其它含表位部分。對于蛋白質Nogo A，Nogo B，TN-R和/或MAG(和/或優選Nogo-C)，所述載體優選表達不超過20％，更優選不超過15％，不超過12％，不超過10％，不超過8％，不超過6％，不超過5％，不超過4％，不超過3％，不超過2％or不超過1％位于上述結構域以外的蛋白質。這對于含有僅僅所述蛋白之一的一或多種結構域的載體尤其如此。
Nogo A，Nogo B，Nogo C，TN-R和MAG的氨基酸序列可得自GenBank，例如根據以下登錄號MAG-X05301(GI 56611)TN-R-Z67996(GI 1261914)Nogo B-AJ251384(GI 9408097)Nogo A-AF320999(GI 11878297)Nogo C-CAB99250(GI 9408100)
所述結構域優選具有下文顯示的氨基酸序列，即對于結構域(c)，MAG(1-508)的508殘基氨基酸序列；對于結構域(d)，TNR(125-329)的205殘基氨基酸序列；對于結構域(a)，NogoN(1-185)的185氨基酸序列；和對于結構域(b)，Nogo66(823-888)的66氨基酸序列。
MAG(1-508)MIFLTTLPLF WIMISASRGG HWGAWMPSSI SAFEGTCVSI PCRFDFPDELRPAVVHGVWY FNSPYPKNYP PVVFKSRTQV VHESFQGRSR LLGDLGLRNCTLLLSTLSPE LGGKYYFRGD LGGYNQYTFS EHSVLDIINT PNIVVPPEVVAGTEVEVSCM VPDNCPELRP ELSWLGHEGL GEPTVLGRLR EDEGTWVQVSLLHFVPTREA NGHRLGCQAA FPNTTLQFEG YASLDVKYPP VIVEMNSSVEAIEGSHVSLL CGADSNPPPL LTWMRDGMVL REAVAESLYL DLEEVTPAEDGIYACLAENA YGQDNRTVEL SVMYAPWKPT VNGTVVAVEG ETVSILCSTQSNPDPILTIF KEKQILATVI YESQLQLELP AVTPEDDGEY WCVAENQYGQRATAFNLSVE FAPIILLESH CAAARDTVQC LCVVKSNPEP SVAFELPSRNVTVNETEREF VYSERSGLLL TSILTLRGQA QAPPRVICTS RNLYGTQSLE LPFQGAHR(SEQ ID NO8)TNR(125-329)CPCASS AQVLQELLSR IEMLEREVSV LRDQCNANCC QESAATGQLDYIPHCSGHGN FSFESCGCIC NEGWFGKNCS EPYCPLGCSS RGVCVDGQCICDSEYSGDDC SELRCPTDCS SRGLCVDGEC VCEEPYTGED CRELRCPGDCSGKGRCANGT CLCEEGYVGE DCGQRQCLNA CSGRGQCEEG LCVCEEGYQGPDCSAVAPP (SEQ ID NO9)NogoN(1-185)MEDLDQSPLV SSSDSPPRPQ PAFKYQFVRE PEDEEEEEEE EEEDEDEDLEELEVLERKPA AGLSAAPVPT APAAGAPLMD FGNDFVPPAP RGPLPAAPPVAPERQPSWDP SPVSSTVPAP SPLSAAAVSP SKLPEDDEPP ARPPPPPPASVSPQAEPVWT PPAPAPAAPP STPAAPKRRG SSGSV (SEQ ID NO10)Nogo66(823-888)RIYKGVIQ AIQKSDEGHP FRAYLESEVA ISEELVQKYS NSALGHVNCTIKELRRLFLV DDLVDSLK (SEQ ID NO11)
所述載體優選編碼具有氨基酸序列MAG(1-508)-Alan-TNR(125-329)-Alan-NogoN(1-185)-Alan-Nogo66(823-888)(SEQ ID NO12)的多肽，其中Alan表示聚丙氨酸接頭。n優選3。
所述結構域優選由以下序列編碼即對于結構域(c)，MAG(126-1649)的508密碼子核酸序列；對于結構域(d)，TNR(454-1068)的205密碼子核酸序列；對于結構域(a)，NogoN(1-555)的185密碼子核酸序列；和/或對于結構域(b)，Nogo66(2467-2664)的66密碼子核酸序列MAG(126-1649)atgatattccttacc accctgcctctgttttggat aatgatttcag cttctcgaggggggcactg gggtgcctgg atgccctcgt ccatctcagccttcgagggc acgtgtgtct ccatcccctg ccgtttcgac ttcccggatgagctcagacc ggctgtggta catggcgtct ggtatttcaa cagtccctaccccaagaact acccgccagt ggtcttcaag tcccgcacac aagtggtccacgagagcttc cagggccgta gccgcctgtt gggagacctg ggcctacgaaactgcaccct gcttctcagc acgctgagcc ctgagctggg agggaaatactatttccgag gtgacctggg cggctacaac cagtacacct tctcggagcacagcgtcctg gacatcatca acacccccaa catcgtggtg cccccagaagtggtggcagg aacggaagta gaggtcagct gcatggtgcc ggacaactgcccagagctgc gccctgagct gagctggctg ggccacgagg ggctaggggagcccactgtt ctgggtcggc tgcgggagga tgaaggcacc tgggtgcaggtgtcactgct acacttcgtg cctactagag aggccaacgg ccaccgtctgggctgtcagg ctgccttccc caacaccacc ttgcagttcg agggttacgccagtctggac gtcaagtacc ccccggtgat tgtggagatg aattcctctgtggaggccat tgagggctcc cacgtcagcc tgctctgtgg ggctgacagcaacccgccac cgctgctgac ttggatgcgg gatgggatgg tgttgagggaggcagttgct gagagcctgt acctggatct ggaggaggtg accccagcagaggacggcat ctatgcttgc ctggcagaga atgcctatgg ccaggacaaccgcacggtgg agctgagcgt catgtatgca ccttggaagc ccacagtgaatgggacggtg gtggcggtag agggggagac agtctccatc ctgtgttccacacagagcaa cccggaccct attctcacca tcttcaagga gaagcagatcctggccacgg tcatctatga gagtcagctg cagctggaac tccctgcagtgacgcccgag gacgatgggg agtactggtg tgtagctgag aaccagtatggccagagagc caccgccttc aacctgtctg tggagtttgc tcccataatccttctggaat cgcactgtgc agcggccaga gacaccgtgc agtgcctgtgtgtggtaaaa tccaacccgg aaccctccgt ggcctttgag ctgccttcccgcaacgtgac tgtgaacgag acagagaggg agtttgtgta ctcagagcgcagcggcctcc tgctcaccag catcctcacg ctccggggtc aggcccaagccccaccccgc gtcatttgta cctccaggaa cctctacggc acccagagcctcgagctgcc tttccaggga gcacaccga (SEQ ID NO13)
該序列開始于起始密碼子；如果任何其它序列用于該核酸的5’末端，將需要起始密碼子。當然可常規地改造它成為任何目的核酸序列，但注意到Nogo(1-555)也開始于起始密碼子。
TNR(454-1068)tgtccat gtgccagttc agcccaggtg ctgcaggagc tgctgagccggatcgagatg ctggagaggg aggtgtcggt gctgcgagac cagtgcaacgccaactgctg ccaagaaagt gctgccacag gacaactgga ctatatccctcactgcagtg gccacggcaa ctttagcttt gagtcctgtg gctgcatctgcaacgaaggc tggtttggca agaattgctc ggagccctac tgcccgctgggttgctccag ccggggggtg tgtgtggatg gccagtgcat ctgtgacagcgaatacagcg gggatgactg ttccgaactc cggtgcccaa cagactgcagctcccggggg ctctgcgtgg acggggagtg tgtctgtgaa gagccctacactggcgagga ctgcagggaa ctgaggtgcc ctggggactg ttcggggaaggggagatgtg ccaacggtac ctgtttatgc gaggagggct acgttggtgaggactgcggc cagcggcagt gtctgaatgc ctgcagtggg cgaggacaatgtgaggaggg gctctgcgtc tgtgaagagg gctaccaggg ccctgactgctcagcagttg cccctcca (SEQID NO14)NogoN(1-555)atggaagacc tggaccagtc tcctctggtc tcgtcctcgg acagcccaccccggccgcag cccgcgttca agtaccagtt cgtgagggag cccgaggacgaggaggaaga agaggaggag gaagaggagg acgaggacga agacctggaggagctggagg tgctggagag gaagcccgcc gccgggctgt ccgcggccccagtgcccacc gcccctgccg ccggcgcgcc cctgatggac ttcggaaatgacttcgtgcc gccggcgccc cggggacccc tgccggccgc tccccccgtcgccccggagc ggcagccgtc ttgggacccg agcccggtgt cgtcgaccgtgcccgcgcca tccccgctgt ctgctgccgc agtctcgccc tccaagctccctgaggacga cgagcctccg gcccggcctc cccctcctcc cccggccagcgtgagccccc aggcagagcc cgtgtggacc ccgccagccc cggctcccgccgcgcccccc tccaccccgg ccgcgcccaa gcgcaggggc tcctcgggct cagtg(SEQ ID NO15)Nogo66(2467-2664)agga tatacaaggg tgtgatccaa gctatccaga aatcagatgaaggccaccca ttcagggcat atctggaatc tgaagttgct atatctgaggagttggttca gaagtacagt aattctgctc ttggtcatgt gaactgcacgataaaggaac tcaggcgcct cttcttagtt gatgatttag ttgattctctgaag(SEQ ID NO16)
然而，認為這些特異性結構域的片段，衍生物或變體將產生出有效疫苗。因此，本發明意義內的多肽結構域可以是上文給出的四種氨基酸之一的片段，所述片段優選由來自所述序列的至少15個連續氨基酸，更優選至少17，更優選至少20，25，30，40，50或60個氨基酸組成。對于MAG，NogoN和TNR，所述片段的大小為更優選至少80個氨基酸，更優選100，120，140，160或180氨基酸。對于TNR和MAG，所述長度更優選200氨基酸。對于MAG，所述長度更優選250，300，350，400或450個氨基酸。所述片段將包括一或多個具體結構域的表位(所述結構域的序列在上文給出)，并將保留所述結構域在體內激發抗體反應的能力。因此，所述片段將能夠在體內激發與相應結構域交叉反應的抗體。線性表位繪圖是本領域技術人員的常規技術。
類似地，本發明意義內的多肽結構域可以是上文給出的氨基酸序列之一(參照氨基酸序列)的變體。其中，所述變體是具有這樣的序列的多肽，所述序列與參照氨基酸序列不同，但包括至少15個氨基酸的部分，該部分與參照序列的相應部分有至少65％氨基酸同一性。優選同一性水平至少70％，75％，80％，85％，90％，95％，98％或99％。優選所述部分的長度至少17氨基酸，更優選的長度是前一段給出的片段的長度。另外，所述變體通常包括一或多個上文給出其序列的具體結構域的表位，并將保留所述結構域在體內激發抗體反應的能力。因此，所述變體將能夠在體內激發與相應結構域的交叉反應的抗體。
本發明還提供包含本發明載體的組合物，其與一或多種可藥用的成分配制在一起用于作為(治療性)疫苗。優選所述組合物被配制成用于通過注射給藥。
本發明還提供了本發明的載體，其用于治療方法中。所述治療可以是CNS損傷，具體是SCI或卒中的治療。
本發明還提供了本發明的載體在制備用于CNS損傷，具體是SCI或卒中的治療的藥物中的用途。
本發明還提供了治療患者體內的CNS損傷的方法，所述方法將本發明的載體作為治療性疫苗給藥患者。
本發明的載體通常通過注射給藥，但本領域已知其它疫苗遞送方法(諸如口服或透皮遞送以及“無針(needle-free)”注射)。注射通常是肌內的。雖然血腦屏障通常成為抗體通過的屏障，CNS損傷(具體是損傷，例如外傷)將通常允許抗體在損傷部位通過血腦屏障。因此認為無需特別措施來允許應答于本發明載體的免疫接種而激發的抗體通過血腦屏障。
該方面，本發明提供了多肽，其基本上由一或多種選自下組的多肽結構域組成(a)Nogo-A的N-末端(NogoN)結構域；(b)Nogo-B的細胞外環(Nogo66)(也存在于Nogo-A和Nogo-C中)；(c)MAG的第三到第五個免疫球蛋白樣重復；和(d)TN-R的EGF-樣結構域。
所述多肽的優選特征是上文中所述載體所編碼多肽的特征。
本發明提供包含本發明多肽的組合物，其與一或多種可藥用的成分配制在一起用作(治療性)疫苗。優選，所述組合物配制成用于通過注射給藥。
本發明還提供了本發明的多肽，用于治療方法中。所述治療可以是CNS損傷，具體是SCI或卒中的治療。
本發明還提供了本發明的多肽在制備用于治療CNS損傷，具體是SCI或卒中的藥物中的用途。
本發明還提供了治療患者中的CNS損傷的方法，所述方法包括將本發明的多肽作為治療性疫苗給藥患者。
給藥優選如上文對載體所述那樣進行。
本發明還提供了類似的方法以及能夠與結構域(a)-(d)之一特異性結合的抗體的用途，或優選能夠與結構域(a)-(d)中的兩個，三個或所有四個結構域結合的抗體混合物，在治療CNS損傷，具體是SCI或卒中之中的用途。所述抗體將直接給藥患者(優選如對于第一方面的肽，例如通過直接注入CNS，注入損傷位點或注入腦脊液)，而不是給藥核酸或多肽疫苗以產生抗體反應。能夠特異性結合的抗體片段被認為是用于該目的的抗體。

發明內容
肽術語“肽”意圖指由數個氨基酸組成的分子，相鄰的氨基酸對由肽鍵相連。肽鍵具有結構-CO-NH-。氨基酸可天然存在或非天然存在。末端氨基酸可包括末端修飾。天然存在的手相氨基酸(即除了非手相甘氨酸以外的氨基酸)是L-同種型。然而，本發明的肽可包括或由D-同種型氨基酸組成。所述D-氨基酸可以是天然存在的L-氨基酸的D-同種型，或者可不具有天然存在的L-同種型。D-氨基酸包括在本發明的肽中可支持肽在體內被清除的減少。
肽的合成肽可通過化學合成完全或部分產生。本發明的肽可通過已經確定的，標準液相或優選固相肽合成方法制備，其常規描述廣泛可得(見例如，J.M.Stewart和J.D.Young，Solid Phase Peptide Synthesis，2nd edition，Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois(1984)，in M.Bodanzsky和A.Bodanzsky，The Practice of Peptide Synthesis，Springer Verlag，New York(1984)；和Applied Biosystems 430A Users Manual，ABI Inc.，Foster City，California)，或它們可在溶液中制備，通過液相方法或任何固相、液相以及溶液化學的組合制備，例如通過首先完成各個肽部分，然后如果需要并且適宜，在去除任何存在的保護性基團以后，通過使分別的碳酸或硫酸或其反應衍生物發生反應而引入殘基X。
噬菌體展示噬菌體展示是生物工程領域中最近且有希望的技術，其可測定成千萬的短肽與抗體受體或其它結合蛋白的緊密結合。噬菌體展示首先在1985(Smith et al，1985)描述，并且是其中肽或蛋白作為與噬菌體外殼蛋白的融合蛋白而表達的選擇技術，導致融合的蛋白在病毒粒的表面顯示，而編碼所述融合物的DNA位于病毒粒內。噬菌體展示產生了大量隨機肽序列與編碼各個序列的DNA之間的物理聯系，允許通過稱為panning的體外選擇法快速鑒定大量靶分子的肽配體(Scott et al，1990；Arap et al 1998)。
涉及具體蛋白結構域的相互作用(蛋白/蛋白或蛋白/非蛋白相互作用)通常僅需要8-12氨基酸，其中5-8氨基酸起重要作用。展示6-10氨基酸殘基的肽的噬菌體展示文庫已經成功用于多種應用中，包括表位繪圖，繪圖型蛋白-蛋白接觸(mapping protein-protein contact)，非肽配體的肽模擬物鑒定，以及新疫苗和新藥物的設計(Scott et al，1990；Cwirlaet al，1990；Devlin et al 1990 Felici et al，1991；Motti et al，1994；Hong et al，1995；Arap et al，1998；Nilsson et al，2000)。
最近的工作通過競爭性分析顯示，利用較廣范圍的酶作為靶分離的一系列肽含有對于每種靶而言類似的氨基酸序列，每個靶結合一或兩個位點。17種受試肽中，13種被發現是酶功能的特異性抑制物。利用噬菌體展示鑒定的肽替代配體優先靶向可抑制酶功能的有限數目位點(Hyde-DeRuyscher et al 2000)。
模擬物非肽“小分子”通常為用于體內藥用的肽所優選的。因此，本發明的肽的模擬物可被設計成用于藥用。
已知的藥物活性化合物的模擬物的設計是基于“前導(lead)”化合物的已知藥物開發方法。這對于活性化合物的合成較困難或昂貴或不適合具體的給藥方法時是理想的，例如肽為不適合口服組合物的活性劑時，這是由于所述肽傾向于較快地由蛋白酶在消化道內代謝。模擬物設計，合成，以及檢測通常用于避免隨機篩選大量具有靶性質的分子。
有數個步驟通常用于由具有給定靶性質的化合物設計模擬物。首先，確定對于確定靶性質而言關鍵和/或重要的所述化合物的具體部分。對于肽，這可通過系統性改變肽中的氨基酸進行，例如通過依次取代每個殘基。肽的丙氨酸掃描通常用于定義所述肽基序。構成化合物的活性區的這些部分或殘基已知為“藥效基團”。
一旦藥效基團被發現，可根據其物理性質，例如立體化學，鍵合，大小和/或電荷，利用各種來源的數據，例如分光鏡技術，X-射線衍射數據和NMR來模擬藥效基團的結構。計算機分析，類似性作圖(模擬藥效基團的電荷和/或體積，而不是原子間的鍵合)以及其它技術可用于該模擬方法。
該方法的變體中，配體的三維結構以及其結合配偶體被模擬。這具體可用于配體和/或結合配偶體在結合時改變構型，允許在模擬物設計的模擬中考慮到這一點。
隨后選擇模板分子，其上移植了模擬藥效基團的化學基團。所述模板分子和移植到其上的化學基團可方便地選擇，使得所述模擬物易于合成，很可能是可藥用的，并且不在體內降解，同時保持前導化合物的生物活性。可選，當模擬物是以肽為基礎時，可通過使所述肽發生環化獲得進一步的穩定性，增加其剛性。通過這種方法發現的模擬物可隨后被篩選以發現它們是否具有靶性質，或它們顯示所述性質的程度。可實施進一步的優化或修飾以實現一或多種終模擬物用于體內或臨床檢驗。
序列同一性與參照序列的百分比(％)氨基酸序列同一性被定義為候選序列中與參照序列中氨基酸殘基相同的氨基酸殘基的百分比，所述定義是在對所述序列進行比對并引入缺口以(如果有必要)以實現最大百分比序列同一性、而不考慮任何保守取代作為部分序列同一性之后。％同一性值可通過WU-BLAST-2(Altschul et al.，Methods in Enzymology，266460-480(1996))確定。WU-BLAST-2利用數種搜索參數，其中大多數被設定為默認值。可調節的參數可定為如下值重疊跨度(overlapspan)＝1，重疊分數(overlap fraction)＝0.125，字符閾值(wordthreshold)(T)＝11。A％氨基酸序列同一性值如下確定通過如WU-BLAST-2測定的匹配的相同殘基數目，除以參照序列殘基總數(由WU-BLAST-2引入參照序列的缺口以最大化被忽略的比對得分)，乘以100。
嚴謹性條件嚴謹性條件可通過以下確定(1)利用低離子強度和高溫度洗滌，例如0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉、50℃；(2)雜交過程中利用變性劑，諸如甲酰胺，例如50％(v/v)甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM磷酸鈉緩沖液、pH 6.5，以及760mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉、42℃；或(3)利用50％甲酰胺，5x SSC(0.75M NaCl，0.075M檸檬酸鈉)，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1％焦磷酸鹽鈉，5x Denhardt′s溶液，超聲處理的鮭精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％硫酸葡萄糖、42℃，在42℃、0.2xSSC(氯化鈉/檸檬酸鈉)和50％甲酰胺、55℃洗滌，然后由含EDTA的0.1xSSC、55℃進行高嚴謹度洗滌。
受試者本發明組合物和/或治療所給藥的受試者是哺乳動物，優選試驗動物諸如嚙齒類動物(例如兔，大鼠或小鼠)，狗，貓，猴或猿，或飼養動物諸如母牛，馬，綿羊，豬或山羊。更優選，所述受試者是人。
通常，所述受試者將患有CNS損傷，通常是CNS外傷，例如頭部外傷。但更優選，所述損傷是脊髓損傷，例如SCI。在試驗動物中，所述損傷是試驗性的。CNS損傷可由例如癲癇，卒中或神經變性病，學習記憶相關的疾病和/或癡呆諸如阿爾茨海默氏癥(Alzheimer’s disease)或帕金森氏癥(Parkinson’s disease)。
本發明的治療將通常與其它治療聯用，諸如手術和/或康復。
配制優選將本發明的肽，模擬物和載體作為藥物配制劑(例如組合物，制備物，藥物)，其包含一種活性化合物，如上所述，以及本領域技術人員已知的一或多種其它可藥用的成分，包括但不限于，可藥用的載體，佐劑，賦形劑，緩沖液，防腐劑和穩定劑。所述配制劑還可包括其它活性藥劑。
因此，本發明還提供了制備如前所述的藥物組合物的方法，所述方法包括將至少一種本發明的肽或載體以及本領域技術人員已知的一或多種可藥用的成分混合，例如，載體，佐劑，賦形劑等。
本文術語“可藥用的”指化合物，成分，物質，組合物，劑型等，其在合理醫學判斷范圍內，適合用于接觸目的受試者(例如人)的組織而沒有過多的毒性，刺激，過敏反應，或其它問題或并發癥，并具有合理的益處/風險比。每種載體，佐劑，賦形劑等必須在與其它配制劑成分相容的意義上而言是“可接受的”。
適宜的載體，佐劑，賦形劑等可見于標準藥物教科書，例如Remington’s Pharmaceutical Sciences，20th Edition，2000，pub.Lippincott，Williams & Wilkins；和Handbook of Pharmaceutical Excipients，2ndedition，1994。
配制劑可適宜地是可注射的配制劑，例如以液體、等張、無致熱源、無菌溶液的形式，其中溶解有活性化合物。所述液體可還含有其它可藥用的成分，諸如抗氧化劑，緩沖液，防腐劑，穩定劑，抑菌劑，懸浮劑，稠化劑，以及使得所述配制劑與血液或腦脊液等張的溶劑。用于所述配制劑的適宜的等張載體的實例包括氯化鈉注射劑，林格氏(Ringer′s)溶液，或乳酸鹽化的林格氏注射液。通常，液體中活性化合物的濃度為約1ng/ml-約10μg/ml，例如約10ng/ml-約1μg/ml。所述配制劑可位于單位劑量或多劑量密封的容器中，例如安瓿和小藥瓶，并可以儲存于冷凍-干燥(凍干)條件中而僅需要在用前加入無菌液體載體例如水用于注射。即配即用注射溶液和懸液可從無菌粉末，顆粒和片劑制備。
給藥本發明肽的給藥通常通過注射，優選直接注入CNS。注射可直接注入損傷位點，例如注入損傷位點。可選，可注射入腦脊液，通常在損傷附近。
本發明的支持性試驗工作以及本發明的實施方案將在現在描述，僅通過實例，并參考附

圖1，該圖顯示用于從蛋白MAG，TN-R和Nogo分離抑制性結構域的引物。編碼序列(或互補鏈)以粗體顯示。起始(Met)和終止(***)密碼子加雙下劃線。限制位點加下劃線。SEQ ID NOS如下引物SEQ ID NOMAG117MAG218TNR119TNR220NogoN1 21NogoN2 22Nogo66-123Nogo66-224還圖示了產生的構建體(SEQ ID NO25)，其通過消化并依次(sequentially)連接產生的PCR產物獲得。限制位點加下劃線。Ala-編碼密型碼子加標記。每個抑制性結構域的編碼序列通過括號內所示結構域的名稱表示。終止密碼子加標記***。
方面1，實施例1鑒定負責具有抑制性質的Nogo結構域排斥試驗將NG108細胞(小鼠神經母細胞瘤-大鼠膠質細胞瘤雜合細胞，可購自美國典型培養物保藏中心，Manassas，VA，USA，ATCC HB-12317)鋪于利用Nogo1-25，Nogo1-50，Nogo1-66和GST-Nogo-66以及對照GST包被的底物。Nogo的重組結構域單獨或者作為與GST的融合蛋白的產生和純化，如前所述進行(Xiao ZC et al，1996)。
NG108細胞明顯受Nogo1-50，Nogo1-66，和GST-Nogo-66排斥，而不是Nogo1-25和GST的排斥。
神經突生長試驗
NG108細胞被鋪于用Nogo1-25，Nogo1-50，Nogo1-66，和GST-Nogo-66以及對照GST包被的底物上。
NG108細胞的神經突生長明顯受Nogo1-50，Nogo1-66，和GSTNogo-66抑制，而不受Nogo1-25和GST抑制。
方面1，實施例2通過噬菌體展示技術篩選針對神經元生長抑制分子TN-R，MAG和Nogo的新短肽TN-R，MAG和Nogo從成人小鼠腦的純化通過免疫親和層析如前所述進行(Pesheva，P et al，1989)。TN-R，MAG，Nogo的重組結構域作為與GST的融合蛋白的產生和純化如前所述(Xiao ZC et al，1996)。所有這些蛋白用作噬菌體結合靶用于快速篩選，其利用Ph.D-7TM噬菌體展示肽文庫試劑盒(New England Biolabs，Ltd)根據生產商的說明進行。
簡而言之，使顯示不同肽序列的噬菌體文庫，暴露于用靶蛋白包被的板。未結合的噬菌體通過洗滌去除，而特異性結合的噬菌體通過降低pH洗脫。洗脫的噬菌體集合經擴增，并重復所述方法3-4次。
3-4輪親和選擇以后，從7-mer隨機肽噬菌體展示的文庫分離數種特異性噬菌體克隆，并通過ELISA鑒定。特異性噬菌體克隆的肽編碼序列通過自動測序確定。獲得與被靶向蛋白特異性結合的肽的序列。
噬菌體外殼蛋白的框架序列，其中的每個噬菌體中都插入了7-mer肽編碼序列，所述框架序列如下TTA TTC GCA ATT CCT TTA GTG GTA CCT TTC TAT TCT CACTCT(SEQ ID NO26)...GGT GGA GGT T AA ACT GTT GAAAGT TGT(SEQ ID NO27)...代表7-mer肽編碼序列的插入位點。Kpn1位點加下劃線，Eag1位點加雙下劃線。
示例性7-mer肽編碼序列如下所示。
“n”指分離的噬菌體的數目，所述噬菌體顯示具有所示序列的肽(盡管編碼核酸序列當然地有一些變異，這是由于遺傳密碼簡并性所致)。“SIN”是“SEQ ID NO.”縮寫，并表示肽序列。核酸序列的SEQ ID NOS為28-35。

方面1，實施例3展示肽的噬茵體的體外實驗，所述肽可降低Nogo，MAG和TN-R對神經元粘附的抑制效應直徑3.5cm的組織培養petri皿(Becton Dickinson)用甲醇溶解的硝化纖維素根據Lagenaur和Lemmon(1987)所述的方法包被，并在無菌加蓋條件下風干。將petri皿和含有5μg/ml聚-DL-烏氨酸的PBS在37℃保溫2小時。隨后用PBS洗滌所述皿三次，并在無菌加蓋條件下風干。
將蛋白樣品(1.5μl 5μM GST，5μM GST-Nogo66，100μM Nogo66，100μM Nogo1-50或100μM Nogo1-25)點樣于硝化纖維素包被的表面petri皿，并在37℃、潮濕環境中保溫2小時。隨后，用PBS洗滌所述點三次。用含有2％熱滅活的無脂肪酸BSA(Sigma)的PBS沖洗所述皿，并保溫過夜以阻斷殘余的非特異性蛋白結合位點。
然后，用PBS洗滌所述皿，并以密度2.5×105細胞/ml將NGl08細胞置于2ml含10％肽牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養基中，在37℃潮濕環境中保溫。12小時后，用PBS輕柔洗滌所述皿三次，并通過用含2.5％戊二醛的PBS沖洗來固定細胞。固定后，用0.5％甲苯胺藍(Sigma)在2.5％碳酸鈉中染色。所述經染色的培養物隨后用水洗滌三次并風干。
對附著于各個點的細胞進行照相和計數。所有試驗都實施至少3次。統計學分析通過Student檢驗實施。顯著性水平選擇為p＜0.05。
GST-Nogo66，Nogo66和Nogo1-50與GST相比都顯示明顯的降低的NG108細胞計數；但Nogo1-25并非如此。
NG108細胞被置于聚-DL-鳥氨酸-處理的組織培養petri皿中作為單細胞懸液。顯示上述鑒定的Nogo66-，MAG-和TNR結合肽的具體噬菌體被加入細胞培養物。細胞在固定前維持24小時，并用甲苯胺藍染色。細胞粘附如前述測定。
展示肽YLTQPQS(SEQ ID NO.1)的噬菌體能夠阻斷Nogo-66和MAG對NG108細胞結合的抑制效應；展示肽TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)的噬菌體能夠阻斷TNR-EGFL對NG108細胞結合的抑制效應。
方面1，實施例4降低Nogo，MAG和TN-R對神經元粘附的抑制效應的肽的體外試驗所有經篩選的共有序列肽利用固相方法通過Peptide SynthesizerModel1000合成。神經突生長和生長錐排斥試驗如上所述進行(Xiao ZCet al，1997)。經純化的完整TN-R，MAG和Nogo以及TN-R，MAG和Nogo的重組結構域可被包被作為底物，以允許鑒定TN-R，MAG和Nogo的抑制性結構域。其它試驗中，合成的肽與相關蛋白/結構域在包被前混合，以鑒定可在體外中和TN-R，MAG和/或Nogo的抑制效應的肽。
方面1，實施例5可緩解脊髓損傷的肽的體內試驗可在體外中和TN-R，MAG和/或Nogo抑制效應的共有序列短肽可用于體內以確定它們緩解脊髓損傷(Bregman et al，1995)。這些肽被注入脊髓受損傷的成年大鼠。軸突的再生通過免疫組織化學，通過與未經處理的對照比較進行檢測。還分析了功能改進。
方面1，實施例6篩選可消除TN-R，MAG和/或Nogo的抑制效應的候選因素測定簡并寡核苷酸序列，搜索可在體外和/或體內(優選在兩種條件下均可)中和TN-R，MAG，和/或Nogo抑制效應的肽。EST數據庫(優選CNS-來源的EST數據庫)利用簡并寡核苷酸序列搜索。CNS cDNA文庫利用標記的簡并寡核苷酸探針篩選。選中(Hits)表示候選因子可消除TN-R，MAG和/或Nogo的抑制效應。這些候選因子作為GST融合蛋白純化，并如上述檢測對所述肽的中和效應。
作為檢測體內中和效應的可選方法，將候選因子轉染的神經元移植到受試動物中的受損脊髓并觀察中和結果。
可消除TN-R，MAG，和/或Nogo抑制效應的新的因子由此獲得，并用于治療CNS損傷，具體是脊髓損傷，或所述治療的開發。
方面2，實施例1載體構建編碼以下結構域的核酸可通過PCR獲得N-末端和Nogo-A的66-Aa細胞外結構域，MAG的第三到第五個Ig樣結構域和人TNR的EGF樣結構域。
PCR引物被設計為包括限制酶位點并編碼位于亞克隆的序列末端的Ala接頭(見圖1)。因此，當PCR產物由限制酶雙重消化并隨后依次連接時，編碼Ala接頭的DNA位于每對相鄰結構域(參見圖1)之間。所述Ala接頭促進所述結構域的正確折疊。
隨后，依次連接的DNA經BamH I和XbaI雙重消化，并隨后插入pcDNA 3.1載體(Invitrogen)，以產生重組載體。所述重組載體通過瓊脂糖凝膠和序列分析證實。
方面2，實施例2
在體外證實重組載體的抑制功能DNA疫苗注入受試動物體內以前，必須進行體外試驗以保證所述疫苗可由哺乳動物細胞表達并分泌到細胞外以刺激宿主的免疫系統。
為檢測，用重組載體轉染COS-1細胞。瞬時表達之后，分別收集所述細胞和培養基，并利用所述抑制型分子的抗體實施Western-印跡(Xiao et al，1996)，以證實所述載體作為疫苗體內給藥時，所述重組蛋白被分泌出細胞，并作為抗原刺激宿主免疫系統。
經檢測發現，與未經轉染的細胞相比，經轉染的細胞為MAG和TNR抗體陽性。在經轉染的和未經轉染的細胞中檢測Nogo的免疫反應性。
利用重組質粒瞬時轉染48小時以后，收集培養基并用抗-NogoN抗體或抗-TNR--EGFL抗體利用蛋白質A-瓊脂糖進行免疫沉淀。所述沉淀物通過10％和6％SDS-PAGE分離，并分別用于檢測Nogo和TNR。每種沉淀顯示相應抗體的免疫反應性，表明所述蛋白可被分泌。
方面2，實施例3GST融合蛋白與預免疫血清和抗血清的斑點印跡用重組質粒免疫接種2個月以后，從Lewis大鼠收集抗血清。將GST-Nogo66，GST-NogoN，GST-TNR/EGFL，GST-MAG Ig3-5和GST的連續稀釋物點樣作為底物，并隨后點上血清。抗血清特異性識別GST融合蛋白，但不是GST。預免疫血清既不識別融合蛋白，也不識別GST。
方面2，實施例4重組載體作為DNA疫苗的試驗為檢驗用DNA疫苗免疫以后受損脊髓的再生，將重組DNA載體注入受試動物。對經免疫的動物的抗血清進行實驗以驗證注入DNA疫苗以后的免疫反應。
利用脊髓損傷的半橫斷模型。一段時間以后，研究受損脊髓的神經元/軸突的形態，以及動物的行為。
(1)免疫和脊髓損傷
6周齡雌性Lewis大鼠每周一次利用來自前述實施例的100μg重組載體免疫。缺乏所述插入的pcDNA3.1載體用作對照。所述載體注入大鼠的背部。大鼠產生抗血清后，損傷其脊髓。所述大鼠繼續接受每周兩次的免疫，再持續6個月。
大鼠用Somnitol(1mg/20g體重)麻醉，并進行低胸段錐板切除術(lower thoracic laminectomy)(T9)。隨后用顯微解剖剪(microscissor)剪切脊髓的背側部分，以便切斷皮質脊髓束。每處損傷的深度(約1mm)通過位于顯微解剖剪尖端的標記估計。損傷后存活6周以后，麻醉所述大鼠并將5％WGA-HRP(小麥芽凝集素辣根過氧化物酶)溶液注入所述感覺運動皮質(Li et al.，1996)。注射WGA-HRP48小時后，通過心內灌注處死動物，并如所述使脊髓縱向恒冷箱切片發生HRP組織化學反應(Liet al.，1996)。
(2)證實經免疫的動物的免疫反應為證實經免疫的動物的抗血清具有阻斷抑制性結構域對神經突生長的抑制效應，利用神經突生長試驗檢測經免疫的動物的血清。4孔盤首先用溶解的硝化纖維素包被，并與5μg/ml聚-L-賴氨酸一起預保溫。GST融合抑制性結構域或肽被置于孔中作為2μl的液滴，并隨后在37℃保溫4hr。這些孔隨后在4℃與來自對照小鼠或用DNA疫苗免疫的小鼠的血清一起保溫過夜。去除血清，通過Percoll密度梯度離心純化的生后10日齡大鼠小腦神經元以1×106細胞每孔鋪板。所述細胞培養在無血清化學方法定義的培養基中24hr，用4％多聚甲醛固定，用考馬斯蘭染色。神經突長度利用Universal Image I image分析系統測定。利用Student-Newman-Keul檢驗分析結果，以確定統計學顯著的差異(Li et.al.，1996)。
(3)受損脊髓的形態學研究為了檢驗橫斷的軸突的再生，用4％多聚甲醛灌注大鼠，將脊髓的10μm厚縱向冷凍切片置于凝膠包被的載玻片上。這些切片用生物素化的山羊抗大鼠抗體保溫過夜，并用鏈霉抗生物素偶聯的熒光素保溫1小時，檢測循環抗體。
(4)動物的功能檢驗還實施了試驗大鼠的功能恢復。接觸(Contact placing)反應通過輕觸后腿背側而不導致關節位移來檢測。動物提高足并將其置于支持表面的能力在隨后的3-6次重復中進行評估。超過30％的反應被評分為陽性(Kukel-Bagden et.al.，1993)。
(5)安全檢驗本免疫接種方法的安全通過以下方法評估將疫苗給藥受試動物(未受損傷的和受損傷的)并發現不利事件，具體是感覺或運動功能喪失以及行為或認知障礙。
CNS組織通過組織學方法檢查以發現自身免疫性損傷，例如利用單克隆抗-CNPase(Sigma C5922，lot 71k4889)的免疫染色。CNPase是寡突細胞表達的蛋白質，2’，3’-環核苷酸3’-磷酸二酯酶。
盡管前述發明已經通過舉例和實例為清楚和理解詳細描述，對于本領域技術人員很明顯，根據本發明的教導，可進行具體的改變和修飾而不偏離所附權利要求的精神和范圍。
本文引用的所有文件都為所有目的以全文包含在本發明內。
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Glu Gly Thr Trp Val Gln Val Ser Leu Leu His Phe Val Pro Thr Arg195 200 205Glu Ala Asn Gly His Arg Leu Gly Cys Gln Ala Ala Phe Pro Asn Thr210 215 220Thr Leu Gln Phe Glu Gly Tyr Ala Ser Leu Asp Val Lys Tyr Pro Pro225 230 235 240Val Ile Val Glu Met Asn Ser Ser Val Glu Ala Ile Glu Gly Ser His245 250 255Val Ser Leu Leu Cys Gly Ala Asp Ser Asn Pro Pro Pro Leu Leu Thr260 265 270Trp Met Arg Asp Gly Met Val Leu Arg Glu Ala Val Ala Glu Ser Leu275 280 285Tyr Leu Asp Leu Glu Glu Val Thr Pro Ala Glu Asp Gly Ile Tyr Ala290 295 300Cys Leu Ala Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Asp Asn Arg Thr Val Glu Leu305 310 315 320Ser Val Met Tyr Ala Pro Trp Lys Pro Thr Val Asn Gly Thr Val Val325 330 335Ala Val Glu Gly Glu Thr Val Ser Ile Leu Cys Ser Thr Gln Ser Asn340 345 350Pro Asp Pro Ile Leu Thr Ile Phe Lys Glu Lys Gln Ile Leu Ala Thr355 360 365Val Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Gln Leu Glu Leu Pro Ala Val Thr Pro370 375 380Glu Asp Asp Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Glu Asn Gln Tyr Gly Gln385 390 395 400Arg Ala Thr Ala Phe Asn Leu Ser Val Glu Phe Ala Pro Ile Ile Leu405 410 415Leu Glu Ser His Cys Ala Ala Ala Arg Asp Thr Val Gln Cys Leu Cys420 425 430Val Val Lys Ser Asn Pro Glu Pro Ser Val Ala Phe Glu Leu Pro Ser435 440 445Arg Asn Val Thr Val Asn Glu Thr Glu Arg Glu Phe Val Tyr Ser Glu450 455 460Arg Ser Gly Leu Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Leu Arg Gly Gln Ala465 470 475 480Gln Ala Pro Pro Arg Val Ile Cys Thr Ser Arg Asn Leu Tyr Gly Thr485 490 495
Gln Ser Leu Glu Leu Pro Phe Gln Gly Ala His Arg500 505<210>9<211>205<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>9Cys Pro Cys Ala Ser Ser Ala Gln Val Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg1 5 10 15Ile Glu Met Leu Glu Arg Glu Val Ser Val Leu Arg Asp Gln Cys Asn20 25 30Ala Asn Cys Cys Gln Glu Ser Ala Ala Thr Gly Gln Leu Asp Tyr Ile35 40 45Pro His Cys Ser Gly His Gly Asn Phe Ser Phe Glu Ser Cys Gly Cys50 55 60Ile Cys Asn Glu Gly Trp Phe Gly Lys Asn Cys Ser Glu Pro Tyr Cys65 70 75 80Pro Leu Gly Cys Ser Ser Arg Gly Val Cys Val Asp Gly Gln Cys Ile85 90 95Cys Asp Ser Glu Tyr Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Leu Arg Cys Pro100 105 110Thr Asp Cys Ser Ser Arg Gly Leu Cys Val Asp Gly Glu Cys Val Cys115 120 125Glu Glu Pro Tyr Thr Gly Glu Asp Cys Arg Glu Leu Arg Cys Pro Gly130 135 140Asp Cys Ser Gly Lys Gly Arg Cys Ala Asn Gly Thr Cys Leu Cys Glu145 150 155 160Glu Gly Tyr Val Gly Glu Asp Cys Gly Gln Arg Gln Cys Leu Asn Ala165 170 175Cys Ser Gly Arg Gly Gln Cys Glu Glu Gly Leu Cys Val Cys Glu Glu180 185 190Gly Tyr Gln Gly Pro Asp Cys Ser Ala Val Ala Pro Pro195 200 205<210>10<211>185<212>PRT<213>人(Homo sapiens)
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Leu Lys65<210>12<211>973<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>融合蛋白<220>
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<220>
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<220>
<221>VARIANT<222>(905)..(907)<223>聚丙氨酸接頭.
<400>12Met Ile Phe Leu Thr Thr Leu Pro Leu Phe Trp Ile Met Ile Ser Ala1 5 10 15Ser Arg Gly Gly His Trp Gly Ala Trp Met Pro Ser Ser Ile Ser Ala20 25 30Phe Glu Gly Thr Cys Val Ser Ile Pro Cys Arg Phe Asp Phe Pro Asp35 40 45Glu Leu Arg Pro Ala Val Val His Gly Val Trp Tyr Phe Asn Ser Pro50 55 60Tyr Pro Lys Asn Tyr Pro Pro Val Val Phe Lys Ser Arg Thr Gln Val65 70 75 80Val His Glu Ser Phe Gln Gly Arg Ser Arg Leu Leu Gly Asp Leu Gly85 90 95Leu Arg Asn Cys Thr Leu Leu Leu Ser Thr Leu Ser Pro Glu Leu Gly
100 105 110Gly Lys Tyr Tyr Phe Arg Gly Asp Leu Gly Gly Tyr Asn Gln Tyr Thr115 120 125Phe Ser Glu His Ser Val Leu Asp Ile Ile Asn Thr Pro Asn Ile Val130 135 140Val Pro Pro Glu Val Val Ala Gly Thr Glu Val Glu Val Ser Cys Met145 150 155 160Val Pro Asp Asn Cys Pro Glu Leu Arg Pro Glu Leu Ser Trp Leu Gly165 170 175His Glu Gly Leu Gly Glu Pro Thr Val Leu Gly Arg Leu Arg Glu Asp180 185 190Glu Gly Thr Trp Val Gln Val Ser Leu Leu His Phe Val Pro Thr Arg195 200 205Glu Ala Asn Gly His Arg Leu Gly Cys Gln Ala Ala Phe Pro Asn Thr210 215 220Thr Leu Gln Phe Glu Gly Tyr Ala Ser Leu Asp Val Lys Tyr Pro Pro225 230 235 240Val Ile Val Glu Met Asn Ser Ser Val Glu Ala Ile Glu Gly Ser His245 250 255Val Ser Leu Leu Cys Gly Ala Asp Ser Asn Pro Pro Pro Leu Leu Thr260 265 270Trp Met Arg Asp Gly Met Val Leu Arg Glu Ala Val Ala Glu Ser Leu275 280 285Tyr Leu Asp Leu Glu Glu Val Thr Pro Ala Glu Asp Gly Ile Tyr Ala290 295 300Cys Leu Ala Glu Asn Ala Tyr Gly Gln Asp Asn Arg Thr Val Glu Leu305 310 315 320Ser Val Met Tyr Ala Pro Trp Lys Pro Thr Val Asn Gly Thr Val Val325 330 335Ala Val Glu Gly Glu Thr Val Ser Ile Leu Cys Ser Thr Gln Ser Asn340 345 350Pro Asp Pro Ile Leu Thr Ile Phe Lys Glu Lys Gln Ile Leu Ala Thr355 360 365Val Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Gln Leu Glu Leu Pro Ala Val Thr Pro370 375 380Glu Asp Asp Gly Glu Tyr Trp Cys Val Ala Glu Asn Gln Tyr Gly Gln385 390 395 400Arg Ala Thr Ala Phe Asn Leu Ser Val Glu Phe Ala Pro Ile Ile Leu
Leu Glu Ser His Cys Ala Ala Ala Arg Asp Thr Val Gln Cys Leu Cys420 425 430Val Val Lys Ser Asn Pro Glu Pro Ser Val Ala Phe Glu Leu Pro Ser435 440 445Arg Asn Val Thr Val Asn Glu Thr Glu Arg Glu Phe Val Tyr Ser Glu450 455 460Arg Ser Gly Leu Leu Leu Thr Ser Ile Leu Thr Leu Arg Gly Gln Ala465 470 475 480Gln Ala Pro Pro Arg Val Ile Cys Thr Ser Arg Asn Leu Tyr Gly Thr485 490 495Gln Ser Leu Glu Leu Pro Phe Gln Gly Ala His Arg Ala Ala Ala Cys500 505 510Pro Cys Ala Ser Ser Ala Gln Val Leu Gln Glu Leu Leu Ser Arg Ile515 520 525Glu Met Leu Glu Arg Glu Val Ser Val Leu Arg Asp Gln Cys Asn Ala530 535 540Asn Cys Cys Gln Glu Ser Ala Ala Thr Gly Gln Leu Asp Tyr Ile Pro545 550 555 560His Cys Ser Gly His Gly Asn Phe Ser Phe Glu Ser Cys Gly Cys Ile565 570 575Cys Asn Glu Gly Trp Phe Gly Lys Asn Cys Ser Glu Pro Tyr Cys Pro580 585 590Leu Gly Cys Ser Ser Arg Gly Val Cys Val Asp Gly Gln Cys Ile Cys595 600 605Asp Ser Glu Tyr Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Leu Arg Cys Pro Thr610 615 620Asp Cys Ser Ser Arg Gly Leu Cys Val Asp Gly Glu Cys Val Cys Glu625 630 635 640Glu Pro Tyr Thr Gly Glu Asp Cys Arg Glu Leu Arg Cys Pro Gly Asp645 650 655Cys Ser Gly Lys Gly Arg Cys Ala Asn Gly Thr Cys Leu Cys Glu Glu660 665 670Gly Tyr Val Gly Glu Asp Cys Gly Gln Arg Gln Cys Leu Asn Ala Cys675 680 685Ser Gly Arg Gly Gln Cys Glu Glu Gly Leu Cys Val Cys Glu Glu Gly690 695 700Tyr Gln Gly Pro Asp Cys Ser Ala Val Ala Pro Pro Ala Ala Ala Met705 710 715 720
Glu Asp Leu Asp Gln Ser Pro Leu Val Ser Ser Ser Asp Ser Pro Pro725 730 735Arg Pro Gln Pro Ala Phe Lys Tyr Gln Phe Val Arg Glu Pro Glu Asp740 745 750Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Glu Asp Glu Asp Leu755 760 765Glu Glu Leu Glu Val Leu Glu Arg Lys Pro Ala Ala Gly Leu Ser Ala770 775 780Ala Pro Val Pro Thr Ala Pro Ala Ala Gly Ala Pro Leu Met Asp Phe785 790 795 800Gly Asn Asp Phe Val Pro Pro Ala Pro Arg Gly Pro Leu Pro Ala Ala805 810 815Pro Pro Val Ala Pro Glu Arg Gln Pro Ser Trp Asp Pro Ser Pro Val820 825 830Ser Ser Thr Val Pro Ala Pro Ser Pro Leu Ser Ala Ala Ala Val Ser835 840 845Pro Ser Lys Leu Pro Glu Asp Asp Glu Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro850 855 860Pro Pro Pro Ala Ser Val Ser Pro Gln Ala Glu Pro Val Trp Thr Pro865 870 875 880Pro Ala Pro Ala Pro Ala Ala Pro Pro Ser Thr Pro Ala Ala Pro Lys885 890 895Arg Arg Gly Ser Ser Gly Ser Val Ala Ala Ala Arg Ile Tyr Lys Gly900 905 910Val Ile Gln Ala Ile Gln Lys Ser Asp Glu Gly His Pro Phe Arg Ala915 920 925Tyr Leu Glu Ser Glu Val Ala Ile Ser Glu Glu Leu Val Gln Lys Tyr930 935 940Ser Asn Ser Ala Leu Gly His Val Asn Cys Thr Ile Lys Glu Leu Arg945 950 955 960Arg Leu Phe Leu Val Asp Asp Leu Val Asp Ser Leu Lys965 970<210>13<211>1524<212>DNA<213>褐家鼠(Rattus norvegicus)<400>13atgatattcc ttaccaccct gcctctgttt tggataatga tttcagcttc tcgagggggg60
cactggggtg cctggatgcc ctcgtccatc tcagccttcg agggcacgtg tgtctccatc120ccctgccgtt tcgacttccc ggatgagctc agaccggctg tggtacatgg cgtctggtat180ttcaacagtc cctaccccaa gaactacccg ccagtggtct tcaagtcccg cacacaagtg240gtccacgaga gcttccaggg ccgtagccgc ctgttgggag acctgggcct acgaaactgc300accctgcttc tcagcacgct gagccctgag ctgggaggga aatactattt ccgaggtgac360ctgggcggct acaaccagta caccttctcg gagcacagcg tcctggacat catcaacacc420cccaacatcg tggtgccccc agaagtggtg gcaggaacgg aagtagaggt cagctgcatg480gtgccggaca actgcccaga gctgcgccct gagctgagct ggctgggcca cgaggggcta540ggggagccca ctgttctggg tcggctgcgg gaggatgaag gcacctgggt gcaggtgtca600ctgctacact tcgtgcctac tagagaggcc aacggccacc gtctgggctg tcaggctgcc660ttccccaaca ccaccttgca gttcgagggt tacgccagtc tggacgtcaa gtaccccccg720gtgattgtgg agatgaattc ctctgtggag gccattgagg gctcccacgt cagcctgctc780tgtggggctg acagcaaccc gccaccgctg ctgacttgga tgcgggatgg gatggtgttg840agggaggcag ttgctgagag cctgtacctg gatctggagg aggtgacccc agcagaggac900ggcatctatg cttgcctggc agagaatgcc tatggccagg acaaccgcac ggtggagctg960agcgtcatgt atgcaccttg gaagcccaca gtgaatggga cggtggtggc ggtagagggg1020gagacagtct ccatcctgtg ttccacacag agcaacccgg accctattct caccatcttc1080aaggagaagc agatcctggc cacggtcatc tatgagagtc agctgcagct ggaactccct1140gcagtgacgc ccgaggacga tggggagtac tggtgtgtag ctgagaacca gtatggccag1200agagccaccg ccttcaacct gtctgtggag tttgctccca taatccttct ggaatcgcac1260tgtgcagcgg ccagagacac cgtgcagtgc ctgtgtgtgg taaaatccaa cccggaaccc1320tccgtggcct ttgagctgcc ttcccgcaac gtgactgtga acgagacaga gagggagttt1380gtgtactcag agcgcagcgg cctcctgctc accagcatcc tcacgctccg gggtcaggcc1440caagccccac cccgcgtcat ttgtacctcc aggaacctct acggcaccca gagcctcgag1500ctgcctttcc agggagcaca ccga 1524<210>14<211>615<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>14tgtccatgtg ccagttcagc ccaggtgctg caggagctgc tgagccggat cgagatgctg60gagagggagg tgtcggtgct gcgagaccag tgcaacgcca actgctgcca agaaagtgct120gccacaggac aactggacta tatccctcac tgcagtggcc acggcaactt tagctttgag180tcctgtggct gcatctgcaa cgaaggctgg tttggcaaga attgctcgga gccctactgc240ccgctgggtt gctccagccg gggggtgtgt gtggatggcc agtgcatctg tgacagcgaa300tacagcgggg atgactgttc cgaactccgg tgcccaacag actgcagctc ccgggggctc360tgcgtggacg gggagtgtgt ctgtgaagag ccctacactg gcgaggactg cagggaactg420
aggtgccctg gggactgttc ggggaagggg agatgtgcca acggtacctg tttatgcgag480gagggctacg ttggtgagga ctgcggccag cggcagtgtc tgaatgcctg cagtgggcga540ggacaatgtg aggaggggct ctgcgtctgt gaagagggct accagggccc tgactgctca600gcagttgccc ctcca 615<210>15<211>555<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>15atggaagacc tggaccagtc tcctctggtc tcgtcctcgg acagcccacc ccggccgcag60cccgcgttca agtaccagtt cgtgagggag cccgaggacg aggaggaaga agaggaggag120gaagaggagg acgaggacga agacctggag gagctggagg tgctggagag gaagcccgcc180gccgggctgt ccgcggcccc agtgcccacc gcccctgccg ccggcgcgcc cctgatggac240ttcggaaatg acttcgtgcc gccggcgccc cggggacccc tgccggccgc tccccccgtc300gccccggagc ggcagccgtc ttgggacccg agcccggtgt cgtcgaccgt gcccgcgcca360tccccgctgt ctgctgccgc agtctcgccc tccaagctcc ctgaggacga cgagcctccg420gcccggcctc cccctcctcc cccggccagc gtgagccccc aggcagagcc cgtgtggacc480ccgccagccc cggctcccgc cgcgcccccc tccaccccgg ccgcgcccaa gcgcaggggc540tcctcgggct cagtg 555<210>16<211>198<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<400>16aggatataca agggtgtgat ccaagctatc cagaaatcag atgaaggcca cccattcagg60gcatatctgg aatctgaagt tgctatatct gaggagttgg ttcagaagta cagtaattct120gctcttggtc atgtgaactg cacgataaag gaactcaggc gcctcttctt agttgatgat180ttagttgatt ctctgaag 198<210>17<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物MAG1<400>17cgggatccat gatattcctt accaccct 28
<210>18<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物MAG2<400>18tccccgcggc tcggtgtgct ccctggaa 28<210>19<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物TNR1<400>19tccccgcggc atgtccatgt gccagttca 29<210>20<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物TNR2<400>20ttgcggccgc tggaggggca actgctga 28<210>21<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物NogoN1<400>21ttgcggccgc aatggaagac ctggaccagt ct 32<210>22<211>31
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物NogoN2<400>22aaactgcagc cactgagccc gaggagcccc t 31<210>23<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物Nogo66-1<400>23aaactgcagc aaggatatac aagggtgt 28<210>24<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>PCR引物Nogo66-2<400>24gctctagatc acttcagaga atcaacta 28<210>25<211>2934<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>依次連接的PCR產物產生的構建體<400>25ggatccatga tattccttac caccctgcct ctgttttgga taatgatttc agcttctcga60ggggggcact ggggtgcctg gatgccctcg tccatctcag ccttcgaggg cacgtgtgtc120tccatcccct gccgtttcga cttcccggat gagctcagac cggctgtggt acatggcgtc180tggtatttca acagtcccta ccccaagaac tacccgccag tggtcttcaa gtcccgcaca240caagtggtcc acgagagctt ccagggccgt agccgcctgt tgggagacct gggcctacga300aactgcaccc tgcttctcag cacgctgagc cctgagctgg gagggaaata ctatttccga360
ggtgacctgg gcggctacaa ccagtacacc ttctcggagc acagcgtcct ggacatcatc420aacaccccca acatcgtggt gcccccagaa gtggtggcag gaacggaagt agaggtcagc480tgcatggtgc cggacaactg cccagagctg cgccctgagc tgagctggct gggccacgag540gggctagggg agcccactgt tctgggtcgg ctgcgggagg atgaaggcac ctgggtgcag600gtgtcactgc tacacttcgt gcctactaga gaggccaacg gccaccgtct gggctgtcag660gctgccttcc ccaacaccac cttgcagttc gagggttacg ccagtctgga cgtcaagtac720cccccggtga ttgtggagat gaattcctct gtggaggcca ttgagggctc ccacgtcagc780ctgctctgtg gggctgacag caacccgcca ccgctgctga cttggatgcg ggatgggatg840gtgttgaggg aggcagttgc tgagagcctg tacctggatc tggaggaggt gaccccagca900gaggacggca tctatgcttg cctggcagag aatgcctatg gccaggacaa ccgcacggtg960gagctgagcg tcatgtatgc accttggaag cccacagtga atgggacggt ggtggcggta1020gagggggaga cagtctccat cctgtgttcc acacagagca acccggaccc tattctcacc1080atcttcaagg agaagcagat cctggccacg gtcatctatg agagtcagct gcagctggaa1140ctccctgcag tgacgcccga ggacgatggg gagtactggt gtgtagctga gaaccagtat1200ggccagagag ccaccgcctt caacctgtct gtggagtttg ctcccataat ccttctggaa1260tcgcactgtg cagcggccag agacaccgtg cagtgcctgt gtgtggtaaa atccaacccg1320gaaccctccg tggcctttga gctgccttcc cgcaacgtga ctgtgaacga gacagagagg1380gagtttgtgt actcagagcg cagcggcctc ctgctcacca gcatcctcac gctccggggt1440caggcccaag ccccaccccg cgtcatttgt acctccagga acctctacgg cacccagagc1500ctcgagctgc ctttccaggg agcacaccga gccgcggcat gtccatgtgc cagttcagcc1560caggtgctgc aggagctgct gagccggatc gagatgctgg agagggaggt gtcggtgctg1620cgagaccagt gcaacgccaa ctgctgccaa gaaagtgctg ccacaggaca actggactat1680atccctcact gcagtggcca cggcaacttt agctttgagt cctgtggctg catctgcaac1740gaaggctggt ttggcaagaa ttgctcggag ccctactgcc cgctgggttg ctccagccgg1800ggggtgtgtg tggatggcca gtgcatctgt gacagcgaat acagcgggga tgactgttcc1860gaactccggt gcccaacaga ctgcagctcc cgggggctct gcgtggacgg ggagtgtgtc1920tgtgaagagc cctacactgg cgaggactgc agggaactga ggtgccctgg ggactgttcg1980gggaagggga gatgtgccaa cggtacctgt ttatgcgagg agggctacgt tggtgaggac2040tgcggccagc ggcagtgtct gaatgcctgc agtgggcgag gacaatgtga ggaggggctc2100tgcgtctgtg aagagggcta ccagggccct gactgctcag cagttgcccc tccagcggcc2160gcaatggaag acctggacca gtctcctctg gtctcgtcct cggacagccc accccggccg2220cagcccgcgt tcaagtacca gttcgtgagg gagcccgagg acgaggagga agaagaggag2280gaggaagagg aggacgagga cgaagacctg gaggagctgg aggtgctgga gaggaagccc2340gccgccgggc tgtccgcggc cccagtgccc accgcccctg ccgccggcgc gcccctgatg2400gacttcggaa atgacttcgt gccgccggcg ccccggggac ccctgccggc cgctcccccc2460gtcgccccgg agcggcagcc gtcttgggac ccgagcccgg tgtcgtcgac cgtgcccgcg2520ccatccccgc tgtctgctgc cgcagtctcg ccctccaagc tccctgagga cgacgagcct2580ccggcccggc ctccccctcc tcccccggcc agcgtgagcc cccaggcaga gcccgtgtgg2640
accccgccag ccccggctcc cgccgcgccc ccctccaccc cggccgcgcc caagcgcagg 2700ggctcctcgg gctcagtggc tgcagcaagg atatacaagg gtgtgatcca agctatccag 2760aaatcagatg aaggccaccc attcagggca tatctggaat ctgaagttgc tatatctgag 2820gagttggttc agaagtacag taattctgct cttggtcatg tgaactgcac gataaaggaa 2880ctcaggcgcc tcttcttagt tgatgattta gttgattctc tgaagtgatc taga2934<210>26<211>42<212>DNA<213>M13大腸桿菌噬菌體(M13coliphage)<400>26ttattcgcaa ttcctttagt ggtacctttc tattctcact ct 42<210>27<211>33<212>DNA<213>M13大腸桿菌噬菌體(M13 coliphage)<400>27ggtggaggtt cggccgaaac tgttgaaagt tgt 33<210>28<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>示例性7-mer肽編碼序列<400>28tatctgacgc agcctcagtc g21<210>29<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>示例性7-mer肽編碼序列<400>29ggttctctgc ctcattcgct g21<210>30
<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>示例性7-mer肽編碼序列<400>30acgcagctgt ttcctcctta g 21<210>31<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>示例性7-mer肽編碼序列<400>31cattctattc ctgataatat t 21<210>32<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>示例性7-mer肽編碼序列<400>32catcatatgc ctcatgataa g 21<210>33<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>示例性7-mer肽編碼序列<400>33tatacgacgc ctccgagtcc t 21<210>34<211>21<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>示例性7-mer肽編碼序列<400>34cagcttccgc ttatgcctcg t 21<210>35<211>21<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>示例性7-mer肽編碼序列<400>35acgcagctgt ttcctcctca g 2權利要求
1.一種肽，其氨基酸序列由選自下組的氨基酸序列組成YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。
2.權利要求1的肽，其中所述氨基酸序列選自YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；或TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)。
3.長度可多至60個氨基酸的肽，其包含選自下組的氨基酸序列YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或QLPLMPR(SEQ ID NO.7)，其中所述肽具有與Nogo，MAG和/或TN-R結合的能力。
4.權利要求3的肽，其包含氨基酸序列YLTQPQS(SEQ ID NO.1)或TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)。
5.長度可多至60個氨基酸的肽，其包含這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少5個與選自下組的氨基酸序列中的相應殘基相同的殘基YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；或QLPLMPR(SEQ ID NO.7)，其中所述肽具有與Nogo，MAG和/或TN-R結合的能力。
6.權利要求5的肽，其具有至少5個與選自下組的氨基酸序列中的相應殘基相同的殘基YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；或TQLFPPQ(SEQ ID NO.3).
7.權利要求5或6的肽，其中相同的殘基的數目為至少6個。
8.權利要求3-7之一的肽，其能夠與Nogo-66和/或TNR-EGFL結合。
9.權利要求3-8之一的肽，其長度可多至40個氨基酸。
10.權利要求9的肽，其長度可多至20個氨基酸。
11.權利要求10的肽，其長度可多至10個氨基酸。
12.一種組合物，其包含根據前述任意權利要求的一或多種肽，以及一或多種可藥用的成分。
13.權利要求1-11之一的肽，其用于治療方法中。
14.權利要求1-11之一的肽在制備用于治療CNS損傷的藥物中的用途。
15.治療CNS損傷的方法，所述方法包括將權利要求1-11之一的肽給藥到患者中的CNS損傷位點或者所述位點附近。
16.治療脊髓損傷或卒中的方法，所述方法包括將具有選自下組的氨基酸序列的肽給藥患者YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；或TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)，所述給藥通過直接注入患者中脊髓損傷或卒中損傷的位點來進行。
17.權利要求1-11之一的肽和/或它的計算機產生的模型在設計能夠與一或多種神經元生長抑制分子Nogo，MAG和/或TN-R結合的模擬物中的用途。
18.設計如權利要求1-11定義的肽的模擬物的方法，所述模擬物能夠與一或多種神經元生長抑制分子Nogo，MAG和/或TN-R結合，所述方法包括(i)分析權利要求1-11定義的肽，所述肽能夠與一或多種神經元生長抑制分子Nogo，MAG和/或TN-R結合，測定對于定義藥效基團的活性而言必不可少且重要的氨基酸殘基；和(ii)模擬所述藥效基團以設計和/或篩選具有所述生物活性的候選模擬物。
19.權利要求17或18的用途或方法，其包括在體外測定候選模擬物與Nogo，MAG和/或TN-R的結合的步驟。
20.權利要求17-19之一的用途或方法，其包括這樣的步驟，鑒定能夠進行所述體外結合的候選模擬物，優化該候選模擬物以用于體外應用。
21.權利要求20的用途或方法，其中所述經優化的模擬物與一或多種可藥用的成分配制在一起。
22.噬菌體，其表達由肽以及噬菌體外殼蛋白組成的融合蛋白，使得所述肽能夠在噬菌體病毒粒表面展示，所述肽為權利要求1-11之一定義約肽。
23.篩選能夠與Nogo，MAG和/或TN-R結合的肽的方法，所述方法包括提供權利要求22的噬菌體，其分別表達不同的肽；和篩選具有與Nogo，MAG和/或TN-R結合的能力的噬菌體。
24.權利要求23的方法，其中隨后根據在體外實驗中阻斷Nogo，MAG和/或TN-R對神經元細胞粘附的抑制作用的能力，來篩選被鑒定為能夠與Nogo，MAG和/或TN-R結合的噬菌體或者它們所展示的肽。
25.包括權利要求24中的所有步驟以及另外的步驟的方法，所述另外的步驟是在鑒定能夠在體外實驗中阻斷Nogo，MAG和/或TN-R對神經元細胞粘附的抑制作用的肽或顯示該肽的噬菌體以后，將所述肽與一或多種可藥用的成分配制在一起用于體內給藥。
26.搜索很可能減少TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的因素的方法，所述方法包括搜索序列數據庫以鑒定多種多肽，或者編碼多肽的核酸，其包括這樣的氨基酸序列，所述氨基酸序列具有至少5個與選自下組的氨基酸序列中的對應殘基相同的殘基YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；和QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。
27.搜索很可能減少TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的因素的方法，所述方法包括利用能在嚴謹條件下與一種核酸序列雜交的寡核苷酸探針來篩選cDNA文庫，所述核酸序列編碼具有至少5個與選自下組的氨基酸序列中的對應殘基相同的殘基YLTQPQS(SEQ ID NO.1)；GSLPHSL(SEQ ID NO.2)；TQLFPPQ(SEQ ID NO.3)；HSIPDNI(SEQ ID NO.4)；HHMPHDK(SEQ ID NO.5)；YTTPPSP(SEQ ID NO.6)；和QLPLMPR(SEQ ID NO.7)。
28.權利要求26或27的方法，其包括這樣的步驟，在鑒定了候選多肽或編碼該候選多肽的核酸以后，檢測所述多肽降低TN-R，MAG和/或Nogo的抑制作用的能力。
29.包括權利要求28中的所有步驟以及另外的步驟的方法，所述另外的步驟是在鑒定能夠在體外實驗中阻斷Nogo，MAG和/或TN-R對神經元細胞粘附的抑制作用的多肽后，將所述多肽與一或多種可藥用的成分配制在一起用于體內給藥。
30.核酸載體，其含有編碼選自下組的一或多個肽結構域的核酸(a)Nogo-A的N-末端結構域(NogoN)，或其變體或片段；(b)Nogo-B的細胞外環(Nogo66)，或其變體或片段；(c)MAG的第三到第五個免疫球蛋白樣重復，或其變體或片段；和(d)TN-R的EGF-樣結構域，或其變體或片段，其中所述片段包含來自所述結構域的至少15個連續的氨基酸，包括所述結構域的一或多個表位，并保持在體內激發抗體應答的能力，和其中所述變體包括至少15個氨基酸的部分，其與所述結構域的相應部分具有至少65％的氨基酸同一性。
31.權利要求30的載體，其中所述核酸編碼上述結構域中的至少兩個結構域。
32.權利要求31的載體，其中所述結構域作為融合蛋白表達。
33.權利要求32的載體，其中所述結構域通過柔性接頭互相分離。
34.權利要求30-33之一的載體，其中對于蛋白Nogo A，Nogo B，TN-R和/或MAG，所述載體優選基本上僅能夠表達權利要求30所述的結構域(a)，(b)，(c)和/或(d)。
35.權利要求34的載體，其中所述載體能夠表達所述蛋白的其它含有表位的部分。
36.權利要求34或35的載體，其中對于蛋白Nogo A，Nogo B，TN-R和/或MAG，所述載體優選表達不超過20％的位于權利要求30所述的結構域(a)-(d)之外的蛋白質。
37.權利要求30-36之一的載體，其中結構域(a)具有氨基酸序列NogoN(1-185)(SEQ ID NO10)，結構域(b)具有氨基酸序列Nogo66(823-888)(SEQ ID NO11)，結構域(c)具有氨基酸序列MAG(1-508)(SEQ ID NO8)，和結構域(d)具有氨基酸序列TNR(125-329)(SEQ ID NO9)。
38.權利要求的載體30，其編碼具有氨基酸序列MAG(1-508)-Alan-TNR(125-329)-Alan-NogoN(1-185)-Alan-Nogo66(823-888)(SEQ ID NO12)的多肽，其中Alan代表聚丙氨酸接頭。
39.一種組合物，其包含權利要求30-38之一的載體，該載體與一或多種可藥用的成分配制在一起用作治療性疫苗。
40.權利要求30-38之一的載體，其用于治療方法中。
41.權利要求30-38之一的載體在制備用于治療CNS損傷的藥物中的用途。
42.治療患者中的CNS損傷的方法，所述方法包括將權利要求30-38之一的載體作為治療性疫苗給藥患者。
43.一種多肽，其基本上由權利要求30定義的一或多個多肽結構域組成。
44.權利要求43的多肽，其由權利要求30-38之一的載體編碼。
45.一種組合物，其包含權利要求43或44的多肽，所述多肽與一或多種可藥用的成分配制在一起用作治療性疫苗。
46.權利要求43或44的多肽，其用于治療方法中。
47.權利要求43或44的多肽在制備用于治療CNS損傷的藥物中的用途。
48.治療患者中的CNS損傷的方法，所述方法包括將權利要求43或44的多肽作為治療性疫苗給藥患者。
49.能夠與權利要求37中定義的結構域(a)-(d)之一特異性結合的抗體，或能夠與權利要求37中定義的結構域(a)-(d)中的兩種、三種或所有四種結構域結合的抗體混合物，所述抗體或抗體混合物用于治療方法中。
50.能夠與權利要求37中定義的結構域(a)-(d)之一特異性結合的抗體，或能夠與權利要求37中定義的結構域(a)-(d)中的兩種、三種或所有四種結構域結合的抗體混合物在制備用于治療CNS損傷的藥物中的用途。
51.治療患者體內的CNS損傷的方法，所述方法包括給藥患者以下抗體作為治療性疫苗能夠與權利要求37中定義的結構域(a)-(d)之一特異性結合的抗體，或能夠與權利要求37中定義的結構域(a)-(d)中的兩種、三種或所有四種結構域結合的抗體混合物。
52.一種組合物，其包含能夠與權利要求37中定義的結構域(a)-(d)之一特異性結合的抗體，或能夠與權利要求37中定義的結構域(a)-(d)中的兩種、三種或所有結構域結合的抗體混合物，所述抗體或抗體混合物與一或多種可藥用的成分配制在一起用作治療性疫苗.
53.權利要求12，39，45或52之一的組合物，其被配制成用于通過注射給藥的劑型。
54.權利要求13的肽，權利要求的載體40，權利要求46的多肽或權利要求49的抗體，其中所述治療是對CNS損傷的治療。
55.權利要求13的肽，權利要求的載體40，權利要求46的多肽或權利要求49的抗體，其中所述治療是對脊髓損傷或卒中的治療。
56.權利要求14，41，47或50之一的用途，其中所述治療是對脊髓損傷或卒中的治療。
全文摘要
本申請提供了與髓磷脂蛋白Nogo，TNR和MAG的抑制性結構域發生相互作用的肽。這些肽可用于治療CNS損傷，并用于開發進一步的治療。還提供了針對所述髓磷脂蛋白的抑制性結構域來免疫受試者以便治療CNS損傷的方法和物質。
文檔編號A61K38/08GK1745094SQ200380109532
公開日2006年3月8日 申請日期2003年12月5日 優先權日2002年12月6日
發明者肖志誠 申請人:新加坡綜合醫院有限公司