專利名稱：抗人抵抗素合成多肽抗體及其制備方法
技術領域：
本發明涉及以抗體為特征的體外試驗用的生物制品，具體是一種抗人抵抗素合成多肽抗體及其制備方法。
背景技術：
抵抗素(resistin，RST)是2001年發現的一種由白色脂肪細胞特異表達和分泌的激素蛋白。由于市售的基因重組人抵抗素價格昂貴，用來制備抗體的成本太高，既有風險又不經濟。
ab1129http//www.abcam.com/？datasheet＝1129“抵抗素抗體(ab1129)數據表”供應商NovuS-Biologicals(NB200-202)提供兔抗抵抗素多克隆抗體，其免疫原合成肽GSWDVRAETTCH，對應于人抵抗素氨基酸序列的79-90位。
ab1130http//www.abcam.com/？datasheet＝1130“抵抗素抗體(ab1129)數據表”供應商Novus-Biologicals(NB200-202)提供兔抗抵抗素多克隆抗體，其免疫原合成肽AGMDWTGAR，對應于人抵抗素氨基酸序列的94-102位。
http//www.phoenixpeptide.com/catalog％20Files/Risistin/risistin.htm公開了“用抵抗素(43-65)抗血清染色的大鼠下丘腦切片”新產品，用人抵抗素(51-108)酶免疫分析藥盒檢測健康人的正常血漿抵抗素水平。
發明內容
本發明就是為了解決實驗室用于免疫沉淀和蛋白印跡試驗，以建立體外免疫分析所需試驗用生物制品的問題，而提供一種抗人抵抗素合成多肽抗體及其制備方法。
一種抗人抵抗素合成多肽抗體，該抗體效價在1∶100000以上，特異性強，親和力高達1.34×1010L/mol，作為半抗原的合成多肽的氨基酸序列為CSMEEAINERIQE。
一種抗人抵抗素合成多肽抗體的制備方法，以抵抗素氨基酸序列中22-34位的CSMEEAINERIQE肽段序列作為抗原肽合成抵抗素抗原肽；純化的抗原肽與蛋白載體偶聯，經柱層析純化后；制備出人工免疫原，免疫動物，制備多肽抗體，并經親和層析純化而成。
所述的制備方法，其載體蛋白為鑰孔堿血藍素。
所述的制備方法，其偶聯的KLH-多肽加福氏佐劑免疫動物后收集抗體。
所述的制備方法，其抗原肽與載體蛋白偶聯作為免疫原，免疫家兔制備兔抗人抵抗素合成多肽抗體。
所述的制備方法，其合成多肽偶聯Sepharos 4B，制備親和層析柱，用于純化抗多肽抗體。
本發明制備的高質量的抵抗素合成多肽抗體效價高、親和力強、特異性好，可與天然人抵抗素分子發生特異結合反應。用多肽抗原制備抗體的成本只有用重組抗原制備成本的十分之一左右。抗體經親和層析法純化后可完全用于免疫沉淀和蛋白印跡(Western blot)試驗，以及建立體外免疫分析方法。該合成肽抗體的制備，為抵抗素分子的研究及相關疾病的研究提供了一個有用的工具。
具體實施例方式
一.抵抗素抗原肽的合成應用Antheprot蛋白質分析軟件，對人抵抗素氨基酸序列(1-108)進行親水性、抗原型及同源性分析。選擇含22～34位的13個氨基酸的肽段序列作為抗原肽，在433A全自動多肽合成儀上由固定羧基向氨基端遞增合成后獲得粗品。經30％乙腈溶解后，進行高壓液相色譜(HPLC)分析，計算主峰面積并收集，經冷凍真空抽干后純化合成肽，質譜鑒定。
二.合成多肽與載體的偶聯載體蛋白選擇鑰孔堿血藍素(KLH，keyhole limpet hemocyanin)，用雙功能試劑順丁烯酰胺苯甲酸-N-琥珀酸酯(MBS)連接法將KLH與合成肽進行偶聯取KLH 5mg(0.11μmol，含賴氨酸2.2μmol)，溶于0.75ml偶聯緩沖液1(50mmol/L硼酸鹽緩沖液，pH8.5)；3mgMBS(11μmol)溶于75μl二甲酰胺(DMF)。將MBS溶液分3次加入KLH溶液，旋轉混勻，室溫下作用30分鐘。迅速離心后，將反應混合物(約0.8ml)加入預先用偶聯緩沖液2(0.1mol/L磷酸鹽，0.15mol/L NaCl，0.01mol/L Na2EDTA，pH7.0)平衡的PD-10柱。用偶聯緩沖液2洗脫，收集洗脫液(即MBS-KLH溶液)。溶解1.5mg合成多肽于0.15ml偶聯緩沖液2，加入MBS-KLH溶液0.56ml，室溫下旋轉混合，作用2小時后置4℃過夜，將反應混合物(約0.7ml)加入預先用磷酸緩沖液平衡的PD-10柱，磷酸緩沖液洗脫，收集流出液。將KLH、MBS-KLH和偶聯物進行SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝膠電泳)鑒定偶聯效率。
三.抗多肽抗體的制備取偶聯的KLH-多肽500μg，溶于500μl磷酸緩沖液，加等體積的完全福氏佐劑，背部皮內多點注射免疫家兔。4周后抗原量減半(250μg)，加等體積的不完全福氏佐劑，第一次加強免疫。2周后進行第二次加強免疫，方法同前。再2周后開始耳緣靜脈少量采血，用合成多肽(1μg/ml)包被酶標板，間接ELISA法監測免疫血清效價。當抗血清效價達到最高后，采用頸動脈放血收集抗體。
四.親和層析純化抗多肽抗體1.抵抗素合成肽親和層析柱的制備稱取1.5g CNBr活化Sepharose 4B，用1mmol/L鹽酸充分浸洗膨脹凝膠后，再用偶聯緩沖液洗2次，迅速與溶于5ml偶聯緩沖液的合成多肽500μg混合，室溫下旋轉混合2小時。加入0.2mol/L甘氨酸4ml終止反應，室溫下旋轉混合1小時。用偶聯緩沖液和甘氨酸緩沖液交替洗凝膠各2次，再用50ml磷酸鹽緩沖液洗凝膠，按終濃度0.02％加疊氮鈉(NaN3)，置4℃保存。
2.親和層析純化抗多肽抗體將20ml兔抗多肽血清與1.6ml多肽偶聯的Sepharose 4B共同加入50ml離心管，4℃旋轉混合6小時。將凝膠加入層析柱，棄去流出液，用15ml磷酸鹽緩沖液沖洗凝膠。每次加0.8ml pH2.9，0.1mol/L甘氨酸緩沖液洗脫，共8次，洗脫液分別接入8支預先加入80μl 2mol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.5)，20ml磷酸鹽緩沖液洗凝膠。上述全部操作過程在4℃下完成。每管取洗脫液2μl，稀釋50倍后測280nm出OD值，計算蛋白質含量并繪制洗脫曲線。
五.抗體的鑒定間接ELISA法鑒定抗體特異性，Schatchard作圖法計算親和力。
試驗效果1.抵抗素合成多肽HPLC純化后純度＞92％，質譜鑒定分子量為1551.7，經蛋白質測序鑒定為氨基酸序列為CSMEEAINERIQE。
2.多肽與載體的偶聯效率SDS-PAGE電泳鑒定偶聯效率與樣品回收率大致相符，為75％。
3.抗多肽抗體的效價用多只家兔得到的抗血清效價均在1100000以上。
4.抗體特異性純化后的Resistin多肽抗體與人Resistin己合成肽交叉反應率接近100％，而與兔、鼠、鼠Resistin、人胰島素、人瘦素無交叉反應。
5.抗體親和力親和常數為1.34×1010L/mol。
6.抗體的應用以上技術指標的實現保證該抗體完全可以應用于免疫沉淀和蛋白印跡試驗，以及建立體外免疫分析。在中國醫學科學院放射醫學研究所試驗核醫學室進行的上述試驗應用效果良好。
權利要求
1.一種抗人抵抗素合成多肽抗體，其特征在于該抗體效價在1∶100000以上，特異性強，親和力高達1.34×1010L/mol，作為半抗原的合成多肽的氨基酸序列為CSMEEAINERIQE。
2.一種抗人抵抗素合成多肽抗體的制備方法，其特征在于以抵抗素氨基酸序列中22-34位的CSMEEAINERIQE肽段序列作為抗原肽合成抵抗素抗原肽；純化的抗原肽與蛋白載體偶聯，經柱層析純化后；制備出人工免疫原，免疫動物，制備多肽抗體，并經親和層析純化而成。
3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于載體蛋白為鑰孔磩血藍素。
4.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于偶聯的KLH—多肽加福氏佐劑免疫動物后收集抗體。
5.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于抗原肽與載體蛋白偶聯作為免疫原，免疫家兔制備兔抗人抵抗素合成多肽抗體。
6.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于合成多肽偶聯Sepharos 4B，制備親和層析柱，用于純化抗多肽抗體。
全文摘要
本發明公開了一種抗人抵抗素合成多肽抗體及其制備方法，屬于以抗體為特征的體外試驗用的生物制品。其制備方法是以抵抗素氨基酸序列中的一段合成多肽，其氨基酸序列CSMEEAINERIQE作為半抗原，與蛋白載體連接后制備出人工免疫原，對動物進行免疫，有效地誘導機體產生免疫應答，從而得到抗體。本發明制備的抗人抵抗素合成多肽抗體效價高、親和力強、特異性好，可與天然人抵抗素分子發生特異結合反應；制備成本相當于用重組抗原制備抗體的1/10；純化后的抗體可完全用于免疫沉淀和蛋白印跡試驗，以及建立體外免疫分析方法。該抗體為抵抗素分子的研究及相關疾病的研究提供了一個有用的工具。
文檔編號C07K16/18GK1594363SQ20041001993
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月8日 優先權日2004年7月8日
發明者趙明輝, 韓佩珍, 張春明, 王勝芬, 王德芝, 王彥, 劉慶芬, 陳冀瑩 申請人:中國醫學科學院放射醫學研究所