專利名稱：馬屬動物抗人、禽流感免疫球蛋白的制備及其藥物制劑的制作方法
技術領域：
本發明提供一種馬屬動物抗人、禽流感免疫球蛋白的制備及其藥物制劑，特別用于預防和治療H1、H2、H3、H5、H7亞型流感病毒(InfluenzaVirus)感染的疾病，屬于流行性感冒疾病的預防和治療技術領域。
背景技術：
流感是一種古老的傳染病。從1918年世界上出現第一次流感大流行后，在世界范圍內又先后出現過四次流感大流行，造成幾千萬人的死亡，元兇分別是H1N1(1918)、H2N2(1957)、H3N2(1968)、H1N1(1977)、H5N1(1997)。人們雖然采取了多種防制措施，但流感的發生與流行依然沒有得到有效控制。
1997年禽流感病毒(H5N1)感染人的事件發生之前，人們普遍認為流感病毒具有極為嚴格的宿主特異性，禽類的流感不會直接跨越種間屏障感染豬以外的哺乳動物，而必須通過中間混合器—豬體進行基因重組獲得感染人的能力。近年來先后發生的H5N1、H9N2、H7N7感染人的事件，表明禽流感病毒有直接感染哺乳動物的能力，并可能在人類引發大流行。特別是自2003年12月以來，在韓國、日本、越南、泰國和中國等東南亞各國相繼爆發了A型H5N1亞型流感病毒引起的高致病性禽流感，而且繼1997香港“禽流感”事件后再次出現了H5N1亞型高致病性禽流感病毒感染人的事件。據世界衛生組織調查統計，截至2004年2月6日，越南、泰國已有20人確診被高致病性禽流感病毒感染，并已有16人死亡，病死率高達80％。有關專家警告，禽流感將比非典對人更具有威脅性。
目前，在流感預防與治療方面，主要通過下列手段①滅活疫苗是通過流感病毒全病毒或亞病毒體成分的滅活制劑，對人群的保護力為60％-70％，疫苗效果取決于接種者的年齡和免疫能力，也取決于所用疫苗中所含毒株與當年流行的毒株是否相配。②活疫苗是一種減毒疫苗，為單價、二價和多價疫苗，可經鼻腔噴霧引起上呼吸道輕微感染而產生免疫力，保護力有時可達85％，但存在潛在的致病危險。③基因疫苗又稱DNA疫苗，一般需構建流感抗原的重組體，主要包括HA、NA、NP基因，以各種方式導入體內，基因表達產物可刺激機體產生細胞免疫和體液免疫。但價格較高。疫苗免疫的共同特點是保護力持久，但產生需要一定的時間，不能立即提供保護。④抗流感病毒藥物金剛烷胺和金剛乙胺，是通過阻抑M2來抑制A型流感病毒進入細胞，對預防A型流感具有一定的作用，對B型流感病毒無效，有明顯的頭暈、嗜睡、失眠甚至共濟失調等副作用，限制了其在臨床上的應用；利巴韋林，屬廣譜抗病毒藥，但對流感病毒的選擇性差和血紅蛋白下降等副作用限制了其在臨床上對流感的作用；新型抗流感病毒藥物----神經氨酸酶抑制劑，能選擇性地抑制A型、B型流感病毒的神經氨酸酶活性，抑制病毒從感染細胞的釋放，從而阻止流感病毒的傳播，但在臨床應用上常見有鼻部不適、腹瀉、惡心、頭痛、支氣管炎等副作用。
病毒抗原刺激機體免疫系統可產生多種特異性抗體(IgA、IgG、IgM)，血清中最主要的中和抗體是IgG。抗體與病毒結合后能覆蓋病毒吸附位點，使病毒不能吸附和穿入易感細胞，從而喪失感染力。目前國內外已有多種抗細菌毒素、抗病毒血清或免疫球蛋白制劑應用于臨床，用于疾病的緊急預防與治療，如抗狂犬病血清、破傷風抗毒素血清、白喉抗毒素血清等。經檢索未見有關馬屬動物抗人、禽流感的免疫球蛋白的制備及其藥物制劑的文獻報道。
發明內容
本發明的目的旨在提供一種馬屬動物抗人、禽流感的免疫球蛋白的制備工藝，適用于工業化生產。
本發明還提供了上述免疫球蛋白所研制成的藥物制劑，用于預防和治療H1、H2、H3、H5、H7亞型流感病毒感染的流行性感冒。
本發明的技術實施方案如下1.免疫血漿制備用國家標準流感病毒H1、H2、H3、H5、H7亞型毒株經組織培養、提純、濃縮、滅活后，由各亞型毒株單獨或聯合免疫馬屬動物而獲得的免疫血漿。
2.抗體提取與精制經胃酶消化、硫酸胺鹽析等常規制備工藝，從免疫血漿中提取特異性免疫球蛋白IgG F(ab’)2。
3.半成品與成品標準檢測精制馬屬動物流感病毒免疫球蛋白制劑半成品經無菌檢驗、熱原質檢驗、化學物質測定后，按國家規程要求進行調整，制成成品。
馬屬動物抗人、禽流感免疫球蛋白的具體制備方法包括以下步驟a.用國家標準流感病毒H1、H2、H3、H5、H7亞型毒株通過SPF雞胚培養增殖，回收雞胚尿囊液進行收毒，病毒經差速離心及密度梯度離心進行提純、濃縮，經福爾馬林滅活后加入弗氏完全與不完全佐劑，制成免疫抗原；b.挑選健康馬匹，經過基礎免疫、超免疫后采血，分離血漿；將分離的免疫血漿用2～4倍注射用水稀釋，調節pH至3.2～3.6，加入胃酶適量及甲苯0.2％～0.4％(ml/ml)，于29～31℃消化1～1.5小時；每100ml消化液加硫酸銨14～16g，調節pH至4.8～5.6，加溫至55℃左右，保持30分鐘；加溫終了，迅速降溫至45℃以下，離心5000rpm，10min，取清液；上述清液調節pH至7.0～7.4，每100ml加硫酸銨19～21g，離心5000rpm，10min，取沉淀，壓干；上述沉淀用水稀釋至蛋白含量不超過2％(g/ml)，加明礬不少于0.8％(g/ml)，調節pH至7.7～7.9，離心5000rpm，10min，取清液；將上述清液按100ml加硫酸銨38g，分離，取沉淀，壓干。沉淀物透析至硫酸銨含量0.1％(g/ml)以下；調整固體總量不超過20％(g/ml)、蛋白含量不超過17％(g/ml)，加氯化鈉使最終含量為0.9％(g/ml)，加三氯甲烷使最終含量為0.5％(ml/ml)或硫柳汞液使最終含量為0.01％(g/ml)。
所述的馬屬動物包括馬、驢及其雜交后代。
本發明利用動物免疫方法生產抗病毒血清制成被動免疫制劑，使用后可使機體立即獲得免疫保護能力，用于預防和治療H1、H2、H3、H5、H7亞型病毒(Influenza Virus)感染的人、禽流感疾病，具有療效顯著，藥效作用迅速與無毒副作用的特點，藥物制劑容易保存，便于運輸，保質期限長，生產工藝簡單，適合于工業化生產。
為表明本發明在緊急預防和治療H1、H2、H3、H5、H7亞型病毒(Influenza Virus)感染的流感疾病，通過以下試驗給予證明首先，以小白鼠為H1、H2、H3、H5和H7亞型流感病毒感染的動物模型，以死亡、體重減輕、檢出病毒或檢出抗體為判定標準，將其分為治愈、有效、顯效和無效四個等級進行統計，用所制備的精致免疫球蛋白進行小鼠的H1、H2、H3、H5和H7亞型流感病毒的緊急預防與治療實驗，預防用量為每鼠肌注0.5U，治療肌注1U。
結果如下表緊急預防與治療效果統計動物使用治愈％有效％顯效％無效％小白鼠 預防80200 0(18-20g)治療7020100綜上所述，馬屬動物抗人、禽流感免疫球蛋白在緊急預防和治療由H1、H2、H3、H5和H7亞型病毒引起的流感具有顯著的療效。
具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例描述本發明，而不是以任何方式限制本發明。在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明所作的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發明的待批權利要求范圍之內。
實施例11.免疫血漿制備a.抗原制備用國家標準流感病毒H1、H2、H3、H5、H7亞型毒株接種SPF雞胚(9-11日齡)，培養增殖病毒，72h回收雞胚尿囊液進行收毒。用HA方法檢測病毒毒力，病毒血凝價應達到1∶27-10。病毒經差速離心(5000rpm/min 30min，25000rpm/min 2.5h)及蔗糖密度梯度離心進行提純、濃縮，經2‰-4‰福爾馬林滅活后加入弗氏完全或不完全佐劑，制成免疫抗原。
弗氏完全佐劑抗原抗原∶羊毛脂∶石臘油＝3∶1∶2，加卡介苗達0.4-0.6mg/mL弗氏不完全佐劑抗原抗原∶羊毛脂∶石臘油＝3∶1∶2b.免疫血漿制備按《中國生物制品規程》中《生物制品生產用馬匹檢疫及管理規程》的規定，挑選健康馬匹(無馬傳染性貧血、馬鼻疽、布氏桿菌病、馬副傷寒性流產及其他傳染病)，經過基礎免疫、超免疫后采血，分離血漿。免疫采取皮下、肌肉、皮內、靜泳、腹腔等途徑。注射部位為頸部兩側、脊背兩側、臀部兩側。采用“多點分散，每點少量”的原則。
基礎免疫采用二針次，首免用弗氏完全佐劑抗原，二免用弗氏不完全佐劑抗原。每次免疫前采少量馬血測定抗體情況。
注射劑量及時間第1天2mL，第7天2.5mL超免疫采用五針次免疫，用弗氏不完全佐劑抗原。每次免疫前采少量馬血測定抗體情況。
注射劑量及時間第1針第14天 3-5mL第2針第20-22天3-10mL第3針第26-28天3-10mL第4針第32-34天4-20mL第5針第38-40天4-20mL采血于末次免疫后第8-15天進行采血，采血量按16-19mL/千克體重，隔天后再采1次。馬血以枸椽酸鈉抗凝分離血漿。
休息10-15天后可進行下程免疫。下程免疫一般采用二針次或三針次免疫。每個針次間隔8-15天，免疫抗原用滅活病毒原液10-30mL。
2.抗體提取與精制a.將分離的免疫血漿用2～4倍水稀釋，調節pH至3.2～3.6，加入胃酶適量及甲苯0.2％～0.4％(ml/ml)，于29～31℃消化1～1.5小時。
b.每100ml消化液加硫酸銨14～16g，調節pH至4.8～5.6，加溫至55℃左右，保持30分鐘。加溫終了，迅速降溫至45℃以下，離心5000rpm，10min，取清液。
c.上述清液調節pH至7.0～7.4，每100ml加硫酸銨19～21g，離心5000rpm，10min，取沉淀，壓干。
d.上述沉淀用水稀釋至蛋白含量不超過2％(g/ml)，加明礬不少于0.8％(g/ml)，調節pH至7.7～7.9，離心5000rpm，10min，取清液。
e.將上述清液按100ml加硫酸銨38g，分離，取沉淀，壓干。沉淀物透析至硫酸銨含量0.1％(g/ml)以下。進行中和實驗檢測抗體效價。
3.半成品與成品標準檢測a.調整固體總量不超過20％(g/ml)、蛋白含量不超過17％(g/ml)，加氯化鈉使最終含量為0.9％(g/ml)，加三氯甲烷使最終含量為0.5％(ml/ml)或硫柳汞液使最終含量為0.01％(g/ml)為防腐劑。用于制造凍干產品者只用三氯甲烷為防腐劑。調節pH至6.0～7.0。
b.上述制品經除菌過濾及半成品檢定合格后，可用凍干法制成精制免疫球蛋白干燥制品。
c.精制免疫球蛋白成品要求是液體精制免疫球蛋白以及凍干制品按規定量溶解后，固體總量不得超過20％(g/ml)，蛋白含量不得超過17％(g/ml)，pH值應為6.0～7.0，氯化鈉含量應為0.85％～0.95％(g/ml)，硫酸銨含量不得超過0.1％(g/ml)，液體精制免疫球蛋白的防腐劑，用三氯甲烷者不得超過0.5％(mlg/ml)，用硫柳汞者不得超過0.01％(g/ml)，凍干精制免疫球蛋白水分含量不得超過3％。將樣品稀釋至2％蛋白濃度，做瓊脂糖電泳分析，應不含或僅含痕量白蛋白遷移率的蛋白。用SDS-PAGE法，預防用F(ab’)2含量不得低于50％，治療用F(ab’)2含量不得低于60％。對H1、H2、H3、H5、H7的中和抗體效價不低于1∶2048。
實施例2 注射劑取實施例1制備的免疫球蛋白100g加注射用水制成5％的水溶液，用微孔濾膜(φ0.20μm)濾過至澄明，滅菌，無菌分裝，每瓶10ml，封口，即得。
實施例3 口服膠囊取實施例1制備的免疫球蛋白1kg，藥用淀粉0.5kg，用80％乙醇濕法制粒，整粒，裝2#膠囊，每粒0.2g。其他項目應符合中華人民共和國藥典2000年版膠囊項下。
實施例4 滴鼻劑取實施例1制備的免疫球蛋白100g加注射用水制成5％水溶液，加透皮劑，經微孔濾膜(φ0.20μm)濾過除菌，無菌分裝滴鼻瓶，每瓶5ml。其他項目應符合中華人民共和國藥典2000年版滴鼻劑項下。
權利要求
1.一種馬屬動物抗人、禽流感的免疫球蛋白制備及其藥物制劑，其特征在于是由國家標準H1、H2、H3、H5、H7亞型流感病毒毒株通過組織培養、提純、濃縮、滅活后，由各亞型毒株單獨或聯合免疫馬屬動物而獲得的免疫血漿，經胃酶消化后，用硫酸銨鹽析法制得的液體或凍干免疫球蛋白制劑以及以此制劑所研制的藥物制劑。
2.權利要求對1所述免疫球蛋白的制備包括以下步驟a.用國家標準流感病毒H1、H2、H3、H5、H7亞型毒株通過SPF雞胚培養增殖，回收雞胚尿囊液進行收毒，病毒經差速離心及密度梯度離心進行提純、濃縮，經福爾馬林滅活后加入弗氏完全或不完全佐劑，制成免疫抗原；b.挑選健康馬匹，經過基礎免疫、超免疫后采血，分離血漿；將分離的免疫血漿用2～4倍注射用水稀釋，調節pH至3.2～3.6，加入胃酶適量及甲苯0.2％～0.4％(ml/ml)，于29～31℃消化1～1.5小時；每100ml消化液加硫酸銨14～16g，調節pH至4.8～5.6，加溫至55℃左右，保持30分鐘；加溫終了，迅速降溫至45℃以下，離心5000rpm，10min，取清液；上述清液調節pH至7.0～7.4，每100ml加硫酸銨19～21g，離心5000rpm，10min，取沉淀，壓干；上述沉淀用水稀釋至蛋白含量不超過2％(g/ml)，加明礬不少于0.8％(g/ml)，調節pH至7.7～7.9，離心5000rpm，10min，取清液；將上述清液按100ml加硫酸銨38g，分離，取沉淀，壓干。沉淀物透析至硫酸銨含量0.1％(g/ml)以下；調整固體總量不超過20％(g/ml)、蛋白含量不超過17％(g/ml)，加氯化鈉使最終含量為0.9％(g/ml)，加三氯甲烷使最終含量為0.5％(ml/ml)或硫柳汞液使最終含量為0.01％(g/ml)。
3.根據權利要求1或2所述的產品。
4.馬屬動物抗人、禽流感的免疫球蛋白在緊急預防和治療H1、H2、H3、H5、H7亞型病毒感染的人、禽感冒疾病中的應用。
全文摘要
本發明公開一種馬屬動物抗人、禽流感的免疫球蛋白的制備及其藥物制劑，是由國家標準H
文檔編號A61P31/14GK1559611SQ20041001070
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月23日 優先權日2004年2月23日
發明者夏咸柱, 章金剛, 黃耕, 王承宇, 高玉偉, 高宏偉, 楊松濤 申請人:中國人民解放軍軍需大學軍事獸醫研究所, 中國人民解放軍軍需大學軍事獸醫研究