專利名稱：CpG DNA分子抗感染免疫制劑的制備和應用的制作方法
技術領域：
1.生物技術 2.分子免疫學背景技術1984年，Tokunaga等人發現結核分枝桿菌的DNA除了一是種遺傳物質外，還具有抗腫瘤特性，由此揭開了細菌DNA具有免疫刺激特性研究的新篇章，隨后，他們通過一些研究認為這種免疫刺激特性是由具有自身互補回文結構的六核苷酸所引起的。至1995年，Krieg等人發現細菌DNA及某些人工合成的ODN(寡聚脫氧核苷酸)均具有免疫刺激作用，但這種作用與其是否具有回文結構并不一定相關，而是與這些DNA中具有的非甲基化的CpG結構單元(motif)密切相關，并將其定義為CpG免疫刺激序列(CpG)。
CpG序列主要存在于細菌、病毒及無脊椎動物的基因組中，而脊椎動物基因組中較少，且大部分是甲基化的。CpG通常有一定的結構特征，即以CpG為核心，5′端緊接2個嘌呤堿、3′端緊接2個嘧啶堿。細菌DNA中這些未甲基化的CpG或者人工合成的含CpG的寡核苷酸(CpG-oligideoxynucleotides，CpG-ODN)在無需T細胞存在的情況惠，可直接激活B細胞，刺激B細胞分泌免疫球蛋白及IL-6。其產生的抗體呈非抗原性異性，細菌DNA誘導小鼠B細胞產生的抗體不僅能同細菌DNA發生抗原抗體反應，與其它DNA亦能發生交叉反應。除B細胞外，CpG亦可直接激活單核細胞、巨噬細胞及樹突狀細胞，活化CD8+T細胞并促進其分化，誘導多種Th1型細胞因子如IFN、TNE、IL-1及IL-12等的分泌，這些因子進一步激活NK細胞并分泌IFN-γ，從而產生溶細胞活性。
雖然細菌DNA及人工合成的CpG-ODN均有免疫刺激作用，但在某些細胞如巨噬細胞，細菌DNA作用強于人工合成的的CpG-ODN。Stcey認為，這可能是由于寡核苷酸比細菌DNA更容易降解，或者由于細菌DNA中不同免疫刺激序列的結合有更強的免疫刺激作用，或者用于大分子DNA更有效。
21世紀人類健康問題日益突出，在以抗生素等化學藥物有效治療感染性疾病的同時，由此也產生了眾多藥源性疾病和細菌對抗生素的耐藥性問題。目前由于過度依賴抗生素控制感染性疾病，導致病菌耐藥性問題。近十多年來細菌對抗生素的耐多藥、全耐藥現象蔓延加劇，造成許多感染性疾病難以控制，如結核桿菌、0157大腸桿菌等引起的傳染性疾病卷土重來，嚴重威脅著人類生命健康。目前迫切需要開拓全新的抗感染技術及藥物，有效增強機體免疫抗感染能力，克服濫用抗生素的危害。近幾年核酸分子免疫刺激序列的出現，為此帶來了新的曙光。
目前，已確定CpG序列對動物機體的免疫激活功能主要體現在以下兩方面一是刺激B淋巴細胞增殖；二是激活單核細胞分泌細胞因子，進而導致自然殺傷細胞和Th1輔助T細胞激活，引發Th1特征的體液和細胞免疫反應。
CpG-ODN的免疫刺激活性不僅與CpG基序和分子結構密切相關，而且具有動物種屬特異性。目前CpG免疫刺激序列的應用研究主要集中在基因治療、疫苗佐劑、腫瘤免疫等方面，而對其抗感染生物效應的研究較少。新近的研究表明，CpG基序除具有免疫調節功能外，對于控制胞內寄生細菌(李斯特菌，分支桿菌等)的感染也起重要作用，這一作用可依賴也可不依賴淋巴細胞，可望開發作為新型抗感染的免疫調節分子藥物。
因免疫途徑和免疫方式不同，所涉及的抗原呈遞細胞、抗原呈遞方式均有不同，故可產生不同類型、不同強度的免疫應答。肌內直接注射和口服是簡便且有效的兩種途徑。肌肉注射不需要額外的設備，且能在肌肉細胞中長期表達外源基因，因此它不僅是免疫動物的有效手段，而且還可應用于基因治療。考慮到今后應用的簡便性，口服也是一種可選的免疫方式。由于肌肉注射主要通過Th1細胞激活方式誘導免疫應答，效率較低，需要注射的DNA劑量較大，而口服經消化道所需的DNA量更大。因此，選擇有效的包裹方式將抗感染DNA制劑靶向投遞到抗原提呈細胞，以誘導強的體液免疫和細胞免疫，在應用免疫增強劑防治傳染性疾病中至關重要。殼聚糖是天然生物多糖甲殼質的脫乙酰基衍生物，具有很好的生物相容性、可被體內多種酶類降解、降解產物安全無毒，并能被生物體完全吸收；而且由于其具有獨特的聚陽離子特性，已有的研究結果顯示它是一種具有很大潛力的緩釋材料。近年來，在基因轉染表達研究領域已出現了基于殼聚糖的納米顆粒系統。大量研究表明，殼聚糖可包裹濃縮DNA，形成小的分散顆粒，將殼聚糖DNA復合物用于基因運載和轉染表達時，能有效攜帶目的基因進入靶細胞中。包封于殼聚糖顆粒中的物質，其釋放率主要決定于殼聚糖的生物降解和溶蝕，因此物質釋放明顯延長。初步研究結果發現基于殼聚糖的顆粒系統在生物醫學方面具有廣闊的應用前景。此外，殼聚糖還具有多種生物學功能，尤其是可作為藥物增效劑。
由于殼聚糖納米顆粒良好的生物相容性使其在DNA制劑的包裹應用中顯示了廣闊的前景，因此利用殼聚糖納米顆粒包裝含CpG基序的寡聚核苷酸制備基因制劑，并將其應用于提高機體細胞和體液免疫水平、增強抗感染能力的應用技術，在科研，醫療，動物保健，和產業化方面具有潛在的巨大價值。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是利用殼聚糖為包裹材料制備含CpG基序的寡聚核苷酸基因制劑，并將此制劑用于抗感染的應用技術。該方法包括下列步驟1、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的設計、合成CpG序列設計及合成CpG序列(見說明書第11頁序列表)合成了含有11個CpG基序、長度為88個堿基的CpG寡聚核苷酸序列，其特點為含有3個5’-AACGTT-3’，3個5’-GTCGTC-3’，1個5’-GACGTT-3’，1個5’-ATCGAT-3’，1個5’-GTCGTT-3’，1個5’-GGCGTT-3’，1個5’-GACGTC-3’的特征序列。
CpG序列引物設計及合成5’端CGAGATCTAACGTTGTC3’端CGAGATCTAACGTTAAC2、免疫用CpG寡聚核苷酸制備以合成的CpG序列為模版，利用PCR(多聚酶連鏈式反應)擴增，擴增產物溶解于滅菌生理鹽水，用紫外分光光度計測其濃度。
3、CpG寡聚核苷酸體外刺激動物血液免疫細胞增殖反應體外培養豬、牦牛及黃牛的淋巴細胞，制備靶細胞，分別將CpG寡聚核苷酸、CpG寡聚核苷酸和大腸桿菌疫苗、CpG寡聚核苷酸和副傷寒疫苗加入靶細胞中，利用MTT法檢測了該CpG寡聚核苷酸及其協同疫苗對動物免疫細胞增殖活性的影響，發現該CpG寡聚核苷酸及其協同疫苗均能顯著刺激豬、牦牛及黃牛淋巴細胞的增殖活性。
4、納米粒的制備利用離子交聯法，以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖制備納米包裝顆粒，將CpG寡聚核苷酸按一定比例加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，制備CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒，并測定了納米粒的形態、粒徑及Zeta電位。
結果顯示制備的CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒表面帶有正電荷，平均粒徑為45nm；多分散度為0.190；zeta電位為+25.6mV。
5、CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒抗感染制劑的應用昆明鼠120只，隨機分為8組，每組15只。其中4組為非特異性免疫組，4組為疫苗免疫組。以肌肉注射和口服兩種方式免疫小鼠，口服組CpG寡聚核苷酸免疫劑量為30pmol/頭小鼠，殼聚糖納米顆粒包裝組為6pmol/頭動物；疫苗免疫組每只小鼠接種1/40頭份以及相應CpG寡聚核苷酸30pmol或殼聚糖納米顆粒包裝的相應CpG寡聚核苷酸6pmol。五周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進行攻毒(3×109/ml)。
小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，檢測了殼聚糖包裝含CpG基序的寡聚核苷酸及未包裝CpG寡聚核苷酸對小鼠的體液免疫(IgG、IgA及IgM的含量、特異性抗體的測定)和細胞免疫水平(細胞因子和外周血免疫細胞數量)的影響情況，并對常規疫苗在不同形式的CpG寡聚核苷酸分子免疫佐劑協同作用下細胞免疫和體液免疫應答的變化，進行了較為系統地分析。在小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88/K99口服攻毒實驗小鼠，觀察發病情況；49天時對所有小鼠進行解剖，觀察各種器官的生理病變情況，檢測免疫保護效應。
結果發現以含CpG基序的寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒作為免疫增強劑時，小鼠的IgG、IgA、IgM含量和血清IL-2、IL-4、IL-6等細胞因子水平比對照組顯著升高；同時，白細胞、淋巴細胞、單核細胞、中性粒細胞等免疫細胞數量也明顯增加；與常規疫苗聯合使用，同樣可以顯著提高實驗動物的IgG、IgA、IgM含量，IL-2、IL-4、IL-6等細胞因子水平以及免疫細胞數量；對疫苗的特異性免疫應答也顯著加強。其中殼聚糖納米顆粒包裝含CpG基序的寡聚核苷酸注射組和口服組血清中IgG、IgA、IgM含量和細胞因子IL-2、IL-4、IL-6的增加尤為顯著；與對照組相比，肌注未包裝CpG寡聚核苷酸組體液免疫和細胞免疫的各項指標也明顯提高。殼聚糖納米顆粒包裝含CpG基序的寡聚核苷酸后，雖然DNA用量僅為未包裝組的1/5，但免疫組體液免疫和細胞免疫應答水平顯著提高，與對照組差異顯著(P＜0.05)。雖口服殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸組小鼠各項免疫指標比對照組有顯著增高，但其CpG寡聚核苷酸的用量是肌注殼聚糖包裹組用量的5倍。
這些結果表明含CpG基序的寡聚核苷酸能顯著提高小鼠的免疫應答水平，以殼聚糖納米顆粒作為免疫投遞系統，具有減少質粒用量、增強體液免疫和細胞免疫的優點。在應用中發現，口服免疫和肌肉注射的方式均能有效提高免疫小鼠對常規疫苗的免疫應答水平，兩種方式的作用效果差異不大，但肌肉注射DNA劑量僅為口服免疫劑量的1/5時就能達到相近的增強效果。這些結果提示殼聚糖納米顆粒包裹含免疫刺激序列CpG的寡聚核苷酸序列可提高機體細胞免疫和體液免疫水平，增強免疫應答及免疫保護力，可望作為有效的新型抗感染免疫調節劑，具有潛在的廣泛應用前景。
表1非特異性免疫小鼠分組(CNP殼聚糖納米顆粒)表2疫苗免疫小鼠分組(CNP殼聚糖納米顆粒)表3CpG體外刺激動物血液免疫細胞增殖反應結果(OD570)圖1CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒透射電鏡圖(放大倍數50000)圖2殼聚糖納米顆粒粒徑分布圖3非特異性免疫組小鼠血清中IgG含量圖4非特異性免疫組小鼠血清中IgA含量圖5非特異性免疫組小鼠血清中IgM含量圖6非特異性免疫組小鼠血清中IL-2含量圖7非特異性免疫組小鼠血清中IL-4含量圖8非特異性免疫組小鼠血清中IL-6含量圖9非特異性免疫組小鼠白細胞數量變化圖10非特異性免疫組小鼠單核細胞數量變化圖11非特異性免疫組小鼠淋巴細胞數量變化圖12非特異性免疫組小鼠中性粒細胞數量變化圖13疫苗免疫組小鼠血清中IgG含量圖14疫苗免疫組小鼠血清中IgA含量圖15疫苗免疫組小鼠血清中IgM含量圖16疫苗免疫組小鼠血清中沙門氏菌特異性抗體含量圖17疫苗免疫組小鼠血清中乙肝疫苗特異性抗體含量圖18疫苗免疫組小鼠血清中大腸桿菌特異性抗體含量圖19疫苗免疫組小鼠血清中IL-2含量圖20疫苗免疫組小鼠血清中IL-4含量圖21疫苗免疫組小鼠血清中IL-6含量圖22疫苗免疫組小鼠白細胞數量變化圖23疫苗免疫組小鼠單核細胞數量變化圖24疫苗免疫組小鼠淋巴細胞數量變化圖25疫苗免疫組小鼠中性粒細胞數量變化具體實施方式
1、CpG寡聚核苷酸序列及其引物的設計、合成CpG序列設計及合成CpG序列(見說明書第11頁序列表)該序列長度為88個堿基，含有11個CpG基序，其特點為含有3個5’-AACGTT-3’，3個5’-GTCGTC-3’，1個5’-GACGTT-3’，1個5’-ATCGAT-3’，1個5’-GTCGTT-3’，1個5’-GGCGTT-3’，1個5’-GACGTC-3’的特征序列。
CpG序列引物設計及合成5’端CGAGATCTAACGTTGTC3’端CGAGATCTAACGTTAAC2、免疫用CpG寡聚核苷酸制備以合成的CpG序列為模版，利用PCR(多聚酶連鏈式反應)擴增，擴增產物溶解于滅菌生理鹽水，用紫外分光光度計測其濃度。
3、CpG寡聚核苷酸體外刺激動物血液免疫細胞增殖反應無菌條件下取豬、牦牛及黃牛外周血，肝素抗凝，用淋巴細胞分離液分離血液淋巴細胞。然后在6孔培養板中每孔加入2×107/ml單細胞懸液2ml，培養48h。制備靶細胞，用含20mg/ml α-MM的RPMI1640完全培養基調整靶細胞濃度為8×106/ml。96孔細胞培養板每孔加入靶細胞50ul，再分別加入CpG寡聚核苷酸(0.6μg/孔)，CpG寡聚核苷酸(0.6μg/孔)和大腸桿菌疫苗(1/500頭份)，CpG寡聚核苷酸(0.6μg/孔)和副傷寒疫苗(1/500頭份)，每個樣品設4個重復孔，并設RPMI 1640完全培養基空白對照，置5％CO2、37℃細胞培養箱培養120h。MTT法檢測CpG寡聚核苷酸及其協同疫苗對動物免疫細胞增殖活性的影響。
結果見說明書附圖表3。表3顯示CpG，CpG和大腸桿菌疫苗，CpG和副傷寒疫苗三組處理均能顯著刺激淋巴細胞的增殖，與對照組差異顯著(P＜0.05)。其中，CpG和大腸桿菌疫苗的刺激效果最為明顯。
4、納米粒的制備以分子量150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖分散在1％醋酸溶液中(A液)；將CpG寡聚核苷酸溶解于三聚磷酸鹽溶液(B液)。將A液、B液置于50℃水浴分別恒溫20min，將DNA溶液按一定比例(氨基摩爾數與DNA的磷酸酯基摩爾數比)加入殼聚糖溶液，磁力攪拌使其充分混合，靜置過濾得到粒徑40-60nm的復合物微粒。即是CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米顆粒樣品液。
5、納米粒的形態、粒徑及Zeta電位測定取少量CpG寡聚核苷酸殼聚糖納米樣品液于透射電子顯微鏡下觀察納米顆粒形態并拍照。另取納米顆粒樣品液適量，加雙蒸水稀釋后用Zetasizer3000HS/IHPL納米粒度分析儀測定粒徑、分散度及Zeta電位。
透射電鏡觀察結果表明殼聚糖納米顆粒多呈球形(見說明書附圖1)。納米粒度分析儀測定結果為平均粒徑為45nm；多分散度為0.190(見說明書附圖2)zeta電位為+25.6mV，說明納米粒表面帶有正電荷。
6、實驗動物的免疫昆明鼠120只，隨機分為8組，每組15只。其中4組為非特異性免疫組，4組為疫苗免疫組。采用肌肉注射法，通過注射小鼠兩側股四頭肌免疫小鼠。
口服組CpG寡聚核苷酸免疫劑量為30pmol/頭小鼠，殼聚糖納米顆粒包裝組為6pmol/頭動物；疫苗免疫組每只小鼠接種1/40頭份以及相應CpG寡聚核苷酸30pmol或殼聚糖納米顆粒包裝的相應CpG寡聚核苷酸6pmol。五周后每只小鼠口服大腸桿菌K88和K99 0.4ml進行攻毒(3×109/ml)。動物免疫分組見說明書附圖表1，表2。表1為非特異性免疫組分組情況，表2為疫苗免疫組分組情況。
7、殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸對小鼠非特異性免疫應答的影響小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，分離血清，用以檢測各項免疫指標。
(1)IgG、IgA及IgM的測定含量實驗鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國Bethyl公司生產)作一抗，酶標羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，測定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
結果見說明書附圖3、圖4、圖5。從圖可見，小鼠在注射CpG寡聚核苷酸后，其血清中IgG、IgA、IgM含量比對照組有顯著增高。殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸后，雖然DNA用量僅為未包裝組的1/5，但免疫組血清中的IgG、IgA、IgM含量仍顯著提高，與對照組差異顯著(P＜0.05)。雖口服殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸組小鼠血清中IgG、IgA、IgM含量比對照組有顯著增高，但其CpG寡聚核苷酸的用量比肌注殼聚糖包裹組的用量高5倍。第6周大腸桿菌攻毒后，免疫組小鼠IgG、IgA、IgM較對照組血清中IgG、IgA、IgM含量有顯著增加。
(2)細胞因子的檢測小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實驗鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標板，兔抗鼠IL2、IL4、IL6 IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法檢測血清中IL2、IL4及IL6含量，觀測小鼠細胞免疫應答情況。
結果見說明書附圖6、圖7、圖8。由圖可知，含CpG基序的寡聚核苷酸免疫組小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量均較對照組明顯升高(P＜0.05)，殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸組與未包裹組相比，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量的提高幅度差異不顯著(P＞0.05)。口服殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸也能有效提高血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量，但口服組其CpG寡聚核苷酸的用量是肌注組的5倍。
(3)免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規法計白細胞總數；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計數中性粒細胞、單核細胞核、淋巴細胞。
結果見說明書附圖9、10、11、12。免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化是考察小鼠細胞免疫應答的一個重要指標。結果顯示CpG寡聚核苷酸免疫小鼠后，免疫小鼠外周血白細胞、單核細胞、淋巴細胞數量較對照組都有顯著增加，中性粒細胞在攻毒前也較對照組明顯升高，但攻毒后中性粒細胞數量則較對照組低；用殼聚糖納米微粒包裝CpG寡聚核苷酸后免疫小鼠，發現在使用DNA量上減少5倍的情況下，可以同樣達到提高免疫細胞數量的效果。
8、殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸對疫苗特異性免疫應答的調節(1)IgG、IgA及IgM的測定含量實驗鼠血清分別作105(IgG)和104(IgM、IgA)稀釋包被Costar酶標板，用特異性的兔抗鼠IgG、IgM和IgA重鏈抗體(美國Bethyl公司生產)作一抗，酶標羊抗兔IgG為二抗(華美生物工程公司)，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，測定小鼠血清中IgG、IgM和IgA含量。
結果見說明書附圖13、14、15。圖13、14、15顯示了CpG寡聚核苷酸與乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗免疫小鼠后，小鼠血清中免疫球蛋白的變化情況。結果表明在同時免疫了CpG寡聚核苷酸后，實驗動物的IgG、IgA、IgM含量比對照組有顯著提高。其中殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸后，再與乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合注射小鼠，結果顯示這種免疫方法雖然在DNA的使用量上只有未包裝組的1/5，但是可以協同疫苗免疫，其IgG、IgA、IgM含量較對照組明顯增加(P＜0.05)，與來包裝免疫組差異不顯著(p＞0.05)。口服與肌注殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸組血清中IgG、IgA、IgM含量增加幅度相似，但口服組DNA所需劑量大。
(2)特異性抗體的測定制備乙肝抗原、沙門氏菌抗原、大腸桿菌抗原包被Costar酶標板，實驗鼠血清100倍稀釋為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法測定小鼠血清中乙肝特異性抗體、傷寒特異性抗體、大腸桿菌特異性抗體含量。
結果見說明書附圖16、17、18。圖16、17、18顯示了乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗與相應CpG寡聚核苷酸聯合免疫動物后實驗動物特異性抗體變化情況。結果顯示動物在免疫一周后，就檢測到特異性抗體的產生；在同時免疫CpG寡聚核苷酸后，實驗小鼠的上述特異性抗體比對照組顯著提高(P＜0.05)。用殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸后與疫苗聯合注射免疫小鼠，在核酸用量僅為未包裝組1/5的情況下，CpG寡聚核苷酸對提高實驗動物對疫苗特異性免疫應答效果同樣顯著。其中肌肉注射方式對乙肝疫苗、傷寒疫苗特異性抗體地提升效果較好，而對于大腸桿菌特異性抗體增加則是口服免疫的方式稍好。
(3)細胞因子的檢測小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，實驗鼠血清100倍稀釋包被Costar酶標板，兔抗鼠IL2、IL4，IL6 IgG抗體(武漢博士德生物工程公司提供)為一抗，TMB(四甲基聯苯胺)為底物，SABC法檢測血清中IL2、IL4及IL6含量，觀測小鼠細胞免疫應答情況。
結果見說明書附圖19、20、21。結果顯示CpG寡聚核苷酸與乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合免疫小鼠后，小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6的含量較對照組高。用殼聚糖納米顆粒包裹含CpG基序的寡聚核苷酸組與未包裝組相比較，包裝的DNA只有未包裹組1/5的用量，但同樣起到了提升免疫小鼠血清中IL-2、IL-4和IL-6含量的作用。口服組與肌注組的差異不顯著(P＞0.05)。
(4)免疫小鼠外周血免疫細胞數量的動態變化小鼠免疫前及免疫后每周自尾靜脈采血，常規法計白細胞總數；血涂片Giemsa染色，鏡檢分類計數中性粒細胞、單核細胞核、淋巴細胞。
結果見說明書附圖22、23、24、25。用乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗聯合CpG寡聚核苷酸免疫小鼠，小鼠外周血免疫細胞數量的變化情況結果同樣發現口服和肌肉注射CpG寡聚核苷酸均對實驗小鼠外周血免疫細胞有較好的提升能力；只是攻毒后小鼠中性粒細胞數量較對照組稍低；免疫組小鼠白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞在免疫后14天達到了最高值，而單核細胞則是在免疫49天達到最高值。用殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸，不僅可以將DNA用量減少至未包裝用量的1/5，還有效增加了小鼠外周血免疫細胞數量。口服和肌肉注射的免疫方式均能有效增加免疫細胞的數量，但肌注的方式DNA用量較口服方式少4/5。
9、攻毒小鼠器官病變的檢測小鼠免疫35天后，以大腸桿菌K88和K99口服攻毒實驗小鼠，觀察小鼠的生長情況；49天時用常規方法對所有小鼠進行解剖，觀察各種器官的生理病變情況。
攻毒3周后剖解實驗小鼠發現，CpG寡聚核苷酸接種小鼠均健康存活，肝、脾、十二指腸、等消化道和呼吸道組織器官未出現明顯病變，而對照小鼠均發病，精神萎靡，被毛聳立，糞便稀軟，帶棕褐色；解剖觀察發現，對照組小鼠均出現以胃、十二指腸、空腸粘膜等處出血、肝脾腫大等為主的病變。
10、數據分析上述各種數據均用方差分析進行差異顯著性比較，以P＜0.05為差異顯著性標準。
CpG序列表<110>四川大學<120>含CpG基序的寡聚核苷酸抗感染基因制劑的制備及應用<160>1<210>1<211>88<212>DNA<213>人工序列<220>
<400>1cgagatctaa cgttgtcgtc gacgtcgtcg tcaggcctga cgttatcgat ggcgttgtcg 60tcaacgttgt cgttaacgtt agatctcg88
表1非特異性免疫小鼠分組
注CNP殼聚糖納米顆粒表2疫苗免疫小鼠分組
注CNP殼聚糖納米顆粒表3CpG體外刺激動物血液免疫細胞增殖反應結果(OD570)
權利要求
1.含CpG基序的寡聚核苷酸抗感染免疫制劑的制備及應用，其特點包括含CpG基序的寡聚核苷酸的人工合成、殼聚糖納米顆粒的制備、殼聚糖納米顆粒對含CpG基序的寡聚核苷酸的分子包裝及將此殼聚糖CpG納米顆粒免疫制劑應用于豬、黃牛、牦牛等動物抗感染增強機體免疫應答的技術。
2.根據權利要求1所述的CpG寡聚核苷酸抗感染免疫制劑的制備，其特征在于所述的免疫制劑的基質是人工合成的含有11個CpG特征序列、長度為88個堿基的寡聚核苷酸，其特點含有3個5’-AACGTT-3’，3個5’-GTCGTC-3’，1個5’-GACGTT-3’，1個5’-ATCGAT-3’，1個5’-GTCGTT-3’，1個5’-GGCGTT-3’，1個5’-GACGTC-3’的特征序列。
3.根據權利要求1所述的含CpG基序的寡聚核苷酸抗感染免疫制劑的制備，其特征在于所述的免疫制劑的包裹材料是分子量為150000，脫乙酰度95％以上的殼聚糖，用離子交聯法制備殼聚糖CpG納米顆粒分子。
4.使用權利要求1要求的殼聚糖包裝含CpG基序的寡聚核苷酸納米顆粒作為豬、黃牛、牦牛等動物新型抗感染分子免疫調節劑的應用技術，其特征在于以下幾方面(1)以小鼠為實驗動物，將制備的殼聚糖CpG寡聚核苷酸納米顆粒以兩種不同的投遞方式(口服和肌注)免疫，比較了不同免疫途徑對免疫效果的影響；(2)以制備的殼聚糖CpG寡聚核苷酸納米顆粒非特異性免疫實驗動物，結果表明殼聚糖CpG納米顆粒能有效提高實驗動物細胞和體液免疫水平，增強其非特異性免疫力；(3)以制備的殼聚糖CpG納米顆粒聯合疫苗(乙肝疫苗、傷寒疫苗及大腸桿菌疫苗)共免疫實驗動物，結果表明殼聚糖CpG寡聚核苷酸納米顆粒可顯著增強實驗動物對疫苗的細胞免疫和體液免疫應答反應。
全文摘要
該發明所屬技術領域1.生物技術，2.分子免疫學。本發明人工合成了能刺激豬、黃牛及牦牛等動物免疫細胞增殖活性的CpG寡聚核苷酸序列，并提供了包裝此段CpG DNA分子以制備抗感染基因納米顆粒制劑的方法，公開了該CpG納米顆粒作為新型抗感染分子免疫增強劑的應用技術。該方法包括利用分子量150000、脫乙酰度95％以上殼聚糖制備殼聚糖納米顆粒，納米顆粒分子包裝CpG寡聚核苷酸，將此制備的納米顆粒制劑以肌肉注射或口服的方式單獨或協同疫苗免疫實驗動物，提高實驗動物的特異性和非特異性細胞和體液免疫水平，提供了殼聚糖納米顆粒包裝CpG寡聚核苷酸作為豬、黃牛及牦牛等動物新型抗感染分子免疫增強劑的應用技術。
文檔編號A61K48/00GK1692943SQ20041004070
公開日2005年11月9日 申請日期2004年9月17日 優先權日2004年9月17日
發明者武梅, 高榮, 李惠, 付滿良, 吳凱源, 楊毅, 章歡, 程馳, 劉狄廣, 李化 申請人:四川大學