人結締組織生長因子突變體蛋白及其應用的制作方法

專利名稱：人結締組織生長因子突變體蛋白及其應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及生物工程技術領域，更具體地說，本發明涉及到對現有的人結締組織生長因子進行多點突變及相應篩選后得到的突變體蛋白。同時，本發明還涉及所述的突變體蛋白的藥學用途。
背景技術：
結締組織生長因子(CTGF)是一類屬于CCN家族的富含半胱氨酸(Cys)的生長因子，它具有多種生物學活性，包括促進細胞增殖、遷徙、粘附、胞外基質形成以及血管生成活性等功能，并且在某些特定條件下還具有促凋亡活性及抑有絲分裂活性。Bradham等人曾于1991年，在培養的靜脈內皮細胞(HUVECs)中，通過用PDGF抗血清與培養物中一個38kDa的多肽分子交聯，發現了人類CTGF的同源體，該蛋白由349個氨基酸組成，因其能在體外刺激成纖維細胞的有絲分裂及趨化性，故起名CTGF(Connective tissue growth factor)。本發明人曾成功地克隆到的一個CTGF基因(其5’端非編碼區具有特殊的序列，其基因庫登記號為A Y395801，中國專利號為ZL01107226.1)hCTGF基因定位于染色體6q23.1，長度大約為3kb，由5個外顯子和4個內含子組成(Fig.1)。外顯子I編碼一段長度為37個氨基酸的前導信號肽，其中34位的Cys對于CTGF從內質網(ER)到高爾基體(Golgi)的輸送是必需的。其余4個外顯子分別編碼4個執行不同功能的結構域，結構域I為IGFBD區域(insulin-like growth factor binding domain，胰島素樣生長因子結合區域)，該區域與6個經典的IGF結合蛋白(IGFBP1-6)N端半胱氨酸富含區有約32％的一致性，其中的GCGCCXXC基序為IGF結合位點；結構域II為VWC區域(Von Willebrand type C domain)，該區域也可見于Von Willebrand因子、粘蛋白、血小板反應素及膠原蛋白中，可能與寡聚化反應有關，尤其可能與介導CTGF二聚體復合物的形成有關；結構域III為TSP1區域(thrombospondin type 1 repeat domain)，該區域含有一個WSXCSXXCG基序，可能是硫化糖綴合物結合位點，因此該區域可能與細胞粘附有關；結構域IV為CT區域(C-rich domain)，該區域的10個半胱氨酸中的6個形成了半胱氨酸結(cystine knot)，這種結構同樣也見于NGF、TGF-β、PDGF中，可能與受體結合活性有關，因此，結構域IV可能同時具有二聚化和受體結合區域。
目前，已在5種哺乳動物(人、小鼠、大鼠、豬、牛)及2種兩棲類動物(青蛙及非洲爪蟾)中發現了CTGF的cDNA。編碼的CTGF蛋白長度從343-349個氨基酸不等(其中hCTGF為349個氨基酸殘基)，其中前22-27殘基為信號肽序列。CTGF蛋白序列除信號肽部份外，可達到90％的高度保守性，而在信號肽區域僅有60-65％的同源性。
CTGF可在多種細胞知成纖維細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、上皮細胞、軟骨細胞、成膠質細胞瘤細胞中表達。當受創傷刺激或某些細胞因子如TGF-β及BMP-2(骨形態蛋白2)的信號刺激時，以即刻早期基因產物形式被迅速合成分泌，作用于多種細胞，以調控細胞周期并作用于胞外基質(ECM)的方式調控細胞的功能，從而促進細胞的增殖和粘附、增強炎性細胞的趨化性[10-12]。此外，CTGF還可表現為促凋亡活性及抑有絲分裂活性，并可與其它生長因子發揮協同作用。因此，CTGF可以參與多種生理學過程，如血管生成、胚胎發育和分化、骨骼形成/再生、女性子宮及卵巢的功能再生、創傷愈合、肢體再生、器官移植等；另一方面，CTGF的過度表達可能在纖維化過程(尤其是依賴于TGF-β過量刺激的纖維化過程)中具有一定的作用，這些病理過程可能導致某些纖維化疾病的形成。
由于CTGF的這些生理學特性及生物學功能，使得CTGF在各類創傷修復，包括外傷修復、軟骨形成、角膜再生修復等方面較好的應用潛力。近年來，有關該因子在各類創傷修復等方面已積累了許多資料，從各方面為CTGF做為創傷治療的細胞因子藥物提供了明確的證據，具體體現在(1)CTGF可以增強血小板的生物學活性，使創傷表面迅速止血；(2)增強巨噬細胞和白細胞的趨化作用，清除傷口內的壞死組織和細菌等；(3)促進創傷表面的毛細血管上皮細胞和平滑肌細胞的生長；(4)促進成纖維細胞分化及活性，并調節創傷部位的纖維修復；(5)在整體上促進和加快創傷組織的修復。
但是，盡管CTGF具有這些生物學活性，但由于其復雜的結構特征及其相關的生物學性質，使得它至今尚未進入臨床應用。其具體原因為第一，人體產生的CTGF分子結構中具有37個半胱氨酸，其極易形成多肽鏈中的二硫鍵，從而導致在原核表達系統或真核系統中制備重組CTGF時形成大量的不溶性蛋白包涵體，因此，在制備重組CTGF過程中形成較大的技術障礙，使得CTGF的規模化生產難以實現；第二，目前在有關CTGF的生物學活性研究中，實驗表明，其無論以體外人工表達的形式還是體內的自體表達形式，均呈現其生物活性的不穩定性，這表現在CTGF的重組表達蛋白分子活性在組織培養檢測體系中無明顯的促細胞增殖活性，以及在體內的CTGF分子表達增加時導致某些組織的纖維增生過度；第三，迄今尚無資料介紹有關CTGF或其突變體進行動物藥效學的研究，更無有關CTGF或其突變體的藥物制劑型或用于靈長類的創傷修復研究及相關的安全性實驗。

發明內容
本發明的目的是提供一種人結締組織生長因子突變體蛋白(簡稱rhCTGF)。該突變體蛋白是對前述的本發明人已克隆到的結締組織生長基因進行多點突變，并根據這些突變產物的生物學性質進行相應篩選，挑取具有較高生物學活性和在創傷修復過程中具有較好的促纖維形成及其調節作用的rhCTGF突變體。
同時，本發明的另一個目的是在前期研究工作基礎上，針對其建立完整的生物學活性檢測體系，并進行詳細的藥效學、藥理學、毒理學及藥劑學分析，完成該rhCTGF突變體做為創傷治療用藥物的臨床前研究，為其最終作為可用于臨床的治療性生物制劑而提供基礎。
本發明的目的通過下述技術方案予以實現。
本發明從CTGF分子結構的改變入手，以在一定程度上調整CTGF的生物學性質，即是為將CTGF作為具有臨床應用意義的生物制劑而進行的結構改造研究工作。本發明的突變主要集中于結構域II和結構域III，因為這兩個結構部位具有CTGF與細胞粘附相關的功能，對其的結構調整，有可能控制CTGF與細胞相關信號分子的結合，從而穩定CTGF的生物學活性，降低CTGF可能引起的纖維增生過度的作用。同時在體外細胞培養體系中，表現較穩定的促細胞增殖作用。
本發明提供了一種人結締組織生長因子突變體蛋白，其序列特征為①具有七個氨基酸的修飾突變，其分別為CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→絲氨酸；第115位的絲氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的絲氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸；而且②核苷酸序列和人結締組織生長因子突變體蛋白序列描述如下核苷酸序列1ATG ACA GCT GCA AGT ATG GGT CCA GTT CGA GTA GCT TTT GTA GTA CTT49 CTA GCA CTT TGT AGT CGT CCT GCA GTA GGT CAA AAT TGT AGT GGA CCT97 TGT CGA TGT CCA GAT GAA CCT GCA CCT CGA TGT CCA GCA GGT GTA AGC145 TTC GTG CTG GAC GGC TGC GGC TGC TGC CGC GTC TGC GCC AAG CAG CTG193 GGC GAG CTG TGC ACC GAG CGC GAC CCC TGC GAC CCG CAC AAG GGC CTC241 TTC AGT GAC TTC GGC TCC CCG GCC AAC CGC AAG ATC GGC GTG TGC ACC289 GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACC GTG TAC CGC AGC337 GGA GAG TTC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACG TGC CTG GAC385 GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG GAC GTT CGT CTG CTC433 AAC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC AAG CTG CCC GGG AAA TGC
481CGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAA CTC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG529CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTC GAG GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA577ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC CAG ACC ACA GAG TGG AGC GCC625TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC673AAC GCC TCC TGC AGG CTA GAG AAG CAG AGC CGC CTG TGC ATG GTC AGG721CCT TGC GAA GCT GAC CTG GAA GAG AAC ATT AAG AAG GGC AAA AAG TGC769ATC CGT ACT CCC AAA ATC TCC AAG CCT ATC AAG TTT GAG CTT TCT GGC817TGC ACC AGC ATG AAG ACA TAT CGA GCT AAA TTC TGT GGA GTA TGT ACC865GAC GGC CGA TGC TGC ACC CCC CAC AGA ACC ACC ACC CTG CCG GTG GAG913TTC AAG TGC CCT GAC GGC GAG GTC ATG AAG AAG AAC ATG ATG TTC ATC961AAG ACC TGT GCC TGC CAT TAC AAC TGT CCC GGA GAT AAT GAC ATC TTT1009 GAA TCG CTG TAC TAC AGG AAG ATG TAC GGA GAC ATG GCA人結締組織生長因子突變體蛋白序列1 MTAASMGPVR VAFVVLLALC SRPAVGQNCS GPCRCPDEPA PRCPAGVSFV51LDGCGCCRVC AKQLGELCTE RDPCDPHKGL FSDFGSPANR KIGVCTAKDG101 APCIFGGTVY RSGEFFQSSC KYQCTCLDGA VGCMPLCSMD VRLLNPDCPF151 PRRVKLPGKC REEWVCDELK DQTVVGPALA AYRLEDTFGP DPTMIRANCL201 VQTTEWSACS KTCGMGISTR VTNDNASCRL EKQSRLCMVR PCEADLEENI251 KKGKKCIRTP KISKPIKFEL SGCTSMKTYR AKFCGVCTDG RCCTPHRTTT301 LPVEFKCPDG EVMKKNMMFI KTCACHYNCP GDNDIFESLY YRKMYGDMA本發明人結締組織生長因子突變體蛋白的制備方法包括以下步驟(1)設計了七個氨基酸的修飾突變，其分別為CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→絲氨酸；第115位的絲氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的絲氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸；(2)設計了6對突變引物，使用QuikChange突變試劑盒，對pET-CTGF質粒分別進行突變操作，其引物分別為m15′_AggTgTAAgCCTCgTgCTggACgg_3′m25′_AgggCCTCTTCTgTgACTTCggCTCC_3′m35′_AgCggAgAgTCCTTCCAgAgCAgC_3′m45′_gTTCgTCTgCCCAgCCCTgAgTgCC_3′
m55′_CgggAAATgCTgCgAggAgTgggT_3′m65′_gTgTgACgAACCCAAggACCAAA_3′(3)依照QuikChange突變試劑盒操作指南將純化的pET-CTGF質粒40ng與ml引物，正鏈及其互補鏈各125ng，dNTP1μl、反應緩沖液5μl，及2.5單位PfuTutbo DNA聚和酶混合，在50μl反應體系中以95℃30″→55℃60″→68℃6′的程序循環12次。反應完成后降溫至37℃，加入DpnI孵育1hr，消化未突變的模版鏈。轉化XL1-Blue超級感受態細胞，培養并挑取陽性克隆，測序驗證；同法完成m2-m6點突變。
(4)根據常規分子克隆的操作方法，將上述突變修飾后的基因以酶切-連接的方式插入載體質粒，并在該基因前以突變方式插入序列片段-ATG GCT AGCATG ACT GGT GGA CAG CAA ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCC ATG GCT GAT ATC，以保證該基因的表達產物能夠通過腸激酶酶切得以純化。
有益效果(1)本發明在對CTGF蛋白進行了全面的結構分析后，對其基因進行了多點突變。獲得了較高生物學活性及較好穩定性的CTGF突變體，使之在所選擇的原核表達體系獲得較高的表達量，并易于純化，同時，得到了具有較好臨床應用意義的CTGF突變體分子；(2)根據CTGF結構特征分析，針對其37個半胱氨酸所形成靶蛋白空間結構中較多的二硫鍵而導致蛋白可溶性降低的情況，在確保表達rhCTGF突變體的基本構象的前提下，設計了七個氨基酸的修飾突變，從而在一定程度上改變表達靶蛋白的構象，使之表達量增加，并增加可溶性蛋白的比例，最重要的是，這七個氨基酸的突變，使得表達的CTGF具有穩定的體外生物學活性，及在藥效學研究中所表現的對創傷處纖維形成的調節作用。


從下面給出的說明結合附圖，本發明的目的及特征將更加清楚明了。
圖1是突變修飾后的pET-CTGF原核表達情況，pET-CTGF質粒轉化BL-21宿主菌后，經IPTG誘導可穩定表達CTGF突變體蛋白；圖2是CTGF突變體原核表達蛋白分布分析，顯示CTGF突變體原核表達蛋白30％為可溶性蛋白，但大部分仍以不可溶性蛋白存在；圖3是CTGF突變體蛋白的免疫印記分析，顯示CTGF突變體蛋白保持了原有的免疫原性；圖4是CTGF突變體蛋白的生物學活性分析(MTT法)，表明CTGF突變體蛋白仍然保持了原有的生物活性；圖5是突變后的CTGF與未突變CTGF的生物學活性的差異分析，表明CTGF突變體蛋白生物學活性已有明顯提高；圖6(A)是顯示大鼠創傷模型CTGF突變體蛋白受試組，創面被再生上皮覆蓋，真皮肉牙組織纖維化間質密，膠原纖維多；圖6(B)是顯示大鼠創傷模型對照組，真皮壞死，滲出組織的圖；圖6(C)是顯示大鼠創傷模型bFGF受試組，肉芽組織與纖維化纖維母細胞變長，有膠原纖維形成；注圖6(A)-圖6(C)系光鏡照片，HE染色，×100倍。
圖7(A)是顯示大鼠創傷模型CTGF突變體蛋白受試組，纖維排列精密、整齊；圖7(B)是顯示大鼠皮膚損傷模型，纖維排列紊亂；圖8(A)是顯示恒河猴創傷模型CTGF突變體蛋白受試組，纖維排列精密、整齊；圖8(B)是顯示恒河猴皮膚損傷模型，纖維排列紊亂；注圖7(A)-圖8(B)系掃描電鏡照片，×7000倍。
具體實施例方式
在下面的實施例中對本發明作進一步說明，但這并不限制本發明的范圍。
實施例1(1)對原有的人結締組織生長因子，設計了七個氨基酸的修飾突變，其分別為CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→絲氨酸；第115位的絲氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的絲氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸；(2)設計了6對突變引物，使用QuikChange突變試劑盒，對pET-CTGF質粒分別進行突變操作，其引物分別為m15′_AggTgTAAgCCTCgTgCTggACgg_3′m25′_AgggCCTCTTCTgTgACTTCggCTCC_3′m35′_AgCggAgAgTCCTTCCAgAgCAgC_3′m45′_gTTCgTCTgCCCAgCCCTgAgTgCC_3′m55′_CgggAAATgCTgCgAggAgTgggT_3′m65′_gTgTgACgAACCCAAggACCAAA_3′依照QuikChange突變試劑盒操作指南將純化的pET-CTGF質粒40ng與m1引物，正鏈及其互補鏈各125ng，dNTP1μl、反應緩沖液5μl，及2.5單位PfuTutbo DNA聚和酶混合，在50μl反應體系中以95℃30″→55℃60″→68℃6′的程序循環12次。反應完成后降溫至37℃，加入DpnI孵育1hr，消化未突變的模版鏈。轉化XL1-Blue超級感受態細胞，培養并挑取陽性克隆，測序驗證；同法完成m2-m6點突變。
實施例2pET-CTGF表達載體改造。設計一條突變引物5-ATG GCT AGC ATGACT GGT GGA CAG CAA ACC GAC GAC GAC GAC AAG GCC ATG GCT GAT ATC-3，其中包含了一個腸激酶酶切序列，并使其保證在改造pET-CTGF載體時，仍然維持pET-28a的讀碼框架，該序列插入在CTGF編碼區起始子ATG之前的幾個氨基酸位置。以保證該基因的表達產物能夠通過腸激酶酶切得以純化，使表達蛋白在腸激酶酶切后產生在N-末端僅帶5個額外氨基酸的CTGF蛋白。
實施例3根據突變結果，對該CTGF突變體的表達情況，表達產物的免疫學原性，生物學活性進行了全面分析，試驗內容及結果如下。
(1)突變后的pET-CTGF質粒轉化BL-21宿主菌，設置不同條件檢測其表達情況，其條件為(1)0.5umol IPTG，1umol IPTG，2UMOL IPTG；(2)培養溫度的改變30℃，200rpm過夜，轉為37℃，200rpm誘導；30℃，200rpm過夜，30℃，200rpm誘導；37℃，200rpm過夜，37℃，200rpm誘導；其結果參見圖1.經比較確定了37℃，200rpm過夜，1umol IPTG，37℃，200rpm誘導培養條件。同時，對表達的突變體靶蛋白進行了分布分析，結果參見圖2.
試驗結果說明，經突變后的CTGF突變體表達蛋白已有30％的比例為可溶性蛋白，但大部分仍以不可溶性蛋白存在。因而其純化系統仍需考慮靶蛋白的溶解和復性步驟。總體看來，突變修飾后的pET-CTGF的表達量已有較大幅度的提高，達到總菌蛋白的20％。
(2)突變修飾后的pET-CTGF表達蛋白的免疫原性分析為確定所設計的突變未影響CTGF的基本結構，利用購自博士德生物工程有限公司的抗CTGF標準抗體，并使用購自Biovendor公司的CTGF標準品對上述突變修飾后的pET-CTGF突變體表達蛋白進行了Western blot分析，其操作方法按標準程序，其結果參見圖3。
Western blot實驗證明，經改造后的CTGF突變體表達蛋白仍然保持了原有的免疫原性。
(3)突變修飾后的pET-CTGF表達蛋白初純后的生物學活性分析為確定經突變后的CTGF突變體表達蛋白仍然具有原有的生物活性，我們根據前期基礎工作中的活性檢測方法，對初步純化的CTGF突變體蛋白進行了活性檢測，方法同樣用MTT法，其結果參見圖4。
MTT檢測證明，經突變后的rhCTGF突變體表達蛋白仍然保持了原有的生物活性。利用MTT檢測分析了突變后的CTGF與未突變CTGF的生物學活性的差異，其結果表明，突變后的CTGF生物學活性已有明顯提高，其ED50＝1.15ng.而突變前CTGF的ED50＝1.45ng。其結果參見圖5.
(4)rhCTGF藥劑學處方研究根據藥效學研究的結果，確定了rhCTGF的臨床應用方式為局部外用。因CTGF為蛋白質多肽類，穩定性相對較差，故以凍干劑型制備而成；經過對動物臨床藥效、制品穩定性等方面指標的分析，最終確定了用于創傷局部使用的rhCTGF制劑處方。每個劑量的組成為rhCTGF2500ng(2500IU)；甘露醇50mg，注射用水1ml。
rhCTGF突變體藥效學研究基于rhCTGF突變體制品在體外實驗中所表現的生物學活性，根據藥學研究的規定，對rhCT6F突變體制品在不同動物創傷模型中所表現的創傷治療作用進行定性定量的研究分析。所使用的實驗動物包括兩類其一是常規藥學實驗所要求的SD大鼠；其二是靈長類動物恒河猴。創傷模型均為動物背部雙側深II度燙傷。藥效分析指標為創面面積及愈合時間；創面組織光學顯微鏡檢測；創面組織掃描電鏡檢測；流式細胞儀檢測細胞生長周期，并由統計學分析方法得出最終結果。
rhCTGF突變體制品促進大鼠燙傷創面愈合實驗SD大鼠由東南大學動物中心提供，動物質量合格證號為97004，實驗環境合格證號為蘇動[環]97008。實驗前一周領取，雌雄各半，體重180-220g，實驗時動物室溫度15-22℃，相對濕度50-70％。
將受試鼠隨機分為受試藥組(CTGF突變體給藥量為100ng/創面)、陽性藥對照組(rhbFGF 250u/創面)和自體對照組，每組8只，單籠喂養。各組動物左右兩側皮膚分別以電燙儀制備深II度燙傷模型，每只背部雙側各設一個創傷面。造模后次日起開始給藥，另一側給等量生理鹽水，每日一次，共14天。每日觀察創面愈合狀況并拍照后行圖像分析，給藥第15天時取愈合組織行光鏡、電鏡觀測并分離細胞行細胞周期檢測。實驗結果表明在大鼠創傷模型的CTGF突變體治療過程中，給藥后第15天時，給藥組動物的受試側創面相對愈合面積與同組對照側差異顯著；創面愈合速度由快至慢分別為rhCTGF突變體、rhbFGF。創面完全脫痂時取組織進行光學顯微鏡觀察并評分發現，受試側與對照側相比差異顯著；掃描電鏡檢測反應受試側纖維排列明顯較對照側更近似于正常皮膚；流式細胞儀檢測結果顯示，受試側細胞G1期較對照側短，并有顯著差異，實驗結果參見附表1.1-1.6，圖6(A)～圖7(B)。提示局部應用rhCTGF突變體可促進受試大鼠深II度燙傷創面的愈合，并明顯縮短創面愈合的時間。
rhCTGF突變體制品促進恒河猴燙傷創面愈合實驗選用的靈長類動物-恒河猴由中國醫學科學院醫學生物學研究所靈長類中心提供，動物質量合格證為滇實動證D2000005，實驗環境合格證號為滇實動證D2000005。雌雄各半，體重4-4.5Kg，單籠喂養，自由飲水，飲食，實驗時動物室溫度21-23℃，相對濕度44-65％。
將受試猴隨機分受試藥組(1100ng/創面)、陰性對照組和陽性對照組(rhbFGF 250u/創面)。每只動物背部以電燙儀制備深II度燙傷模型，雙側各三個創傷面，燙傷次日起始給受試藥，陰性對照采用等量生理鹽水。每日觀察創面愈合狀況并拍照后行圖像分析，給藥18天時取愈合組織行光鏡、電鏡檢測并分離細胞行細胞周期檢測。結果表明，在恒河猴創傷后局部用藥的第18天，受試動物的受試側面相對愈合面積與同組對照側差異顯著；同時受試側創面相對愈合周期與同組對照側差異顯著；掃描電鏡可見受試側纖維排列明顯較對照側更近似于正常皮膚，這提示局部應用rhCTGF可促進恒河猴深II度燙傷創面愈合，縮短創面愈合的時間，結果詳見表2.1-2.6，圖8(A)～圖8(B)。
在上述應用rhCTGF突變體的大鼠及恒河猴創傷治療藥學研究中，選用了作為基因工程產品的上市藥物bFGF作為陽性對照。bFGF的生物學活性主要表現為刺激成纖維細胞的增生，因而可促進創傷的修復，其在創傷臨床治療中意義已被明確，并已作為商品化藥物被廣泛使用。與bFGF相比較，rhCTGF突變體具有更為廣泛的生物學活性，它除了可以促進成纖維細胞的增殖之外，還具有刺激血管內皮細胞、上皮細胞、細胞外基質的活性及增生的能力，尤其是具有針對創傷修復過程中纖維修復的調節作用，因此，在促進創傷修復的治療過程中，其具有突出的調節創傷組織纖維疤痕形成的作用，避免了創傷修復過程中通常存在的疤痕形成這一生理學的結果，上述藥學研究中針對創傷組織的修復過程使用rhCTGF突變體調節其纖維形成作用的電鏡分析明確地證實了這一點。
因此，臨床前實驗已表明，rhCTGF突變體具有較好的促創傷修復活性和安全性，可以作為創傷修復治療制劑用于創傷修復的臨床試驗治療。
序列表1.結締組織生長因子突變體蛋白核苷酸序列SEQ ID NO11 ATG ACA GCT GCA AGT ATG GGT CCA GTT CGA GTA GCT TTT GTA GTA CTT49 CTA GCA CTT TGT AGT CGT CCT GCA GTA GGT CAA AAT TGT AGT GGA CCT97 TGT CGA TGT CCA GAT GAA CCT GCA CCT CGA TGT CCA GCA GGT GTA AGC145TTC GTG CTG GAC GGC TGC GGC TGC TGC CGC GTC TGC GCC AAG CAG CTG193GGC GAG CTG TGC ACC GAG CGC GAC CCC TGC GAC CCG CAC AAG GGC CTC241TTC AGT GAC TTC GGC TCC CCG GCC AAC CGC AAG ATC GGC GTG TGC ACC289GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACC GTG TAC CGC AGC337GGA GAG TTC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACG TGC CTG GAC385GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG GAC GTT CGT CTG CTC433AAC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC AAG CTG CCC GGG AAA TGC481CGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAA CTC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG529CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTC GAG GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA577ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC CAG ACC ACA GAG TGG AGC GCC625TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC673AAC GCC TCC TGC AGG CTA GAG AAG CAG AGC CGC CTG TGC ATG GTC AGG721CCT TGC GAA GCT GAC CTG GAA GAG AAC ATT AAG AAG GGC AAA AAG TGC769ATC CGT ACT CCC AAA ATC TCC AAG CCT ATC AAG TTT GAG CTT TCT GGC817TGC ACC AGC ATG AAG ACA TAT CGA GCT AAA TTC TGT GGA GTA TGT ACC865GAC GGC CGA TGC TGC ACC CCC CAC AGA ACC ACC ACC CTG CCG GTG GAG913TTC AAG TGC CCT GAC GGC GAG GTC ATG AAG AAG AAC ATG ATG TTC ATC961AAG ACC TGT GCC TGC CAT TAC AAC TGT CCC GGA GAT AAT GAC ATC TTT1009 GAA TCG CTG TAC TAC AGG AAG ATG TAC GGA GAC ATG GCA2.結締組織生長因子突變體蛋白序列SEQ ID NO21MTAASMGPVR VAFVVLLALC SRPAVGQNCS GPCRCPDEPA PRCPAGVSFV51 LDGCGCCRVC AKQLGELCTE RDPCDPHKGL FSDFGSPANR KIGVCTAKDG101 APCIFGGTVY RSGEFFQSSC KYQCTCLDGA VGCMPLCSMD VRLLNPDCPF151 PRRVKLPGKC REEWVCDELK DQTVVGPALA AYRLEDTFGP DPTMIRANCL201 VQTTEWSACS KTCGMGISTR VTNDNASCRL EKQSRLCMVR PCEADLEENI251 KKGKKCIRTP KISKPIKFEL SGCTSMKTYR AKFCGVCTDG RCCTPHRTTT301 LPVEFKCPDG EVMKKNMMFI KTCACHYNCP GDNDIFESLY YRKMYGDMA
表1.1 rhCTGF對大鼠皮膚創面愈合面積的影響

x±sd，組內Student t檢驗，*p＜0.05表1.2 rhCTGF對大鼠II度燙傷創面愈合面積的影響Δ％

x±sd，組內Student t檢驗，*p＜0.05**p＜0.01
表1.3 rhCTGF對創面面積愈合60％時間的影響

表1.5 電鏡觀察rhCTGF對創面細胞及纖維的影響

表1.4 rhCTGF對創面愈合的組織學影響

x±sd，組內Student t檢驗，*p＜0.05
表1.6 rhCTGF對創面愈合細胞的細胞周期的影響

x±sd，組內配對Student t檢驗，*p≤0.05
表2.1 rhCTGF對獼猴皮膚創面愈合面積的影響

表2.2 rhCTGF對獼猴皮膚創面愈合周長的影響

表2.3 rhCTGF對獼猴II度燙傷創面愈合面積的影響Δ％

表2.4 rhCTGF對獼猴II度燙傷創面愈合周長的影響Δ％

表2.5 rhCTGF對創面面積愈合60％時間的影響

表2.6 rhCTGF對創面周長愈合60％時間的影響

權利要求
1.一種人結締組織生長因子(CTGF)突變體蛋白，其序列特征為在CTGF蛋白序列中具有七個氨基酸的修飾突變，該類突變為相應位置上的氨基酸的非特定置換。該突變體蛋白序列描述如下1 MTAASMGPVR VAFVVLLALC SRPAVGQNCS GPCRCPDEPA PRCPAGVSFV51LDGCGCCRVC AKQLGELCTE RDPCDPHKGL FSDFGSPANR KIGVCTAKDG101APCIFGGTVY RSGEFFQSSC KYQCTCLDGA VGCMPLCSMD VRLLNPDCPF151PRRVKLPGKC REEWVCDELK DQTVVGPALA AYRLEDTFGP DPTMIRANCL201VQTTEWSACS KTCGMGISTR VTNDNASCRL EKQSRLCMVR PCEADLEENI251KKGKKCIRTP KISKPIKFEL SGCTSMKTYR AKFCGVCTDG RCCTPHRTTT301LPVEFKCPDG EVMKKNMMFI KTCACHYNCP GDNDIFESLY YRKMYGDMA
2.權利要求1所述及的人結締組織生長因子突變體蛋白的編碼基因，其序列特征為在七個氨基酸的編碼子結構上具有非特定的堿基置換，同時，在編碼區第1-100位堿基上進行了密碼簡并性置換修飾，其序列描述如下1ATG ACA GCT GCA AGT ATG GGT CCA GTT CGA GTA GCT TTT GTA GTA CTT49CTA GCA CTT TGT AGT CGT CCT GCA GTA GGT CAA AAT TGT AGT GGA CCT97TGT CGA TGT CCA GAT GAA CCT GCA CCT CGA TGT CCA GCA GGT GTA AGC145TTC GTG CTG GAC GGC TGC GGC TGC TGC CGC GTC TGC GCC AAG CAG CTG193GGC GAG CTG TGC ACC GAG CGC GAC CCC TGC GAC CCG CAC AAG GGC CTC241TTC AGT GAC TTC GGC TCC CCG GCC AAC CGC AAG ATC GGC GTG TGC ACC289GCC AAA GAT GGT GCT CCC TGC ATC TTC GGT GGT ACC GTG TAC CGC AGC337GGA GAG TTC TTC CAG AGC AGC TGC AAG TAC CAG TGC ACG TGC CTG GAC385GGG GCG GTG GGC TGC ATG CCC CTG TGC AGC ATG GAC GTT CGT CTG CTC433AAC CCT GAC TGC CCC TTC CCG AGG AGG GTC AAG CTG CCC GGG AAA TGC481CGC GAG GAG TGG GTG TGT GAC GAA CTC AAG GAC CAA ACC GTG GTT GGG529CCT GCC CTC GCG GCT TAC CGA CTC GAG GAC ACG TTT GGC CCA GAC CCA577ACT ATG ATT AGA GCC AAC TGC CTG GTC CAG ACC ACA GAG TGG AGC GCC625TGT TCC AAG ACC TGT GGG ATG GGC ATC TCC ACC CGG GTT ACC AAT GAC673AAC GCC TCC TGC AGG CTA GAG AAG CAG AGC CGC CTG TGC ATG GTC AGG721CCT TGC GAA GCT GAC CTG GAA GAG AAC ATT AAG AAG GGC AAA AAG TGC769ATC CGT ACT CCC AAA ATC TCC AAG CCT ATC AAG TTT GAG CTT TCT GGC817TGC ACC AGC ATG AAG ACA TAT CGA GCT AAA TTC TGT GGA GTA TGT ACC865GAC GGC CGA TGC TGC ACC CCC CAC AGA ACC ACC ACC CTG CCG GTG GAG913TTC AAG TGC CCT GAC GGC GAG GTC ATG AAG AAG AAC ATG ATG TTC ATC961AAG ACC TGT GCC TGC CAT TAC AAC TGT CCC GGA GAT AAT GAC ATC TTT1009GAA TCG CTG TAC TAC AGG AAG ATG TAC GGA GAC ATG GCA
3.包含權利要求2所述人結締組織生長因子編碼基因的，經特定構建的重組表達載體，其特征包括權利要求2的基因序列和具有易于純化該基因表達產物的特定酶切位點的編碼序列。
4.一種權利要求1所述的人結締組織生長因子突變體蛋白在制備修復治療創傷的藥中的應用。
5.權利要求1所述的人結締組織生長因子突變體蛋白以安全有效量與甘露醇，特定緩沖系統按比例配成的凍干藥物組合物。
全文摘要
本發明公開了一種人結締組織生長因子突變體蛋白及其應用，其序列特征為①具有七個氨基酸的修飾突變，其分別為CTGF第49位的亮氨酸→苯丙氨酸；第82位半胱氨酸→絲氨酸；第115位的絲氨酸→精氨酸；第144位的脯氨酸→蛋氨酸；第145位的絲氨酸→天冬酰氨；第161位的半胱氨酸→精氨酸；第169位的脯氨酸→蛋氨酸。同時，本發明在前期研究工作基礎上，針對其建立完整的生物學活性檢測體系，并進行詳細的藥效學、藥理學、毒理學及藥劑學分析，完成該rhCTGF突變體做為創傷治療用藥物的臨床前研究，為其最終作為可用于臨床的治療性生物制劑而提供基礎。
文檔編號A61P27/02GK1657539SQ200410079560
公開日2005年8月24日 申請日期2004年11月12日 優先權日2004年11月12日
發明者李琦涵, 董承紅, 劉龍丁, 趙紅玲, 王麗春, 姜莉, 馬紹輝, 王晶晶, 趙樹棟, 廖蕓, 王烔, 和邵清 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所