遞送胸腺素β4、類似物、同工型和其它衍生物的組合物和方法

專利名稱：遞送胸腺素β4、類似物、同工型和其它衍生物的組合物和方法
技術領域：
本發明涉及用于遞送多肽藥物的組合物和方法領域。
背景技術：
多肽藥物在治療各種疾病方面可以成為極其有效的藥劑。由于多肽藥物的生產非常昂貴，因此本領域中需要用于遞送多肽藥物的改進組合物和方法。

發明內容
根據本發明，組合物包含基本純化的組分，所述基本純化的組分包括粘合劑和包含氨基酸序列LKKTET或其保守變體的多肽。遞送多肽至一定部位的方法包括將上述組合物引入所述部位。
具體實施例方式
本發明提供利用包含氨基酸序列LKKTET或其保守變體的肌動蛋白螯合肽如胸腺素β4(Tβ4)和其它肌動蛋白螯合肽或肽片段的組合物和方法。所包括的是N-或C-端變體，如KLKKTET和LKKTETQ。這些肽和肽片段在促進傷口愈合和其它生理用途方面有用。
胸腺素β4最初被鑒定為體外內皮細胞遷移和分化過程中上調的蛋白質。胸腺素β4為在多種組織中鑒定到的43個氨基酸、4.9kDa的普遍存在的多肽。該蛋白質的幾種功能包括在內皮細胞分化和遷移、T細胞分化、肌動蛋白螯合(actin sequestration)和血管形成期間的作用。
胸腺素β4是在多種組織和細胞類型中發現的高度保守的極性5-kDa多肽的β-胸腺素家族成員。最初純化自胸腺并認為是胸腺激素的胸腺素β4隨后被發現參與多種生化過程。作為主要的G-肌動蛋白螯合肽，其在細胞增殖、遷移和分化期間對肌動蛋白組裝的調節發揮重要作用。大量研究表明胸腺素β4對癌變、炎癥、血管生成和創傷愈合起調節作用。發現胸腺素β4表達通過基于肌動蛋白的細胞骨架組構來調節癌細胞系中的致腫瘤性和轉移活性。發現胸腺素β4在形成管的內皮細胞中增高；這增加內皮細胞的附著、擴散和遷移，從而促進血管生成。還發現胸腺素β4在潰瘍提取物和傷口流體中以高濃度存在，并被認為作為抗菌因子起作用。胸腺素β4在傷口愈合中的刺激作用在一些動物模型研究中得以證實。當局部加入或腹腔內施用時，胸腺素β4在大鼠全層厚度模型中增強皮膚創傷的愈合。還在db/db糖尿病小鼠、類固醇免疫抑制小鼠和老年小鼠中觀察到胸腺素β4加速皮肽創傷愈合的能力。還表明胸腺素β4加速燒傷后角膜上皮的愈合，并下調多種減輕炎癥反應的角膜細胞因子和趨化因子。
血管損傷時凝血級聯系統的激活導致將纖維蛋白原轉化為纖維蛋白的凝血酶生成。纖維蛋白自發聚合形成封閉受損部位的血栓，從而防止血液流失。纖維蛋白還作為臨時基質，隨后的創傷愈合過程中，各種細胞類型附著于其上、遷移和分化，將纖維蛋白替換為正常組織。作為血漿谷氨酰胺轉移酶的因子XIIIa共價交聯纖維蛋白栓以增強其結構。而且，因子XIIIa還將可調節纖維蛋白基質性質的大量生理活性蛋白質交聯到纖維蛋白上。例如，共價引入α2-抗纖維蛋白溶酶增加基質抗纖維蛋白溶解性，而引入纖連蛋白可影響基質支撐細胞附著和遷移的能力。組織谷氨酰胺轉移酶可選擇性引入胸腺素β4到纖維蛋白中。
胸腺素β4是組織谷氨酰胺轉移酶的特異性底物，可以通過組織谷氨酰胺轉移酶選擇性地交聯到膠原、肌動蛋白、纖維蛋白原和纖維蛋白、同樣參與上述過程的蛋白質。在以凝血酶活化血小板之后，胸腺素β4以時間和鈣依賴性方式釋放并交聯到纖維蛋白上。血小板因子XIIIa由受刺激的血小板共釋放。血小板釋放的胸腺素β4與纖維蛋白的交聯似乎由因子XIIIa介導，提供了提高血塊和組織損傷部位附近的胸腺素β4局部濃度的機制，以促進傷口愈合、血管生成和炎性反應。
纖維蛋白原是含有兩個相同亞單元的化學二聚物，其中每一個均由通過大量二硫鍵結合在一起的三條多肽鏈Aα、Bβ和γ組成。所有六條鏈的二硫鍵合NH2端部分形成中央E區，而COOH端部分形成兩端的D區和兩個αC域。當纖維蛋白原轉化為纖維蛋白時，凝血酶介導的NH2端血纖維蛋白肽A和B從纖維蛋白原的移除和NH2端血纖維蛋白肽A和B從纖維蛋白原Aα和Bβ鏈的移除導致其活性序列(聚合位點)暴露，使相鄰分子的E和D區之間能夠相互作用(DDE相互作用)以形成纖維蛋白聚合物。所述聚合物由因子XIIIa通過纖維蛋白α和γ鏈的COOH-端部分交聯。相鄰D區γ鏈的分子間交聯快速發生，生成γ-γ二聚物，而α聚合物之間(αC結構域)的交聯發生較慢，導致形成α聚合物。此外，α鏈用于將纖維蛋白與諸如纖連蛋白、α2-抗血纖維蛋白酶和PAI-2的蛋白質交聯。因而，設想這些鏈亦可參與胸腺素β4的交聯。
為了闡明將胸腺素β4引入纖維蛋白(原)的機理，在存在和不存在因子XIIIa的條件下利用纖維蛋白原、纖維蛋白及其重組片段(結構域)研究了其相互作用。研究表明雖然纖維蛋白(原)和胸腺素β4之間似乎沒有表現出明顯的非共價相互作用，但是因子XIIIa將胸腺素β4有效交聯至纖維蛋白原和纖維蛋白，并且所述交聯主要通過其包括殘基392-610的αC結構域的COOH-端部分發生。
根據一個實施方案，提供包括粘合劑和含有氨基酸序列LKKTET或其保守變體的多肽的基本純化組分。根據一個實施方案，所述粘合劑能夠粘接至諸如支架(stent)的醫療器械。在特別優選的實施方案中，所述粘合劑能夠粘接至活體如人類的組織。
在優選實施方案中，所述粘合劑是生物可降解粘合劑。當用于本文時，術語生物可降解粘合劑包括生物可吸收或可侵蝕(errodable)粘合劑。在優選實施方案中，所發明的組合物最初為流體或半流體狀態，最優選為液體或半液體狀態。在特別優選的實施方案中，應用后，所述粘合劑粘度上升并且在粘接至組織的同時最終部分固化。所述組合物可通過涂覆至層狀區域，最優選通過噴霧或利用刷子來導入。
在優選實施方案中，用于本發明的粘合劑是纖維蛋白封接膠基質(纖維蛋白膠)。纖維蛋白膠是分離的纖維蛋白原和胸腺素/鈣溶液的雙組分體系。當所述兩種溶液組合時，所得混合物模擬凝血級聯的最終階段形成纖維蛋白凝塊。纖維蛋白原可臨時由自體同源、單一供體或庫藏血液制得。在歐洲，可購得的纖維蛋白膠品牌為Beriplast、Tissel和Tissucol。纖維蛋白膠廣泛用于各種手術程序以在各個解剖部位修補、封接和附著組織。
因而，本發明提供將LKKTET多肽遞送至活體一定部位的方法。在優選實施方案中，該部位是表面。本發明方法包括將本發明的組合物涂覆至所述部位。在優選實施方案中，所述部位是傷口，如急性或慢性傷口。
在優選實施方案中，所述粘合劑是纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白膠、膠原、任意上述物質的片段或任意上述物質的混合物。可用的膠原粘合劑包括1、2、3、4和/或5型膠原。其它粘合劑包括肌動蛋白或整合素粘合劑。
在其它實施方案中，用于本發明組合物的生物可降解粘合劑是凝膠(例如粘性膠原凝膠)、凝膠/纖維蛋白混合物、粉末等。
在優選實施方案中，粘合劑共價結合至LKKTET肽，最為優選的是通過因子XIIIa結合。在特別優選實施方案中，粘合劑是纖維蛋白或纖維蛋白原的片段。
在優選實施方案中，LKKTET多肽包含氨基酸序列KLKKTET或LKKTETQ、胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的N-端變體、Tβ4的C-端變體、Tβ4的同工型、Tβ4的剪接變體、Tβ4、Tβ4亞砜、淋巴Tβ4、聚乙二醇改性(pegylate)Tβ4或任何其它的具有肌動蛋白結合結構域的肌動蛋白螯合或集束蛋白，或者包含或基本由氨基酸序列LKKTET或其保守變體組成的肽片段。通過引用并入本文的國際申請No.PCT/US99/17282公開了根據本發明有用的Tβ4同工型以及可用于本發明的氨基酸序列LKKTET及其保守變體。通過引用并入本文的國際申請No.PCT/GB99/00833(WO 99/49883)公開了可根據本發明利用的氧化胸腺素β4。雖然下文中主要針對Tβ4和Tβ4同工型來描述本發明，但是應該理解以下描述可同樣適用于氨基酸序列LKKTET、LKKTETQ、包含或基本由LKKTET、LKKTETQ、其保守變體組成的肽和片段，以及氧化胸腺素β4。
接觸損傷部位的實例包括用只包含粘合劑/Tβ4的組合物接觸所述部位，或用包含粘合劑/Tβ4和增強Tβ4的滲透性或延遲或減慢Tβ4肽釋放至待治療區域的至少一種藥劑的組合物接觸所述部位。患者可以是哺乳動物，優選人。
Tβ4或其類似物、同工型或衍生物可以任意合適的有效量施用。例如，Tβ4的施用劑量可為約0.1-50微克的Tβ4，更優選為約1-25微克。
根據本發明的組合物可每日、隔日等施用，每天施用一次或多次，如每天施用2、3、4或更多次。
已鑒定出Tβ4同工型，其與Tβ4的已知氨基酸序列具有約70％或約75％或約80％或更高的同源性。所述同工型例如包括Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15。與Tβ4類似，Tβ10和Tβ15同工型以及Tβ4剪接變體已顯示為螯合肌動蛋白。Tβ4、Tβ10和Tβ15以及其它同工型具有氨基酸序列LKKTET，該序列似乎參與介導肌動蛋白的螯合或結合。雖然不希望拘束于任何特定理論，但是Tβ4同工型的活性至少部分是由于調節肌動蛋白聚合所致。β-胸腺素似乎是通過螯合游離G-肌動蛋白來解聚F-肌動蛋白。因此，Tβ4調節肌動蛋白聚合的能力可全部或部分地由其通過LKKTET序列結合或螯合肌動蛋白所致。因此，如同Tβ4一樣，其它結合或螯合肌動蛋白或調節肌動蛋白聚合的蛋白質，包括具有氨基酸序列LKKTET的Tβ4同工型，單獨或如本文所述與Tβ4組合可能是有效的。
因此，具體考慮已知的Tβ4同工型，如Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14和Tβ15以及尚未鑒定的Tβ4同工型和Tβ4剪接變體對于本發明的方法將是有用的。這種Tβ4同工型在本發明方法(包括實施于患者的方法)中是有用的。因此，本發明還提供包含Tβ4與Tβ4同工型Tβ4ala、Tβ9、Tβ10、Tβ11、Tβ12、Tβ13、Tβ14、Tβ15以及藥學上可接受的載體的藥物組合物。
此外，如在合適的螯合、結合、活動化或聚合分析中所驗證或者通過介導肌動蛋白結合的氨基酸序列例如LKKTET的存在所鑒定的，具有肌動蛋白螯合和結合能力或能夠使肌動蛋白活動或調節肌動蛋白聚合的其它蛋白質可類似地應用于本發明方法中。該蛋白質例如包括凝溶膠蛋白、維生素D結合蛋白(DBP)、微絲結合蛋白(profilin)、切絲蛋白(cofilin)、adsevertin、propomyosin、fincilin、蠶食蛋白(depactin)、DnaseI、絨毛蛋白(villin)、法安明(Fragmin)、肌割蛋白(severin)、加帽蛋白(cappingprotein)、β-輔肌動蛋白和acumentin。當該方法包括實施于患者的方法時，本發明還提供包含如本文所指出的凝溶膠蛋白、維生素D結合蛋白(DBP)、微絲結合蛋白(profilin)、切絲蛋白(cofilin)、蠶食蛋白(depactin)、DnaseI、絨毛蛋白(villin)、法安明(Fragmin)、肌割蛋白(severin)、加帽蛋白(capping protein)、β-輔肌動蛋白和acumentin的藥物組合物。因而，本發明包括包含氨基酸序列LKKTET(可在其一級氨基酸序列內)及其保守變體的多肽的用途。
在此，術語“保守變體”或其語法變化指由另一生物學相似殘基替代氨基酸殘基。保守變異的例子包括將親水殘基如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或蛋氨酸替代為另一種，將極性殘基替代為另一種，如將精氨酸替代為賴氨酸、將谷氨酸替代為天冬氨酸或谷氨酰胺替代為天冬酰胺等。
Tβ4位于許多組織和細胞類型中，因而刺激Tβ4生成的藥劑可加入或包含影響Tβ4組織和/或細胞生成的組合物。這種藥劑包括生長因子家族成員，如胰島素樣生長因子(IGF-1)、血小板衍生生長因子(PDGF)、表皮生長因子(EGF)、轉化生長因子β(TGF-β)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、胸腺素α1(Tα1)和血管內皮生長因子(VEGF)。更優選的是，所述藥劑為轉化生長因子β(TGF-β)或TGF-β家族的其它成員。
此外，輔助或刺激愈合的藥劑可連同Tβ4或Tβ4同工型一起加入組合物。該藥劑包括血管生成藥、生長因子、指導細胞分化的藥劑。例如，但并非限制，單獨或組合的Tβ4或Tβ4同工型可與一種或多種有效量的以下藥劑組合加入VEGF、KGF、FGF、PDGF、TGFβ、IGF-1、IGF-2、IL-1、前胸腺素α和胸腺素α11。
治療或防止炎癥、損傷和退變的實際劑量、配方或組合物取決于多種因素，包括患者體形和健康狀況。然而，本領域普通技術人員可以利用上述PCT/US99/17282和本文所引用的參考文獻所公開的用于確定臨床劑量的方法和技術的教導來確定合適的施用劑量。
在優選實施方案中，多肽濃度為約0.01-1摩爾多肽每摩爾粘合劑，更優選為約0.1-0.5摩爾多肽每摩爾粘合劑，最優選為約0.2-0.4摩爾多肽每摩爾粘合劑。
合適的配方包括濃度為約0.001-10重量％、約0.01-0.1重量％或甚至為約0.05重量％的Tβ4或Tβ4同工型。
本發明包括與Tβ4肽或其功能片段相互作用的抗體的用途。提供了基本由合并的具有不同表位特異性的單克隆抗體組成的抗體以及不同的單克隆抗體制劑。單克隆抗體是由含蛋白質片段的抗原通過本領域普通技術人員所公知的方法，如公開在上文的PCT/US99/17282中的方法所制備。本發明所用的術語抗體包括單克隆和多克隆抗體。
在又一實施方案中，本發明提供通過施加有效量的調節Tβ4基因表達的藥劑來治療患者的方法。術語“調節”是指當Tβ4過表達時抑制或阻遏Tβ4表達，當Tβ4表達低時誘導其表達。術語“有效量”是指有效調節Tβ4的基因表達產生有效治療的Tβ4藥劑的量。調節Tβ4或Tβ4同工型基因表達的藥劑例如可以是多聚核苷酸。多聚核苷酸可以是反義、三聯體藥劑或核酶。例如，可以利用針對結構基因區或針對Tβ4的啟動子區的反義藥劑。
在另一實施方案中，本發明提供利用調節Tβ4活性的化合物的方法。影響Tβ4活性的化合物(例如拮抗劑和激動劑)包括肽、多模擬物、多肽、化學化合物、無機物如鋅和生物試劑。
然而不拘泥于任何特定理論，本發明可促進愈合或預防炎癥和損傷，這是通過誘導末端脫氧核苷轉移酶(非模板指導的DNA聚合酶)以降低一種或多種炎性細胞因子或趨化因子的水平，并充當內皮細胞的趨化因子，從而促進愈合或預防由損傷或其它變性或環境因素引起的組織變性變化。
本發明由以下實施例進一步說明，以下實施例不具有限制性。
實施例蛋白質和試劑去除纖維蛋白原、纖連蛋白和von Willebrand因子的人纖維蛋白溶解原購自Enzyme Research Laboratories(South Bend，IN)。對應于人纖維蛋白原αC-結構域(殘基Aα221-610)的重組αC-片段和其對應于NH2和COOH-端一半(分別是殘基Aα221-391和Aα392-610)的截短變體使用pET20b表達載體在E.coli中生成。包含人纖維蛋白原γ鏈中殘基148-411的重組γ-模塊使用相同的表達載體在E.coli生成。
牛凝血酶(1000NIHu/mg)、抑肽酶(4.4TIU/mg)、抗兔IgG-辣根偶聯物和熒光素異硫氰酸酯(FITC)購自Sigma。重組因子XIII由Zymogenetics，Inc.(西雅圖，WA)贈送。合成胸腺素β4由Regenerx Biopharmaceuticals，Inc.(Bethesda，MD)贈送。抗胸腺素β4血清根據公知方法制備。
因子XIII的活化因子XIII溶于含0.15M NaCl的25mM Tris緩沖液，pH8.0(TBS)，利用凝血酶或利用CaCl2將其活化；CaCl2的制備應避免可潛在激活纖維蛋白原的凝血酶的存在。通過加入終濃度為25NIH u/ml的牛凝血酶和2.5CaCl2mM來制備凝血酶激活的FFXIII[FXIIIa(THr)]。通過加入終濃度為50mM的CaCl2來制備Ca2+-激活的凝血酶[FXIIIa(Ca)]。在兩種混合物中FXIII的終濃度為1.5mg/ml；兩種混合物在實驗之前室溫孵育10分鐘。
用FITC標記胸腺素β4通過與熒光素異硫氰酸酯(FITC)反應來熒光標記胸腺素β4。通過在NAP5Sephadex G-25柱(Amersham Biosciences)上凝膠過濾，將胸腺素β4轉移至pH9.5的0.1M NaHCO3緩沖液中，隨后加入1.2摩爾過量的FITC并在黑暗中于37℃下孵育該混合物2小時。在NAP5柱上除去未反應的FITC。山所述分光光度分析確定的標記程度為0.9摩爾FITC每摩爾胸腺素β4。
固相結合分析通過使用塑料微升板進行ELISA研究在存在或不存在FXIIIa下，胸腺素β4和纖維蛋白(原)及其片段之間的相互作用。在-4℃下，以均溶于pH8.3的0.1M NaHCO3緩沖液中10μg/ml纖維蛋白原和纖維蛋白或20μg/ml重組體片段將微升板孔包被過夜。通過向孔中加入含10μg/ml纖維蛋白原、1NIH u/ml凝血酶和400u/ml抑肽酶的混合物并隨后在+4℃下孵育過夜來制備纖維蛋白。隨后通過在37℃下與Super Blocker(Pierce)孵育1小時來封閉孔。用含0.05％Tween-20的TBS(TBS-Tween)洗后，將指示濃度的胸腺素β4、FXIII、FXIIIa(Thr)和FXIIIa(Ca)加入孔中并在37℃下孵育2-2.5小時。通過與兔抗胸腺素β4血清和偶聯過氧化酶的抗兔IgG反應來檢測結合(引入)的胸腺素β4。將TMB Microwell Peroxidase Substrase加入孔中，并且在450nm分光光度分析法測量引入的胸腺素β4。
將胸腺素β4引入纖維蛋白原和纖維蛋白在Eppendorf管中進行將FITC標記和未標記的胸腺素β4引入纖維蛋白原和纖維蛋白中的反應，所述Eppendorf管含有溶于加有2.5mM CaCl2的100μL TBS的3mg/mL(9μM)纖維蛋白原和150μg/L(30μM)胸腺素β4或FITC標記胸腺素β4的混合物。通過添加FXIIIa(Ca)或FXIIIa(Thr)至終濃度30μg/mL的來起始反應。在含FXIIIa(Thr)的混合物中凝血酶的終濃度為2.5NIHu/mL，足以快速形成肉眼可見的纖維蛋白凝塊。與FITC標記的胸腺素β4的反應在37℃下于黑暗中持續4小時，通過在沸水中加熱5分鐘使酶熱失活來終止反應，期間纖維蛋白原和纖維蛋白變性并沉淀。將沉淀物離心并在TBS中洗滌3次，隨后溶解。采用吸收摩爾系數E2801％＝15.0和ε495＝72,000M-1cm-1通過分光光度分析測定溶解的沉淀物中纖維蛋白(原)和FITC標記的胸腺素β4的量。為了制備通過SDS-PAGE和Western blot分析用的具有未標記胸腺素β4的樣品，將反應混合物在指示時間如上熱失活并通過加入含有SDS和還原劑的樣品緩沖液(Invitrogen)而溶解。
動力學分析為了分析將胸腺素β4引入不同的纖維蛋白(原)片段的動力學，將所述片段固定在微升板的孔上(如上所述，除了所有片段的濃度為20μg/mL)并且在存在10μg/L凝血酶激活因子XIIIa的情況下與幾種濃度的胸腺素β4孵育。在1小時的孵育期間，通過每15分鐘加入碘乙酰胺至終濃度10mM來抑制孵育混合物，并用上述兔抗胸腺素β4血清檢測每個時間點引入的胸腺素β4。不同胸腺素β4濃度下引入(V)反應的初始速率由反應時間進程圖的斜率得到并且表示為tanα＝A450/t(分鐘)，其中A450表示450nm處以光學單位(o.u)表示的吸光度，其正比于引入胸腺素β4的量。表觀Michaelis常數Km得自lineweaver-Burk作圖，1/V(min/o.u.)對1/[S](μM-1)，其中[S]為胸腺素β4的濃度。
Western印跡分析如下所述檢測引入至纖維蛋白(原)及其片段的胸腺素β4。將如上所述制備的樣品電泳并如早先所述電遷移至硝酸纖維膜(Invitrogen)。將膜用酪蛋白封閉劑封閉1小時，并且通過與兔抗胸腺素β4血清和偶聯過氧化物酶的抗兔IgG反應來檢測胸腺素β4。通過制造商推薦的使用supersignal west pico化學發光底物的程序進行過氧化物酶標記的蛋白帶的可視化。
ELISA檢測胸腺素β4向纖維蛋白原和纖維蛋白的引入為了測試因子XIIIa可介導胸腺素β4與纖維蛋白(原)的交聯并闡明該交聯的機理，我們在存在或不存在重組體因子XIII的情況下進行了對胸腺素β4與纖維蛋白原和纖維蛋白的相互作用的直接研究。應該注意的是重組體因子XIII包含兩個a亞單位(a2)，與對應于血小板形成因子XIII的血漿因子XIII相反。
在ELISA實驗中，當將150μg/ml(30μM)胸腺素β4與固定的纖維蛋白原孵育時，不存在因子XIII和存在未激活的因子XIII時僅觀察到低信號，說明它們之間的相互作用如果有的話也是非常弱。當在不存在或存在未激活的因子XIIIa的條件下將胸腺素β4與固定的纖維蛋白孵育時，信號明顯增加，說明因子XIIIa介導胸腺素β4向纖維蛋白原的結合(引入)，所述未激活的因子XIIIa通過加入CaCl2而被激活，從而避免纖維蛋白原在孔中轉化為纖維蛋白。采用固定的纖維蛋白觀察到相似的情況，只是引入水平要高于向纖維蛋白原的引入。兩種情況下的引入均為劑量依賴的。當因子XIII由凝血酶而非Ca2+激活時，在纖維蛋白上的引入進一步增加。該差異可能是這兩種因子XIIIa物質不同的比活性所致。這些結果說明激活的XIII與組織轉谷氨酰胺酶類似，介導胸腺素β4向纖維蛋白原和纖維蛋白中的引入。所述結果還說明胸腺素β4與纖維蛋白原和纖維蛋白之間均無明顯的非共價相互作用。
胸腺素β4引入至纖維蛋白原和纖維蛋白的進一步分析為了進一步表征因子XIIIa介導的胸腺素β4向纖維蛋白(原)的引入，通過免疫印跡法在不同時間點分析混合物的凝血酶、因子XIII、胸腺素β4和纖維蛋白。如實驗程序所述制備分析用的混合物和樣品。將樣品電遷移至硝酸纖維膜并且以抗胸腺素β4血清作為探針檢測。免疫分析結果表明因子XIIIa將胸腺素β4共價引入纖維蛋白，類似于組織轉谷氨酰胺酶，且引入(交聯)胸腺素β4的量似乎在4小時后達到飽和。選擇該時間以評價引入程度。為此，以FITC發色基團標記胸腺素β4，該發色基團可以在纖維蛋白原/胸腺素β4和纖維蛋白/胸腺素β4混合物中直接測量。基于由Werstern印跡分析所揭示的引入模式，該修飾并不影響其引入至纖維蛋白原或纖維蛋白。如上所述但具有FTIC標記的胸腺素β4的類似混合物孵育4小時，然后基于分光光度分析測定的每個樣品中纖維蛋白(原)和引入的FITC標記胸腺素β4的量來評價引入程度。結果表明在包括生理濃度(9μM)纖維蛋白原的選定條件下，因子XIIIa分別引入大量的FITC-胸腺素β4，約0.2-0.4摩爾每摩爾纖維蛋白原和纖維蛋白。
胸腺素β4向單獨的纖維蛋白(原)鏈引入為了確定三條纖維蛋白(原)鏈中哪一條參與同胸腺素β4的交聯，我們通過SDS-PAGE和Western印跡法分析了存在或不存在胸腺素β4的條件下因子XIIIa介導的纖維蛋白原和纖維蛋白交聯的時間進程。眾所周知，在纖維蛋白中，因子XIIIa快速交聯γ鏈的COOH端部分以生成γ-γ二聚體，隨后交聯α鏈形成α-二聚體、三聚體和α-聚合物；纖維蛋白原以相同方式但較慢速率交聯。當通過SDS-PAGE在還原條件下分析時，分別對應于單獨的纖維蛋白原和纖維蛋白多肽鏈Aα、Bβ、γ和α、β、γ的條帶被充分溶解。纖維蛋白原與因子XIIIa的孵育導致對應于γ-γ二聚體和Aα-Aα二聚體與三聚體的條帶逐漸消失；開始時還觀察到出現最可能對應于Aα聚合物的一些物質。當纖維蛋白原與因子XIIIa在胸腺素β4存在下孵育時，在對應于單獨鏈和其交聯變體的條帶強度方面未發現明顯差異。用纖維蛋白得到了類似結果，只是其α和γ鏈的交聯發生得更為快速，與預期一樣，起始時物質量較高。隨后的Western印跡實驗表明孵育30分鐘之后，大量胸腺素β4被引入纖維蛋白原Aα鏈，孵育150分鐘后，一些胸腺素β4被引入Aα-Aα二聚體中。胸腺素β4想象纖維蛋白α鏈和α-α二聚體的引入更為快速，并且在孵育150分鐘后，胸腺素β4物質在更高分子量形式的α鏈(α聚合物)中觀察到。這些結果說明纖維蛋白原Aα和纖維蛋白α鏈含有用于共價引入胸腺素β4的主要位點。同時，150分鐘孵育后，遷移率在γ-γ和α-α二聚體之間的低強度條帶的出現表明胸腺素β4也可以引入到纖維蛋白γ鏈(γ-γ二聚體)。作為選擇，該條帶可對應于α-α二聚體的蛋白水解的截短變體。
胸腺素β4向重組纖維蛋白(原)片段的引入充分認識到形成αC結構域和γ模塊的纖維蛋白原Aα和γ鏈的COOH端蛋白質包含反應性Gln和Lys殘基，所述殘基通過因子XIIIa交聯在纖維蛋白中，因此可能參與同胸腺素β4的交聯。為了驗證這一點，并進一步定位胸腺素β4在纖維蛋白(原)中的交聯位點，通過SDS-PAGE和Western印跡法分析胸腺素β4向重組體γ-模塊(殘基148-411)和αC-結構域(Aα221-391和Aα392-610亞片段)的引入。在胸腺素β4存在下將αC-結構域和γ-模塊與因子XIIIa孵育導致有效交聯，并出現較高分子量形式、二聚體、三聚體和寡聚體。同時，分別含有主要受體Gln和供體Lys殘基的Aα221-391和Aα392-610亞片段的交聯效率大大下降。當樣品電遷移至硝酸纖維膜并用抗胸腺素β4血清做為探針檢測時，在αC-結構域、γ-模塊和其較高分子量形式的變體、二聚體、三聚體和寡聚體中檢測到大量的胸腺素β4。向Aα392-610亞片段單體和寡聚體中的引入也是明顯的，而在Aα221-391寡聚體中僅檢測到少量的胸腺素β4。該結果表明胸腺素β4可以交聯至αC-結構域和γ-模塊，并且前者Aα392-610區中的反應性Lys殘基參與交聯。
通過ELISA證實了上述觀察。當胸腺素β4在因子XIIIa存在下與固定的γ-模塊和αC-結構域變體孵育時，其有效引入到γ-模塊中，并引入到αC-結構域和Aα392-610亞片段中，而向Aα221-391的引入非常慢。應該注意在所有研究的濃度下，γ-模塊的引入幾乎比αC-結構域變體低兩倍。當胸腺素β4在未激活的因子XIII存在或不存在下與相同的固定物質孵育時，在所有情況下引入都非常慢。這表明和纖維蛋白和纖維蛋白原情況一樣，在胸腺素β4和重組片段之間沒有明顯的非共價相互作用。
之前顯示因子XIIIa交聯纖維蛋白γ鏈表現出表觀Michaelis行為。假設因子XIIIa表現為Michawlis酶，當交聯胸腺素β4至固定的γ-模塊和αC-結構域變體時，可以確定該交聯的動力學參數。動力學數據的分析給出以下數值的引入反應的表觀Michawlis常數(Km)胸腺素β4向γ-模塊的引入為183±29μM；胸腺素β4向αC-結構域和其Aα392-610亞片段的引入分別為17.6±2.5μM和8.6±3.7μM。γ-模塊的Km值遠高于αC-結構域及其亞片段的值，這說明胸腺素β4向αC-結構域的交聯更為有效。就此而論，Aα392-610亞片段的Km與之前測定的因子XIIIa介導的γ-γ交聯的Km＝6.2μM相當。αC-結構域和Aα392-610亞片段的Km值的兩倍差異可解釋為胸腺素β4的反應性Gln殘基和Aα392-610區之間的競爭，即αC-至-αC和胸腺素β4-至-αC的交聯之間的競爭。一致地，對αC-結構域和其Aα392-610亞片段的雙倒數作圖顯示出競爭抑制的特征性模式。
總體而言，所述結果表明因子XIIIa有效地將胸腺素β4交聯至包含殘基Aα392-610的分離的αC-結構域的COOH-端部分，而向分離的γ-模塊的引入效率較低，并且在纖維蛋白原和纖維蛋白中所述引入主要發生在αC-結構域。
纖維蛋白(原)通過與生理活性蛋白質和細胞受體的相互作用在傷口愈合中發揮重要作用。具體而言，纖維蛋白基質刺激炎性反應和由內皮細胞的毛細血管形成(血管生成)，這是傷口愈合過程中的基本步驟，分別通過與白細胞整合素Mac-1和內皮細胞受體VE-鈣粘著蛋白的相互作用進行。其還以高親和力與堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和血管內皮生長因子(VEGF)相互作用，將這些強的血管生成刺激劑共定位在纖維蛋白沉積部位和使其促進傷口愈合。纖維蛋白也可保留在胰島素樣生長因子結合蛋白(IGFPB-3)處，形成與IGF-1的復合體。胸腺素β4作為強的血管生成和傷口愈合因子，還可以通過組織轉谷氨酰胺酶引入纖維蛋白并且明顯進一步增加纖維蛋白基質的傷口愈合潛力。
雖然所有的轉谷氨酰胺酶催化相同的反應，在反應性Gln和Lys殘基之間共價的γ-谷氨酰-ε-賴氨酰異肽鍵的形成、其對底物的特異性可以不同。例如，作為血漿轉谷氨酰胺酶的因子XIIIa在纖維蛋白中特異性交聯γ和α鏈分別得到γ-γ二聚體和α-聚合物，而組織轉谷氨酰胺酶具有較低特異性并且還可以生成α-γ鏈交聯。絲氨酸蛋白酶抑制劑(serpin)PAI-2對于纖維蛋白(原)的交聯模式對于組織轉谷氨酰胺酶和因子XIIIa也發現是不同的。最初顯示胸腺素β4通過幾內亞豬的肝組織轉谷氨酰胺酶引入纖維蛋白中；假設其通過因子XIIIa向纖維蛋白的引入是基于凝血酶激活的血小板共釋放因子XIII和胸腺素β4以及胸腺素β4交聯纖維蛋白。本研究中，直接證實胸腺素β4可通過因子XIIIa引入纖維蛋白原和纖維蛋白中。此外，發現引入程度相當高，分別為0.2-0.4摩爾胸腺素β4每摩爾纖維蛋白原和纖維蛋白。由于纖維蛋白原在血漿中的濃度為約9uM，因此纖維蛋白在纖維蛋白沉積處的局部濃度應該高得多。考慮到胸腺素β4在0.1nM-1μM濃度下表現出前血管生成活性，該引入程度明顯在生理上是顯著的，應該足以增加纖維蛋白凝塊的傷口愈合潛力。
已知因子XIIIa將多種血漿蛋白、α2-抗纖維蛋白溶酶、PAI-2、纖連蛋白、凝血栓蛋白和von Willebrand因子引入纖維蛋白中。僅確定了其中一些的引入機理。例如，纖連蛋白在共價交聯因子XIIIa之前以高親和力非共價結合纖維蛋白αC-結構域；每個蛋白質中的識別位點和反應性Gln和Lys殘基位于不同區域，提供合適的交聯位點取向。此外，因子XIIIa與αC-結構域的相互作用還增加了反應的特異性。為了驗證非共價結合的胸腺素β4是否進行與纖維蛋白的交聯，研究了有和沒有非激活因子XIII存在下其與固定的纖維蛋白原和纖維蛋白的相互作用。與對纖維蛋白表現出高親和力的其它促血管生成因子如bFGF和VEGF不同，在所有情況下都沒有觀察到與胸腺素β4的明顯非共價相互作用。僅在活化因子XIIIa存在下觀察到引入，說明共價交聯可能是在纖維蛋白凝塊中保留胸腺素β4的唯一機制。
所述結果清楚表明雖然胸腺素β4可通過因子XIIIa引入分離的γ-模塊和αC-結構域變體中，但是在纖維蛋白(原)中它主要交聯到αC-結構域中，亦即交聯到其Aα392-610區中。胸腺素β4和纖維蛋白(原)中鑒定到的反應性Lys和Gln殘基分布的分析對該發現提供了合理的解釋。胸腺素β4含有反應性氨基供體Lys38和兩個氨基受體Gln23和Gln36，其可能參與同其它蛋白質的交聯反應。在γ鏈中僅有兩個反應性殘基參與分子間γ-γ交聯，即Gln398(或Gln399)和Lys406，二者均位于γ-模塊中。當分離的γ-模塊用因子XIIIa處理時，交聯似乎隨機發生，得到二聚體、三聚體/寡聚體；胸腺素β4引入至所有這些物質中。在纖維蛋白中，這些區域通過DD:E相互作用以反平行方式排列，促進一條鏈中Gln398/399和另一條鏈中Lys406之間交聯形成γ-γ二聚體。該交聯反應效率遠高于這些殘基和胸腺素β4之間的交聯反應，因此在本研究中觀察到很少或沒有胸腺素β4被引入到纖維蛋白γ鏈并不令人驚奇。
與γ鏈相反，Aα鏈含有多個反應性谷氨酰胺和賴氨酸殘基。發現以下殘基參與纖維蛋白中α鏈或重組αC-結構域之間的交聯Gln221、237、328和366以及Lys508、539、556、580和601。Aα鏈Lys303表現為充當因子XIIIa介導的交聯絲氨酸蛋白酶抑制劑與纖維蛋白(原)交聯的氨基供體。該Lys對另一絲氨酸蛋白酶抑制劑PAI-2并無反應性，其利用組織轉谷氨酰胺酶和因子XIIIa通過其它Aα鏈賴氨酸殘基148、176、183、230、413和457來交聯。以合成肽模擬α2-抗纖維蛋白溶酶交聯區的研究表明其通過12個反應性賴氨酸殘基引入到纖維蛋白α鏈中，12個反應性賴氨酸殘基是占總活性78％的Lys418、448、508、539、556和580以及較低反應性的Lys208、Lys219和/或224、Lys427、429、601和606。纖維蛋白(原)Aα368-610區內的至少10個賴氨酸殘基涉及與纖連蛋白的交聯反應。上述分析表明纖維蛋白中鑒定到的大部分反應性殘基位于其αC-結構域中，即αC-結構域的392-610區，胸腺素β4優選交聯至該區域，該區域包含至少11個反應性Lys殘基，并且這些殘基中僅有半數被用于α-α交聯。還表明雖然胸腺素β4可以競爭參與α-α交聯的反應性賴氨酸殘基，但是其與αC-結構域的交聯的發生可不依賴于其分子間α-α交聯，從而提供其向纖維蛋白的有效引入。因而，αC-結構域的反應性賴氨酸殘基不僅用于α-α交聯，而且同時容納有助于傷口愈合和其他生理與病理過程的纖維蛋白基質性質的生理活性蛋白質，包括胸腺素β4。
纖維蛋白原以可控方式聚合生成易于粘附至不同細胞、無免疫原性且生物可降解的凝塊。這使其成為理想的止血劑和生物粘附劑(纖維蛋白封接劑)，其已經逐漸作為用于止血的止血劑而用于大量外科應用，輔助組織封接和傷口愈合。纖維蛋白封接劑在傷口愈合和其他治療中的用途可以通過加入生物活性藥劑得到增強。例如，在細胞和動物模型中表明纖維蛋白可用作局部遞送抗生素和生長因子的載體。當由纖維蛋白包封的抗生素由于低溶解度而緩慢釋放時，通過生長因子與纖維蛋白之間高親和力的相互作用或通過生長因子直接共價交聯至纖維蛋白而實現生長因子在纖維蛋白中的保留。胸腺素β4通過與因子XIIIa交聯而引入纖維蛋白(原)中的能力可用于將其固定在纖維蛋白封接劑上。該研究證明了向纖維蛋白原和纖維蛋白引入的高效率，支持該方法。
總而言之，實驗研究證實作為生物活性肽的胸腺素β4可通過與因子XIIIa共價交聯而引入纖維蛋白中，證明了在組分的生理濃度下其引入至纖維蛋白原和纖維蛋白的高效率，并定位了纖維蛋白(原)αC-結構域的Aα392-610區內的引入位點。實驗數據支持引入生理顯著量的胸腺素β4到纖維蛋白封接劑中，以遞送至創傷愈合處。
組織轉谷氨酰胺酶和可能的血漿轉谷氨酰胺酶、因子XIIIa可將生理活性肽胸腺素β4引入纖維蛋白(原)中。為了闡明該引入的機理，通過免疫印跡法和ELISA研究了胸腺素β4與纖維蛋白原、纖維蛋白和其重組體片段、γ-模塊(γ鏈殘基148-411)和αC-結構域(Aα鏈殘基221-610)以及其截短變體的相互作用。不存在活化的因子XIIIa時檢測不到它們之間明顯的非共價相互作用，而在其存在時，胸腺素β4被有效引入到纖維蛋白中，較小程度地引入到纖維蛋白原中。在纖維蛋白(原)和因子XIIIa的生理濃度下引入是顯著的，其中胸腺素β4與纖維蛋白原和纖維蛋白的摩爾引入比分別為0.2和0.4。進一步的實驗表明雖然活化的因子XIIIa將胸腺素β4引入到分離的γ-模塊和αC-結構域中，但是在纖維蛋白中αC-結構域用作主要的引入位點。該位點進一步定位至αC-結構域的COOH-端部分，包括殘基392-610。
權利要求
1.一種包含基本純化組分的組合物，所述基本純化組分包括粘合劑和含有氨基酸序列LKKTET或其保守變體的多肽。
2.權利要求1的組合物，其中所述粘合劑能夠粘附于活體組織。
3.權利要求2的組合物，其中所述粘合劑是生物可降解的。
4.權利要求1的組合物，其中所述粘合劑是纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白膠、膠原、其片段或其混合物。
5.權利要求4的組合物，其中所述粘合劑和所述多肽共價結合在一起。
6.權利要求5的組合物，其中所述粘合劑和所述多肽通過因子XIIIa共價結合。
7.權利要求6的組合物，其中所述粘合劑是纖維蛋白或纖維蛋白原的片段。
8.權利要求1的組合物，其中所述多肽包含氨基酸序列KLKKTET或LKKTETQ、胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的N-端變體、Tβ4的C-端變體、Tβ4的同工型、Tβ4的剪接變體、氧化的Tβ4、Tβ4亞砜、淋巴Tβ4和聚乙二醇改性Tβ4。
9.權利要求1的組合物，其中所述多肽是重組的或合成的。
10.權利要求1的組合物，其中所述多肽是抗體。
11.權利要求10的組合物，其中所述抗體是多克隆的或單克隆的。
12.權利要求4的組合物，其中所述多肽的濃度為約0.01-1摩爾所述多肽每摩爾所述粘合劑。
13.權利要求12的組合物，其中所述多肽的濃度為約0.1-0.5摩爾所述多肽每摩爾所述粘合劑。
14.權利要求13的組合物，其中所述多肽的濃度為約0.2-0.4摩爾所述多肽每摩爾所述粘合劑。
15.一種遞送多肽至一定部位的方法，包括將權利要求1的組合物引入所述部位。
16.權利要求15的方法，其中所述組合物通過噴霧應用于所述部位。
17.權利要求16的方法，其中所述部位是傷口。
18.權利要求15的方法，其中所述粘合劑能夠粘附于活體組織。
19.權利要求18的方法，其中所述粘合劑是生物可降解的。
20.權利要求15的方法，其中所述粘合劑是纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白膠、膠原、其片段或其混合物。
21.權利要求20的方法，其中所述粘合劑和所述多肽共價結合。
22.權利要求21的方法，其中所述粘合劑和所述多肽通過因子XIIIa共價結合。
23.權利要求22的方法，其中所述粘合劑是纖維蛋白或纖維蛋白原的片段。
24.權利要求1的方法，其中所述多肽包含氨基酸序列KLKKTET或LKKTETQ、胸腺素β4(Tβ4)、Tβ4的N-端變體、Tβ4的C-端變體、Tβ4的同工型、Tβ4的剪接變體、氧化的Tβ4、Tβ4亞砜、淋巴Tβ4和聚乙二醇改性Tβ4。
25.權利要求15的方法，其中所述多肽是重組的或合成的。
26.權利要求15的方法，其中所述多肽是抗體。
27.權利要求26的方法，其中所述抗體是多克隆的或單克隆的。
28.權利要求20的方法，其中所述多肽的濃度為約0.01-1摩爾所述多肽每摩爾所述粘合劑。
29.權利要求28的方法，其中所述多肽的濃度為約0.1-0.5摩爾所述多肽每摩爾所述粘合劑。
30.權利要求29的方法，其中所述多肽的濃度為約0.2-0.4摩爾所述多肽每摩爾所述粘合劑。
全文摘要
利用包括粘合劑和含有氨基酸序列LKKTET或其保守變體的多肽的基本純化組分的組合物和方法。
文檔編號A61K47/42GK1852727SQ200480008892
公開日2006年10月25日 申請日期2004年3月31日 優先權日2003年3月31日
發明者艾倫·L·戈爾茨坦 申請人:雷金納克斯生物制藥公司