專利名稱：凝集素在促進糖蛋白和抗原分子的低聚反應中的用途的制作方法
本申請要求享有2003年2月28日提交的美國臨時申請序號60/450,721的利益，其在這里整體引作參考。
1.導言本發明涉及生物治療、免疫治療和應激蛋白介導的免疫調制領域。更具體地，本發明涉及使用含有與免疫學和/或生物學活性分子結合的凝集素或凝集素樣分子的分子復合物來增強免疫學和/或生物學活性分子在預防或治療疾病(特別是預防或治療癌癥或傳染病)中的預防和/或治療作用的組合物和方法。
2.發明背景這里對參考文獻的引用和討論不應當理解為對其構成本發明的現有技術的承認。
2.1免疫反應和抗原呈遞生物的免疫系統以2種反應與病原體或其它有害物反應——體液反應和細胞介導的反應(見Alberts，B.等，1994，Molecular Biology ofthe Cell，1195-96)。當靜息B細胞被抗原激活以增殖和成熟成能分泌抗體的細胞時，它們會生成和分泌具有獨特的抗原結合位點的抗體。該分泌抗體的反應稱作體液反應。另一方面，T細胞的各種反應統一稱作細胞介導的免疫反應。有兩大類T細胞——細胞毒性T細胞和輔助性T細胞。細胞毒性T細胞直接殺死感染了病毒的細胞或一些其它的胞內微生物。相反地，輔助性T細胞輔助刺激其它細胞的反應它們幫助活化例如巨噬細胞、樹突細胞和B細胞(見Alberts，B.等，同上，1228)。細胞毒性T細胞和輔助性T細胞都能識別靶細胞內的外來蛋白抗原降解生成的肽片段形式的抗原，因此二者都依賴于主要組織相容性復合體(MHC)分子，后者能結合這些肽片段，將它們帶至細胞表面，并將它們呈遞給T細胞。MHC分子一般大量存在于呈遞抗原細胞(APC)。
呈遞抗原細胞(APC)，例如巨噬細胞和樹突細胞，是先天的和適應性的免疫反應的關鍵組分。抗原一般在其他細胞，即APC的表面上“呈遞”給T細胞或B細胞。APC可以捕獲淋巴-和血液-攜帶的抗原，并且在內在化和降解后，將結合到主要組織相容性復合體(MHC)的細胞表面分子上的抗原性肽片段呈遞給T細胞。APC然后可以活化T細胞(細胞介導的反應)，進行克隆擴充，且它們的子細胞可以發育成細胞毒性T細胞或輔助性T細胞，后者又用相同的MHC-結合抗原活化B細胞(體液反應)，以進行克隆擴充和生產特異性的抗體(見Alberts，B.等，同上，1238-45)。
已經識別出了兩類抗原加工機制。第一類涉及APC通過胞吞作用攝入蛋白，小泡內的抗原片段化，與II類MHC分子的結合和在細胞表面上的表達。能表達CD4的輔助性T細胞可以識別出該復合物。另一類用于在細胞內合成的且可能參與細胞質中的蛋白片段化的蛋白，例如病毒抗原。以該方式生成的肽會與I類MHC分子結合，并被能表達CD8的細胞毒性T細胞識別(見Alberts，B.等，同上。1233-34)。
T細胞的刺激涉及T細胞和APC兩者表達的許多附屬分子。共同刺激分子是那些能促進T細胞的生長和活化的附屬分子。刺激后，共同刺激分子會誘導細胞因子的釋放，例如白細胞介素1(IL-1)或白細胞介素2(IL-2)、干擾素等，后者能促進T細胞的生長和表面受體的表達(見Paul，1989，Fundamental Immunology，109-10)。
通常，APC是靜止的，且需要活化才能發揮作用。能活化APC的信號的鑒定是一個至關重要的且未解決的問題(見Banchereau，等，1998，Nature，392245-252；Medzhitov，等，1998，Curr Opin Immunol.，1012-15)。
2.2熱激蛋白熱激蛋白(HSP)也稱作應激蛋白，起初將其鑒定為由熱激引起的細胞合成的蛋白。已知了約十個家族的HSP，且每個家族由1-5個密切相關的蛋白組成。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20395-425。隨后發現其它的應激刺激也能誘導這些家族中的許多成員，所述刺激包括營養喪失、代謝破壞、氧自由基和胞內病原體的感染(見Welch，May 1993，Scientific American，56-64；Young，1990，Annu.Rev.Immunol.，8401-420；Craig，1993，Science，2601902-1903；Gething等，1992，Nature，35533-45；和Lindquist等，1988，Annu.Rev.Genetics，22631-677)。
熱激蛋白能在所有形式的生命的所有細胞中和許多胞內位置中表達，即它們能在原核生物的細胞溶膠和真核生物的細胞溶膠、核、內質網(ER)、線粒體和葉綠體中表達。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20395-425。HSP也構成一個細胞內最豐富的蛋白組。它們在正常的非熱激條件下大量表達，且熱激或其它形式的應激會將它們的表達有力地誘導到更高的水平。
熱激蛋白屬于現有的最高度保守的蛋白。例如，DnaK，來自大腸桿菌(E.coli)的Hsp70與來自脫皮(excoriate)的Hsp70蛋白具有約50％的氨基酸序列同一性(Bardwell等，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.，81848-852)。Hsp60和Hsp90家族也表現出類似的高水平的家族內保守性(Hickey等，1989，Mol.Cell.Biol.，92615-2626；Jindal，1989，Mol.Cell.Biol.，92279-2283)。另外，已經發現Hsp60、Hsp70和Hsp90家族由與應激蛋白在序列上相關的蛋白組成，例如，具有超過35％的氨基酸同一性，但是應激不改變其表達水平。
對熱激和其它生理應激的細胞反應的研究表明，HSP具有下述功能例如蛋白的折疊和解折疊，蛋白的降解，多亞基復合物的裝配，耐熱性，突變的表達的緩沖等。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20395-425。HSP能實現不同種類的陪伴功能。例如，位于細胞質、核、線粒體或內質網中的Hsp70家族的成員(Lindquist等，1988，Ann.Rev.Genetics，22631-677)會參與抗原向免疫系統的細胞的呈遞，且也參與正常細胞中的蛋白的轉移、折疊和裝配。HSP能結合蛋白或肽，并在存在腺苷三磷酸(ATP)或低pH的情況下釋放結合的蛋白或肽。
2.3HSP-肽復合物的免疫原性Srivastava等證實了對甲基膽蒽誘導的近交小鼠的肉瘤的免疫反應(1988，Immunol.Today，978-83)。在這些研究中，發現負責這些腫瘤的各個不同的免疫原性的分子是96kDa糖蛋白(gp96)和84-86kDa胞內蛋白(Srivastava等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，833407-3411；Ullrich等，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，833121-3125)。用從特定的腫瘤分離出的gp96或p84/86免疫小鼠，能賦予小鼠對該特定腫瘤的免疫，但是對抗原性不同的腫瘤則不能。對能編碼gp96和p84/86的基因的分離和表征，揭示了它們之間的顯著同源性，并顯示了gp96和p84/86分別是相同的熱激蛋白的內質網的和胞質的對應物(Srivastava等，1988，Immunogenetics，28205-207；Srivastava等，1991，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，167109-123)。而且，顯示了Hsp70能引起對其所分離自的腫瘤的免疫性，但是對抗原性不同的腫瘤則不能。但是，發現缺少肽的Hsp70會失去其免疫原性活性(Udono和Srivastava，1993，J.Exp.Med.，1781391-1396)。這些發現表明，熱激蛋白本身不是免疫原性的，但是能形成具有抗原性肽的非共價復合物，且該復合物可以引起對抗原性肽的特異性免疫(Srivastava，1993，Adv.Cancer Res.，62153-177；Udono等，1994，J.Immunol.，1525398-5403；Suto等，1995，Science，2691585-1588)。
熱激蛋白gp96陪伴著許多種類的肽，這依賴于gp96的分離來源(關于綜述，見Srivastava等，1998，Immunity，8657-665)。腫瘤衍生的gp96攜帶著腫瘤抗原性的肽(Ishii等，1999，J Immunology，1621303-1309)；來自感染了病毒的細胞的gp96制劑攜帶著病毒表位(Suto和Srivastava，1995，Science，2691585-1588；Nieland等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，951800-1805)，且來自轉染了模型抗原(例如卵清蛋白或β-半乳糖苷酶)的gp96制劑與對應的表位結合(Arnold等，1995，J Exp.Med.，182885-889；Breloer等，1998，Eur.J；Immunol.，281016-1021)。gp96與肽的結合在體內發生(Menoret和Srivastava，1999，Biochem.Biophys.Research Commun.，262813-818)。無論是分離自細胞的(Tamura等，1997，Science，278117-120)還是在體外重構的(Blachere等，1997，J.Exp.Med.，1861183-1406)Gp96-肽復合物，都是優秀的免疫原，且已經廣泛地用于引起對gp96-陪伴的抗原性肽特異性的CD8+T細胞反應。
gp96-肽復合物引起免疫反應的能力依賴于肽向呈遞抗原細胞的MHC I類分子的轉移(Suto和Srivastava，1995，同上)。由內質網(ER)中的gp96陪伴的內源合成的抗原可以體內引發抗原特異性的CD8+T細胞(或MHC I-限制的CTL)；CD8+T細胞的這種引發需要巨嗜細胞。盡管外源性抗原一般經過MHC II-呈遞途徑、并引起CD4+反應，但外源誘導的gp96-肽復合物可以引起CD8+T細胞反應。Suto和Srivastava，1995，同上；Blachere等，1997，J.Exp.Med.，1861315-22。
考慮到免疫所需的極小量的gp96-陪伴的抗原性肽(Blachere等，1997，同上)和gp96-肽復合物對功能性呈遞抗原細胞(APC)的免疫原性的嚴格依賴性(Udono等，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，913077-3081)，已經猜想APC具有gp96的受體(Srivastava等，1994，Immunogenetics，3993-98)。當顯示α2巨球蛋白(α2M)受體CD91能結合gp96和α2M，以及CD91的抗體完全抑制APC對gp96-陪伴的肽的重新呈遞(representation)時該猜想得到了確認。Binder等，2000，Nat.Immunol.1(2)151-55；Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20395-425。后來，證實了CD91不僅對gp96，而且對hsp90、hsp70和肌鈣網蛋白也起受體的作用。Basu等，2001，Immunity 14(3)301-13。
已經證實，除了MHC I分子的重新呈遞外，APC的MHC II分子也能重新呈遞HSP-陪伴的肽。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20395-425。MHC II分子的重新呈遞也通過CD91受體產生。因而，已經表明，HSP-肽復合物一旦通過CD91攝入，就可以進入數個交通和加工途徑中的一個或多個。Srivastava，同上。
HSP還已經涉入先天免疫。將APC暴露于gp96(或其它的HSP)，會使APC分泌低水平的TNFα，無論gp96分子是否與抗原性肽結合。Suto和Srivastava，1995，Science 2691585-88。后來發現，HSP(例如gp96，hsp90，hsp 70和hsp60)與APC的相互作用可以導致一系列的與先天免疫有關的事件，例如巨噬細胞分泌炎性細胞因子TNFα，IL-Iβ，IL-12和GM-CSF；巨噬細胞分泌趨化因子，例如MCP-1，MIP-2和RANTES；可誘導的氧化氮合酶的誘導和巨嗜細胞和DC生成氧化氮；DC的成熟，如通過CD11 c+細胞上的MHC II、B7-2和CD40分子的增強表達所測量的；大量DC(推測是朗格漢斯細胞)從gp96的注射位點向引流淋巴結的遷移；和NFκB向巨噬細胞和DC的核中的轉移。Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20395-425。幾乎沒有證據表明CD91是參與這些現象的受體，且已經暗示有其它的受體參與。Ohashi等，2000，J Immunol.164(2)558-61；Panjwani等，2000，Cell Stress Chaperones 5391；Srivastava，2002，Annu.Rev.Immunol.20395-425。
從癌細胞中純化出的HSP和肽的非共價復合物可以用于治療和預防癌癥，且已經記載在1996年4月11的PCT公開號WO 96/10411和1997年3月20日的WO 97/10001(分別是1998年4月12日授權的美國專利號5,750,119和1998年11月17日授權的美國專利號5,837,251，它們中的每一篇都在這里整體引作參考)中。已經記載了應激蛋白-抗原復合物的分離和純化，例如，從病原體感染的細胞中的分離和純化，并用于治療和預防病原體(例如病毒和其它胞內病原體，包括細菌、原生動物、真菌和寄生物)造成的感染(見，例如，1995年9月21日的PCT公開號WO 95/24923)。還可以通過應激蛋白和抗原性肽的體外復合，制備免疫原性的應激蛋白-抗原復合物，且這樣的復合物在治療和預防癌癥和傳染病中的應用已經記載在1997年3月20日的PCT公開號WO 97/10000(2000年2月29日授權的美國專利號6,030,618)中。應激蛋白-抗原復合物在體外敏化用于過繼免疫治療的呈遞抗原細胞中的應用記載在1997年3月20日的PCT公開號WO97/10002(也見1999年11月16日授權的美國專利號5,985,270)中。
對可以增強HSP-介導的肽的抗原呈遞的免疫原性的特異性的分子或方法的鑒別和表征，可以提供有用的用于引起HSP和HSP-肽復合物的特異性免疫和開發新的診斷和治療方法的試劑和技術。
2.4.凝集素凝集素是一組在植物、動物、真菌、藻類和細菌中發現的蛋白，其共有結合特異性的碳水化合物基團的性質(見Sharon等，1972，Science，177949)。它們是一組結構上不同的蛋白，且它們唯一的共同特征是特異性地且可逆地結合碳水化合物和通過在細胞表面上的寡糖基之間形成交聯來凝集細胞的能力。Sharon，1993，Trends BiochemSci 18(6)221-6。凝集素廣泛地用于診斷和實驗目的，例如鑒別細胞培養物中的突變細胞，通過觸發紅細胞的凝集來測定血型，或細胞膜表面的成像。凝集素也用于蛋白純化，因為它們能特異性地且可逆地結合碳水化合物。
有些凝集素可以一起歸入不同的家族，例如結構上相似的豆類或谷類的那些，或者含有同源的碳水化合物識別結構域的c-型(Ca2+-依賴性的)動物凝集素。Sharon，同上。豆類凝集素在它們的一級、二級和三級結構上驚人地相似。Srinivas等，2001，Biochim.Biophy.Acta1527102-111。關于迄今已知的所有豆類凝集素，三級結構由2個反平行的β折疊、1個6-鏈的平“后”β折疊和1個7-鏈的彎曲的“前”β折疊組成。Srinivas等，同上。這些折疊依次連接，形成所謂的“jellyroll”基序。盡管它們在一級、二級和三級結構水平上相似，但豆類凝集素的二聚/四聚體集聚在它們的四級結合和單體組織的模式上表現出顯著差異。Srinivas等，同上。
來自刀豆的伴刀豆球蛋白A(Con A)是已知其結構的豆類家族的第一種凝集素。Con A由237個氨基酸組成，且具有2個金屬結合位點。Becker等，1975，J.Biol.Chem.2501513。在pH 4.5-5.6，Con A以單一的二聚體存在。McKenzie等，1972，Biochim.Biophys.Acta，263283。在pH 7以上，它主要是四聚體。Wang等，1975，J.Biol.Chem.2501490。Con A能與非還原的D-葡萄糖和D-甘露糖反應。Smith等，1967，Arch.Biochem.Biophys.，12188。在這樣的反應中，α-甲基-D-吡喃型葡糖苷可以作為競爭性抑制劑起作用。Smith等，同上。
3.發明概述本發明提供了含有一種或多種分子復合物的組合物，其中每種分子復合物包含凝集素和免疫學和/或生物學活性的糖蛋白(包括糖肽和糖多肽)。在一個實施方案中，分子復合物包含凝集素和免疫學和/或生物學活性的非抗原分子糖蛋白。如本文所使用的，術語“抗原分子”是指能表現出一個或多個抗原決定簇(需要在受試者中針對其發生免疫反應，例如為了治療目的)的分子。在5.2部分給出了抗原分子的非限制性實例。在另一個實施方案中，分子復合物包含凝集素和免疫學和/或生物學活性的抗原分子糖蛋白。在另一個實施方案中，分子復合物包含凝集素、免疫學和/或生物學活性的非抗原分子糖蛋白和抗原分子，所述抗原分子可以是或不是糖蛋白。在一個優選的實施方案中，免疫學和/或生物學活性的分子是治療劑。還提供了制備這樣的組合物的方法和使用該組合物預防或治療疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏病、酶缺乏病、免疫抑制狀況)和在需要的受試者中刺激免疫反應的方法。不受任何理論的限制，本發明部分地基于申請人的發現，即凝集素能促進糖蛋白(包括糖肽和糖多肽)或免疫學和/或生物學活性的包含一種或多種糖蛋白的復合物的低聚反應，且該低聚的復合物與未低聚的分子相比表現出增強的生物活性(體外和體內)。
在一個實施方案中，本發明提供了一種或多種非共價的分子復合物或包含一種或多種非共價的分子復合物的組合物，其中每種分子復合物包含與免疫學和/或生物學活性的糖蛋白結合的凝集素，且其中組合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是相同的，或超過1fg、100fg、500fg、1pg、100pg、500pg、1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。在一個具體的實施方案中，組合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、50ng-250ng或100ng-500ng凝集素/μg糖蛋白。在另一個實施方案中，凝集素相對于糖蛋白是摩爾過量的。在一個實施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一個具體的實施方案中，本發明的分子復合物包含凝集素、抗原分子糖蛋白和另一個分子，例如熱激蛋白(“HSP”)，其可以是或不是糖基化的。在另一個實施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在一個具體的實施方案中，糖蛋白是糖基化的熱激蛋白。在另一個實施方案中，本發明的分子復合物包含凝集素、非抗原分子糖蛋白和抗原分子(其可以是或不是糖蛋白)。在一個具體的實施方案中，抗原分子是能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的蛋白(包括肽和多肽)。
在另一個實施方案中，本發明提供了一種或多種分子復合物或包含一種或多種分子復合物的組合物，每種復合物包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素，其中熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。優選地，復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg熱激蛋白。在一些實施方案中，復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg熱激蛋白。優選地，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg熱激蛋白。
在另一個實施方案中，本發明還提供了一種包含藥學上可接受的載體和一種或多種分子復合物的藥物組合物，其中每種分子復合物包含凝集素和免疫學和/或生物學活性的糖蛋白，且其中所述的糖蛋白能在存在凝集素的情況下在所述的復合物中形成低聚物。在一個實施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一個具體的實施方案中，本發明的分子復合物包含凝集素、抗原分子糖蛋白和另一個分子，例如熱激蛋白(“HSP”)，其可以是或不是糖基化的。在另一個實施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在一個具體的實施方案中，糖蛋白是糖基化的熱激蛋白。在另一個實施方案中，本發明的分子復合物包含凝集素、非抗原分子糖蛋白和抗原分子(其可以是或不是糖蛋白)。在一個優選的實施方案中，抗原分子是能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的蛋白(包括肽和多肽)。在一些實施方案中，糖蛋白是熱激蛋白，且組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。優選地，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、50ng-250ng或100ng-500ng凝集素/μg HSP。在一些實施方案中，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg HSP。優選地，組合物中的凝集素的量相對于HSP的量是0.1ng-5ng、0.1ng-4ng、0.1ng-3ng、0.1ng-2ng、0.1ng-1ng、0.5ng-5ng、0.5ng-3ng或1ng-4ng凝集素/μg糖蛋白。在一些實施方案中，糖蛋白不是熱激蛋白，且組合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是相同的，或超過1fg、100fg、500fg、1pg、100pg、500pg、1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。
在一些實施方案中，本發明的分子復合物包含與復合到抗原分子(例如，抗原蛋白(包括抗原肽和多肽))上的糖基化的熱激蛋白結合的凝集素。有些熱激蛋白是天然糖基化的，包括但不限于gp96、GRP170、肌鈣網蛋白和Bip(GRP78)。通過添加一個或多個在包含熱激蛋白的天然氨基酸序列中不存在的糖基化位點，然后添加碳水化合物基團，或通過將HSP工程改造成含有能結合Con A的肽序列(見Scott等，PNAS(1992)895398-5402)，或使用本領域已知的偶聯化學將HSP共價附著到Con A上，也可以將非天然糖基化的熱激蛋白轉化成糖蛋白。在一些其它的實施方案中，分子復合物包含凝集素，所述凝集素與免疫學和/或生物學活性的非熱激蛋白的糖蛋白結合。在另一些其它的實施方案中，分子復合物包含凝集素，所述凝集素與復合到熱激蛋白(其可以是或不是糖基化的)上的免疫學和/或生物學活性的糖蛋白結合。在一些實施方案中，本發明的分子復合物是非共價復合物。在一些實施方案中，本發明的分子復合物是共價復合物。
在一個優選的實施方案中，本發明的分子復合物中的凝集素是能結合甘露糖的凝集素。在一個具體的實施方案中，本發明的分子復合物中的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。在一個優選的實施方案中，本發明的分子復合物中的熱激蛋白是gp96。在一個具體的實施方案中，本發明的分子復合物是純化的。
本發明還提供了制備本發明的分子復合物的方法。在一些實施方案中，在純化糖蛋白或糖蛋白與其它分子(例如，糖基化的與抗原分子結合的HSP)的復合物之后添加凝集素，以促進糖蛋白的低聚反應。在一些實施方案中，在純化糖蛋白或糖蛋白與其它分子(例如，糖基化的含有抗原分子的HSP)的復合物的過程中添加凝集素，以促進糖蛋白的低聚反應。在一個實施方案中，本發明提供了制備一種或多種非共價復合物的方法，其中每種復合物包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素，且其中所述的熱激蛋白是糖基化的，所述的方法包括下述步驟(a)使所述的凝集素結合到所述的熱激蛋白；和(b)使所述的熱激蛋白與抗原分子復合。在另一個實施方案中，本發明提供了制備一種或多種非共價復合物的方法，其中每種復合物包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素，且其中所述的熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，所述的方法包括使凝集素結合一種或多種復合物，每種復合物包含熱激蛋白和抗原分子，其中所述的凝集素未結合到固相上。在一個具體的實施方案中，該方法包括在使復合物結合凝集素之前，通過基于凝集素的親和層析分離熱激蛋白和抗原分子的復合物。在另一個具體的實施方案中，該方法包括在使復合物結合凝集素之前，通過基于非凝集素的蛋白純化方法(例如基于抗體的親和層析)分離所述的熱激蛋白和抗原分子的復合物。本發明還提供了通過所述方法制備的組合物。
本發明還提供了預防或治療疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制狀況等)的方法，包括給需要的受試者施用預防或治療有效量的包含一種或多種非共價復合物的組合物，其中每種復合物包含與免疫學和/或生物學活性的糖蛋白結合的凝集素。在一個實施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一個具體的實施方案中，復合物包含凝集素、抗原分子糖蛋白和另一個分子，例如熱激蛋白(“HSP”)，其可以是或不是糖基化的。在另一個實施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在一個具體的實施方案中，糖蛋白是糖基化的熱激蛋白。在另一個實施方案中，本發明的分子復合物包含凝集素、非抗原分子糖蛋白和抗原分子(其可以是或不是糖蛋白)。在一個具體的實施方案中，抗原分子是能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的蛋白(包括肽和多肽)。該組合物還可以包含藥學上可接受的載體。
在一個優選的實施方案中，本發明提供了預防或治療疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制狀況等)的方法，包括給需要的受試者施用預防或治療有效量的包含一種或多種非共價復合物的組合物，其中每種復合物包含凝集素、熱激蛋白和抗原分子，其中所述的熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中組合物中凝集素的量相對于HSP的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。優選地，組合物中凝集素的量相對于Hsp的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、50ng-250ng或100ng-500ng凝集素/μg熱激蛋白。在一些實施方案中，組合物中的凝集素的量相對于Hsp的量是相同的，或小于5ng/μg熱激蛋白。優選地，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.1ng-4ng、0.1ng-3ng、0.1ng-2ng、0.1ng-1ng、0.5ng-5ng、0.5ng-3ng或1ng-4ng凝集素/μg熱激蛋白。該組合物還可以包含藥學上可接受的載體。在一個具體的實施方案中，抗原分子是能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的蛋白。
在一個優選的實施方案中，分子復合物的免疫學和/或生物學活性的糖蛋白，例如與能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的肽相復合的熱激蛋白，是受試者自體的；也就是說，它是從受試者自身的細胞分離出的(例如，當需要治療癌癥時，從患者的腫瘤活組織檢查中制備)。或者，分子復合物可以對于本發明的分子復合物的組合物的施用受試者是異源的。或者，分子復合物是體外制備的，例如，從能重組表達熱激蛋白的培養細胞中制備。
在一些實施方案中，本發明涉及預防和治療原發性和轉移性的腫瘤病的方法和組合物。除了癌癥治療外，本發明的組合物可以用于預防多種癌癥，例如，在由于家族史而易患病的受試者中，或在由于環境因素而具有更高的癌癥風險的受試者中。
在一些實施方案中，本發明提供了預防或治療疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制狀況等)的方法，包括給需要的受試者施用預防或治療有效量的包含一種或多種本發明的分子復合物的組合物，并組合施用一種或多種本發明的分子復合物之外的預防或治療劑。在一個實施方案中，本發明提供了預防或治療疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制狀況等)的方法，包括給需要的受試者施用預防或治療有效量的包含一種或多種本發明的分子復合物的組合物，和一種或多種免疫反應增強劑或生物反應調節劑，包括但不限于細胞因子、各種配體的激動劑或拮抗劑、受體和信號轉導分子、免疫刺激核酸和佐劑。根據本發明的該方面，本發明的組合物與這些免疫反應增強劑或生物反應調節劑中的一種或多種在聯合療法中一起使用。在另一個實施方案中，為了治療癌癥，本發明的組合物與放療或一種或多種化療劑組合施用。在另一個實施方案中，為了治療或預防傳染病，本發明的組合物與抗病毒劑、抗細菌劑、抗真菌劑、抗寄生物劑組合施用。
本發明還提供了向受試者的所需位點或所需細胞類型中遞送一種或多種糖蛋白或一種或多種包含糖蛋白的復合物的方法，所述的方法包括給受試者施用一種或多種分子復合物，其中每種分子復合物包含所述的糖蛋白和凝集素。在一個具體的實施方案中，糖蛋白是抗原分子。
本發明還提供了包含多個容器的試劑盒，每個容器包含的藥物制劑或組合物含有足以滿足一次預防或治療施用的劑量的本發明的分子復合物。本發明還提供了包含一個裝有免疫學和/或生物學活性的糖蛋白或其復合物的容器和一個裝有凝集素的容器的試劑盒。在一個具體的實施方案中，本發明提供了一種試劑盒，其包含(a)第一容器，其裝有包含大量非共價復合物的組合物，每種復合物包含熱激蛋白和抗原分子，其中熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的；和(b)裝有純化的凝集素的第二容器。任選地，試劑盒中可以包括關于根據本發明的方法配制低聚的復合物的說明書。
本發明還提供了具體的治療方案和藥物組合物。
4.附圖簡述
圖1.人gp96-肽復合物批次中的始終如一升高水平的Con A。制備了來自4個獨立的人腎腫瘤樣品的組織勻漿物(A至D)，并通過ConA柱層析進行處理。分離Con A洗脫物，一半材料備用。剩余的樣品緩沖液更換為PBS(PD-10柱)，然后經分離DEAE柱進一步純化2種樣品，生成2種勻漿物匹配的終產物——1種在Con A和DEAE柱之間沒有緩沖液更換(無Bx)，1種在兩柱之間有緩沖液更換步驟(Bx)。然后用檢測Con A的靈敏ELISA來確定這些獨立的gp96-肽復合物樣品中的Con A濃度。使用包含緩沖液更換步驟的方法從普通勻漿物中純化出的gp96具有比對應的在省略緩沖液更換步驟時生成的勻漿物匹配的gp96樣品更高水平的Con A。
圖2.Con A存在于低聚化的分子復合物中。制備了來自化學誘導的鼠纖維肉瘤(Meth A)組織的普通勻漿物，并通過Con A柱層析進行處理。分離Con A洗脫物，一半材料備用。剩余的樣品緩沖液更換為PBS，然后經分離DEAE柱進一步純化2種樣品，生成2種勻漿物匹配的終產物——1種在Con A和DEAE柱之間沒有緩沖液更換(無Bx)，1種有緩沖液更換步驟(Bx)。在Superdex 200柱(分別為上、中、下)上通過SEC一起分級分離2種樣品和游離Con A(5μg、50μg/mL)的樣品。通過SDS-PAGE分析收集的級分的gp96(級分1至8；插圖)，并通過針對Con A的直接ELISA評價單獨級分的Con A含量(級分1至14；覆蓋圖)。在無Bx-gp96的制劑中只有少量Con A，但是顯示級分1至5中的用Bx生產的gp96具有Con A。游離Con A洗脫得更晚，表明Bx-gp96樣品中的Con A不是游離的，而是與更高分子量的物質結合的。
圖3.Con A介導gp96的洗脫位置的移動。制備了來自Meth A-誘導的鼠纖維肉瘤組織的普通勻漿物，并使用包含Con A和DEAE柱層析的方法進行處理。將最終的純化的gp96制劑分成2份。向一半材料中加入外源的Con A至終濃度為50μg/mL，向另一半中只加入緩沖液作為對照，將2份樣品均在37℃溫育2小時，然后通過SEC(Superdex 200)分級分離。通過SDS-PAGE、和gp96-和Con A-特異性的ELISA分析各級分。沒有緩沖液更換步驟生產的材料的分析數據如左圖所示；添加了Con A的在右邊。在左圖中，gp96的峰在級分5中，且通過特異性的ELISA檢測到的con A水平較低。在右圖(添加了con A)中，如通過SDS-PAGE(插圖；峰級分3(箭標)和5)和gp96 ELISA(級分3和5)以及集中在級分3的Con A的不同峰所證實的，gp96的2個峰都是明顯的。Con A介導了gp96的洗脫位置的移動。
圖4.人gp96樣品中的Con A的含量與體外效力相關聯。如上所述從4個獨立的人腎腫瘤樣品(A至D)制備了gp96樣品(見圖1)，生成了4對差別僅僅在于包括或省略了Con A和DEAE柱之間的緩沖液更換步驟的樣品。使用CD71系統測定了所有8個樣品的Con A含量(圖A；也見圖1)和體外抗原重新呈遞(圖B)。在每種情況下，與從匹配腫瘤勻漿物生成并通過省略了緩沖液更換步驟的步驟制備的樣品相比，通過包含緩沖液更換步驟(且含有升高水平的con A)的方法制備的材料具有更高的體外重新呈遞活性。
圖5.在鼠CT26系統中，Con A與體外效力相關聯。如上關于源自人腫瘤的樣品所述(見圖1)，從2個獨立的鼠CT26腫瘤樣品(制劑A和B)，制備了gp96樣品。使用CT26系統測定了所有4個樣品的Con A含量(圖A)和體外抗原重新呈遞(圖B)。在每種情況下，與從匹配腫瘤勻漿物生成并通過省略了緩沖液更換步驟的步驟制備的樣品相比，通過包含緩沖液更換步驟(且含有增加量的Con A)的方法制備的材料具有更高的體外重新呈遞活性。
圖6.Con A與體外Meth A重新呈遞測定和體內鼠Meth A腫瘤保護模型中的效力相關聯。從普通的腫瘤勻漿物(上面圖1所述)制備了2份分開的Meth A gp96制劑，生成一對差別僅僅在于包括或缺少Con A和DEAE柱之間的緩沖液更換步驟的樣品。通過Con A ELISA測定這些樣品的Con A含量(圖A)、在Meth A重新呈遞測定中的體外活性(圖B)和以10μg劑量在meth A腫瘤保護測定中的體內活性(圖C)。與通過缺少緩沖液更換步驟的方法制備的樣品相比，通過包含Con A和DEAE柱之間的緩沖液更換步驟的方法制備的Meth A gp96具有升高的Con A含量、更高的體外抗原重新呈遞和更高的體內腫瘤保護活性。
圖7.外源的Con A會增加CD71體外重新呈遞測定中的gp96活性。勻漿人肝組織，并離心，生成11K上清液，分成3等份樣品，并通過不同的方法進行處理。2個批次進行Con A柱層析處理，分離ConA洗脫物，一半材料備用。剩余的樣品緩沖液更換為PBS，然后經分離DEAE柱進一步純化2種樣品，生成2種勻漿物匹配的終產物——1種在Con A和DEAE柱之間沒有緩沖液更換(無Bx-樣品A)，1種在兩柱之間有緩沖液更換步驟(Bx-樣品B)。如(Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)4175-4178)所述，使用gp96-特異性的scFv柱從剩余的11K上清液中純化gp96，濃縮洗脫物，生成樣品D。通過Con A特異性的ELISA分析所有樣品的Con A濃度和在與μg/mL的蛋白濃度時CD71系統中的體外抗原重新呈遞。關于匹配的樣品對，通過包含緩沖液更換步驟的方法生產的材料(樣品#1；Con A含量7.5ng/μg總蛋白)比通過省略了緩沖液更換步驟的方法生產的材料(樣品A；con A含量0.43ng/μg總蛋白)更具有體外活性。通過沒有使用Con A柱純化步驟的一步方法生產的材料(scFv gp96；0ng/μg)具有類似于樣品A的低體外活性。向樣品A和C中添加外源的Con A至與在樣品B中相同的水平(7.5ng con A/μg總蛋白)，會將特異性的體外抗原重新呈遞活性增加到與樣品B中相似的水平。該Con A水平對T細胞自身無影響。
圖8.低聚物種類是甲基α-D-吡喃型甘露糖苷(α-MM)靈敏的。通過包括Con A和DEAE層析(沒有緩沖液更換)的標準純化方法純化了meth A gp96樣品，使用superose 6柱(Pharmacia)、通過分析型SEC分析了蛋白，其表明蛋白制劑主要含有二聚體的gp96(gp96 T＝0)。向該gp96樣品(濃度500μg/ml)的等分試樣中加入Con A(最終50μg/mL)，在室溫溫育樣品，每小時一次取樣(T＝1至T＝5)，并進行SEC分析。還進行了只包含Con A的樣品。con A的加入介導了gp96二聚體峰的洗脫位置的移動，其在第一時間點后僅僅有輕微變化。gp96自身在該時間段內不能改變(gp96 T＝5)。在最后的時間點后，取出最后5小時樣品的2份獨立的等分試樣，加入等體積的PBS或含有10％α-MM的PBS。然后通過SEC重新分析每份樣品。加入了PBS的樣品沒有明顯變化(未顯示)。α-MM的添加離解了高分子量復合物(gp96+con A T＝5+αMM)，產生與原始的gp96樣品(gp96T＝0或T＝5)類似的SEC圖。
圖9.低Con Agp96化學計量會介導gp96洗脫位置的SEC靈敏性移動。通過包含Con A和DEAE層析的標準純化方法純化了人腎腫瘤gp96，使用superose 6柱(Pharmacia)，通過分析型SEC分析了蛋白。向gp96(180μg/mL)中加入Con A至終濃度為0.005-50μg/mL，在室溫溫育樣品1小時，并進行SEC分析。約1 Con A10gp96的化學計量能產生gp96洗脫位置的SEC靈敏性移動。
圖10.甲基α-D-吡喃型甘露糖苷的加入會造成CT26體外抗原重新呈遞活性的濃度依賴性的降低。在稀釋(1∶5)進含有RAW264.7 APC細胞和AH1特異性的T-細胞的微量滴定板孔之前，在存在50、100或400mM α-MM的情況下，將CT26-衍生的gp96的樣品(通過Bx方法制備)和陽性對照9聚體肽(SPSYVYHQF)溫育30分鐘。將樣品溫育過夜，通過INF-γ特異性的ELISA分析得到的上清液。α-MM造成了CT26抗原重新呈遞的劑量依賴性的降低，且對陽性對照9聚體肽的T細胞識別沒有影響。
圖11.在純化Hsp-肽的過程中加入Con A造成了HSPPC-96的腫瘤排斥活性的可滴定的增加。
圖12.Con A增加了gp96的腫瘤排斥活性。(A)在純化Hsp-肽的過程中加入Con A。(B)將Con A加入終產物。
圖13.Con A增加了通過免疫親和柱純化的HSPPC-96的腫瘤排斥活性。
5.發明詳述本發明涉及使用凝集素來促進糖蛋白或包含糖蛋白的免疫學和/或生物學活性的復合物的低聚反應。優選地，糖蛋白的生物學活性對其施用受試者是治療性的。具體地，本發明提供了一種或多種分子復合物或包含一種或多種分子復合物的組合物，其中每種分子復合物包含凝集素和免疫學活性的(即免疫原的)和/或生物學活性的糖蛋白(包括糖肽和糖多肽)。如本領域的技術人員能夠明白的，當在復合物的上下文中使用時(即作為復合物的組分)，“一種”凝集素、“一種”糖蛋白或“一種”任何其它分子分別是指“至少一種”凝集素、“至少一種”糖蛋白或“至少一種”任何其它分子，除非另有特別說明。在一些實施方案中，本發明的分子復合物是非共價的分子復合物。在一些實施方案中，本發明的分子復合物是共價復合物。還提供了制備分子復合物的方法和使用分子復合物或包含這樣的分子復合物的組合物來預防和治療各種疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制狀況等)和在有需要的受試者中誘發免疫反應的方法。本發明可以用于多種情形，包括但不限于需要調節免疫治療劑和/或生物學活性的分子的生物學效力的情形；需要通過特異性的和/或替代性的受體或非受體介導的事件來改善疫苗向呈遞抗原細胞中的送遞的情形；需要改善免疫治療劑和/或生物學活性部分向目標靶的送遞的情形；需要改善免疫治療部分的佐劑能力；或者需要捕獲第二種免疫治療劑/免疫活性部分，并通過特異性的受體-介導的攝入，將它們送遞進呈遞抗原細胞中的情形。
如本文所使用的，除非另有說明，當以單數形式使用術語“分子”、“復合物”、“分子復合物”、“糖蛋白”、“糖肽”、“熱激蛋白”、“糖基化的熱激蛋白”和“凝集素”時，也包括多個分子，且可以指大量優選的分子。
如本文所使用的，除非另有說明，術語“糖蛋白”是指包含蛋白和一種或多種碳水化合物部分的分子。糖蛋白可以是天然存在的糖蛋白，或通過合成糖基化方法形成，即在該方法中將碳水化合物連接到蛋白分子上。糖蛋白可以是糖肽或糖多肽。天然存在的糖蛋白的非限制性實例包括但不限于人生長激素、紅細胞生成素(EPO)、抗體、組織纖溶酶原激活物(tPA)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和葡糖腦苷脂酶(來自Genzyme的CerezymeTM)。在一個優選的實施方案中，糖蛋白是熱激蛋白。在另一個優選的實施方案中，糖蛋白是免疫活性的熱激蛋白。如本文所使用的，“免疫活性的熱激蛋白”是指能調節(優選地增強)免疫反應(優選針對熱激蛋白所復合的抗原分子的免疫反應)的熱激蛋白。如本文所使用的，術語“抗原分子”是指表現出一種或多種抗原決定簇(在受試者中需要針對它的免疫反應，例如為了治療目的)的分子。抗原分子的非限制性實例如5.2部分所述。在一個優選的實施方案中，糖蛋白是糖基化的熱激蛋白，包括但不限于gp96、GRP170、肌鈣網蛋白和Bip(GRP78)。優選地，糖基化的熱激蛋白是gp96。在某些實施方案中，糖蛋白還可以是抗原分子，其可以是天然存在的糖蛋白或工程改造成糖蛋白的抗原分子。抗原分子的非限制性實例如5.2部分所述。在某些實施方案中，本發明的分子復合物包含凝集素和未變性的糖蛋白。
通過添加一種或多種在天然氨基酸序列中不存在的糖基化位點，并在可以對蛋白進行糖基化的宿主細胞中重組表達蛋白，可以將蛋白(包括肽和多肽)遺傳地工程改造成糖蛋白。蛋白的糖基化一般是N-連接的或O-連接的。術語“N-連接的”是指碳水化合物部分向天冬酰胺殘基的側鏈的附著。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸，其中X是脯氨酸之外的任意氨基酸，是碳水化合物部分向天冬酰胺側鏈酶促附著的識別序列。因而，這些三肽序列中的任一個在多肽中的存在，都會產生潛在的糖基化位點。術語“O-連接的糖基化”是指諸如N-乙酰基半乳糖胺、半乳糖或木糖的糖中的一個向羥基氨基酸的附著，最常見的是絲氨酸或蘇氨酸，盡管5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸也可以使用。
可以通過多種方法實現糖基化位點的添加。例如，可以改變目標蛋白或肽的氨基酸序列，從而使其含有一種或多種上述的三肽序列(對于N-連接的糖基化位點)。還可以通過向天然序列添加一種或多種絲氨酸或蘇氨酸殘基或用其取代，來進行改變(對于O-連接的糖基化位點)。通過DNA水平的變化，特別是通過在預選的堿基處突變能編碼目標蛋白的DNA，從而使產生的密碼子會翻譯成需要的氨基酸，可以任選地改變氨基酸序列。可以進行DNA突變，例如使用美國專利號5,364,934所述的方法。
增加蛋白(包括肽和多肽)上的碳水化合物部分的數目的另一種方法是向蛋白化學或酶促地偶聯糖苷。依賴于使用的偶聯模式，糖可以附著到(a)精氨酸和組氨酸，(b)游離的羧基，(c)游離的巰基，例如半胱氨酸的那些，(d)游離的羥基，例如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的那些，(e)芳族殘基，例如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的那些，或(f)谷氨酰胺的酰胺基團。可以使用本領域已知的任何方法，例如國際公開號WO 87/05330和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.，pp.259-306(1981)中所述的方法。一旦將一種或多種碳水化合物添加到蛋白上，凝集素就可以通過結合到碳水化合物單元上而與蛋白形成復合物。
在本發明的一些實施方案中，糖蛋白表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性。在本發明的一些其它的實施方案中，糖蛋白未表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性。在一些實施方案中，糖蛋白是熱激蛋白，且熱激蛋白陪伴(體內)或復合的蛋白表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性。
如本文所使用的，術語“抗原性”是指分子結合抗體或MHC分子的能力。如本文所使用的，“一類癌癥”是指起源組織的細胞類型，例如，乳房、肺、卵巢。在一個實施方案中，抗原分子表現出對傳染因子的抗原的抗原性。在另一個實施方案中，抗原分子表現出對在癌細胞中相對于其在所述的細胞類型的非癌細胞中的表達而言超表達的抗原的抗原性。在另一個實施方案中，抗原分子是腫瘤特異性的抗原或腫瘤-相關抗原。在另一個實施方案中，分子復合物是純化的。在另一個實施方案中，純化的分子復合物包含與熱激蛋白和傳染因子的抗原分子或在癌細胞中相對于其在所述細胞類型的非癌細胞中的表達而言超表達的抗原結合的凝集素。
本領域已知了許多凝集素。術語“凝集素”是指共有結合特異性的碳水化合物基團的性質的蛋白組。可以從天然來源純化凝集素，例如從植物、動物、真菌、藻類和細菌，或者可以化學合成它。在某些實施方案中，凝集素通過本領域已知的任意方法彼此交聯，以形成用于本發明的二聚體或低聚物。在一個優選的實施方案中，凝集素分子是能結合甘露糖的凝集素，其可以是、但不限于表1所列的那些。凝集素可以商業上從許多商業供應商獲得，例如Sigma(見Sigma的網站sigmaaldrich.com/Brands/Sigma/Enzyme_Explorer_Home/Lectin_for_life_Science.html)。在一個優選的實施方案中，凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。
表1.凝集素的實例
本發明提供了包含凝集素和糖蛋白(其可以是或不是抗原分子)的分子復合物和包含凝集素、糖蛋白以及非糖蛋白的分子(例如，抗原分子)的分子復合物。本發明的每種分子復合物可以包含一種或多種糖蛋白分子、一種或多種凝集素分子和一種或多種抗原分子(如果在復合物中存在的話)。優選地，復合物包含超過一種能在有凝集素存在時形成低聚物的糖蛋白分子。當分子復合物包含超過一種糖蛋白時，糖蛋白不需要是均質的，即群體中的一些糖蛋白是抗原分子，而一些糖蛋白不是抗原分子。本發明的分子復合物的組分的化學計量可以通過比例(g)∶(l)∶(a)予以表達，其中(g)、(l)和(a)可以是任意的整數，且(g)是復合物中的糖蛋白分子(其可以是或不是抗原分子)的數目，(l)是復合物中的凝集素分子的數目，且(a)是復合物中的其它分子(例如，非糖蛋白的抗原分子)的數目。在復合物中，當沒有其它分子(例如，非糖蛋白的抗原分子)時，a＝0。例如，分子復合物可以包含一種糖蛋白(其可以是或不是抗原分子)和一種凝集素。在另一個實例中，分子復合物可以包含一種凝集素、兩種熱激蛋白和兩種抗原分子。本發明還包括更多的組合。在一個優選的實施方案中，l大于g，即分子復合物中的凝集素的數目大于分子復合物中的糖蛋白的數目。在一些實施方案中，糖蛋白和凝集素的摩爾比是3∶1、2∶1或1∶1。在一個優選的實施方案中，凝集素是四聚體形式的Con A，且對于每個四聚體Con A分子，附著有3個、2個或1個糖蛋白。
因此，在一個實施方案中，本發明提供了復合物的均質群體，其中所有復合物的(g)∶(l)∶(a)化學計量比都是相同的或大致相同的。在另一個實施方案中，本發明提供了復合物的群體，其中復合物表現出超過一種(g)∶(l)∶(a)比例，或者該比例對于群體中的所有復合物都是未知的，即本發明的分子復合物的組分的化學計量可以在群體的分子復合物中有所變化。在本發明的實施方案中，當尚未確定復合物或復合物群體的化學計量比時，在大多數情況下可以使用每種組分的質量比來表征復合物或復合物群體。例如，可以通過凝集素和糖蛋白(包括熱激蛋白)的相對量來表征復合物群體，從而與其它群體區別開。下文的5.4部分中提供了這樣的復合物和測定質量比的方法的實例。在一些實施方案中，優選包含熱激蛋白、凝集素和抗原分子的復合物，其中凝集素相對于熱激蛋白的量為大于或等于5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。在其它的實施方案中，優選包含熱激蛋白、凝集素和抗原分子的復合物，其中凝集素相對于熱激蛋白的量為小于或等于5ng、4ng、3ng、2ng或1ng。
在一個優選的實施方案中，分子復合物包含凝集素、糖基化的熱激蛋白和能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的蛋白。在另一個優選的實施方案中，分子復合物包含凝集素和免疫學和/或生物學活性的糖蛋白，其中所述的免疫學和/或生物學活性的糖蛋白可以是、但不限于人生長激素、紅細胞生成素(EPO)、抗體治療劑、組織纖溶酶原激活物(tPA)、粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)和CerezymeTM(Genzyme)。在另一個優選的實施方案中，分子復合物包含凝集素和免疫學和/或生物學活性的糖蛋白，其中所述的免疫學和/或生物學活性的糖蛋白是抗原分子。
在一些實施方案中，本發明提供了一種或多種分子復合物，每種復合物包含凝集素和免疫學和/或生物學活性的糖蛋白，其中凝集素與糖蛋白形成低聚物，且其中復合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是相同的，或超過1fg、100fg、500fg、1pg、100pg、500pg、1ng、2ng、5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。優選地，復合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg糖蛋白。在一些實施方案中，復合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg糖蛋白。優選地，復合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量為0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg糖蛋白。分子復合物還可以包含一種或多種其它的能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的分子，優選蛋白(包括肽和多肽)。在一些實施方案中，糖蛋白是熱激蛋白。在一些實施方案中，糖蛋白不是熱激蛋白。在一些實施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一些實施方案中，糖蛋白不是抗原分子。
本發明還提供了一種或多種分子復合物，每種復合物包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素，其中復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。優選地，復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg熱激蛋白。在一些實施方案中，復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg熱激蛋白。優選地，復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg熱激蛋白。
在一些實施方案中，本發明提供了一種包含一種或多種分子復合物和藥學上可接受的載體的藥物組合物，其中每種分子復合物是包含凝集素和免疫學的和/或生物學活性的糖蛋白的非共價復合物。在一些實施方案中，糖蛋白是熱激蛋白，且復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。優選地，復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg熱激蛋白。在一些實施方案中，復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg熱激蛋白。優選地，復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg熱激蛋白。分子復合物還可以包含一種或多種分子，優選能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的蛋白。
在一些實施方案中，本發明提供了分子復合物的純化的群體，其中每種復合物包含免疫學和/或生物學活性的糖蛋白和凝集素。在一些實施方案中，糖蛋白是熱激蛋白，且群體中凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。優選地，群體中凝集素的量相對于熱激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg熱激蛋白。在一些實施方案中，群體中凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg熱激蛋白。優選地，群體中凝集素的量相對于熱激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg熱激蛋白。分子復合物還可以包含一種或多種能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的分子，例如蛋白(包括肽和多肽)。在一個實施方案中，群體的分子復合物包含相同的抗原分子。在另一個實施方案中，群體的分子復合物包含不同的抗原分子。本發明還提供了包含與從重組細胞中純化出的復合物結合的凝集素的分子復合物的純化群體，其中每種復合物包含與能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的蛋白結合的糖蛋白。
本發明還提供了制備組合物的方法，其優選地對疾病(例如，對一類癌癥或傳染病因子)是免疫原性的，所述方法包括添加凝集素分子來促進分子復合物的低聚反應的步驟，其中所述的分子復合物通過本申請的5.1-5.4部分所述的方法或本領域已知的方法制備。在一個實施方案中，低聚化的分子復合物包含凝集素和免疫學和/或生物學活性的糖蛋白(其可以是或不是抗原分子)。在另一個實施方案中，低聚化的分子復合物包含凝集素、糖蛋白和抗原分子，其中所述的抗原分子表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性。在另一個實施方案中，低聚化的分子復合物包含凝集素、熱激蛋白和免疫學和/或生物學活性的糖蛋白。在另一個實施方案中，分子復合物包含凝集素、糖基化的熱激蛋白和抗原分子，且其中所述的抗原分子表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性。本發明還提供了通過所述方法制備的組合物。
在一個實施方案中，制備免疫學和/或生物學活性的糖蛋白或包含免疫學和/或生物學活性的與一種或多種非凝集素的其它分子結合的糖蛋白的復合物的步驟不包括凝集素的應用，例如結合到固相上的凝集素，其一般用在柱層析中。將凝集素添加到免疫學和/或生物學活性的糖蛋白制劑或復合物制劑中，以促進糖蛋白的低聚反應。在另一個實施方案中，添加凝集素是制備免疫學和/或生物學活性的糖蛋白(或與一種或多種非凝集素的其它分子結合的糖蛋白)的一個步驟或步驟的一部分，其中添加的凝集素的量足以促進制劑的低聚反應，并生成最終的產品。在一些實施方案中，分子復合物包含熱激蛋白和凝集素，且添加凝集素從而使終產品中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。優選地，終產品中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg熱激蛋白。在一些實施方案中，添加的凝集素的量足以促進制劑的低聚反應和生成終產品，其中終產品中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg熱激蛋白。優選地，終產品中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg熱激蛋白。在一個優選的實施方案中，凝集素是Con A。
在一個優選的實施方案中，所述的糖蛋白是糖基化的熱激蛋白(Hsp)，包括天然存在的糖基化的熱激蛋白(例如，gp96，GRP170，肌鈣網蛋白，Bip(GRP78)或其組合)和非天然地糖基化的熱激蛋白，后者通過添加一種或多種在編碼熱激蛋白的天然序列中不存在的糖基化位點、隨后添加碳水化合物基團來轉化成糖蛋白。免疫學和/或生物學活性的復合物還可以包含能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的分子。在其中抗原分子是體內復合到Hsp上的蛋白的實施方案中，可以從細胞中分離出復合物(見5.1部分)。或者，可以從Hsp和抗原分子的純化制劑體外生產出Hsp-抗原復合物(見5.3部分)。在該實施方案中，癌癥或傳染因子的抗原可以通過從天然來源純化、通過化學合成或重組地得到。凝集素可以通過體外方法(例如5.1至5.4部分所述的那些)與體內和體外生成的Hsp-抗原復合物形成低聚物。在一個優選的實施方案中，所述的凝集素是能結合甘露糖的凝集素分子。更優選地，能結合甘露糖的凝集素分子是伴刀豆球蛋白A(Con A)。
本發明的組合物和方法可以用于多種情形。例如，本發明的組合物可以用于增強分子復合物的免疫原性和/或在治療或預防疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏、酶缺乏病或免疫抑制狀況)的受試者中引起免疫反應。如本文所使用的，術語“受試者”是指患有該病或易患該病的動物，優選哺乳動物，更優選人。
根據本發明，給受試者施用低聚化的免疫學和/或生物學活性的復合物會在受試者中引起、刺激、調制(包括增強和下調)和/或維持免疫反應和/或生物學活性，特別是針對對目標抗原來源特異性的抗原蛋白。低聚化的復合物可以作為一劑或多劑進行施用。預防或治療劑量可以隨不同的受試者和不同的治療或預防用途而變化。
在一個實施方案中，本發明提供了通過亞免疫性量的疫苗組合物誘導免疫反應的方法，其中低聚反應會通過適量的疫苗組合物(其在未低聚地使用時不足以誘導免疫反應)來促進免疫反應的誘導。
本發明還可以用于通過添加凝集素形成低聚物來增加免疫治療性部分和/或生物學活性部分的生物學活性。如本文所使用的，術語“免疫治療性部分”是指其是免疫治療復合物的一部分的分子。如本文所使用的，術語“低聚物”是指2個或多個單元的復合物(例如，包含一種凝集素分子和一種HSP分子的復合物，或包含一種凝集素分子和兩種HSP分子的復合物，等)。在一個實施方案中，本發明的低聚物是包含免疫治療性部分和/或生物學活性部分和凝集素的二聚體。在另一個實施方案中，免疫治療性部分和/或生物學活性部分形成更高級的種類，即具有超過2個亞基的低聚物。根據本發明，免疫治療性部分和/或生物學活性部分的低聚會增加其生物學活性。在一個優選的實施方案中，本發明的低聚物包含凝集素分子和gp96。
本發明還可以用于通過受體介導的事件來增加疫苗向呈遞抗原細胞(APC)中的攝入。不受任何理論的限制，通過受體介導的事件來增加疫苗向APC中的攝入的一種可能的解釋是，與非低聚化的復合物(其中僅僅一個亞基與受體相互作用)相比，免疫學和/或生物學活性的復合物中的低聚物的多個亞基會增加與呈遞抗原細胞上的受體的相互作用。在一個具體的實施方案中，受體是CD91。
本發明還可以用于通過非-受體介導的事件來增加疫苗向呈遞抗原細胞中的攝入。一些免疫學和/或生物學活性的包含糖蛋白的復合物不通過受體-介導的事件來起作用。而且，即使當免疫學和/或生物學活性的復合物通過受體-介導的事件發揮它的一些功能時，它仍然可以通過非-受體介導的事件來發揮相同的或一些其它的功能。例如，呈遞抗原細胞可以通過非-受體介導的事件攝入與抗原性肽結合的熱激蛋白，所述事件包括但不限于胞飲作用、吞噬作用和與細胞表面組分的非-特異性相互作用和隨后Hsp-肽復合物插入和/或跨細胞膜的移位。根據本發明，低聚反應將增加這種攝入。生物學活性部分的低聚反應也會增強它們向靶位點的遞送。
在一個具體的實施方案中，本發明提供了向受試者的免疫系統遞送抗原分子的方法，包括施用包含凝集素和所述的抗原分子的分子復合物，其中抗原分子是天然存在的糖蛋白或已經工程改造成糖蛋白的蛋白。
本發明還可以用于改善免疫治療性部分的佐劑能力。如本文所使用的，術語“佐劑能力”是指非抗原物質與抗原一起增強免疫反應的能力，其通過例如誘導炎性反應實現，這導致免疫活性的細胞(例如能形成抗體的細胞和T淋巴細胞)的局部流入。具有佐劑能力的免疫治療性部分在治療上用于制備疫苗，因為它們能增強生成針對小量抗原的抗體，并延長抗體生成的時間段和/或細胞免疫反應的水平(例如，T淋巴細胞)。不受任何理論的限制，免疫治療性部分和/或生物學活性部分的低聚反應會提高它們的佐劑能力。如本文所使用的，免疫治療性部分和/或生物學活性部分是指糖蛋白(包括天然存在的糖蛋白和化學合成的糖蛋白)。在一個優選的實施方案中，糖蛋白是糖基化的熱激蛋白，包括但不限于gp96，GRP170，肌鈣網蛋白，Bip(GRP78)或其組合。
本發明還可以用于改善免疫治療性部分和/或生物學活性部分的遞送。不受任何理論的限制，免疫治療性部分和/或生物學活性部分的低聚反應可以使復合物能開發替代性的和更有效的進入靶位點(例如，器官例如腎、肺、肝、心；組織；或細胞，例如呈遞抗原細胞、紅細胞(“RBC”)、巨噬細胞、淋巴細胞或參與特定的信號轉導途徑的細胞)的途徑。
本發明還提供了在受試者中捕獲第二種免疫治療性部分并通過受體介導的攝入將所述的部分遞送進呈遞抗原細胞的方法，包括給受試者施用分子復合物的組合物，其中所述的分子復合物包含在有凝集素分子存在的情況下與第二種糖蛋白低聚化的第一種糖蛋白，組合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。優選地，組合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg糖蛋白。在一些實施方案中，組合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是相同的，或低于5ng/μg糖蛋白。優選地，組合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg糖蛋白。分子復合物還可以包含一種或多種能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的分子，優選肽。在一個實施方案中，第二種糖蛋白與第一種糖蛋白不同。在另一個實施方案中，第一種糖蛋白可以被呈遞抗原細胞攝入，且第二種糖蛋白一般不會被呈遞抗原細胞或前述的其它靶細胞攝入，而第一種糖蛋白與第二種糖蛋白的低聚反應使第二種糖蛋白能被呈遞抗原細胞攝入。
在一個具體的實施方案中，第一種糖蛋白是糖基化的熱激蛋白中的成員，而第二種糖蛋白選自相同的組但是是不同的成員。在另一個實施方案中，第一種糖蛋白是糖基化的熱激蛋白的成員，而第二種糖蛋白不是熱激蛋白。在另一個實施方案中，第一種糖蛋白不是熱激蛋白，而第二種糖蛋白是熱激蛋白。在另一個實施方案中，第一種和第二種糖蛋白都是熱激蛋白。在一個優選的實施方案中，第一種糖蛋白還與能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的抗原分子結合。在另一個優選的實施方案中，第二種糖蛋白還與能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的抗原分子結合。
本發明還提供了治療或預防疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、免疫抑制狀況、酶缺乏或激素缺乏)的方法，包括給需要的受試者施用治療或預防有效量的本發明的組合物。在一個實施方案中，組合物包含純化的含有熱激蛋白、抗原分子和凝集素分子的非共價復合物，其中熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，其中抗原分子表現出對所述類型癌癥的抗原或所述傳染病因子的抗原的抗原性，且其中組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。優選地，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg熱激蛋白。在一些實施方案中，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg熱激蛋白。優選地，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg熱激蛋白。
在另一個實施方案中，組合物是包含分子復合物和藥學上可接受的載體的藥物組合物，其中分子復合物包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素分子，其中熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，其中抗原分子表現出對所述類型癌癥的抗原或所述傳染病因子的抗原的抗原性，且其中組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。優選地，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg熱激蛋白。在一些實施方案中，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg熱激蛋白。優選地，組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg熱激蛋白。
在另一個實施方案中，本發明還提供了治療或預防疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、免疫抑制狀況、酶缺乏或激素缺乏)的方法，包括給需要的受試者施用(a)糖蛋白(例如，糖基化的Hsp)、凝集素和第一種抗原分子的一種或多種分子復合物，其中第一種抗原分子表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性，且其中抗原分子可以是或不是糖基化的，且其中復合物中凝集素的量相對于糖蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg糖蛋白。優選地，復合物中凝集素的量相對于糖蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg糖蛋白。在一些實施方案中，復合物中凝集素的量相對于糖蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg糖蛋白。優選地，復合物中凝集素的量相對于糖蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg糖蛋白；和(b)在施用分子復合物之前、同時或之后，給受試者施用包含呈遞抗原細胞的組合物，所述呈遞抗原細胞是用敏化量的與凝集素分子和第二種抗原分子結合的第二種糖蛋白分子復合物體外敏化的，其中所述的第二種抗原分子表現出對所述類型的癌癥的第二種抗原或所述傳染病因子的第二種抗原的抗原性。APC可以選自本領域已知的那些呈遞抗原細胞，包括但不限于巨噬細胞、樹突細胞、B淋巴細胞和其組合，且優選巨噬細胞。在一個實施方案中，第一種分子復合物與用于敏化APC的第二種分子復合物相同。在另一個實施方案中，第一種分子復合物與用于敏化APC的第二種分子復合物不同。在一個特定的實施方案中，其中APC和本發明的組合物同時施用，APC和本發明的組合物可以存在于相同的組合物(包含APC和分子復合物)或不同的組合物中。根據本發明的過繼免疫治療(使用敏化的APC)使得能通過與低聚化的分子復合物一起溫育來活化免疫呈遞抗原細胞。優選地，在體內使用細胞之前，完成對腫瘤或傳染因子的反應性的體外測量。該體外增強后，進行克隆選擇和/或擴充，且向患者施用構成有用的治療/預防方案。在一個優選的實施方案中，糖蛋白是糖基化的熱激蛋白。
在一個優選的實施方案中，分子復合物的免疫學和/或生物學活性部分，例如復合到能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的蛋白的熱激蛋白，是受試者自體的；也就是說，它是從受試者自身分離出的(例如，當需要治療癌癥時，從患者的腫瘤活組織檢查中制備)。或者，分子復合物可以對于本發明分子復合物的組合物的施用受試者是異源的。可以體外制備分子復合物，例如，從能重組表達熱激蛋白的培養細胞中制備。熱激蛋白可以是天然地糖基化的熱激蛋白(例如，gp96，GRP170，肌鈣網蛋白，Bip(GRP78)，或其組合)、轉化成糖蛋白的非天然地糖基化的熱激蛋白或其組合。
可以用于與糖蛋白復合以形成特定的復合物的外源抗原和其片段和衍生物可以選自本領域已知的那些，以及通過本領域已知的標準免疫測定、借助于結合抗體或MHC分子(抗原性)或產生免疫反應(免疫原性)的能力能容易地鑒別出的那些。外源抗原的非限制性實例包括但不限于癌癥特異性的抗原、癌癥相關抗原、由感染了病原體或轉染了能編碼腫瘤特異性抗原的基因的細胞系或受試者表達的抗原，腫瘤相關抗原或病原體因子的抗原。糖蛋白和抗原分子的特異性復合物可以從患者的癌癥或癌前期組織、或從癌細胞系中分離，或者可以體外生產(如在其中外源抗原用作抗原分子的實施方案中所必需的)。
本發明還提供了包含多個容器的試劑盒，每個容器裝有包含一劑足以進行一次免疫原性施用的本發明的分子復合物的藥物制劑或組合物。本發明還提供了包含裝有免疫活性的糖蛋白或其復合物的容器和裝有凝集素的容器的試劑盒。任選地，試劑盒中可以包括根據本發明的方法制備低聚復合物的說明書。
在一個具體的實施方案中，本發明涉及預防和治療原發性和轉移性的腫瘤性疾病的方法和組合物。
本發明的治療方案和藥物組合物可以與另一種治療方法或預防方法一起使用，例如其它的免疫反應增強劑或生物反應調節劑，包括但不限于細胞因子、各種配體的激動劑或拮抗劑、受體和信號轉導分子、免疫刺激核酸和佐劑。根據本發明的這一方面，本發明的組合物在組合療法中與這些免疫反應增強劑或生物反應調節劑中的一種或多種一起施用。在另一個實施方案中，本發明的組合物與用于治療癌癥的放療或一種或多種化療劑一起施用。
除了癌癥治療外，本發明的組合物可以用于預防多種癌癥，例如，在由于家族史而易患病的受試者中或在由于環境因素而具有更高的癌癥風險的受試者中。
本發明提供了具體的治療方案、藥物組合物和試劑盒。
5.1.熱激蛋白制備在本發明的一些實施方案中，分子復合物包含與復合到抗原分子(例如，一種或多種能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性的蛋白(包括肽和多肽))上的糖基化的熱激蛋白結合的凝集素。在一些其它的實施方案中，分子復合物包含與糖基化的熱激蛋白結合的凝集素。可以獨立制備熱激蛋白或Hsp-抗原分子復合物，且作為附加步驟添加凝集素來促進Hsp或Hsp-抗原分子復合物的低聚反應。
熱激蛋白(Hsp)在本文中可互換地稱作應激蛋白，且可以選自能滿足下述標準的任何細胞蛋白當細胞暴露于應激刺激時，該蛋白的胞內濃度會增加；它能結合其它蛋白；在有腺苷三磷酸(ATP)或低pH(例如，pH 1，2，3，4，5或6)存在時，它能釋放結合的蛋白；且該蛋白表現出與具有上述性質中的任一項的任意細胞蛋白至少35％的同源性。熱激蛋白的非限制性實例記載在Srivastava，Nature Reviews(Immunology)2185-194(2002)中，其完整內容在這里引作參考。在一些實施方案中，僅僅使用天然糖基化的熱激蛋白，其包括但不限于gp96、肌鈣網蛋白、GRP 170、Bip(GRP78)或其非共價的或共價的復合物。在本發明的一些實施方案中，通過添加一種或多種在熱激蛋白的天然序列中不存在的糖基化位點并隨后添加碳水化合物，將熱激蛋白轉化成糖基化的熱激蛋白。
根據本文所述的方法，在本發明的組合物中采用的每種特異性的Hsp-抗原復合物(Hsp-蛋白復合物)優選地純化成60-100％的總mg蛋白，或至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的總mg蛋白。在另一個實施方案中，每種特異性的Hsp-抗原分子復合物純化成表觀均質的，如通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳所測定的。
在一個優選的實施方案中，從由癌癥患者得到的腫瘤細胞，在手術后純化和制備了Hsp(例如，hsp70，hsp90和gp96)和蛋白的非共價復合物，以用作本發明的組合物中的特異性的復合物。
根據本文所述的方法，內源地復合到Hsp或MHC抗原上的免疫原性的或抗原性的蛋白(包括肽和多肽)可以用作特異性的抗原分子。例如，可以制備這樣的蛋白，其能刺激針對不同的腫瘤抗原(例如，酪氨酸酶，gp100，melan-A，gp75，粘蛋白，等)和病毒蛋白的細胞毒性T細胞反應，所述病毒蛋白包括但不限于I型免疫缺陷病毒(HIV-I)、II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)、甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、水痘、腺病毒、I型單純皰疹病毒(HSV-I)、II型單純皰疹病毒(HSV-II)、牛疫、鼻病毒、艾可病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒、巨細胞病毒、echinovirus、蟲媒病毒、huntavirus、柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒和脊髓灰質炎病毒的蛋白。在抗原分子是體內地復合到Hsp上的蛋白的實施方案中，可以從細胞分離出復合物。或者，可以從Hsp和抗原分子的每種純化的制劑體外生產復合物。在一些實施方案中，抗原分子是外源的抗原和其片段和衍生物。
在希望通過體外復合到Hsp上來使用抗原分子的實施方案中，可以在有ATP或低pH(pH 1，2，3，4，5或6)存在的情況下，從內源的Hsp-蛋白復合物中純化用于這種用途的Hsp。還可以化學合成或重組生產Hsp。在本文中所述的方法可以用于從任何真核細胞(例如，感染了預定的胞內病原體的組織、分離的細胞或無限增殖化真核生物細胞系、腫瘤細胞或腫瘤細胞系)中分離特異性的Hsp-蛋白復合物或Hsp自身。
5.1.1 Hsp 70或Hsp70-蛋白復合物的制備和純化以前已經記載了Hsp70-蛋白復合物的純化，見，例如，Udono等，1993，J.Exp.Med.1781391-1396。下面通過實例但非限制性方式描述了可以使用的方法。
首先，將腫瘤細胞懸浮到3體積由30mM碳酸氫鈉pH7.5，1mMPMSF組成的1X裂解緩沖液中。然后，在冰上超聲處理沉淀，直到通過顯微鏡檢測確定裂解了超過99％細胞。作為超聲處理的替代方案，可以在Dounce勻漿器中勻漿細胞，通過機械剪切來裂解細胞，直到裂解了超過95％細胞。
然后在1,000g離心裂解物10分鐘，去除未破碎的細胞、核和其它的細胞碎片。在100,000g離心得到的上清液90分鐘，收獲上清液，然后與用含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的磷酸緩沖鹽水(PBS)平衡的Con A瓊脂糖凝膠混合。當通過機械剪切裂解細胞時，在與Con A瓊脂糖凝膠混合之前，用等體積的2X裂解緩沖液稀釋上清液。然后讓上清液在4℃結合ConA瓊脂糖凝膠2-3小時。收獲不能結合的物質，并對10mM Tris-醋酸鹽pH7.5、0.1mM EDTA、10mM NaCl、1mMPMSF透析36小時(3次，100體積/次)。然后在17,000rpm(Sorvall SS34轉子)離心透析物20分鐘。然后，收獲得到的上清液，并應用到在20mMTris-醋酸鹽pH 7.5、20mM NaCl、0.1mM EDTA和15mM 2-巰基乙醇中平衡的Mono Q FPLC柱上。然后用20mM-500mM NaCl梯度展開該柱，然后通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分級分離洗脫的級分，并使用合適的抗-HSP70抗體(例如來自克隆N27F3-4，來自StressGen)通過免疫印跡進行表征。
收集與抗-HSP70的抗體強烈免疫反應性的級分，并用硫酸銨沉淀HSP70-蛋白復合物；更具體地用50％-70％硫酸銨的分流(cut)。然后在17,000rpm(SS34 Sorvall轉子)離心收獲得到的沉淀，并用70％硫酸銨洗滌。然后溶解洗滌的沉淀，并通過在SephadexR G25柱(Pharmacia)上進行凝膠過濾，除去任何殘余的硫酸銨。如果需要，可以如上所述通過Mono Q FPLC柱純化這樣得到的HSP70制劑。
使用該方法，可以將Hsp70-蛋白復合物純化成表觀均質的。一般地，可以從1g細胞/組織中純化出1mg Hsp70-蛋白復合物。
改進的純化HSP70的方法包括使細胞蛋白與固定在固體基質上的ATP或ATP的不可水解的類似物接觸，從而使裂解物中的HSP70可以結合到ATP或不可水解的ATP類似物上，開洗脫結合的HSP70。優選的方法使用具有固定到固體基質上的ATP(例如，ATP-瓊脂糖)的柱層析。得到的HSP70制劑的純度更高，且沒有污染蛋白。HSP70得率也明顯增加了約超過10倍。
或者，可以用具有ADP的不可水解的類似物(代替ATP)的層析來純化HSP70-蛋白復合物。見Peng等，Journal of ImmunologicalMethods 20413-21(1997)，其完整內容在本文中引作參考。通過實例但非限制性的方式，可以如下所述通過ATP-瓊脂糖層析純化無蛋白的HSP70在低滲緩沖液中使Meth A肉瘤細胞(5億細胞)勻漿化，并在4℃、100,000g離心裂解物90分鐘。將上清液應用到ATP-瓊脂糖柱上。在緩沖液中洗滌該柱，并用5柱體積的3mM ATP洗脫。HSP70洗脫物在洗脫的全部15個級分的級分2至10中。通過SDS-PAGE分析洗脫的級分。使用該方法，可以將HSP70純化成表觀均質的。
或者，使用本領域已知的免疫親和純化方法，可以純化Hsp70或Hsp70-蛋白。例如，可以使用Hsp70-特異性的scFv柱。(見Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)4175-4178，其在本文中整體引作參考。盡管Arnold-Schild描述了gp96-特異性的scFv柱，但通過等同的方法可以生產出Hsp70-特異性的scFv柱)。通過實例但非限制性的方式，可以如下進行使用Hsp70-特異性的scFv柱的純化將scFv抗-Hsp70偶聯到CNBr-活化的瓊脂糖凝膠上。將含有Hsp70或Hsp70-蛋白復合物的樣品應用到scFv抗-Hsp70柱上。用PBS充分洗滌后，可以用PBS、1.3M NaCl或10mM磷酸鈉(pH 7.2)洗脫Hsp70或Hsp70-蛋白。
在有ATP或低pH存在的情況下，可以從hsp70-蛋白復合物分離蛋白。這2種方法可以用于從hsp70-蛋白復合物洗脫蛋白。第一種方法包括在有ATP存在的情況下溫育hsp70-蛋白復合物制劑。另一種方法包括在低pH緩沖液(例如，pH是1，2，3，4，5或6)中溫育hsp70-蛋白復合物制劑。這些方法和本領域已知的任何其它方法都可以用于從Hsp-蛋白復合物分離HSP和蛋白。
5.1.2 Hsp90或Hsp90-蛋白復合物的制備和純化通過實例和非限制性的方式予以陳述的、可以使用的方法如下
首先，將人或哺乳動物細胞懸浮到3體積由5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)、150mM NaCl、2mM CaCl2、2mM MgCl2和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)組成的1X裂解緩沖液中。然后，在冰上超聲處理沉淀，直到通過顯微鏡檢測確定裂解了超過99％細胞。作為超聲處理的替代方案，通過機械剪切來裂解細胞，且在該方法中，一般將細胞重新懸浮到30mM碳酸氫鈉(pH 7.5)、1mM PMSF中，在冰上溫育20分鐘，然后在Dounce勻漿器中勻漿，直到裂解了超過95％細胞。
然后在1,000g離心裂解物10分鐘，去除未破碎的細胞、核和其它的細胞碎片。在100,000g離心得到的上清液90分鐘，收獲上清液，然后與用含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS平衡的Con A瓊脂糖凝膠(SepharoseTM)混合。當通過機械剪切裂解細胞時，在與Con A瓊脂糖凝膠混合之前，用等體積的2X裂解緩沖液稀釋上清液。然后讓上清液在4℃結合Con A瓊脂糖凝膠2-3小時。收獲不能結合的材料，并對20mM磷酸鈉(pH 7.4)、1mM EDTA、250mM NaCl、1mMPMSF透析36小時(3次，100體積/次)。然后在17,000rpm(Sorvall SS34轉子)離心透析物20分鐘。然后，收獲得到的上清液，并應用到用透析緩沖液平衡的Mono Q FPLCTM離子交換層析柱(Pharmacia)上。然后用200mM至600mM NaCl鹽梯度洗脫蛋白。
通過SDS-PAGE分級分離洗脫的級分，并使用抗-hsp90抗體例如3G3(Affinity Bioreagents)，通過免疫印跡鑒別出含有hsp90-蛋白復合物的級分。使用該方法，可以將Hsp90-蛋白復合物純化成表觀均質的。一般地，可以從1g細胞/組織中純化出150-200μg hsp90-蛋白復合物。
或者，使用本領域已知的任何免疫親和純化方法，可以純化Hsp90或Hsp90-蛋白。例如，可以使用Hsp90-特異性的scFv柱。(見Arnold-Schild，其在本文中整體引作參考。盡管Arnold-Schild描述了gp96-特異性的scFv柱，但通過等同的方法可以生產出Hsp90-特異性的scFv柱)。通過實例但非限制性的方式，可以如下進行使用Hsp90-特異性的scFv柱的純化將scFv抗-Hsp90偶聯到CNBr-活化的瓊脂糖凝膠上。將含有Hsp90或Hsp90-蛋白復合物的樣品應用到scFv抗-Hsp70柱上。用PBS充分洗滌后，可以用PBS、1.3M NaCl或10mM磷酸鈉(pH 7.2)洗脫Hsp90或Hsp90-蛋白。
在有ATP或低pH存在的情況下，可以從hsp90-蛋白復合物分離蛋白。這2種方法可以用于從hsp90-蛋白復合物洗脫蛋白。第一種方法包括在有ATP存在的情況下溫育hsp90-蛋白復合物制劑。另一種方法包括在低pH緩沖液(例如，pH是1，2，3，4，5或6)中溫育hsp90-蛋白復合物制劑。這些方法和本領域已知的任何其它方法都可以用于從Hsp-蛋白復合物分離HSP和蛋白。
5.1.3 Gp96或Gp96-蛋白復合物的制備和純化通過實例和非限制性的方式予以陳述的、可以使用的方法如下將人或哺乳動物細胞的沉淀重新懸浮到3體積由30mM碳酸氫鈉緩沖液(pH 7.5)和1mM PMSF組成的緩沖液中，并使細胞在冰上膨脹20分鐘。然后在冰上、在Dounce勻漿器(勻漿器的合適間隙(clearance)隨每種細胞類型而異)中勻漿細胞沉淀，直到裂解了超過95％細胞。
在1,000g離心裂解物10分鐘，去除未破碎的細胞、核和其它的細胞碎片。然后在100,000g離心來自該離心步驟的上清液90分鐘。可以從100,000沉淀或從上清液中純化gp96-蛋白復合物。
當從上清液中純化時，用等體積的2X裂解緩沖液稀釋上清液，并將上清液在4℃與用含有2mM Ca2+和2mM Mg2+的PBS平衡的ConA瓊脂糖凝膠混合2-3小時。然后將漿裝入柱中，用1X裂解緩沖液洗滌直到OD280下降到基線。然后，用1/3柱床體積的溶解在含有2mMCa2+和2mM Mg2+的PBS中的10％α-甲基甘露糖苷(α-MM)洗滌柱，用一片石蠟膜密封柱，并在37℃溫育15分鐘。然后將柱冷至室溫，并從柱底部去除石蠟膜。將5柱體積的α-MM緩沖液應用到柱上，并通過SDS-PAGE分析洗脫物。一般地，得到的材料是約60-95％純的，但是這依賴于細胞類型和使用的組織與裂解緩沖液的比率。然后將樣品應用到用含有5mM磷酸鈉(pH 7)的緩沖液平衡的Mono Q FPLCTM離子交換層析柱(Pharmacia)上。然后用0-1M NaCl梯度從柱上洗脫蛋白，且gp96級分在400mM和550mM NaCl之間洗脫。
但是，該方法可以通過2個單獨使用或組合使用的附加步驟予以修飾，以始終如一地生產表觀均質的gp96-蛋白復合物。一個任選的步驟包括在Con A純化步驟之前的硫酸銨沉淀，而另一個任選的步驟包括在Con A純化步驟以后的DEAE-瓊脂糖凝膠純化、并代替Mono QFPLCTM步驟。
在第一種任選的步驟中，以實例方式描述如下通過添加硫酸銨，使從100,000g離心步驟得到的上清液產生50％硫酸銨的終濃度。在輕輕攪拌置于一盤冰水中的燒杯中的溶液的同時，緩慢地加入硫酸銨。將溶液在4℃攪拌約1/2至12小時，并在6,000rpm(Sorvall SS34轉子)離心得到的溶液。獲取從該步驟得到的上清液，通過加入硫酸銨溶液調成70％硫酸銨的飽和度，并在6,000rpm(Sorvall SS34轉子)離心。收獲從該步驟得到的沉淀，懸浮到含有70％硫酸銨的PBS中，以沖洗沉淀。在6,000rpm(Sorvall SS34轉子)離心該混合物，并將沉淀溶解到含有2mM Ca2+和Mg2+的PBS中。通過在15,000rpm(SorvallSS34轉子)的簡短離心去除未溶解的物質。然后，將溶液與Con A瓊脂糖凝膠混合，方法如前所述。
在第二種任選的步驟中，以實例方式描述如下匯集從Con A柱洗脫的含有gp96的級分，并通過透析或優選通過在交聯葡聚糖凝膠G25柱上進行緩沖液更換而將緩沖液更換為5mM磷酸鈉緩沖液(pH7)，300mM NaCl。緩沖液更換后，將溶液與預先用5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)、300mM NaCl平衡的DEAE-瓊脂糖凝膠混合。將蛋白溶液和珠輕輕混合1小時，倒入柱中。然后，用5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)、300mM NaCl洗滌柱，直到在280nm的吸光度下降至基線。然后，用5體積的5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)、700mM NaCl從柱上洗脫結合的蛋白。匯集含有蛋白的級分，用5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)稀釋，以將鹽濃度降低至175mM。然后將得到的材料任選地應用到用5mM磷酸鈉緩沖液(pH 7)平衡的Mono Q FPLCTM離子交換層析柱(Pharmacia)上，然后用0-1M NaCl梯度從柱上洗脫結合在Mono QFPLCTM離子交換層析柱(Pharmacia)上的蛋白。gp96級分在400mM和550mM NaCl之間洗脫。
但是，本領域的技術人員能夠通過常規實驗估計出將第二種任選的步驟整合進純化方案中的益處。另外，也可以明白，添加每種任選步驟的益處依賴于原材料的來源。
當從100,000g沉淀中分離gp96級分時，將沉淀懸浮到5體積含有1％脫氧膽酸鈉或1％辛基吡喃型葡糖苷(但是沒有Mg2+和Ca2+)的PBS中，并在冰上溫育1小時。在20,000g離心懸浮液30分鐘，對幾次PBS變化(也沒有Mg2+和Ca2+)透析得到的上清液，以去除去污劑。在100,000g離心透析物90分鐘，收獲上清液，向上清液中分別加入鈣和鎂至終濃度2mM。然后通過未修飾的或修飾的方法純化樣品，以從100,000g上清液中分離gp96-蛋白復合物，見上。
使用該方法，可以將gp96-蛋白復合物純化成表觀均質的。從1g細胞/組織中可以分離出約10-20μg gp96。
或者，使用本領域已知的任意的免疫親和純化方法，可以純化gp96或gp96-蛋白。例如，可以使用Hsp96-特異性的scFv柱。(見Arnold-Schild，Cancer Research，2000，60(15)4175-4178，其在本文中整體引作參考。)在有ATP或低pH(例如，pH 1，2，3，4，5或6)存在的情況下，可以從gp96-蛋白復合物中分離蛋白。這2種方法可以用于從gp96-蛋白復合物洗脫蛋白。第一種方法包括在有ATP存在的情況下溫育gp96-蛋白復合物制劑。另一種方法包括在低pH緩沖液中溫育gp96-蛋白復合物制劑。這些方法和本領域已知的任何其它方法都可以用于從Hsp-蛋白復合物分離HSP和蛋白。
5.1.4 Hsp110-蛋白復合物的制備和純化Wang等，2001，J.Immunol.166(l)490-7描述的、可以使用的方法通過實例和非限制性的方式描述如下通過Dounce勻漿，將細胞或組織(例如，腫瘤細胞組織)的沉淀(40-60ml)在5體積低滲緩沖液(30mN碳酸氫鈉，pH7.2和蛋白酶抑制劑)中勻漿。在4,500xg離心裂解物，然后在100,000xg離心2小時。如果細胞或組織是肝來源的，則將得到的上清液首先應用到藍色瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia)上，以去除白蛋白。否則，將得到的上清液應用到預先用結合緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.5；100mMNaCl；ImM MgCl2；1mM CaCl2；1mM MnCl2和15mM 2-ME)平衡的Con A-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的結合緩沖液洗脫結合的蛋白。
首先對20mM Tris-HCl，pH 7.5、100mM NaCl和15mM 2-ME的溶液透析未結合Con A-瓊脂糖凝膠的材料，然后應用到DEAE-瓊脂糖凝膠柱上，并通過100至500mM NaCl的鹽梯度洗脫。收集含有hsp110的級分，透析，并裝載到用20mM Tris-HCl，pH 7.5、200mMNaCl和15mM 2-ME平衡的Mono Q(Pharmacia)10/10柱上。用200-500mM NaCl梯度洗脫結合的蛋白。通過SDS-PAGE、隨后用Hsp110的Ab進行免疫印跡分析級分，如Wang等，1999，J.Immunol.1623378所述。通過Centriplus(Amicon，Beverly，MA)濃縮含有Hsp110的匯集的級分，并應用到Superose 12柱(Pharmacia)上。用0.2ml/分鐘流速的40mM Tris-HCl，pH 8.0、150mM NaCl和15mM 2-ME洗脫蛋白。
或者，使用本領域已知的任何免疫親和純化方法，可以純化Hsp110或Hsp 110-蛋白。例如，可以使用Hsp110-特異性的scFv柱。(見Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)4175-4178，其在本文中整體引作參考。盡管Arnold-Schild描述了gp96-特異性的scFv柱，但通過等同的方法可以生產出Hsp110-特異性的scFv柱)。通過實例但非限制性的方式，可以如下進行使用Hsp 110-特異性的scFv柱的純化將scFv抗-Hsp110偶聯到CNBr-活化的瓊脂糖凝膠。將含有Hsp 110或Hsp 110-蛋白復合物的樣品應用到scFv抗-Hsp110柱上。用PBS充分洗滌后，可以用PBS、1.3M NaCl或10mM磷酸鈉(pH 7.2)洗脫Hsp110或Hsp110-蛋白。
5.1.5 Grp170-蛋白復合物的制備和純化Wang等，2001，J.Immunol.166(l)490-7描述的、可以使用的方法通過實例和非限制性的方法描述如下通過Dounce勻漿，將細胞或組織(例如，腫瘤細胞組織)的沉淀(40-60ml)在5體積低滲緩沖液(30mN碳酸氫鈉，pH7.2和蛋白酶抑制劑)中勻漿。在4,500xg離心裂解物，然后在100,000xg離心2小時。如果細胞或組織是肝來源的，則將得到的上清液首先應用到藍色瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia)上，以去除白蛋白。否則，將得到的上清液應用到預先用結合緩沖液(20mM Tris-HCl，pH 7.5；100mMNaCl；1mM MgCl2；1mM CaCl2；1mM MnCl2和15mM 2-ME)平衡的Con A-瓊脂糖凝膠柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。用含有15％α-D-o-甲基甘露糖苷(Sigma，St.Louis，MO)的結合緩沖液洗脫結合的蛋白。
首先對20mM Tris-HCl，pH 7.5和150mM NaCl透析結合了ConA-瓊脂糖凝膠的材料，然后應用到Mono Q柱上，并通過150至400mMNaCl梯度洗脫。濃縮匯集的級分，并應用到Superose 12柱(Pharmacia)上。收集含有均質的grp170的級分。
或者，使用本領域已知的任何免疫親和純化方法，可以純化GRP170或GRP170-蛋白。例如，可以使用GRP170-特異性的scFv柱。(見Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)4175-4178，其在本文中整體引作參考。盡管Arnold-Schild描述了gp96-特異性的scFv柱，但通過等同的方法可以生產出Hsp170-特異性的scFv柱)。通過實例但非限制性的方式，可以如下進行使用Hsp170-特異性的scFv柱的純化將scFv抗-Hsp170偶聯到CNBr-活化的瓊脂糖凝膠。將含有Hsp170或Hsp170-蛋白復合物的樣品應用到scFv抗-Hsp170柱上。用PBS充分洗滌后，可以用PBS、1.3M NaCl或10mM磷酸鈉(pH7.2)洗脫Hsp170或Hsp170-蛋白。
5.1.6 Hsp的重組表達本領域已知的方法可以用于重組地生產Hsp。可以將能編碼熱激蛋白的核酸序列插入表達載體中，以在宿主細胞中繁殖和表達。
如本文所使用的，表達構建體是指能編碼HSP的核苷酸序列，其可操作地結合到一個或多個能使HSP在合適的宿主細胞中表達的調控區。“可操作地結合”是指一種結合，其中調控區和要表達的HSP序列連接、并以允許進行轉錄和最終的翻譯的方式排列。
表達載體可以提供轉錄HSP所必需的調控區。如果要表達缺少其同源起始密碼子的HSP基因序列，則還可以提供翻譯起始密碼子(ATG)。在相容的宿主-構建體系統中，細胞轉錄因子(例如RNA聚合酶)會結合到表達構建體的調控區上，以影響宿主生物中的修飾的HSP序列的轉錄。基因表達所需的調控區的精確性質會隨宿主細胞的不同而變化。通常，需要啟動子，它能結合RNA聚合酶和促進可操作地連接的核酸序列的轉錄。這樣的調控區可以包括那些涉及轉錄和翻譯起始的5′非-編碼序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。編碼序列3’的非編碼區可以含有轉錄終止調控序列，例如終止子和多腺苷酸化位點。
為了使具有調控功能的DNA序列(例如啟動子)附著到HSP基因序列上、或將HSP基因序列插入載體的克隆位點，可以通過本領域熟知的技術將能提供合適的相容的限制位點的接頭或連接物連接到cDNA的末端(Wu等，1987，Methods in Enzymol，152343-349)。用限制酶切割后進行修飾，以通過向后消化或在連接前填充單鏈DNA末端來產生平端。或者，通過使用含有所需的限制酶切位點的引物的PCR擴增DNA，可以將所需的限制酶切位點導入DNA片段中。
可以將包含可操作地結合到調控區上的HSP序列的表達構建體直接導入合適的宿主細胞中，以表達和生產Hsp-肽復合物，而無需進一步克隆。見，例如，美國專利號5,580,859。表達構建體還可以含有能促進HSP序列向宿主細胞的基因組中整合的DNA序列，例如通過同源重組。在該情況中，不必使用包含適用于合適的宿主細胞的復制起點的表達載體，以在宿主細胞中擴增和表達HSP。
可以使用多種表達載體，包括但不限于質粒、粘粒、噬菌體、噬菌粒或修飾的病毒。一般地，這樣的表達載體包含載體在合適的宿主細胞中增殖的功能性復制起點、一個或多個用于插入HSP基因序列的限制性內切核酸酶位點和一個或多個選擇標記。表達載體必須與相容的宿主細胞一起使用，后者可以源自原核生物或真核生物，包括但不限于細菌、酵母、昆蟲、哺乳動物和人。
通過添加一種或多種在天然序列中不存在的糖基化位點，也可以改變熱激蛋白的編碼序列。多肽的糖基化一般是N-連接的或O-連接的。術語“N-連接的”是指碳水化合物部分向天冬酰胺殘基側鏈的附著。三肽序列天冬酰胺-X-絲氨酸和天冬酰胺-X-蘇氨酸(其中X是脯氨酸以外的任意氨基酸)是碳水化合物部分向天冬酰胺側鏈的酶促附著的識別序列。因而，在多肽中存在這些三肽序列中的任一種，都可以產生潛在的糖基化位點。術語“O-連接的糖基化”是指諸如N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖的糖中的一種向羥基氨基酸的附著，最常見絲氨酸或蘇氨酸，盡管也可以使用5-羥脯氨酸或5-羥賴氨酸。
可以通過多種方法實現糖基化位點的添加。例如，可以通過DNA水平的變化進行改變，特別是通過在預選堿基處突變能編碼目標蛋白或肽的DNA，從而使產生的密碼子能翻譯成所需的氨基酸。可以進行DNA突變，例如使用美國專利號5,364,934所述的方法。
為了長期、高得率地生產適當加工過的Hsp或Hsp-蛋白復合物，優選在哺乳動物細胞中的穩定表達。使用含有選擇標記的載體，可以對能穩定表達HSP或Hsp-蛋白復合物的細胞系進行工程改造。通過實例但非限制性的方式，在導入表達構建體后，可以使工程改造的細胞在滋養培養基中生長1-2天，然后轉換到選擇培養基。表達構建體中的選擇標記會賦予對選擇的抗性，并最佳地使細胞將表達構建體穩定地整合進它們的染色體中，并在培養基中生長并擴充為細胞系。這樣的細胞可以培養較長的時間段，同時連續表達HSP。
可以在標準的溫度、培養時間、光密度和培養基組成條件下培養重組細胞。但是，重組細胞的生長條件可以與HSP和抗原蛋白的表達條件不同。修改的培養條件和培養基還可以用于提高Hsp的生產。例如，可以將含有具有其同源啟動子的HSP的重組細胞暴露于熱或其它環境應激或化學應激。本領域已知的任何技術都可以用于建立生產HSP或HSP-蛋白復合物的最佳條件。
5.1.7 肽合成通過重組技術生產Hsp的替代方案是肽合成。例如，通過使用肽合成儀，可以合成完整的Hsp或與Hsp的一部分相對應的肽。可以使用常規的肽合成或本領域熟知的其它合成方案。
使用與Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.，852149所述的方法類似的方法，可以通過固相肽合成方法合成具有HSP的氨基酸序列或其一部分的肽。在合成過程中，將具有保護側鏈的N-α-保護的氨基酸逐步添加到生長的通過其C-末端連接且連接到不溶的聚合物支持體(即聚苯乙烯珠)上的多肽鏈上。通過將N-α-脫保護的氨基酸的氨基連接到已經通過與試劑(例如二環己基碳二亞胺)反應活化的N-α-保護的氨基酸的α-羧基上，合成了肽。游離氨基與活化的羧基的附著，導致了肽鍵的形成。最常用的N-α-保護基包括酸不穩定的Boc和堿不穩定的Fmoc。本領域熟知合適的化學物質、樹脂、保護基、保護的氨基酸和試劑的詳細內容，所以在本文不再詳細討論(見，Atherton，等，1989，Solid Phase Peptide SynthesisA Practical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，Peptide Chemistry，A Practical Textbook，第2版，Springer-Verlag)。
在合成過程中，還可以添加一種或多種在天然序列中不存在的糖基化位點。例如，可以改變目標蛋白或肽的氨基酸序列，從而使其含有一種或多種5.1.6部分所述的三肽序列(對于N-連接的糖基化位點)。還可以通過向天然序列添加一種或多種絲氨酸或蘇氨酸殘基或用其取代，來進行改變(對于O-連接的糖基化位點)。
使用常規方法，例如使用凝膠滲透、分配和/或離子交換層析的制備型HPLC，可以純化得到的Hsp。本領域熟知合適的基質和緩沖液的選擇，所以在本文不再詳細討論。
5.2.抗原分子下面的小部分綜述了可以用作本發明的分子復合物的抗原/免疫原組分的蛋白(包括肽和多肽)和如何鑒別這樣的蛋白，例如，在重組表達用于HSP和抗原分子的體外復合的肽中的應用。但是，在本發明的實踐中，例如，當從癌細胞或從感染了病原體的組織中直接純化HSP/肽復合物時，不需要知道分子復合物的抗原分子的特性。
使用本領域已知的方法，可以鑒別出抗原分子的抗原表位。如本文所使用的，“表位”是指能結合或預計能結合受試者的抗體或主要組織相容性(MHC)分子的抗原肽的區域。優選地，在與MHC分子結合后，表位會體內地刺激對該抗原肽的免疫反應。本發明的肽含有預計能結合選定的MHC分子和誘導免疫反應的表位。本發明的抗原肽表位包含參與結合MHC等位基因編碼的蛋白的保守殘基。預測能結合MHC I類分子的抗原肽表位一般是8-10個殘基，而預測能結合MHC II類分子的抗原肽表位一般是10-20個殘基。
預測能結合本發明的抗原性肽的特異性的人MHC等位基因的非限制性實例包括下述的人白細胞抗原(HLA)分子HLA-A1，HLA-A201，HLA-A203，HLA-A3，HLA-A2402，HLA-A26，HLA-B702，HLA-B8，HLA-B1510，HLA-B2705，HLA-B2709，HLA-B4402和HLA-B5101(Rammen see，等，Immunogenetics 41，178-228，1995)。可以用多種不同的方式測量結合MHC分子的能力，例如通過抑制抗原呈遞(Sette，等，J.Immunol.1413893，1991)、體外裝配測定(Townsend，等，Cell62285，1990)和使用突變細胞的基于FACS的測定，例如RMA.S(Melief，等，Eur.J.Immunol.212963，1991)。
在一些實施方案中，抗原分子是糖蛋白，且在有凝集素存在時形成低聚物。在其它的實施方案中，抗原分子不是糖蛋白(但是復合物的不同成員是糖蛋白)。在一些實施方案中，從細胞裂解物中分離抗原分子。在一些實施方案中，抗原分子是合成的。在一些實施方案中，將抗原分子工程改造成糖蛋白，例如，通過添加一種或多種在抗原分子的天然序列中不存在的糖基化位點，隨后添加碳水化合物。見，例如，Scott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 895398-5402(1992)。
5.2.1 抗原/免疫原組分的分離已經發現，在有ATP或低pH存在的情況下，可以從Hsp復合物洗脫抗原蛋白(包括肽和多肽)和/或組分。這些實驗條件可以用于從可能含有潛在有用的抗原決定簇的細胞分離蛋白和/或抗原組分。一旦分離，則使用常規的氨基酸測序方法，可以測定每種抗原蛋白的氨基酸序列。然后可以通過化學合成或重組方法生產這樣的抗原分子，純化，并體外復合到Hsp上，以形成本發明的Hsp復合物。
類似地，已經發現，使用本領域熟知的技術，可以從MHC-蛋白復合物洗脫潛在免疫原性的蛋白(Falk，K.等，1990Nature 348248-251；Elliott，T.等，1990，Nature 348195-197；Falk，K.等，1991，Nature 351290-296)。
因而，可以從內源的Hsp-蛋白復合物或內源的MHC-蛋白復合物分離出潛在免疫原性的或抗原性的蛋白，隨后通過體外復合到糖蛋白(例如，糖基化的熱激蛋白)來形成本發明的分子復合物，用作抗原分子。下文描述了本領域已知的從這些復合物分離肽和/或抗原組分的示例性的方法。
5.2.2 來自Hsp-肽復合物的肽可以用2種方法來從Hsp-肽復合物洗脫肽。
一種方法包括，在有ATP存在的情況下，溫育Hsp-肽復合物。另一種方法包括，在低pH緩沖液中溫育復合物。
簡而言之，通過Centricon 10裝置(Millipore)離心目標復合物，以獲取與復合物松散結合的任何小分子量的物質。通過SDS-PAGE，可以獲取和分析大分子量的級分，而可以通過如下所述的HPLC分析小分子量。在ATP溫育方案中，將大分子量級分中的應激蛋白-肽復合物與10mM ATP在室溫溫育30分鐘。在低pH(例如，pH 1、2、3、4、5或6)方案中，向應激蛋白-肽復合物中加入醋酸或三氟醋酸(TFA)，至終濃度為10％(體積/體積)，且在室溫或在沸水浴中或二者之間的任意溫度溫育混合物10分鐘(見，Van Bleek，等，1990，Nature 348213-216；和Li，等，1993，EMBO Journal 123143-3151)。
如前所述，通過Centricon 10裝置離心得到的樣品。回收大和小分子量的級分。與ATP或低pH(例如，pH 1、2、3、4、5或6)一起再次溫育剩余的大分子量應激蛋白-肽復合物，以獲取任何剩余肽。
匯集得到的小分子量級分，通過蒸發濃縮，并溶解到0.1％ TFA中。然后通過反相高壓液相層析(HPLC)，使用例如用0.1％ TFA平衡的VYDAC C18反相柱，分級分離溶解的材料。然后通過用溶于0.1％ TFA中的0-80％乙腈線性梯度展開柱，以約0.8ml/分鐘的流速洗脫結合的材料。可以通過OD210監控肽的洗脫，并收集含有肽的級分。
5.2.3 來自MHC-肽復合物的肽本領域熟知從MHC分子分離潛在免疫原性的肽，所以在本文不再詳細討論(見，Falk等，1990，Nature 348248-251；Rotzsche等，1990，Nature 348252-254；Elliott等，1990，Nature 348191-197；Falk等，1991，Nature 351290-296；Demotz等，1989，Nature 343682-684；Rotzsche等，1990，Science 249283-287)，其公開內容在這里引作參考。
簡而言之，可以通過常規的免疫親和方法分離MHC-肽復合物。然后可以通過在有約0.1％ TFA(溶于乙腈中)存在的情況下溫育復合物，從MHC-肽復合物洗脫肽。如前所述，可以通過反相HPLC分離和純化洗脫的肽。
通過本領域熟知的人工的或自動的氨基酸測序技術，可以測定洗脫的肽的氨基酸序列。一旦已經確定了潛在保護肽的氨基酸序列，則可使用常規的肽合成或本領域熟知的其它方法，合成任意所需量的肽。
使用與Merrifield，1963，J.Am.Chem.Soc.，852149所述的方法類似的方法，可以通過固相肽合成方法合成具有與上面分離的肽相同的氨基酸序列的肽。在合成過程中，將具有保護側鏈的N-α-保護的氨基酸逐步添加到生長的通過其C-末端連接且連接到不溶的聚合物支持體(即聚苯乙烯珠)上的多肽鏈上。通過將N-α-脫保護的氨基酸的氨基連接到已經通過與試劑(例如二環己基碳二亞胺)反應活化的N-α-保護的氨基酸的α-羧基上，合成了肽。游離氨基與活化的羧基的附著，導致了肽鍵的形成。最常用的N-α-保護基包括酸不穩定的Boc和堿不穩定的Fmoc。
簡而言之，首先將C-末端N-α-保護的氨基酸附著到聚苯乙烯珠上。然后去除N-α-保護基。將脫保護的α-氨基偶聯到下一個N-α-保護的氨基酸的活化的α-羧基上。重復該過程，直到合成了所需的肽。然后從不溶的聚合物支持體上切割下得到的肽，并脫保護氨基酸側鏈。通過縮合保護的肽片段，可以衍生出更長的肽。本領域熟知合適的化學物質、樹脂、保護基、保護的氨基酸和試劑的詳細內容，所以在本文不再詳細討論(見，Atherton，等，1989，Solid Phase PeptideSynthesisA Practical Approach，IRL Press，和Bodanszky，1993，Peptide Chemistry，A Practical Textbook，第2版，Springer-Verlag)。
使用常規方法，例如使用凝膠滲透、分配和/或離子交換層析的制備型HPLC，可以純化得到的肽。本領域熟知合適的基質和緩沖液的選擇，所以在本文不再詳細討論。
5.2.4 外源的抗原分子可以從本領域已知的或通過免疫測定確定能結合抗體或MHC分子(抗原性)或產生免疫反應(免疫原性)的分子中，選擇能表現出病原體的已知抗原的抗原性、或癌癥類型的腫瘤-特異性的或腫瘤-相關的抗原(例如抗原或其抗原部分)的抗原性的分子用作抗原分子，以復合糖蛋白和/或凝集素。為了通過檢測與抗體的結合來確定免疫原性或抗原性，可以使用本領域已知的多種免疫測定，包括但不限于競爭性的和非-競爭性的使用下述技術的測定系統，例如放射免疫測定、ELISA(酶聯免疫吸附測定)、“夾心”免疫測定、免疫放射分析、凝膠擴散沉淀素反應、免疫擴散測定、體內免疫測定(使用例如膠體金、酶或放射性同位素標記)、蛋白印跡、免疫沉淀反應、凝集測定(例如，凝膠凝集測定、血凝測定)、補體結合測定、免疫熒光測定、A蛋白測定和免疫電泳測定等。在一個實施方案中，通過檢測第一抗體上的標記來檢測抗體結合。在另一個實施方案中，通過檢測第二抗體或試劑與第一抗體的結合來檢測第一抗體。在其它的實施方案中，標記了第二抗體。預期可以使用本領域已知的多種檢測免疫測定中的結合的方法。在檢測免疫原性的一個實施方案中，可以通過標準方法來測定T細胞介導的反應，例如，體外細胞毒性測定或體內遲發型超敏反應測定。
還可以通過多種標準鑒別出用作抗原分子的潛在有用的抗原或其衍生物，例如抗原在中和病原體的感染性中的參與(其中需要治療或預防這樣的病原體的感染)(Norrby，1985，Summary，in Vaccines 85，Lerner，等(eds.)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，New York，pp.388-389)、特異性的類型或組、患者抗血清或免疫細胞的識別和/或對抗原特異性的抗血清或免疫細胞的保護作用的證實。另外，當需要治療或預防病原體造成的疾病時，及時地或在相同病原體的不同分離物中，抗原的編碼的表位應當優選地表現出較小程度的或沒有抗原性差異。
優選地，當需要治療或預防癌癥時，使用腫瘤-特異性的抗原(即在腫瘤細胞中表達)或腫瘤相關抗原(即在腫瘤細胞中相對超表達)或其片段或衍生物。例如，這樣的腫瘤特異性的或腫瘤相關的抗原包括但不限于KS 1/4全癌抗原(pan-carcinoma antigen)(Perez和Walker，1990，J.Immunol.1423662-3667；Bumal，1988，Hybridoma 7(4)407-415)；卵巢癌抗原(CA125)(Yu，等，1991，Cancer Res.51(2)468-475)；前列腺酸式磷酸鹽(Tailer，等，1990，Nucl.Acids Res.18(16)4928)；前列腺特異性的抗原(Henttu和Vihko，1989，Biochem.Biophys.Res.Comm.160(2)903-910；Israeli，等，1993，Cancer Res.53227-230)；黑素瘤相關的抗原p97(Estin，等，1989，J.Natl.Cancer Inst.81(6)445-446)；黑素瘤抗原gp75(Vijayasardahl，等，1990，J.Exp.Med.171(4)1375-1380)；大分子量黑素瘤抗原(Natali，等，1987，Cancer 5955-63)和前列腺特異性的膜抗原。可以復合到糖蛋白上的其它外源抗原包括在癌細胞中高頻率地突變的部分或蛋白，例如癌基因(例如，ras，特別是具有僅僅發生在4個氨基酸殘基(12，13，59或61)處的活化突變的ras突變體(Gedde-Dahl等，1994，Eur.J.Immunol.24(2)410-414))和腫瘤抑制基因(例如，p53，已經為其鑒別出了多種能刺激細胞毒性T細胞反應的突變體或多態的p53肽抗原(Gnjatic等，1995，Eur.J.Immunol.25(6)1638-1642)。
在一個具體的實施方案中，選擇了對腫瘤特異性的抗原或其片段或衍生物來復合HSP，以形成用于進行低聚反應，然后施用給患有腫瘤的患者的HSP-抗原復合物。
優選地，當需要治療或預防病毒病時，使用包含已知病毒的表位的分子。例如，這樣的抗原表位可以從下述病毒制備，包括但不限于甲型肝炎、乙型肝炎、丙型肝炎、流感、水痘、腺病毒、I型單純皰疹病毒(HSV-I)、II型單純皰疹病毒(HSV-II)、牛疫、鼻病毒、艾可病毒、輪狀病毒、呼吸道合胞病毒、乳頭瘤病毒、乳多空病毒、巨細胞病毒、echinovirus，蟲媒病毒、huntavirus，柯薩奇病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、風疹病毒、脊髓灰質炎病毒、I型人免疫缺陷病毒(HIV-I)和II型人免疫缺陷病毒(HIV-II)。優選地，當需要治療或預防細菌感染時，使用包含已知細菌的表位的分子。例如，可以從下述細菌制備這樣的抗原表位，包括但不限于分枝桿菌立克次氏體、支原體、奈瑟氏球菌和軍團菌。
優選地，當需要治療或預防原生動物感染時，使用包含已知原生動物的表位的分子。例如，這樣的抗原表位可以從下述原生動物制備，包括但不限于利什曼原蟲、kokzidioa和錐蟲。
優選地，當需要治療或預防寄生物感染時，使用包含已知寄生物的表位的分子。例如，這樣的抗原表位可以從下述寄生物制備，包括但不限于衣原體和立克次氏體。
5.3.Hsp/抗原分子復合物的體外生產在一個實施方案中，其中沒有使用體內內源結合的Hsp和抗原分子的特異性的復合物，體外地生產了Hsp與抗原分子的復合物。如本領域的技術人員能夠明白的，可以用多種純化的天然的或體外重組的應激蛋白重構通過前述方法分離的或化學合成或重組生產的抗原分子，以生成免疫原的非共價的應激蛋白-抗原分子復合物。或者，為了用于本發明的免疫治療性的或預防性的疫苗，可以將外源的抗原或其抗原性的或免疫原性的片段或衍生物復合到應激蛋白上。下面討論了一個優選的、示例性的體外復合應激蛋白和抗原分子的方法。
在復合之前，用ATP或低pH(例如，pH為1、2、3、4、5或6)預處理Hsp，以獲取可能與目標Hsp結合的任何肽。當使用ATP方法時，如Levy，等，1991，Cell 67265-274所述，通過加入apyranase來去除制劑中多余的ATP。當使用低pH方法時，通過加入pH修飾試劑，將緩沖液重新調至中性pH。
混合抗原分子(1μg)和預處理的Hsp(9μg)，得到約5抗原分子1應激蛋白摩爾比。然后，在合適的結合緩沖液(例如含有20mM磷酸鈉，pH 7.2，350mM NaCl，3mM MgCl2和1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)的緩沖液)中，將混合物在4至45℃溫育15分鐘至3小時。通過Centricon 10裝置(Millipore)離心制劑，以去除任何未結合的肽。通過SDS-PAGE，可以測定肽與應激蛋白的結合。這是體外復合從由內源的hsp-肽復合物解離出的肽的MHC-肽復合物分離出的肽的優選方法。
在本發明的一個替代實施方案中，優選地為了生產hsp70與外源的抗原分子(例如蛋白)的復合物，將5-10μg純化的Hsp與100微升體積的溶于20mM磷酸鈉緩沖液pH 7.5，0.5M NaCl，3mM MgCl2和1mM ADP中的等摩爾量的抗原分子在37℃溫育1小時。在磷酸緩沖鹽水中，將溫育混合物再稀釋至1ml。
在本發明的一個替代實施方案中，優選地為了生產gp96或hsp90與肽的復合物，將5-10μg純化的gp96或hsp90與溶于合適的緩沖液(例如含有20mM磷酸鈉緩沖液pH 7.5，0.5M NaCl，3nM MgCl2的緩沖液)中的等摩爾量或過量的抗原肽在37-65℃溫育5-20分鐘。將該溫育混合物冷卻至室溫，且如果需要，通過Centricon 10裝置(Millipore)離心一次或多次，以去除任何未結合的肽。
復合后，使用例如下述的混合淋巴細胞靶細胞測定(MLTC)，可以任選地體外測定免疫原性的應激蛋白-抗原分子復合物。一旦已經分離了免疫原性的復合物，可以使用下面討論的優選的施用方法和賦形劑，任選地在動物模型中進一步表征它們。
作為Hsp和抗原分子的非共價復合物的替代方案，可以在根據本發明的方法施用之前，將抗原分子共價地附著到Hsp上。在如5.1.1.至5.1.4部分所述的從細胞或組織中純化后，優選地交聯Hsp-抗原分子復合物。在一個實施方案中，將Hsp化學交聯地共價偶聯到抗原分子上。化學交聯方法是本領域熟知的。例如，在一個優選的實施方案中，可以使用戊二醛交聯。戊二醛交聯已經用于形成肽和hsp的共價復合物(見Barrios等，1992，Eur.J.Immunol.221365-1372)。優選地，在有0.002％戊二醛存在的情況下，將1-2mg Hsp-抗原分子復合物交聯2小時。通過對磷酸緩沖鹽水(PBS)透析過夜，去除戊二醛(Lussow等，1991，Eur.J.Immunol.212297-2302)。
在另一個實施方案中，Hsp和特異性的抗原通過紫外光(UV)交聯進行交聯。
在另一個實施方案中，生產了由熱激蛋白序列和抗原肽序列組成的重組融合蛋白。為了生產這樣的重組融合蛋白，使用本領域已知的重組方法，例如在上面的5.1.6.部分所述的那些，使用與編碼抗原的序列相融合的能編碼熱激蛋白的核酸序列，構建了表達載體。然后表達和分離了Hsp-抗原肽融合體。這樣的融合蛋白可以用于引起免疫反應(Suzue等，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.9413146-51)。通過特別設計分子的抗原肽部分，這樣的融合蛋白可以用于引起針對癌癥或傳染病的免疫反應和用于免疫治療。
5.4.生物學活性復合物的低聚反應根據本發明，凝集素或凝集素樣分子會與免疫學和/或生物學活性的糖蛋白形成分子復合物。在一些實施方案中，糖蛋白是熱激蛋白。在一些實施方案中，糖蛋白不是熱激蛋白。在一些實施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一些實施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在某些實施方案中，分子復合物還可以包含一種或多種非糖蛋白的部分。在一個具體的實施方案中，分子復合物還包含抗原性部分。在一個具體的實施方案中，分子復合物包含與糖蛋白和熱激蛋白結合的凝集素分子。在另一個實施方案中，分子復合物包含與糖蛋白、熱激蛋白和抗原分子結合的凝集素。在另一個具體的實施方案中，分子復合物包含與糖基化的熱激蛋白和抗原分子結合的凝集素分子，其中所述的糖基化的熱激蛋白可以是天然存在的熱激蛋白(例如，gp96，GRP170，肌鈣網蛋白和Bip(GRP78))或非天然存在的熱激蛋白，后者通過添加一種或多種在包含熱激蛋白的天然氨基酸序列中不存在的糖基化位點、隨后添加碳水化合物基團來轉化成糖蛋白。糖蛋白(例如，熱激蛋白)和抗原分子的復合物可以是非共價的或共價的。優選地，凝集素非共價地結合一種或多種糖蛋白或糖蛋白(例如，熱激蛋白)和一種或多種其它部分(例如，抗原分子)的復合物。在一個優選的實施方案中，凝集素分子是能結合甘露糖的凝集素分子，包括但不限于表1中所列的那些。更優選地，能結合甘露糖的凝集素分子是伴刀豆球蛋白A(ConA)。
在一個優選的實施方案中，分子復合物中的凝集素的數目大于分子復合物中的糖蛋白的數目。在一些實施方案中，糖蛋白和凝集素之間的摩爾比是3∶1、2∶1或1∶1。在一個優選的實施方案中，凝集素是四聚體形式的Con A，且對于每個四聚體Con A分子，附著了3個、2個或1個糖蛋白。
可以通過不同的方法制備本發明的分子復合物。在某些實施方案中，體內形成分子復合物，并從細胞中分離出分子復合物。在某些實施方案中，從一種或多種分子復合物的組分的純化的制劑體外生產分子復合物。在本發明的分子復合物制劑中使用的技術依賴于復合物的性質。制備本發明的分子復合物的組分的非限制性實例在上文5.1.-5.3.部分給出。還可以采用蛋白純化領域熟知的其它技術，它們包括但不限于吸附分離，例如，層析、離子交換、無機吸附劑、疏水吸附劑、固定金屬親和層析、免疫吸附劑、染料配體層析、從離子交換劑和其它的吸附劑的親和洗脫；凝膠過濾；電泳方法；液相分配和超濾。見Scopes，1994，PROTEIN PURIFICATION，PRINCIPLES ANDPRACTICE，第3版，Springer，其完整內容在本文中引作參考。
可以在制備分子復合物的各個階段加入凝集素，例如，在用于純化免疫學和/或生物學活性部分(例如，Hsp-蛋白復合物)的各層析步驟之前或之后。可以以各種形式加入凝集素，例如粉末或液體溶液。可以組合使用不同的凝集素，以制備本發明的低聚物。在加入本發明的分子制劑之前，還可以使用本領域熟知的方法交聯凝集素，以促進低聚反應。在一些實施方案中，添加凝集素是純化分子復合物中的一個步驟。在一些實施方案中，首先制備了分子復合物的其它組分，并向終產物中加入凝集素，以促進分子復合物的低聚反應。在一個優選的實施方案中，本發明的分子復合物包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素，其中添加的凝集素的量足以促進制劑的低聚反應和生成終產品，其中終產品中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或超過5ng、10ng、20ng、30ng、40ng、50ng、75ng、100ng或200ng/μg熱激蛋白。優選地，終產品中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是40ng-1000ng、50ng-1000ng、50ng-500ng、100ng-250ng或150ng-200ng凝集素/μg熱激蛋白。在一些實施方案中，添加的凝集素的量足以促進制劑的低聚反應和生成終產品，其中終產品中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是相同的，或小于5ng/μg熱激蛋白。優選地，終產品中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量是0.1ng-5ng、0.2ng-4ng、0.3ng-3ng、0.5ng-2ng或0.1ng-1ng凝集素/μg糖蛋白。
本領域已知的任何實驗都可以用于驗證分子復合物的低聚反應。例如，可以使用SEC作圖(profiling)，其中低聚化的分子復合物在尺寸排阻柱純化時洗脫在與未低聚化的分子復合物不同的級分中(例如，見第7部分)。
本領域已知的任何測定都可以用于驗證凝集素分子在低聚物中的存在，包括但不限于任何基于免疫的方法，例如ELISA、放射免疫測定、“夾心”免疫測定、免疫放射分析、免疫擴散測定、免疫熒光測定和免疫電泳測定等，所有的這些測定都是本領域熟知的，在這里不再詳細描述(關于Con A特異性的ELISA的實例，見第6部分)。
通過本領域已知的任何測定，可以證實分子復合物的低聚與其體內和體外活性的關聯，包括但不限于能檢測本發明的分子復合物的生物學活性和/或免疫原性的那些測定(例如但不限于下面的5.5部分所述的那些)，能檢測本發明的分子復合物的體外活性的測定(例如但不限于重新呈遞測定，例如，CD71體外重新呈遞測定、Meth A體外重新呈遞測定和CT26體外抗原重新呈遞測定，見下面的實施例部分)和能使用動物模型檢測本發明的分子復合物的體內活性的測定(例如，體內Meth A腫瘤抑制測定，見下面的實施例部分)。在一個優選的實施方案中，使用了重新呈遞測定或腫瘤抑制測定。
5.5.分子復合物的免疫原性的測定任選地，可以使用本領域已知的任何方法測定本發明的分子復合物的免疫原性。通過實例但非限制性的方式，可以使用下述方法之一。
5.5.1 MLTC測定簡而言之，使用任意的方便的施用途徑，給小鼠注射一定量的本發明的分子復合物。作為陰性對照，給其它的小鼠注射例如不包含低聚化的糖蛋白的分子復合物。已知含有特異性的抗原的細胞(例如感染了傳染病因子的腫瘤細胞或細胞)可以作為測定的陽性對照。給小鼠注射2次，間隔7-10天。最后一次免疫后10天，取出脾，釋放淋巴細胞。隨后可以通過加入死亡的表達目標抗原的細胞，體外地重新刺激釋放出的淋巴細胞。
例如，可以在3ml含有10％胎牛血清的RPMI培養基中，用4×104絲裂霉素C處理的或γ-輻射的(5-10,000拉德)含有目標抗原的細胞(或轉染了適當基因的細胞，視情況而定)刺激8×106免疫脾細胞。在某些情況中，可以在培養基中包含33％二次混合的淋巴細胞培養物上清液，作為T細胞生長因子來源(見，Glasebrook，等，1980，J Exp.Med.151876)。為了檢測免疫后原發的細胞毒性T細胞反應，可以無刺激地培養脾細胞。在有些實驗中，還可以用抗原性不同的細胞重新刺激免疫的小鼠的脾細胞，以測定細胞毒性T細胞反應的特異性。
6天后，在4小時51Cr-釋放測定中檢測培養物的細胞毒性(見，Palladino，等，1987，Cancer Res.475074-5079和Blachere，等，1993，J.Immunotherapy 14352-356)。在該測定中，向靶細胞懸浮液中添加混合的淋巴細胞培養物，以產生不同的效應物靶(E∶T)比(通常是1∶1至40∶1)。通過在37℃、在含有20mCi51Cr/ml的培養基中溫育1×106靶細胞1小時，預標記靶細胞。標記后，洗滌細胞3次。每個測定點(E∶T比)進行一式三份，并整合適當的對照以測量自發的51Cr釋放(測定中未加入淋巴細胞)和100％釋放(用去污劑裂解的細胞)。溫育細胞混合物4小時后，通過在200g離心5分鐘，沉淀細胞。通過γ計數器測量釋放到上清液中的51Cr的量。將(實驗樣品中的cpm-自發釋放的cpm)/(總去污劑釋放的cpm-自發釋放的cpm)測量為百分比細胞毒性。
為了阻斷MHC I類級聯，向實驗樣品中加入從K-44雜交瘤細胞(抗-MHC I類雜交瘤)衍生出的濃縮雜交瘤上清液，至終濃度為12.5％。
5.5.2 CD4+T細胞增殖測定從脾、新鮮血液或CSF得到了原代T細胞，并使用基本上如Kruse和Sebald，1992，EMBO J.113237-3244所述的FICOLL-PAQUEPLUS(Pharmacia，Upsalla，瑞典)通過離心進行純化。將外周血單核細胞與能表達抗原分子的細胞的裂解物一起溫育7-10天。在測定之前的24至48小時，可以任選地向培養物中加入呈遞抗原細胞，以在裂解物中加工和呈遞抗原。然后離心收獲細胞，在RPMI 1640培養基(GibcoBRL，Gaithersburg、Md.)中洗滌。在37℃，將5×104活化的T細胞/孔(PHA-胚細胞)置于在96孔平板中的含有10％胎牛血清、10mM HEPES.pH 7.5、2mM L-谷氨酰胺、100單位/ml青霉素G和100μg/ml硫酸鏈霉素的RPMI 1640培養基中72小時，用1μCi3H-胸苷(DuPont NEN，Boston，Mass.)/孔脈沖6小時，收獲，并在TOPCOUNT閃爍計數器(Packard Instrument Co.，Meriden，Conn.)中測量放射性。
5.5.3 抗體反應測定在本發明的某些實施方案中，通過測量施用復合物生成的抗體，可以測定包含低聚化的糖蛋白的本發明的分子復合物的免疫原性。在該實施方案的一個模式中，用50μl/孔的0.75μg/ml純化的非復合形式的用于分子復合物(例如Aβ42)中的抗原肽的PBS溶液在4℃涂覆微量滴定板(96-孔Immuno Plate II，Nunc)16小時，并在20℃涂覆1小時。排空孔，用200μl PBS-T-BSA(含有0.05％(v/v)TWEEN 20和1％(w/v)牛血清白蛋白的PBS)/孔在20℃封閉1小時，然后用PBS-T洗滌3次。將50μl/孔的來自已經接受了本發明的分子復合物的動物(例如模型小鼠或人患者)的血漿或CSF在20℃應用1小時，然后用PBS-T洗滌平板3次。然后適當地在20℃與50μl/孔的山羊抗-小鼠或抗-人免疫球蛋白溫育1小時后，后兩者與在PBS-T-BSA中以1∶1,500稀釋的辣根過氧化物酶(Amersham)和(如上所述3次另外的PBS-T洗滌后)50μl對苯二胺(OPD)-H2O2底物溶液綴合，量熱地測量抗-肽抗體的活性。5分鐘后，用150μl 2M H2SO4終止反應，用Kontron SLT-210光度計(SLT Lab-instr.，Zurich，瑞士)在492nm(參考620nm)測定吸光度。
5.5.4 細胞因子檢測測定通過檢測和定量特定細胞因子的水平，可以測量CD4+T細胞對本發明的HSP-復合物的增殖反應。在一個實施方案中，例如，使用IFN-γ檢測測定來測試本發明的復合物的免疫原性，可以測量胞內細胞因子。在該方法的一個實例中，用特定腫瘤的肽抗原或傳染病因子的肽抗原刺激了來自用凝集素-HSP-肽復合物處理的受試者的外周血單核細胞。然后用流式細胞儀可檢測的T細胞-特異性標記的抗體(例如FITC-綴合的抗-CD8和PerCP-標記的抗-CD4抗體)對細胞染色。洗滌后，固定細胞，滲化，并與染料標記的可與人IFN-γ反應的抗體(PE-抗-IFN-γ)反應。使用標準技術，通過流式細胞儀分析樣品。
或者，可以用濾器免疫實驗，即酶聯免疫斑點測定(ELISPOT)來檢測T細胞周圍的特異性的細胞因子。在一個實施方案中，例如，用純化的細胞因子-特異性的第一抗體(即抗-IFN-γ)涂覆硝酸纖維素襯墊的微量滴定板，并封閉該板，以避免其它蛋白的非特異性的結合造成的背景。從用凝集素-HSP-肽復合物處理的受試者得到了含有能分泌細胞因子的細胞的單核血細胞的樣品，將該樣品稀釋到微量滴定板的孔上。加入標記的(例如，生物素-標記的)第二抗-細胞因子抗體。然后可以檢測抗體細胞因子復合物，即通過酶綴合的鏈霉抗生物素蛋白-能分泌細胞因子的細胞在可視的、顯微鏡的或電子檢測方法中會顯示為“斑點”。
5.5.5 四聚體測定在另一個實施方案中，可以用“四聚體染色”測定(Altman等，1996，Science 27494-96)來鑒別抗原-特異性的T-細胞。例如，在一個實施方案中，使含有特異性的肽抗原(例如腫瘤-特異性的抗原)的MHC分子多聚化，以生成可溶的肽四聚體，并標記，例如通過復合鏈霉抗生物素蛋白。然后將MHC-肽抗原復合物與從大量用凝集素-HSP-復合物處理的受試者得到的T細胞混合。然后用生物素對能表達目標抗原(即腫瘤-特異性的抗原)的T細胞進行染色。
5.6.與過繼免疫治療的組合過繼免疫治療是指治療癌癥或傳染病的治療方法，其中給宿主施用免疫細胞，其目的是使該細胞直接或間接介導對腫瘤細胞和/或抗原組分的特異性免疫或腫瘤的退化或傳染病的治療，這視情況而定(見1999年11月16日授權的美國專利號5,985,270，其在這里整體引作參考)。作為任選的步驟，根據本文所述的方法，用本發明的分子復合物敏化APC，并用于過繼免疫治療中。
在一個實施方案中，用凝集素結合的與根據本文所述的方法制備的抗原蛋白復合的HSP敏化在過繼免疫治療中使用的呈遞抗原細胞(APC)。通過將凝集素-Hsp復合到源自能表達造成傳染病的因子的抗原決定簇的抗原性細胞或病毒顆粒中的至少50％不同蛋白或至少100不同蛋白的抗原蛋白上，可以生成復合物。通過(a)用蛋白酶消化源自所述癌癥類型的細胞的蛋白制劑，或者使其與ATP、鹽酸胍和/或酸接觸，以生成大量抗原性肽，和(b)使該大量抗原性肽復合到凝集素-Hsp上，也可以生產復合物。
在另一個實施方案中，施用體外復合的通過本發明的方法制備的抗原性肽、HSP和凝集素的療法可以與使用通過本領域已知的任何方法(見例如，美國專利號5,985,270)制備出的HSP-抗原肽復合物敏化的APC的過繼免疫治療組合，其中抗原性肽能表現出所需的抗原性(例如，癌癥類型或病原體的)。敏化的APC可以單獨施用，與體外復合的蛋白、HSP和凝集素組合施用，或在施用復合的蛋白、HSP和凝集素之前或之后施用。更具體地，敏化的APC在預防和治療癌癥方面的應用還可以包括給受試者施用對所述的治療或預防有效量的包含凝集素和復合到抗原蛋白上的熱激蛋白的復合物，其中所述的復合物如上所述制備。類似地，敏化的APC在治療或預防傳染病類型方面的應用還可以包括給受試者施用對所述的治療或預防有效量的包含凝集素結合的熱激蛋白和抗原蛋白的復合物。
而且，可以改變體外生產的本發明的分子復合物的施用模式，包括但不限于例如，皮下地、靜脈內地或肌內地，盡管優選皮內地。在另一個具體的實施方案中，施用由根據本發明制備的復合物敏化的呈遞抗原細胞的過繼免疫治療可以與施用與通過本領域已知的任何方法(見例如，美國專利號5,750,119；5,837,251；5,961,979；5,935,576,PCT公開號WO 94/14976或WO 99/50303)制備的HSP-抗原分子復合物結合的凝集素的療法組合，其中抗原分子表現出所需的抗原性(例如，癌癥類型或病原體的)。
5.6.1 得到巨噬細胞和呈遞抗原細胞優選地通過體外生產，如Inaba，K.，等，1992，J.Exp.Med.，1761693-1702所述，從來自人外周血或骨髓的干細胞和祖先細胞得到了抗原-呈遞細胞，包括但不限于巨噬細胞、樹突細胞和B-細胞。
通過本領域已知的各種方法中的任一種，可以得到APC。在優選的方面，使用了從人血細胞得到的人巨噬細胞。通過實例但非限制性的方式，可以如下得到巨噬細胞通過Ficoll-Hypaque梯度離心，從患者(優選要治療的患者)的外周血分離出了單核細胞，并接種到用患者自己的血清或其它AB+人血清預涂覆的組織培養皿中。將細胞在37℃溫育1小時，然后通過移液操作取出非貼壁的細胞。向皿中剩余的貼壁細胞中加入在磷酸緩沖鹽水中的冷的(4℃)1mM EDTA，并將皿置于室溫中15分鐘。收獲細胞，用RPMI緩沖液洗滌，并懸浮到RPMI緩沖液中。通過在37℃與巨噬細胞-集落刺激因子(M-CSF)一起溫育，可以得到增加數目的巨噬細胞；如Inaba，K.，等，1992，J.Exp.Med.，1761693-1702所詳細描述的，通過與粒細胞-巨噬細胞-集落刺激因子(GM-CSF)一起溫育，可以得到增加數目的樹突細胞。
5.6.2 用本發明的分子復合物敏化巨噬細胞和呈遞抗原細胞用本發明的分子復合物敏化了APC，優選地通過與復合物一起體外溫育細胞實現。通過在37℃與復合物體外溫育15分鐘至24小時，用包含與凝集素和抗原分子結合的糖蛋白/糖肽的復合物敏化了APC。通過實例但非限制性的方式，可以使5×104巨噬細胞在1ml簡單RPMI培養基中，與所需濃度(從150μg/ml開始，向下滴定)的Hsp一起在37℃溫育15分鐘至24小時。洗滌細胞3次，并重新懸浮到優選無菌的適用于給患者注射的方便濃度(例如，1×107/ml)的生理介質中。優選地，給其注射敏化的APC的患者是從其原始分離APC的患者(自體的實施方案)。
任選地，通過它們刺激CTL釋放腫瘤壞死因子的能力和它們作為這樣的CTL的靶的能力，可以監控敏化的APC刺激例如抗原-特異性的I類-限制的細胞毒性T-淋巴細胞(CTL)的能力。
5.6.3 敏化的APC的重新灌注通過常規的臨床方法，將分子復合物-敏化的APC全身地、優選靜脈內地重新灌注進患者中。將這些活化的細胞優選地通過全身施用重新灌注到自體患者中。依賴于患者的狀況，患者一般接受約106至約1012敏化的巨噬細胞。在一些方案中，患者可以任選地另外接受合適劑量的生物學反應調節劑，包括但不限于細胞因子IFN-α、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6、TNF或其它的細胞因子生長因子。
5.7.被動免疫療法本發明的組合物還可以用于針對癌癥和傳染病的被動免疫療法。被動免疫是宿主通過施用預先形成的針對異源生物的抗體獲得的短期保護。例如，包含從感染了傳染性生物的細胞得到的、且與凝集素分子低聚化的Hsp-肽復合物的本發明的組合物可以用于引起受試者中的免疫反應，從該受試者取出的血清還可以用于治療或預防該傳染性生物在另一個受試者中造成的疾病。
5.8.疾病的預防和治療本發明還提供了預防或治療疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制狀況等)的方法，包括給需要的受試者施用預防或治療有效量的包含一種或多種分子復合物的組合物，其中每種復合物包含與免疫學和/或生物學活性的糖蛋白結合的凝集素。在一個實施方案中，糖蛋白是抗原分子。在一個具體的實施方案中，復合物包含凝集素、抗原分子糖蛋白和其它分子，例如熱激蛋白，其可以是或不是糖基化的。在另一個實施方案中，糖蛋白不是抗原分子。在一個具體的實施方案中，糖蛋白是糖基化的熱激蛋白。在另一個實施方案中，本發明的分子復合物包含凝集素、非抗原分子糖蛋白和抗原分子(其可以是或不是糖蛋白)。在一個具體的實施方案中，抗原分子是能表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原性的蛋白(包括肽和多肽)。組合物還可以包含藥學上可接受的載體。在一些實施方案中，受試者是動物。在一些實施方案中，受試者是哺乳動物。在一些實施方案中，受試者是家畜，例如馬、雞、羊或豬。在一些實施方案中，受試者是寵物，例如鳥、狗或貓。在一個優選的實施方案中，受試者是人。
在一個實施方案中，“治療”是指疾病或其至少一項可辨別的癥狀的改善。在另一個實施方案中，“治療”是指至少一項可測量的與疾病有關的、受試者未必可辨別的身體參數的改善。在另一個實施方案中，“治療”是指身體地(例如，可辨別的癥狀的穩定)、生理地(例如，身體參數的穩定)或二者兼有地抑制疾病的進展。在另一個實施方案中，“治療”是指延遲疾病或紊亂的發作。
在某些實施方案中，將本發明的組合物施用給受試者作為對疾病的預防措施。如本文所使用的，“預防”是指減小患特定疾病(例如癌癥或傳染病)的風險。在該實施方案的一個模式中，將本發明的組合物施用給具有癌癥的遺傳性素因的受試者作為預防措施。在該實施方案的另一個模式中，將本發明的組合物施用給面臨暴露于致癌劑(包括但不限于化學物質和/或輻射)的受試者或面臨暴露于傳染病因子的受試者作為預防措施。
例如，在某些實施方案中，施用本發明的組合物，會使癌細胞或傳染因子的生長相對于不存在所述的組合物時的生長被抑制或減少至少99％、至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少60％、至少50％、至少45％、至少40％、至少45％、至少35％、至少30％、至少25％、至少20％或至少10％。
通過本發明的方法制備的組合物包含與糖蛋白、優選熱激蛋白結合的凝集素的復合物。組合物還可以包含大量抗原性肽(其可以是或不是糖蛋白)。本發明的組合物可以用于在腫瘤位點誘導炎性反應，且可以在治療的癌癥患者中最終造成腫瘤負荷量的衰退。本發明的組合物可以增強受試者的免疫活性，并引起針對傳染因子的特異性免疫和針對腫瘤前細胞和贅生性細胞的特異性免疫。本發明的組合物還可以用于預防傳染病的發作和進展，并抑制腫瘤細胞的生長和進展。
聯合療法是指本發明的分子復合物與其它用藥程式在預防和治療疾病(例如，癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏、酶缺乏病、免疫抑制狀況)中的應用。施用本發明的復合物可以增強預防劑或治療劑(例如抗癌劑或抗傳染劑)的作用，反之亦然。優選地，該其它形式的用藥程式是基于非凝集素-HSP的用藥程式，即該用藥程式不包含HSP或凝集素作為組分。該方法通常稱作聯合療法、輔助療法或結合療法(這些術語在本文中可互換地使用)。通過聯合療法，可以觀察到加和的效力或加和的治療效果。還可以預期治療功效大于加和功效的協同結果。使用聯合療法，還可以提供比單獨施用治療用藥程式或凝集素-HSP復合物更好的治療特征。加和的或協同的作用可以允許調節一種或兩種用藥程式的劑量和/或施用頻率，以減小或避免有害的或負面的作用。
根據本發明，本發明的分子復合物可以單獨使用，或者與許多不同類型的治療用藥程式組合使用。一些這樣的用藥程式對于特定類型的癌癥或傳染病是特別有用的，且在5.8.1和5.8.2部分予以討論。許多其它的用藥程式對免疫系統的功能有作用，并且通常可以應用于腫瘤病和傳染病。
在一個實施方案中，本發明的分子復合物與一種或多種生物反應調節劑組合使用，以治療癌癥或傳染病。一組生物反應調節劑是細胞因子。在一個這樣的實施方案中，將細胞因子施用給接受本發明的分子復合物的受試者。在另一個這樣的實施方案中，將分子復合物施用給接受化療劑和細胞因子的組合的受試者。在各種實施方案中，可以使用一種或多種細胞因子，且它們選自IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IFNα，IFNβ，IFNγ，TNFα，TNFβ，G-CSF，GM-CSF，TGF-β，IL-15，IL-18，GM-CSF，INF-γ，INF-α，SLC，內皮單核細胞活化蛋白-2(EMAP2)，MIP-3α，MIP-3β或MHC基因，例如HLA-B7。另外，其它示例性的細胞因子包括TNF家族的其它成員，包括但不限于與TNF-α有關的誘導細胞凋亡的配體(TRAIL)，與TNF-α有關的活化誘導的細胞因子(TRANCE)，與TNF-α有關的細胞凋亡弱誘導物(TWEAK)，CD40配體(CD40L)，淋巴毒素α(LT-α)，淋巴毒素β(LT-β)，OX40配體(OX40L)，Fas配體(FasL)，CD27配體(CD27L)，CD30配體(CD30L)，41BB配體(41BBL)，APRIL，LIGHT，TL1，TNFSF16，TNFSF17和AITR-L，或其功能部分。見，例如，Kwon等，1999，Curr.Opin.Immunol.11340-345關于TNF家族的綜述。優選地，在治療用藥程式之前施用分子復合物。在一個具體的實施方案中，將本發明的復合物施用給接受環磷酰胺和IL-12的組合的受試者，以治療癌癥。
在另一個實施方案中，將本發明的分子復合物與一種或多種生物反應調節劑組合使用，所述調節劑是免疫系統的各種配體、受體和信號轉導分子的激動劑或拮抗劑。例如，生物反應調節劑包括但不限于Toll樣受體(TLR-2，TLR-7，TLR-8和TLR-9)的激動劑；LPS；41BB，OX40，ICOS和CD40的激動劑；和Fas配體、PD1和CTLA-4的拮抗劑。這些激動劑和拮抗劑可以是抗體、抗體片段、肽、擬肽(peptidomimetic)化合物和多糖。
在另一個實施方案中，將本發明的分子復合物與一種或多種生物反應調節劑組合使用，后者是免疫刺激性的核酸。這樣的核酸(其中的許多是包含未甲基化的CpG基序的寡核苷酸)是促脊椎動物淋巴細胞有絲分裂的，且已知其能增強免疫反應。見Woolridge等，1997，Blood 892994-2998。這樣的寡核苷酸記載在國際專利公開號WO01/22972、WO 01/51083、WO 98/40100和WO 99/61056中，其中的每篇都在這里整體引入，和美國專利號6,207,646、6,194,388、6,218,371、6,239,116、6,429,199和6,406,705，其中的每篇都在這里整體引入。Kandimalla等已經在Bioorganic & Medicinal Chemistry 9807-813(2001)中描述了其它種類的免疫刺激性的寡核苷酸，例如含有YpG-和CpR-基序的硫代磷酸酯寡脫氧核苷酸，其在這里整體引作參考。還包括免疫刺激性的寡核苷酸，其缺少CpG二核苷酸，后者當通過粘膜途徑(包括低劑量施用)或通過腸胃外的途徑以高劑量施用時會增強抗體反應，經常與CpG核酸的程度一樣，但是該反應是Th2-偏向的(IgG1＞＞IgG2a)。見美國專利公開號20010044416 A1，其在這里整體引作參考。按照前述專利和文獻，可以進行測定免疫刺激性的寡核苷酸的活性的方法。而且，可以在磷酸酯主鏈、糖、核堿基(nucleobase)和核苷酸間連接的范圍內修飾免疫刺激性的寡核苷酸，以調控活性。這樣的修飾是本領域的技術人員已知的。
在另一個實施方案中，本發明的分子復合物與一種或多種佐劑組合使用。在一個具體的實施方案中，本發明的分子復合物與皂苷(例如，QS-21)和/或免疫刺激性的寡核苷酸(例如，包含至少1個CpG二核苷酸的寡核苷酸)組合使用。可以分開施用佐劑，或者在與本發明的復合物混合在一起的組合物中施用。全身佐劑是可以腸胃外地遞送的佐劑。全身佐劑包括能產生貯存(depot)效果的佐劑、能刺激免疫系統的佐劑和能實現二者的佐劑。如本文所使用的，能產生貯存效果的佐劑是能使抗原在體內緩慢釋放、從而延長免疫細胞向抗原的暴露時間的佐劑。這類佐劑包括但不限于明礬(例如，氫氧化鋁、磷酸鋁)；或基于乳狀液的制劑，包括礦物油、非礦物油、油包水包油乳狀液、水包油的乳狀液，例如Seppic ISA系列的Montanide佐劑(例如，Montanide ISA 720，AirLiquide，Paris，法國)；MF-59(用Span 85和Tween 80穩定化的水包角鯊烯的乳狀液；Chiron Corporation，Emeryville，Calif.；和PROVAX(含有穩定化去污劑和膠束形成劑的水包油乳狀液；IDEC，Pharmaceuticals Corporation，San Diego，Calif.)。
其它佐劑會刺激免疫系統，例如使免疫細胞生產和分泌細胞因子或IgG。這類佐劑包括但不限于免疫刺激性的核酸，例如CpG寡核苷酸；從皂樹(Q.saponaria)的樹皮純化出的皂苷，例如QS21；聚[二(羧基苯氧基)膦腈(poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene)(PCPP聚合物；Virus Research Institute，美國)；脂多糖(LPS)的衍生物，例如單磷酰脂質A(MPL；Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hamilton，Mont.)，胞壁酰二肽(MDP；Ribi)和蘇氨酰-胞壁酰二肽(t-MDP；Ribi)；OM-174(與脂質A有關的葡糖胺二糖；OM Pharma SA，Meyrin，瑞士)；氨烷基氨基葡糖苷磷酸鹽(AGPs，Corixa Corporation)和利什曼原蟲屬(Leishmania)延伸因子(純化的利什曼原蟲屬蛋白；CorixaCorporation，Seattle，Wash.)。
其它的全身佐劑是能生成貯存效果和刺激免疫系統的佐劑。這些化合物是具有上面鑒別出的全身佐劑的2種功能的那些化合物。這類佐劑包括但不限于ISCOM(免疫刺激復合物，其含有混合的皂苷、脂質，并形成具有能容納抗原的孔的病毒大小的顆粒；CSL，Melbourne，澳大利亞)；SB-AS2(SmithKline Beecham佐劑系統#2，它是含有MPL和QS21的水包油乳狀液SmithKline Beecham Biologicals[SBB]，Rixensart，比利時)；SB-AS4(SmithKline Beecham佐劑系統#4，它含有明礬和MPL；SBB，比利時)；能形成膠束的非離子性的嵌段共聚物，例如CRL 1005(它們含有通過聚氧乙烯鏈在側面連接的疏水聚氧丙烯的線性鏈；Vaxcel，Inc.，Norcross，Ga.)；和Syntex佐劑制劑(SAF，含有Tween 80和非離子性的嵌段共聚物的水包油乳狀液；SyntexChemicals，Inc.，Boulder，Colo.)。
根據本發明有用的粘膜佐劑是當與本發明的復合物一起施用給粘膜表面時能在受試者中誘導粘膜免疫反應的佐劑。粘膜佐劑包括但不限于CpG核酸(例如PCT公布的專利申請WO 99/61056)，細菌毒素例如，霍亂毒素(CT)，CT衍生物，包括但不限于CT B亞基(CTB)(Wu等，1998，Tochikubo等，1998)；CTD53(Val至Asp)(Fontana等，1995)；CTK97(Val至Lys)(Fontana等，1995)；CTK104(Tyr至Lys)(Fontana等，1995)；CTD53/K63(Val至Asp，Ser至Lys)(Fontana等，1995)；CTH54(Arg至His)(Fontana等，1995)；CTN107(His至Asn)(Fontana等，1995)；CTE114(Ser至Glu)(Fontana等，1995)；CTE112K(Glu至Lys)(Yamamoto等，1997a)；CTS61F(Ser至Phe)(Yamamoto等，1997a，1997b)；CTS106(Pro至Lys)(Douce等，1997，Fontana等，1995)；和CTK63(Ser至Lys)(Douce等，1997，Fontana等，1995)，密閉小帶毒素，zot，大腸桿菌熱不穩定腸毒素(LT)，LT衍生物包括但不限于LT B亞基(LTB)(Verweij等，1998)；LT7K(Arg至Lys)(Komase等，1998，Douce等，1995)；LT61F(Ser至Phe)(Komase等，1998)；LT112K(Glu至Lys)(Komase等，1998)；LT118E(Gly至Glu)(Komase等，1998)；LT146E(Arg至Glu)(Komase等，1998)；LT192G(Arg至Gly)(Komase等，1998)；LTK63(Ser至Lys)(Marchetti等，1998，Douce等，1997，1998，Di Tommaso等，1996)；和LTR72(Ala至Arg)(Giuliani等，1998)，百日咳毒素，PT.(Lycke等，1992，Spangler BD，1992，Freytag和Clemments，1999，Roberts等，1995，Wilson等，1995)包括PT-9K/129G(Roberts等，1995，Cropley等，1995)；毒素衍生物(見下文)(Holmgren等，1993，Verweij等，1998，Rappuoli等，1995，Freytag和Clements，1999)；脂質A衍生物(例如，單磷酰脂質A，MPL)(Sasaki等，1998，Vancott等，1998；胞壁酰二肽(MDP)衍生物(Fukushima等，1996，Ogawa等，1989，Michalek等，1983，Morisaki等，1983)；細菌外膜蛋白(例如，布氏疏螺旋體(Borreliaburgdotferi)的外表面蛋白A(OspA)脂蛋白、腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)的外膜蛋白)(Marinaro等，1999，Van de Verg等，1996)；水包油的乳狀液(例如，MF59)(Barchfield等，1999，Verschoor等，1999，O′Hagan，1998)；鋁鹽(Isaka等，1998，1999)；和皂苷(例如，QS21)Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Worster，Me.)(Sasaki等，1998，MacNeal等，1998)，ISCOM，MF-59(用Span 85和Tween 80穩定化的水包角鯊烯的乳狀液；Chiron Corporation，Emeryville，Calif.)；the Seppic ISA系列的Montanide佐劑(例如，Montanide ISA 720；AirLiquide，Paris，法國)；PROVAX(含有穩定化去污劑和膠束形成劑的水包油乳狀液；IDEC PharmaceuticalsCorporation，San Diego，Calif.)；Syntext佐劑制劑(SAF；SyntexChemicals，Inc.，Boulder，Colo.)；聚[二(羧基苯氧基)膦腈(PCPP聚合物；Virus Research Institute，美國)和利什曼原蟲屬延伸因子(CorixaCorporation，Seattle，Wash.)。
5.8.1 靶癌癥單獨或與敏化的APC一起施用本發明的組合物，會刺激宿主受試者的免疫活性，并引起針對腫瘤前細胞和/或贅生性細胞的特異性免疫。如本文所使用的，“腫瘤前”細胞是指處于從正常形式向腫瘤形式的過渡中的細胞。逐漸得到分子生物學研究支持的形態學證據表明，腫瘤形成前通過多個步驟進行。非贅生性細胞生長通常由增生、化生或最獨特的發育異常組成(關于這樣的異常生長狀況的綜述，見Robbins和Angell，1976，Basic Pathology，2d Ed.，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，pp.68-79)。增生是有控制的細胞增殖的形式，涉及組織或器官中的細胞數目的增加，而不顯著改變結構或功能。例如，子宮內膜增生經常先于子宮內膜癌。化生是有控制的細胞生長的形式，其中一種類型的成年或完全分化的細胞取代另一種類型的成年細胞。化生可以發生在上皮組織或結締組織的細胞中。非典型的化生涉及稍微混亂的化生上皮。發育異常經常是癌癥的預兆，且主要見于上皮；它是非贅生性細胞生長的最混亂的形式，涉及個體細胞均勻性和細胞的結構取向的損失。發育異常的細胞經常具有異常大的、深度染色的核，并表現出多型現象。當存在慢性刺激或炎癥時，發育異常會特征地發生，且常見于子宮頸、呼吸道、口腔和膽囊。盡管腫瘤前的病變可能發展成瘤形成，但它們也可以保持穩定較長的時間段，甚至可以退化，特別是如果去除了刺激劑或如果病變被宿主的免疫攻擊征服時。可以用本發明的組合物治療的癌癥還包括但不限于人肉瘤和癌。人肉瘤和癌還是對低聚化的糖蛋白復合物敏化的APC的過繼免疫治療起反應的。
在一個實施方案中，聯合療法除了包括施用本發明的分子復合物以外，還包括輔助使用一種或多種能輔助預防或治療癌癥的用藥程式，該用藥程式包括但不限于化療劑、免疫治療劑、抗血管發生劑、細胞因子、激素、抗體、多核苷酸、輻射和光動力學的治療劑。在具體的實施方案中，聯合療法可以用于預防癌癥的復發、抑制轉移或抑制癌癥或轉移的生長和/或擴散。
通過本發明的方法可以治療或預防的癌癥類型包括但不限于人肉瘤和癌，例如，纖維肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮肉瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝瘤、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、腎母細胞瘤、子宮頸癌、睪丸瘤、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、成血管細胞瘤、聽神經瘤、少突神經膠質瘤、腦膜瘤、黑素瘤、成神經細胞瘤、成視網膜細胞瘤；白血病，例如、急性淋巴細胞性白血病和急性髓細胞性白血病(原粒細胞的、早幼粒細胞的、骨髓單核細胞的、單核細胞的和紅白血病)；慢性白血病(慢性髓細胞性(粒細胞的)白血病和慢性淋巴細胞性白血病)；和真性紅細胞增多、淋巴瘤(何杰金病和非何杰金病)、多發性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫巨球蛋白血癥和重鏈病。
在另一個實施方案中，癌癥患者由于在施用本發明的分子復合物或施用凝集素-Hsp敏化的APC之前已經進行了抗癌治療(例如，化療輻射)而被免疫抑制。
本發明提供的免疫療法能理想地用于癌癥患者具有多種原因。首先，具有麻醉的手術會導致免疫抑制。利用手術前階段的適當的免疫療法，可以預防或逆轉該免疫抑制。這會導致更少的感染并發癥，并促進傷口愈合。其次，手術后的腫瘤體積是最小的，在該情況下免疫療法最可能是有效的。第三個原因是如下可能性，即腫瘤細胞在手術時會流入循環中，在此時應用有效的免疫療法可以消除這些細胞。
本發明的預防和治療方法指向在手術前、手術時或手術后增強癌癥患者的免疫活性，以及誘導對癌細胞的腫瘤-特異性的免疫，其目的是抑制癌癥，且最終的臨床目的是完全的癌退化和根除。本發明的方法還可以用于面臨特定種類癌癥的高風險的個體，例如，由于家族史或環境危險因素所導致的。
在一些實施方案中，除了本發明的分子復合物外，還給需要治療或預防癌癥的受試者施用一種或多種抗癌劑。抗癌劑是指能輔助治療腫瘤或癌癥的任何分子或化合物。在本發明的方法中可以使用的抗癌劑的實例包括但不限于異噁唑醋酸；阿柔比星；鹽酸阿可達唑；阿克羅寧；阿多來新；阿地白細胞介素；六甲密胺；丙氨肽霉素；阿美坦醌；氨魯米特；安吖啶；阿那曲唑；氨茴霉素；天冬酰胺酶；曲林菌素(asperlin)；阿托胞苷；阿扎替派；阿佐霉素；巴馬司他；苯佐替派；比卡魯胺；鹽酸必桑郡；二甲磺酸雙奈法德(bisnafide dimesylate)；比折來新(bizelesin)；硫酸博來霉素；白瑞夸爾鈉；溴匹立明；白消安；放線菌素C；卡普睪酮；卡拉酰胺；卡貝替姆；卡鉑；卡莫司汀；鹽酸卡米諾霉素；卡折來新(carzelesin)；西地芬戈(cedefingol)；苯丁酸氮芥；西羅里霉素；順鉑；克拉利平；甲磺酸克雷斯托；環磷酰胺；阿糖胞苷；達卡巴嗪；放線菌素D；鹽酸柔紅霉素；脫氧氮雜胞苷；右奧馬鉑(dexormaplatin)；地扎胍寧(dezaguanine)；甲磺酸地扎胍寧；地吖醌；多西他賽；阿霉素；鹽酸阿霉素；屈洛昔芬；檸檬酸屈洛昔芬；丙酸甲雄烷酮；偶氮霉素；依達曲沙；鹽酸艾佛鳥氨酸；elsamitrucin；恩絡鉑；恩普氨酯；依匹哌啶；鹽酸表阿霉素；厄布洛唑(erbulozole)；鹽酸去羥阿霉素；雌莫司汀；雌莫司汀磷酸鈉；依他硝唑；依托泊苷；磷酸依托泊苷；艾托卜寧；鹽酸法羅唑啉；法扎拉濱(fazarabine)；維甲酰酚胺；氟尿苷；磷酸氟達拉濱；氟尿嘧啶；氟西他賓；磷喹酮(fosquidone)；佛司曲辛鈉；吉西他濱；鹽酸吉西他濱；羥基脲；鹽酸去甲柔毛霉素；異環磷酰胺；依莫佛新；白細胞介素II(包括重組的白細胞介素II，或rIL2)，干擾素α-2a；干擾素α-2b；干擾素α-n1；干擾素α-n3；干擾素β-Ia；干擾素γ-Ib；異丙鉑；鹽酸伊立替康；生長妥林；來曲唑；醋酸亮丙瑞林；鹽酸利阿唑；洛美曲索鈉；洛莫氮芥；鹽酸洛索蒽醌(loxoxantrone hydrochloride)；馬丙考；美登素；鹽酸氮芥；醋酸甲地孕酮；醋酸美侖孕酮；美法侖；美洛格端；巰嘌呤；甲氨蝶呤；甲氨蝶呤鈉；氯苯氨啶；四甲尿烷亞胺；米汀多酰胺；mitocarcin；絲裂紅素；絲林霉素；絲裂馬菌素；絲裂霉素；絲裂帕菌素；米托坦；鹽酸米托蒽醌；霉酚酸；洛可達唑；諾加拉霉素；奧馬鉑(ormaplatin)；奧昔舒侖；紫杉醇；培加帕酶；培利霉素(peliomycin)；戊氮芥；硫酸培來霉素；哌磷酰胺；哌泊溴烷；哌泊舒凡；鹽酸必散特隆；普卡霉素；普洛美坦(plomestane)；卟吩姆鈉；泊非羅霉素；松龍苯芥；鹽酸丙卡巴肼；嘌呤霉素；鹽酸嘌呤霉素；吡唑呋喃菌素；利波腺苷；吡魯米特；沙芬戈(safingol)；鹽酸沙芬戈；司莫司汀；雙曲秦；斯帕磷酸鈉；司帕素霉素；鹽酸鍺螺胺；螺旋氮芥；順螺鉑；鏈黑霉素；鏈脲霉素；磺氯苯脲(sulofenur)；他利霉素；tecogalan sodium；喃氟啶；鹽酸替洛蒽醌(teloxantronehydrochloride)；替莫泊芬(temoporfin)；替尼泊苷；臺羅西隆；睪內酯；硫唑鳥嘌呤；硫鳥嘌呤；噻替哌；噻唑呋林；替拉扎明；檸檬酸托瑞米芬；醋酸7-甲諾酮；磷酸曲西瑞賓；曲麥克特；三甲曲沙葡糖醛酯；曲普瑞林；鹽酸九布洛唑；尿嘧啶氮芥；烏瑞替哌；伐普肽(vapreotide)；維替泊芬(verteporfin)；硫酸長春堿；硫酸長春新堿；長春地辛；硫酸長春地辛；硫酸長春匹定(vinepidine sulfate)；硫酸長春甘酯；硫酸長春素；長春瑞賓；硫酸異長春堿；硫酸長春氮芥；伏羅唑；折尼拉汀；新制癌菌素；鹽酸佐柔比星。
可以使用的其它抗癌藥包括但不限于20-表-1，25二羥基維生素D3；5-乙炔基尿嘧啶；阿比特龍(abiraterone)；阿柔比星；酰基富烯(acylfulvene)；adecypenol；阿多來新；阿地白介素；ALL-TK拮抗劑；六甲密胺；安巴司丁；amidox；氨磷丁；氨基乙酰丙酸；氨柔比星(amrubicin)；安吖啶；阿那格雷；阿那曲唑；穿心蓮內酯；血管生成抑制劑；拮抗劑D；拮抗劑G；安雷利克斯；抗-背部化形態發生蛋白-1；抗雄激素物質，前列腺癌；抗雌激素；抗瘤酮；反義寡核苷酸；氨基乙酸艾菲地可寧；細胞凋亡基因調節劑；細胞凋亡調節劑；脫嘌呤核酸；ara-CDP-DL-PTBA；精氨酸脫氨酶；asulacrine；阿他美坦；阿曲氮芥；axinastatin 1；axinastatin 2；axinastatin 3；阿扎西隆；azatoxin；重氮酪氨酸(azatyrosine)；漿果赤霉素III衍生物；balanol；巴馬司他；BCR/ABL拮抗劑；benzochlorins；苯甲酰十字孢堿；β內酰胺衍生物；beta-alethine；亞阿克拉霉素B；白樺酯酸；bFGF抑制劑；比卡魯胺；必桑郡；雙吖丙啶基精胺；雙奈法德；bistratene A；比折來新；breflate；溴匹立明；布朵替坦；丁硫氨酸亞砜胺(buthionine sulfoximine)；鈣泊三醇；calphostin C；喜樹堿衍生物；canarypox IL-2；卡培他濱；氨甲酰-氨基-三唑；羧基氨基三唑；CaRest M3；CARN 700；軟骨衍生的抑制劑；卡折來新；酪蛋白激酶抑制劑(ICOS)；澳粟精胺；殺菌肽B；西曲瑞克；chlorlns；氨磺酰氯喹噁啉；西卡前列素；順式卟啉；克拉利平；氯米芬類似物；克霉唑；collismycin A；collismycin B；風車子素A4；風車子素類似物；conagenin；crambescidin 816；克雷斯托；隱藻素8(cryptophycin8)；隱藻素A衍生物；庫拉素A(curacin A)；環戊蒽醌(cyclopentanthraquinones)；cycloplatam；cypemycin；阿糖胞苷酯；溶細胞因子；磷酸己烷雌酚；達昔單抗(dacliximab)；脫氧氮雜胞苷；脫氫代代寧B；地洛瑞林(deslorelin)；地塞米松；右異環磷酰胺(dexifosfamide)；右雷佐生；右維拉帕米(dexverapamil)；地吖醌；代代寧B；didox；diethylnorspermine；二氫-5-氮胞苷；二氫紫杉醇，9-；dioxamycin；聯苯螺旋氮芥；多西他賽；二十二烷醇；多拉司瓊；脫氧氟尿苷；屈洛昔芬；屈大麻酚；duocarmycin SA；依布硒；依考莫司汀(ecomustine)；依地福新(edelfosine)；依決洛單抗(edrecolomab)；艾佛鳥氨酸；欖烯；乙嘧替氟(emitefur)；表阿霉素；依立雄胺；雌莫司汀類似物；雌激素激動劑；雌激素拮抗劑；依他硝唑；磷酸依托泊苷；依西美坦；法羅唑啉；法扎拉濱；維甲酰酚胺；非格司亭；非那雄胺；flavopiridol；氟噻司汀；fluasterone；氟達拉濱；fluorodaunorunicin hydrochloride；伏芬尼美司；福美坦；佛司曲辛；福泰氮芥；gadolinium texaphyrin；硝酸鎵；加洛他濱(galocitabine)；加尼瑞克；明膠酶抑制劑；吉西他濱；谷胱甘肽抑制劑；hepsulfam；heregulin；六亞甲基二乙酰胺；金絲桃素；伊本膦酸；去甲柔毛霉素；艾多昔芬；伊決孟酮(idramantone)；伊莫福新；伊洛馬司他(ilomastat)；咪唑吖啶酮(imidazoacridones)；咪喹莫特；免疫刺激肽；胰島素樣生長因子-1受體抑制劑；干擾素激動劑；干擾素；白細胞介素；碘芐胍；碘阿霉素；甘薯黑疤霉醇，4-；伊羅普拉(iroplact)；伊索拉定；isobengazole；isohomohalicondrin B；伊他司瓊(itasetron)；jasplakinolide；kahalalide F；三醋酸片螺素(lamellarin)-N；緩釋蘭樂肽；leinamycin；來格司亭；硫酸香菇多糖；leptolstatin；來曲唑；白血病抑制因子；白細胞α干擾素；亮丙瑞林+雌激素+孕酮；亮丙瑞林；左旋咪唑；利阿唑；線性多胺類似物；親脂的二糖肽；親脂的鉑化合物；lissoclinamide 7；洛巴鉑；蚯蚓氨酸(lombricine)；洛美曲索；氯尼達明；洛索蒽醌；洛伐他汀；洛唑利賓；勒托替康(lurtotecan)；lutetium texaphyrin；lysofylline；裂解肽；美坦生；mannostatin A；馬馬司他；馬丙考；脈絲平；基質分解素(matrilysin)抑制劑；基質金屬蛋白酶抑制劑；美洛格瑞；美巴龍(merbarone)；meterelin；甲硫氨酸酶；甲氧氯普胺；MIF抑制劑；米非司酮；米替福星；米英司定；錯配的雙鏈RNA；丙米腙；二溴衛矛醇；絲裂霉素類似物；胺硝萘酞胺；mitotoxin成纖維細胞生長因子-皂草素；米托蒽醌；莫法羅汀(mofarotene)；重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；單克隆抗體，人絨毛膜促性腺激素；單磷酰脂質A+分枝桿菌細胞壁sk；蒙匹胺醇；多重抗藥性基因抑制劑；基于多重腫瘤抑制劑1的療法；芥子抗癌劑；印度洋海綿(mycaperoxide)B；分枝桿菌細胞壁提取物；myriaporone；N-acetyldinaline；N-取代的苯甲酰胺；萘法瑞林；nagrestip；納洛酮+噴他佐辛；napavin；naphterpin；納妥格拉斯丁；奈達鉑；奈莫柔比星(nemorubicin)；奈立膦酸(neridronic acid)；中性內肽酶；尼魯米特；nisamycin；氧化氮調節劑；硝基氮抗氧化劑；nitrullyn；O6-芐基鳥嘌呤；善得定；okicenone；寡核苷酸；奧那司酮；奧丹西隆；奧丹西隆；oracin；經口的細胞因子誘導劑；奧馬鉑；奧沙西羅(osaterone)；奧沙利鉑；oxaunomycin；紫杉醇；紫杉醇類似物；紫杉醇衍生物；palauamine；棕櫚酰根霉素；帕米膦酸；人參三醇；巴洛米芬；三羥水楊胺；泊澤尼普定；培加帕酶；peldesine；木聚硫鈉；噴司他丁；pentrozole；全氟溴烷(perflubron)；哌磷酰胺；紫蘇子醇；phenazinomycin；乙酸苯酯；磷酸酶抑制劑；溶鏈菌；鹽酸毛果蕓香堿；吡柔比星；吡曲克辛；placetin A；placetin B；纖溶酶原激活物抑制劑；鉑復合物；鉑化合物；鉑-三胺復合物；卟吩姆鈉；泊非羅霉素；潑尼松；丙基雙吖啶酮；前列腺素J2；蛋白酶體抑制劑；基于A蛋白的免疫調節劑；蛋白激酶C抑制劑；蛋白激酶C抑制劑，微觀藻類的；蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑；嘌呤核苷磷酸化酶抑制劑；紫紅素；9-甲氧基吡唑啉吖啶(pyrazoloacridine)；吡多酸化的血紅蛋白聚氧乙烯綴合物；raf拮抗劑；雷替曲塞；拉莫西隆；ras法尼基蛋白轉移酶抑制劑；ras抑制劑；ras-GAP抑制劑；脫甲基化的雷替尼卜定；羥乙膦酸錸Re 186；根霉素；核酶；RII retinamide；吡魯米特；rohitukine；磷壁酰基二肽；羅喹美克；rubiginone B1；ruboxyl；沙芬戈；saintopin；SarCNU；sarcophytol A；重組人粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子；Sdi 1模擬物；司莫司汀；衰老衍生的抑制劑1；有義寡核苷酸；信號轉導抑制劑；信號轉導調節劑；單鏈抗原結合蛋白；西索菲蘭；索布佐山；硼卡鈉(sodium borocaptate)；苯乙酸鈉；solverol；生長調節素結合蛋白；索納明(sonermin)；斯帕磷酸；spicamycin D；螺旋氮芥；斯耐潘定；spongistatin 1；角鯊胺(squalamine)；干細胞抑制劑；干細胞分裂抑制劑；stipiamide；溶基質素抑制劑；sulfinosine；強效的血管活性的腸肽拮抗劑；suradista；蘇拉明；苦馬豆素(swainsonine)；合成的糖胺聚糖；他莫司汀(tallimustine)；他莫昔芬甲碘化物；牛磺莫司汀；他佐羅汀；tecogalansodium；喃氟啶；tellurapyrylium；端粒末端轉移酶抑制劑；替莫泊芬；替莫唑胺；替尼泊苷；tetrachlorodeeaoxide；tetrazomine；thaliblastine；thiocoraline；血小板生成素；血小板生成素模擬物；胸腺法新；胸腺生成素受體激動劑；胸腺曲南(thymotrinan)；促甲狀腺素素；tin ethyl etiopurpurin；替拉扎明；二氯環戊二烯鈦；topsentin；托瑞米芬；全能干細胞因子；翻譯抑制劑；維A酸；三乙酰基尿苷；曲西瑞賓；曲麥克特；曲普瑞林；托烷司瓊；妥羅雄脲(turosteride)；酪氨酸激酶抑制劑；酪氨酸磷酸化抑制劑；UBC抑制劑；烏苯美司；尿殖竇-衍生的生長抑制因子；尿激酶受體拮抗劑；伐普肽；variolin B；載體系統，紅細胞基因療法；維拉雷瑣(velaresol)；vermine；verdins；維替泊芬；長春烯堿；vinxaltine；vitaxin；伏羅唑；扎諾特隆(zanoterone)；折尼拉汀；亞芐維(zilascorb)和凈司他丁替馬拉美。
抗癌劑可以是化療劑，其包括但不限于下述的化合物細胞毒性的抗生素、抗代謝物、抗有絲分裂劑、烷化劑、鉑化合物、砷化合物、DNA拓撲異構酶抑制劑、紫杉烷、核苷類似物、植物生物堿和毒素；和其合成的衍生物。表2列出了所述組中的示例性的化合物
表2
本發明還預期含有一種或多種化療劑(例如，FLAG、CHOP)的組合物。FLAG包括氟達拉濱、胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)和G-CSF。CHOP包括環磷酰胺、長春新堿、阿霉素和潑尼松。前面的表中的每一種都是說明性的，無意進行限制。
在一個實施方案中，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與5-氟尿嘧啶、順鉑、多西他賽、阿霉素、Herceptin、吉西他濱、IL-2、紫杉醇和/或VP-16(依托泊苷)一起組合治療乳腺癌。
在另一個實施方案中，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與紫杉醇、多西他賽、米托蒽醌和/或雄激素受體拮抗劑(例如，氟他胺)一起組合治療前列腺癌。
在另一個實施方案中，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與氟達拉濱、胞嘧啶阿拉伯糖苷、gemtuzumab(MYLOTARG)、柔紅霉素、甲氨蝶呤、長春新堿、6-巰嘌呤、去甲柔毛霉素、米托蒽醌、依托泊苷、天冬酰胺酶、潑尼松和/或環磷酰胺一起組合治療白血病。作為另一個實例，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與地塞米松一起組合治療骨髓瘤。
在另一個實施方案中，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與達卡巴嗪一起組合治療黑素瘤。
在另一個實施方案中，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與伊立替康一起組合治療結腸直腸癌。
在另一個實施方案中，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與紫杉醇、多西他賽、依托泊苷和/或順鉑一起組合治療肺癌。
在另一個實施方案中，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與環磷酰胺、CHOP、依托泊苷、博來霉素、米托蒽醌和/或順鉑一起組合治療非何杰金淋巴瘤。
在另一個實施方案中，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與順鉑一起組合治療胃癌。
在另一個實施方案中，可以用包含本發明的復合物的藥物組合物與吉西他濱一起組合治療胰腺癌。
根據本發明，本發明的復合物可以在抗癌劑之前、之后或與之同時施用，以預防或治療癌癥。依賴于癌癥的類型、受試者的歷史和狀況、選擇的抗癌劑，可以使本發明的復合物的應用與化療的劑量和時間選擇相協調。
可以將本發明的復合物的應用加入化療方案中。在一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為100至1000mg/m2/周期的吉西他濱。在一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為200至4000mg/m2/周期的達卡巴嗪。在一個優選的實施方案中，達卡巴嗪的劑量范圍為700至1000mg/m2/周期。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為25至50mg/m2/周期的氟達拉濱。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為200至2000mg/m2/周期的胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為1.5至7.5mg/kg/周期的多西他賽。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為5至15mg/kg/周期的紫杉醇。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為5至20mg/kg/周期的順鉑。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為5至20mg/kg/周期的5-氟尿嘧啶。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為2至8mg/kg/周期的阿霉素。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為40至160mg/kg/周期的表鬼臼毒素。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為50至200mg/kg/周期的環磷酰胺。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為50至75、75至100、100至125或125至150mg/m2/周期的伊立替康。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為3.7至5.4、5.5至7.4、7.5至11或11至18.5mg/m2/周期的長春堿。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為0.7至1.4或1.5至2mg/m2/周期的長春新堿。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為3.3至5、5至10、10至100或100至1000mg/m2/周期的甲氨蝶呤。
在一個優選的實施方案中，本發明還包括，當作為聯合療法方案的一部分施用時，低劑量的化療劑的應用。例如，本發明的復合物的起始治療會增加腫瘤對隨后的一定劑量的化療劑攻擊的敏感性，所述劑量接近或低于在沒有本發明的復合物時施用化療劑的劑量低限。
在一個實施方案中，給癌癥患者施用本發明的復合物和低劑量(例如，6-60mg/m2/天或更少)的多西他賽。在另一個實施方案中，給癌癥患者施用本發明的復合物和低劑量(例如，10-135mg/m2/天或更少)的紫杉醇。在另一個實施方案中，給癌癥患者施用本發明的復合物和低劑量(例如，2.5-25mg/m2/天或更少)的氟達拉濱。在另一個實施方案中，給癌癥患者施用本發明的復合物和低劑量(例如，0.5-1.5g/m2/天或更少)的胞嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)。
在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為10-100mg/m2/周期的吉西他濱。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為5-10、10-20、20-40或40-75mg/m2/周期的順鉑，例如，PLATINOL或PLATINOL-AQ(Bristol Myers)。在另一個實施方案中，給卵巢癌患者施用劑量范圍為7.5-75mg/m2/周期的順鉑。在另一個實施方案中，給膀胱癌患者施用劑量范圍為5-50mg/m2/周期的順鉑。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為2-4、4-8、8-16、16-35或35-75mg/m2/周期的卡鉑，例如，PARAPLATIN(Bristol Myers)。在另一個實施方案中，給卵巢癌患者施用劑量范圍為7.5-75mg/m2/周期的卡鉑。在另一個實施方案中，給膀胱癌患者施用劑量范圍為5-50mg/m2/周期的卡鉑。在另一個實施方案中，給睪丸癌患者施用劑量范圍為2-20mg/m2/周期的卡鉑。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為6-10、10-30或30-60mg/m2/周期的多西他賽，例如，TAXOTERE(Rhone PoulencRorer)。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為10-20、20-40、40-70或70-135mg/kg/周期的紫杉醇，例如，TAXOL(Bristol MyersSquibb)。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為0.5-5mg/kg/周期的5-氟尿嘧啶。在另一個實施方案中，化療劑是劑量范圍為2-4、4-8、8-15、15-30或30-60mg/kg/周期的阿霉素，例如，ADRIAMYCIN(Pharmacia & Upjohn)、DOXIL(Alza)、RUBEX(Bristol Myers Squibb)。
在另一個實施方案中，本發明的復合物與一種或多種免疫治療劑(例如抗體和疫苗)組合施用。在一個優選的實施方案中，抗體具有對癌癥的體內治療和/或預防用途。在一些實施方案中，抗體可以用于治療和/或預防傳染病。治療和預防性抗體的實例包括但不限于MDX-010(Medarex，NJ)，它是目前在臨床上用于治療前列腺癌的人源化的抗-CTLA-4抗體；SYNAGIS(MedImmune，MD)，它是用于治療RSV感染的患者的人源化的抗-呼吸道合胞病毒(RSV)單克隆抗體；HERCEPTIN(Trastuzumab)(Genentech，CA)，它是用于治療轉移性乳腺癌患者的人源化的抗-HER2單克隆抗體。其它的實例是人源化的抗-CD18F(ab′)2(Genentech)；CDP860，它是人源化的抗-CD18F(ab′)2(Celltech，英國)；PR0542，它是與CD4融合的抗-HIV gp120抗體(Progenics/Genzyme Transgenics)；Ostavir，它是人抗乙型肝炎病毒抗體(Protein Design Lab/Novartis)；PROTOVIRTM，它是人源化的抗-CMV IgG1抗體(Protein Design Lab/Novartis)；MAK-195(SEGARD)，它是鼠抗-TNF-αF(ab′)2(Knoll Pharma/BASF)；IC14，它是抗-CD14抗體(ICOS Pharm)；人源化的抗-VEGF IgG1抗體(Genentech)；OVAREXTM，它是鼠抗-CA 125抗體(Altarex)；PANOREXTM，它是鼠抗-17-IA細胞表面抗原IgG2a抗體(GlaxoWellcome/Centocor)；BEC2，它是鼠抗-獨特型(GD3表位)IgG抗體(ImClone System)；IMC-C225，它是嵌合的抗-EGFR IgG抗體(ImClone System)；VITAXINTM，它是人源化的抗-αV β3整聯蛋白抗體(Applied Molecular Evolution/MedImmune)；Campath 1H/LDP-03，它是人源化的抗CD52 IgG1抗體(Leukosite)；Smart M195，它是人源化的抗-CD33 IgG 抗體(Protein Design Lab/Kanebo)；RITUXANTM，它是嵌合的抗-CD20 IgG1抗體(IDEC Pharm/Genentech，Roche/Zettyaku)；LYMPHOCIDETM，它是人源化的抗-CD22 IgG抗體(Immunomedics)；Smart ID 10，它是人源化的抗-HLA抗體(ProteinDesign Lab)；ONCOLYMTM(Lym-1)是放射性標記的鼠抗-HLADIAGNOSTIC REAGENT抗體(Techniclone)；ABX-IL8是人抗-IL8抗體(Abgenix)；抗-CD11a是人源化的IgG1抗體(Genentech/Xoma)；ICM3是人源化的抗-ICAM3抗體(ICOS Pharm)；IDEC-114是靈長類化的抗-CD80抗體(IDEC Pharm/Mitsubishi)；ZEVALINTM是放射性標記的鼠抗-CD20抗體(IDEC/Schering AG)；IDEC-131是人源化的抗-CD40L抗體(IDEC/Eisai)；IDEC-151是靈長類化的抗-CD4抗體(IDEC)；IDEC-152是靈長類化的抗-CD23抗體(IDEC/Seikagaku)；SMART抗-CD3是人源化的抗-CD3 IgG(Protein Design Lab)；5Gl.1是人源化的抗-補體因子5(C5)抗體(Alexion Pharm)；D2E7是人源化的抗-TNF-α抗體(CAT/BASF)；CDP870是人源化的抗-TNF-α Fab片段(Celltech)；IDEC-151是靈長類化的抗-CD4 IgG1抗體(IDECPharm/SmithKline Beecham)；MDX-CD4是人抗-CD4 IgG抗體(Medarex/Eisai/Genmab)；CDP571是人源化的抗-TNF-αIgG4抗體(Celltech)；LDP-02是人源化的抗-α4β7抗體(LeukoSite/Genentech)；OrthoClone OKT4A是人源化的抗-CD4 IgG抗體(Ortho Biotech)；ANTOVATM是人源化的抗-CD40L IgG抗體(Biogen)；ANTEGRENTM是人源化的抗-VLA-4 IgG抗體(Elan)；MDX-33是人抗-CD64(FcγR)抗體(Medarex/Centeon)；SCH55700是人源化的抗-IL-5 IgG4抗體(Celltech/Schering)；SB-240563和SB-240683分別是人源化的抗-IL-5和IL-4抗體(SmithKline Beecham)；rhuMab-E25是人源化的抗-IgEIgG1抗體(Genentech/Norvartis/Tanox Biosystems)；ABX-CBL是鼠抗CD-147 IgM抗體(Abgenix)；BTI-322是大鼠抗-CD2 IgG抗體(MedImmune/Bio Transplant)；Orthoclone/OKT3是鼠抗-CD3 IgG2a抗體(ortho Biotech)；SIMULECTTM是嵌合的抗-CD25 IgG1抗體(Novartis Pharm)；LDP-01是人源化的抗-β2-整聯蛋白IgG抗體(LeukoSite)；抗-LFA-1是鼠抗CD 18 F(ab′)2(Pasteur-Merieux/Immunotech)；CAT-152是人抗-TGF-β2抗體(Cambridge AbTech)；Corsevin M是嵌合的抗-因子VII抗體(Centocor)。根據本領域的技術人員已知的任何方案，包括免疫反應性試劑的供應商推薦的方案，可以施用上述的免疫反應性試劑以及任何其它的免疫反應性試劑。在一個優選的實施方案中，本發明的分子復合物與抗-CTLA4抗體或抗-41BB抗體組合施用。
在另一個實施方案中，本發明的復合物與一種或多種抗血管發生劑組合施用，后者包括但不限于angiostatin，沙立度胺，三環域(kringle)5，血管內皮抑素(endostatin)，Serpin(絲氨酸蛋白酶抑制劑)抗-凝血酶，纖連蛋白的29kDa N-末端和40kDa C-末端蛋白水解片段，促乳素的16kDa蛋白水解片段，血小板因子-4的7.8kDa蛋白水解片段，與血小板因子-4的片段對應的13個氨基酸的肽(Maione等，1990，Cancer Res.512077-2083)，與膠原I的片段對應的14個氨基酸的肽(Tolma等，1993，J.Cell Biol.122497-511)，與血小板反應蛋白I的片段對應的19個氨基酸的肽(Tolsma等，1993，J.Cell Biol.122497-511)，與SPARC的片段對應的20個氨基酸的肽(Sage等，1995，J.Cell.Biochem.571329-1334)，或其任意片段、家族成員或變體，包括其藥學上可接受的鹽。
還已經描述了能抑制血管發生、且與層粘連蛋白、纖連蛋白、前膠原和EGF的片段相對應的其它肽(見，例如，Cao，1998，Prog MolSubcell Biol.20161-176)。已經證實，能阻斷某些結合RGD蛋白(即具有肽基序Arg-Gly-Asp)的整聯蛋白的單克隆抗體和環五肽具有抗血管形成的活性(Brooks等，1994，Science 264569-571；Hammes等，1996，Nature Medicine 2529-533)。而且，通過受體拮抗劑抑制尿激酶纖溶酶原激活物受體可以抑制血管發生、腫瘤生長和轉移(Min等，1996，Cancer Res.562428-33；Crowley等，1993，Proc Natl Acad Sci.905021-25)。本發明還預期將這樣的抗血管發生劑與復合物組合使用。
在另一個實施方案中，本發明的復合物與激素治療結合使用。激素治療性治療劑包含激素激動劑、激素拮抗劑(例如，氟他胺、比卡魯胺、他莫昔芬、雷洛昔芬、醋酸亮丙瑞林(LUPRON)、LH-RH拮抗劑)、激素生物合成和加工的抑制劑和類固醇(例如，地塞米松、類視黃醇、deltoids、倍他米松、皮質醇、可的松、潑尼松、去氫睪酮、糖皮質激素、鹽皮質激素、雌激素、睪酮、孕酮)、維生素A衍生物(例如，全反視黃酸(ATRA))；維生素D3類似物；抗孕激素(例如，米非司酮、奧那司酮)和抗雄激素物質(例如，環丙孕酮)。
在另一個實施方案中，本發明的復合物在癌癥的治療中與基因治療方案結合使用。在一個實施方案中，將使用能分泌白細胞介素-2的重組細胞的基因治療與本發明的復合物組合使用，以預防或治療癌癥，特別是乳腺癌(見，例如，Deshmukh等，2001，J Neurosurg.94287-92)。在其它實施方案中，使用多核苷酸化合物進行基因治療，例如但不限于反義多核苷酸、核酶、RNA干擾分子、三螺旋多核苷酸等，其中這樣的化合物的核苷酸序列與腫瘤或癌癥的起始、發展和/或病理學的相關基因的DNA和/或RNA的核苷酸序列有關。例如，許多是癌基因、生長因子基因、生長因子受體基因、細胞周期基因、DNA修復基因，且是本領域熟知的。
在另一個實施方案中，本發明的復合物與輻射治療方案結合施用。關于輻射治療，輻射可以是γ射線或X-射線。該方法包括包含輻射治療的癌癥治療，例如外射束輻射治療、放射同位素(I-125，鈀，銥)的間質植入，例如鍶-89，胸輻射治療，腹膜內的P-32輻射治療，和/或全腹部的和骨盆的輻射治療。關于輻射治療的一般綜述，見Hellman，第16章Principles of Cancer ManagementRadiation Therapy，第6版，2001，DeVita等，編，J.B.Lippencott Company，Philadelphia。在優選的實施方案中，輻射治療是作為外射束輻射或遠距離治療來施用的，其中輻射是從遠處源發出。在各種優選的實施方案中，輻射治療是作為內部治療或近距離放射療法施用的，其中放射活性源置于體內臨近癌細胞或腫瘤塊處。還包括組合使用本發明的復合物和包含施用感光劑的光動力學療法，所述感光劑例如血卟啉及其衍生物，Vertoporfin(BPD-MA)，酞菁，感光劑Pc4，脫甲氧-竹紅菌甲素A和2BA-2-DMHA。
在各種實施方案中，給癌癥患者組合施用本發明的復合物和至少一種化療劑較短的治療周期，以治療癌癥。使用化療劑進行治療的持續時間可以根據使用的具體癌癥治療劑而變化。本發明還預期不連續的施用或以分成數次部分施用的每日劑量施用。普通技術人員能夠明白具體的癌癥治療劑的適當治療時間，且本發明預期連續評價每種癌癥治療劑的最佳治療方案。本發明預期至少一個周期，優選超過一個周期，在該過程中施用單一治療劑或系列治療劑。普通技術人員能夠明白一個周期的適當時段，例如周期的總個數和周期之間的間隔。
在另一個實施方案中，將本發明的復合物與能改善癌癥癥狀(例如但不限于疼痛)和本發明的復合物產生的副作用(例如但不限于流感樣癥狀、發燒等)的化合物組合使用。因此，可以與本發明的復合物組合或混合使用已知能減少疼痛、流感樣癥狀和發燒的許多化合物。這樣的化合物包括鎮痛藥(例如，醋氨酚)，減充血劑(例如，偽麻黃堿)，抗組胺(例如，撲爾敏)和鎮咳劑(例如，美沙芬)。
5.8.2 靶傳染病本發明的方法可以治療或預防的傳染病是傳染因子造成的，包括但不限于病毒、細菌、真菌、原生動物、蠕蟲和寄生物。本發明不限于治療或預防胞內病原體造成的傳染病。文獻中已經廣泛地描述了許多醫學上有關的微生物，例如，見C.G.A Thomas，MedicalMicrobiology，Bailliere Tindall，Great Britain 1983，其完整內容在這里引作參考。
聯合療法除了包括施用本發明的復合物以外，還包括使用一種或多種能輔助預防或治療傳染病的用藥程式，該用藥程式包括但不限于抗生素、抗病毒劑、抗原生動物的化合物、抗真菌的化合物和驅蟲劑。可以用于治療或預防傳染病的其它治療用藥程式包括如上所述的免疫治療劑、多核苷酸、抗體、細胞因子和激素。
人和非-人脊椎動物的傳染性病毒包括逆轉錄病毒、RNA病毒和DNA病毒。已經在人類中發現的病毒的實例包括但不限于反錄病毒科(Retroviridae)(例如人免疫缺陷病毒、例如HIV-1(也稱作HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其它分離物，例如HIV-LP；小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如脊髓灰質炎病毒、甲型肝炎病毒；腸道病毒、人柯薩奇病毒、鼻病毒、艾可病毒)；嵌杯狀病毒科(Calciviridae)(例如能造成胃腸炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如馬腦炎病毒、風疹病毒)；黃病毒科(Flaviridae)(例如登革病毒、腦炎病毒、黃熱病毒)；冠狀病毒科(Coronaviridae)(例如冠狀病毒)；彈狀病毒科(Rhabdoviridae)(例如水泡性口炎病毒、狂犬病病毒)；纖狀病毒科(Filoviridae)(例如歐鮑拉病毒)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)(例如副流感病毒、腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒)；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如流感病毒)；布尼亞病毒科(Bungaviridae)(例如漢坦病毒、bunga virus、白蛉病毒和內羅病毒)；砂粒病毒科(Arena viridae)(出血熱病毒)；呼腸病毒科(Reoviridae)(例如呼腸弧病毒、環狀病毒和輪狀病毒)；雙RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝DNA病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒)；細小病毒科(Parvovirida)(細小病毒)；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳頭瘤病毒、多瘤病毒)；腺病毒科(Adenoviridae)(大多數腺病毒)；皰疹病毒科(Herpesviridae)(單純皰疹病毒(HSV)1和2，水痘帶狀皰疹病毒、巨細胞病毒(CMV)，皰疹病毒；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒、痘苗病毒、痘病毒)；和虹彩病毒科(Irodoviridae)(例如非洲豬瘟病毒)；和未分類的病毒(例如海綿狀腦病的病原體，丁型肝炎因子(認為是乙肝病毒的缺陷型伴隨體)，非甲型肝炎和非乙型肝炎的因子(1類＝內部傳遞；2類＝腸胃外傳遞(即丙型肝炎)；諾沃克和相關病毒和星狀病毒)。
預期的逆轉錄病毒包括簡單的逆轉錄病毒和復合的逆轉錄病毒。簡單的逆轉錄病毒包括B-型逆轉錄病毒、C-型逆轉錄病毒和D-型逆轉錄病毒亞群。B-型逆轉錄病毒的實例是小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)。C-型逆轉錄病毒包括C-型A組(包括勞斯肉瘤病毒(RSV)，禽類白血病病毒(ALV)和禽類成髓細胞瘤病毒(AMV))和C-型B組(包括鼠白血病病毒(MLV)，貓白血病病毒(FeLV)，鼠肉瘤病毒(MSV)，長臂猿白血病病毒(GALV)，脾臟壞死病毒(SNV)，網狀內皮組織增殖病毒(RV)和猿猴肉瘤病毒(SSV))亞群。D-型逆轉錄病毒包括Mason-Pfizer猴病毒(MPMV)和猿猴逆轉錄病毒1型(SRV-1)。復合的逆轉錄病毒包括慢病毒、T-細胞白血病病毒和泡沫病毒亞群。慢病毒包括HIV-1，但是也包括HIV-2，SIV，綿羊髓鞘脫落病毒、貓免疫缺陷病毒(FIV)和馬傳染性貧血病毒(EIAV)。T-細胞白血病病毒包括HTLV-1，HTLV-II，猿猴T-細胞白血病病毒(STLV)和牛白血病病毒(BLV)。泡沫病毒包括人泡沫病毒(HFV)，猿猴泡沫病毒(SFV)和牛泡沫病毒(BFV)。
是脊椎動物抗原的RNA病毒的實例包括但不限于呼腸病毒科的成員，包括正呼腸病毒屬(Orthoreovirus)(哺乳動物和禽逆轉錄病毒的多種血清型)，環狀病毒屬(Orbivirus)(藍舌病病毒、Eugenangee病毒、Kemerovo病毒、非洲馬瘟病毒和科羅拉蜱傳熱病毒)，輪狀病毒屬(Rotavirus)(人輪狀病毒、內布拉斯加小牛腹瀉病毒(Nebraska calf diarrhea virus)、鼠輪狀病毒、猿猴輪狀病毒、牛或綿羊輪狀病毒、禽輪狀病毒)；小RNA病毒科，包括腸道病毒屬(Enterovirus)(脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒A和B，人類腸道致細胞病變的孤兒病毒、甲型肝炎病毒、猿猴腸道病毒、鼠腦脊髓炎(ME)病毒、Poliovirus muris，牛腸道病毒、豬腸道病毒、心病毒屬(Cardiovirus)(腦心肌炎病毒(EMC)，門戈病毒(Mengovirus))，鼻病毒屬(Rhinovirus)(包括至少113個亞型的人鼻病毒；其它鼻病毒)，Apthovirus屬(口蹄疫(FMDV)；嵌杯狀病毒科，包括豬水皰疹病毒、圣米格爾海獅病毒、貓小RNA病毒和諾沃克病毒；披膜病毒科，包括α病毒屬(Alphavirus)(東部馬腦炎病毒、塞姆利基森林病毒、新培斯病毒、基孔貢亞病毒、奧尼永尼永病毒、羅斯河病毒(Ross rivervirus)、委內瑞拉馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒)，黃病毒屬(Flavirus)(蚊傳播的黃熱病毒、登革病毒、日本腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、墨累山谷腦炎病毒、西尼羅病毒、昆津病毒(Kunjin virus)、中歐蜱傳播的病毒、遠東蜱傳播的病毒、賈薩努爾森林病毒、跳躍病病毒(Louping III virus)、玻瓦散病毒、鄂木斯克出血熱病毒)，風疹病毒屬(風疹病毒)，瘟病毒屬(Pestivirus)(粘膜病病毒、豬瘟病毒、邊界病病毒)；布尼病毒科，包括布尼病毒屬(Bunyavirus)(布尼亞病毒和相關病毒、加州腦炎組病毒)，白蛉病毒屬(Phlebovirus)(白蛉熱西西里病毒(Sandfly fever Sicilian virus)、雷付脫谷熱病毒)，內羅病毒屬(Nairovirus)(克里米亞-剛果出血熱病毒、內羅皮綿羊病病毒)和烏庫病毒屬(Uukuvirus)(吳孔尼米蜱傳病毒和有關病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒屬(Influenza virus)(A型流感病毒，許多人亞型)；豬流感病毒和禽和馬流感病毒；B型流感(許多人亞型)和C型流感(可能的獨立的屬)；副粘病毒科，包括副粘病毒屬(Paramyxovirus)(副流感病毒1型，仙臺病毒、致血細胞吸附病毒、副流感病毒2至5型，新城疫病毒、腮腺炎病毒)，麻疹病毒屬(Morbillivirus)(麻疹病毒、亞急性硬化性全腦炎病毒(subacutesclerosing panencephalitis virus)、犬瘟病毒、牛瘟病毒)，肺病毒屬(Pneumovirus)(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；森林病毒、新培斯病毒、基孔貢亞病毒、奧尼永尼永病毒、羅斯河病毒、委內瑞拉馬腦炎病毒、西部馬腦炎病毒)，黃病毒屬(蚊傳播的黃熱病毒、登革病毒、日本腦炎病毒、圣路易腦炎病毒、墨累山谷腦炎病毒、西尼羅病毒、昆津病毒、中歐蜱傳播的病毒、遠東蜱傳播的病毒、賈薩努爾森林病毒、跳躍病病毒、玻瓦散病毒、鄂木斯克出血熱病毒)，風疹病毒屬(風疹病毒)，瘟病毒屬(粘膜病病毒、豬瘟病毒、邊界病病毒)；布尼病毒科，包括布尼病毒屬(布尼亞病毒和相關病毒、加州腦炎組病毒)，白蛉病毒屬(白蛉熱西西里病毒、雷付脫谷熱病毒)，內羅病毒屬(克里米亞-剛果出血熱病毒、內羅皮綿羊病病毒)和烏庫病毒屬(吳孔尼米蜱傳病毒和有關病毒)；正粘病毒科，包括流感病毒屬(A型流感病毒，許多人亞型)；豬流感病毒和禽和馬流感病毒；B型流感(許多人亞型)和C型流感(可能的獨立的屬)；副粘病毒科，包括副粘病毒屬(副流感病毒1型，仙臺病毒、致血細胞吸附病毒、副流感病毒2至5型，新城疫病毒、腮腺炎病毒)，麻疹病毒屬(麻疹病毒、亞急性硬化性全腦炎病毒、犬瘟病毒、牛瘟病毒)，肺病毒屬(呼吸道合胞病毒(RSV)，牛呼吸道合胞病毒和小鼠肺炎病毒)；彈狀病毒科，包括水泡病毒屬(Vesiculovirus)(VSV)，ChanBipura病毒、Flanders-Hart公園病毒)，狂犬病病毒屬(Lyssavirus)(狂犬病病毒)，魚彈狀病毒，和兩種可能的彈狀病毒(馬堡病毒和歐鮑拉病毒)；沙粒病毒科，包括淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒(LCM)，塔卡里伯病毒群(Tacaribe virus complex)和拉薩病毒；冠狀病毒科，包括傳染性支氣管炎病毒(IBV)，小鼠肝炎病毒，人腸冠狀病毒和貓傳染性腹膜炎(貓冠狀病毒)。
是脊椎動物的抗原的DNA病毒的實例包括但不限于痘病毒科，包括正痘病毒屬(Orthopoxvirus)(大天花、類天花、猴痘痘苗，牛痘，水牛痘，兔痘，脫腳病)，野兔痘病毒屬(Leporipoxvirus)(粘液瘤，纖維瘤)，禽痘病毒屬(Avipoxvirus)(禽痘，其它的禽痘病毒)，山羊痘病毒屬(Capripoxvirus)(綿羊痘，山羊痘)，豬痘病毒屬(Suipoxvirus)(豬痘)，副痘病毒屬(Parapoxvirus)(觸染性膿皰性皮炎病毒、假牛痘，牛丘疹性口炎病毒)；虹彩病毒科(非洲豬瘟病毒、蛙病毒2和3型，魚淋巴囊腫病病毒)；皰疹病毒科，包括α-皰疹病毒(單純皰疹1和2型，水痘帶狀皰疹，馬流產病毒、馬皰疹病毒2和3型，假狂犬病病毒、傳染性牛角膜結膜炎病毒、傳染性牛鼻氣管炎病毒、貓鼻氣管炎病毒、傳染性喉氣管炎病毒)，β-皰疹病毒(人巨細胞病毒和豬、猴和嚙齒類的巨細胞病毒)；γ-皰疹病毒(EB病毒(EBV)，馬立克氏病病毒、松鼠猴皰疹，蛛猴皰疹病毒，sylvilagus皰疹病毒，豚鼠皰疹病毒、Lucke腫瘤病毒)；腺病毒科，包括哺乳動物腺病毒屬(Mastadenovirus)(人亞群A，B，C，D，E和未分組的；猿猴腺病毒(至少23個血清型)，犬傳染性肝炎和牛、豬、綿羊、蛙和許多其它物種的腺病毒、禽腺病毒屬(Aviadenovirus)(禽腺病毒)；和不可培養的腺病毒；乳多空病毒科，包括乳頭瘤病毒屬(Papillomavirus)(人乳頭瘤病毒、牛乳頭瘤病毒、兔乳頭瘤病毒，和各種其它物種的致病性乳頭瘤病毒)，多瘤病毒屬(Polyomavirus)(多瘤病毒、猿空泡因子(SV-40)，兔空泡因子(RKV)，K病毒、BK病毒、JC病毒，和其它靈長類多瘤病毒，例如嗜淋巴性乳頭瘤病毒)；細小病毒科，包括腺伴隨病毒屬(Adeno-associated virus)、細小病毒屬(Parvovirus))(貓泛白細胞減少癥病毒、牛細小病毒、犬細小病毒、水貂阿留申病病毒，等)。最后，DNA病毒可以包括未歸入上述科的病毒，例如Kuru病和Creutzfeldt-Jacob病病毒和慢性傳染性神經病因子。
可以與本發明的復合物組合使用的抗病毒化合物的許多實例是本領域已知的，并且包括但不限于利福平，核苷逆轉錄酶抑制劑(例如，AZT，ddI，ddC，3TC，d4T)，非-核苷逆轉錄酶抑制劑(例如，依非韋倫，奈韋拉平)，蛋白酶抑制劑(例如，aprenavir，吲哚那韋，利托那韋和沙喹那韋)，碘苷，西多福韋，無環鳥苷，丙氧鳥苷，扎那米韋，金剛烷胺和帕利珠單抗(Palivizumab)。抗病毒劑的其它實例包括但不限于乙酰嗎喃；無環鳥苷；無環鳥苷鈉；阿德福韋；阿洛夫定(Alovudine)；阿韋舒托(Alvircept Sudotox)；鹽酸金剛烷胺；珠囊殼素；阿立酮(Arildone)；甲磺酸阿的維定；阿夫立定；西多福韋；西潘茶堿(Cipamfylline)；鹽酸阿糖胞苷；甲磺酸地拉韋定；地昔洛韋；地達諾新；二噁沙利；依度尿苷；氨韋拉登；韋羅肟；泛昔洛韋；鹽酸抑感靈；非西他濱；非阿尿苷；膦利酯；膦甲酸鈉；膦乙酸鈉；丙氧鳥苷；丙氧鳥苷鈉；碘苷；凱托沙；拉米夫定；洛布卡韋；鹽酸甲氧苯異喹；甲吲噻腙；奈韋拉平；噴昔洛維；吡羅達韋(Pirodavir)；三氮唑核苷；鹽酸金剛乙胺；甲磺酸沙喹那韋；鹽酸索金剛胺；索利夫定；匐枝青霉素；司他夫定；鹽酸泰洛倫；三氟尿苷；鹽酸伐昔洛韋；阿糖腺苷；磷酸阿糖腺苷；阿糖腺苷磷酸鈉；韋羅肟；扎西胞苷；齊多夫定；凈韋肟(Zinviroxime)。
本發明的方法可以治療或預防的細菌感染或疾病是由以下細菌造成的，包括但不限于在其生活周期中具有胞內階段的細菌，例如分枝桿菌(例如，結核分枝桿菌(Mycobacteria tuberculosis)，牛分枝桿菌(M.bovis)，鳥分枝桿菌(M.avium)，麻風分枝桿菌(M.leprae)或非洲分枝桿菌(M.africanum))、立克次氏體、支原體、衣原體和軍團菌。預期的細菌感染的其它實例包括但不限于革蘭氏陽性桿菌(例如，李斯忒氏菌屬(Listeria)，芽孢桿菌屬(Bacillus)例如炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis)，丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)物種)，革蘭氏陰性桿菌(例如，巴爾通氏體屬(Bartonella)，布魯氏菌屬(Brucella)，彎曲桿菌屬(Campylobacter)，腸桿菌屬(Enterobacter)，埃希氏菌屬(Eschericha)，弗朗西絲氏菌屬(Francisella)，嗜血菌屬(Hemophillus)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，摩根氏菌屬(Morganella)，變形菌屬(Proteus)，普羅威登斯菌屬(Providencia)，假單胞菌屬(Pseudomonas)，沙門氏菌屬(Salmonella)，沙雷氏菌屬(Serratia))，志賀氏菌屬(Shigella)，弧菌屬(Vibrio)和耶爾森氏菌屬(Yersinia)物種)，螺旋體細菌(例如，疏螺旋體屬(Borrelia)物種，包括會造成Lyme病的布氏疏螺旋體(Borrelia burgdorferi))，厭氧細菌(例如，放線菌屬(Actinomyces)和梭菌屬(Clostridium)物種)，革蘭氏陽性的和陰性的球菌，腸球菌屬(Enterococcus)物種，鏈球菌屬(Streptococcus)物種，肺炎球菌屬(Pneumococcus)物種，葡萄球菌屬(Staphylococcus)物種，奈瑟氏球菌屬(Neisseria)物種造成的感染。傳染性細菌的具體實例包括但不限于幽門螺桿菌(Helicobacter pyloris)，布氏疏螺旋體，侵肺軍團菌(Legionella pneumophilia)，結核分枝桿菌，鳥分枝桿菌，胞內分枝桿菌(M.intracellulare)，堪薩斯分枝桿菌(M.kansaii)，戈登分枝桿菌(M.gordonae)，金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，單核細胞增生李斯忒氏菌(Listeriamonocytogenes)，釀膿鏈球菌(Streptococcus pyogene)(A組鏈球菌)，無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)(B組鏈球菌)，綠色鏈球菌(Streptococcus viridans)，糞鏈球菌(Streptococcus faecalis)，牛鏈球菌(Streptococcus bovis)，肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)，流感嗜血菌(Haemophilus infiuenzae)，Bacillusantracis，corynebacterium Biphtheriae，豬紅斑丹毒絲菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，產氣莢膜梭菌(Clostridiumperfringers)，破傷風梭菌(Clostridium tetani)，產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，多殺巴斯德氏菌(Pasturella multocida)，具核梭桿菌(Fusobacterium nucleatum)，念珠狀鏈桿菌(Streptobacillusmoniliformis)，徹白密螺旋體(Treponema pallidium)，極細密螺旋體(Treponema pertenue)，鉤端螺旋體屬(Leptospira)，立克次氏體屬(Rickettsia)和衣氏放線菌(Actinomyces israelli)。
可以與本發明的復合物組合使用的抗菌劑或抗生素包括但不限于氨基糖苷抗生素類(例如，安普霉素，阿貝卡星，默諾霉素，丁胺菌素，地貝卡星，新霉素，十一烯酸新霉素，奈替米星，巴龍霉素，核糖霉素，西索米星和大觀霉素)，酰胺醇(amphenicol)抗生素類(例如，疊氮氯霉素，氯霉素，氟砜尼可(florfenicol)和甲砜霉素)，安沙霉素抗生素類(例如，利福米特和利福平)，碳頭孢烯類(carbacephems)(例如，氯拉卡比)，碳青霉烯類(例如，比阿培南和亞胺培南)，頭孢菌素類(例如，頭孢克洛，頭孢羥氨芐，頭孢孟多，頭孢曲秦，頭孢吡酮，頭孢唑蘭(cefozopran)，頭孢咪唑，頭孢匹胺和頭孢匹羅)，頭霉素類(例如，頭孢拉宗，頭孢美唑和頭孢米諾)，單菌霉素類(例如，氨曲南，卡蘆莫南和泰格莫南)，氧頭孢烯類(oxacephems)(例如，氟氧頭孢和拉氧頭孢)，青霉素類(例如，美西林，匹美西林，阿莫西林，巴氨西林，芐青霉酸，芐青霉素鈉，依匹西林，芬貝西林，氟氯青霉素，醋甲西林，噴沙西林，苯明青霉素O(penicillin o-benethamine)，青霉素O，青霉素V，芐星青霉素V，海巴明青霉素V，青哌四環素，和phencihicillin potassium)，林可胺類(lincosamides)(例如，克林霉素，和林可霉素)，大環內酯類(例如，阿奇霉素，卡波霉素，克拉霉素，地紅霉素，紅霉素和紅霉素阿西曲酯)，安福霉素，桿菌肽，卷曲霉素，多粘菌素E，持久殺霉素，恩威霉素，四環素類(例如，阿匹四環素，金霉素，氯莫環素和地美環素)，2，4-二氨基嘧啶(例如，溴莫普林)，硝基呋喃類(例如，呋喃它酮和氯化呋噻咪唑)，喹諾酮類和其類似物(例如，西諾沙星，環丙沙星，克林沙星，氟甲喹和grepagloxacin)，磺胺類(例如，乙酰基磺胺甲氧吡嗪，芐磺胺，苯丙磺胺二磺酸鈉，酞磺醋胺，偶氮磺胺和磺胺西汀)，砜類(例如，百里砜，葡萄糖氨苯砜鈉和苯丙砜)，環絲氨酸，莫匹羅星和抗結核菌素。
抗菌劑的其它實例包括但不限于醋氨苯砜；磺胺苯砜鈉；Alamecin；己聯雙辛胍；美西林；匹美西林；阿米環素；氨氟沙星；甲磺酸氨氟沙星；阿米卡星；硫酸阿米卡星；對氨水楊酸；對氨基水楊酸鈉；阿莫西林；安福霉素；氨芐青霉素；氨芐青霉素鈉；阿帕西林鈉；安普霉素；門冬托星(Aspartocin)；硫酸阿司米星；卑霉素；阿佛帕星；阿奇霉素；阿洛西林；阿洛西林鈉；鹽酸巴氨西林；桿菌肽；桿菌肽亞甲基雙水楊酸酯；桿菌肽鋅；默諾霉素；苯酰胺水楊酸鈣；紅霉素B；硫酸倍他霉素；比阿培南；皮尼拉霉素；鹽酸苯柳胺酯；Bispyrithione Magsulfex；氨羥丁卡鈉霉素；硫酸丁胺菌素；硫酸卷曲霉素；卡巴多司；羧芐基青霉素雙鈉鹽；茚滿酯羧芐青霉素鈉；羧芐苯青霉素鈉；羧芐青霉素鉀；卡蘆莫南鈉；頭孢克洛；頭孢羥氨芐；頭孢孟多；頭孢孟多酯鈉；頭孢孟多鈉；頭孢哌羅；頭孢曲秦；頭孢氟唑鈉；頭孢唑啉；頭孢唑啉鈉；頭孢拉宗；頭孢地尼；頭孢吡肟；鹽酸頭孢吡肟；頭孢替考；頭孢克肟；鹽酸頭孢甲肟；頭孢美唑；頭孢美唑鈉；頭孢尼西單鈉；頭孢尼西鈉；頭孢哌酮鈉；頭孢雷特；頭孢氨噻肟鈉；頭孢替坦；頭孢替坦二鈉；鹽酸頭孢替安；頭孢西丁；頭孢西丁鈉；頭孢咪唑；頭孢咪唑鈉；頭孢匹胺；頭孢匹胺鈉；硫酸頭孢匹羅；頭孢泊肟酯；頭孢丙烯；頭孢沙定；頭孢磺啶鈉；頭孢他啶；頭孢布坦；頭孢唑肟鈉；頭孢曲松鈉；頭孢氨呋肟；頭孢呋辛酯；頭孢呋辛Pivoxetil；頭孢呋辛鈉；頭孢乙氰鈉；頭孢氨芐；鹽酸頭孢氨芐；頭孢格來星；頭孢噻啶；頭孢噻吩鈉；頭孢吡硫鈉；環己烯胺頭孢菌素；鹽酸四環林；乙酰氯霉素；氯霉素；棕櫚酸氯霉素；泛酸氯霉素復合物；琥珀酸鈉氯霉素；氯己定Phosphanilate；氯二甲酚；金霉素硫酸氫鹽；鹽酸金霉素；西諾沙星；環丙沙星；鹽酸環丙沙星；西羅里霉素；克拉霉素；鹽酸克林沙星；克林霉素；鹽酸克林霉素；鹽酸氯林可霉素棕櫚酸酯；磷酸克林霉素；氯法齊明；芐星鄰氯青霉素；氯唑西林鈉；氯羥喹；多粘菌素E甲磺酸鈉；硫酸多粘菌素E；庫馬霉素；庫馬霉素鈉；氨環己青霉素；環絲氨酸；達福普汀；氨苯砜；達帕托霉素；地美環素；鹽酸地美環素；去甲環素；地奴真菌素；雙氨藜蘆啶；雙氯西林；雙氯西林鈉；硫酸雙氫鏈霉素；Bipyrithione；地紅霉素；多西環素；多西環素鈣；多西環素Fosfatex；鹽酸多西環素；氧呋喹酸鈉；依諾沙星；依匹西林；鹽酸差向四環素；紅霉素；紅霉素阿西曲酯；依托紅霉素；琥乙紅霉素；葡庚糖酸紅霉素；乳糖酸紅霉素；紅霉素丙酸酯；紅霉素硬脂酸酯；鹽酸乙胺丁醇；乙硫異煙胺；氟羅沙星；氟氯青霉素；氟氘丙氨酸；氟甲喹；磷霉素；磷霉素氨基丁三醇；呋莫克西林；氯化呋噻咪唑；酒石酸呋噻咪唑；夫西地酸鈉；夫西地酸；硫酸慶大霉素；格洛莫南(gloximonam)；短桿菌肽；鹵普羅近；海他西林；海他西林鉀；海克西定；依巴氟沙星；亞胺培南；異康唑；異帕米星；異煙肼；交沙霉素；卡那霉素硫酸鹽；吉他霉素；左旋呋喃它酮；苯氧丙基青霉素鉀；來西索霉素；林可霉素；鹽酸林可霉素；洛美沙星；鹽酸洛美沙星；甲磺酸洛美沙星；氯拉卡比；磺胺米隆；甲基氯環素；磺基水楊酸甲基氯環素；巨霉素磷酸鉀；美喹多司；美羅培南；美他環素；鹽酸美他環素；烏洛托品；馬尿酸烏洛托品；孟德立酸烏洛托品；甲氧苯青霉素鈉；美替普林；鹽酸甲硝唑；磷酸甲硝唑；美洛西林；美洛西林鈉；米諾環素；鹽酸米諾環素；鹽酸米林可霉素；莫能星；莫能星鈉；萘夫西林鈉；萘啶酸鈉；萘啶酸；那他霉素；妥布霉素；棕櫚酸新霉素；硫酸新霉素；十一烯酸新霉素；硫酸奈替米星；中性霉素；硝呋拉定；硝呋氨氧腙；硝呋拉太；硝呋氮酮；硝呋羥乙咪酮；硝呋甲咪酮；硝呋吡醇；硝呋喹胺醇；硝呋噻唑；硝基四環素；呋喃妥因；硝米特；諾氟沙星；新生霉素鈉；氧氟沙星；奧美普林；苯唑西林鈉；肟莫南(oximonam)；肟莫南鈉；奧索利酸；土霉素；土霉素鈣；鹽酸土霉素；泡迪霉素；對氯酚；帕羅霉素；培氟沙星；甲磺酸培氟沙星；醋甲西林；芐星青霉素G；青霉素G鉀；普魯卡因青霉素G；青霉素G鈉；青霉素V；芐星青霉素V；海巴明青霉素V；青霉素V鉀；戊胺唑酮鈉；苯基氨基水楊酸鹽；哌拉西林鈉；吡芐西林鈉；磺苯吡酮青霉素鈉；鹽酸皮里霉素；鹽酸匹氨青霉素；雙羥萘酸匹氨青霉素；丙苯酸匹氨青霉素；硫酸多粘菌素B；泊非羅霉素；普匹卡星(propikacin)；吡嗪酰胺；吡硫鋅；醋酸喹地卡明；奎奴普丁；消旋甲砜霉素；雷冒拉寧；雷尼霉素；雷洛霉素；瑞波羅霉素；利福布丁；利福美坦(rifametane)；利福克昔(rifamexil)；利福米特；利福平；利福噴丁；利福昔明；氫吡四環素；硝酸氫吡四環素；薔薇霉素；丁酸薔薇霉素；丙酸薔薇霉素；薔薇霉素磷酸鈉；硬脂酸薔薇霉素；羅索沙星；羅沙胂；羅紅霉素；去甲去氧四環素；山費培南(sanfetrinem)鈉；酚醚青霉素；沙匹西林；Scopafingin；西索米星；硫酸西索米星；司帕沙星；鹽酸大觀霉素；螺旋霉素；鹽酸司他霉素；斯堡霉素；硫酸鏈霉素；鏈霉素異煙肼；磺胺苯；磺胺苯酰；磺胺醋酰；磺胺醋酰鈉；磺胺西汀；磺胺噠嗪；磺胺噠嗪鈉；磺胺多辛；磺胺林；磺胺甲基嘧啶；磺胺對甲氧嘧啶；磺胺二甲嘧啶；磺胺甲二唑；磺胺甲噁唑；磺胺間甲氧嘧啶；磺胺二甲噁唑；對氨基苯磺酸鋅；磺胺硝苯；柳氮磺吡啶；磺胺異噻唑；磺胺噻唑；磺胺吡唑；磺胺異噁唑；磺胺乙酰異噁唑；磺胺異噁唑二醇胺；磺粘霉素；硫培南(sulopenem)；舒他西林；森西林鈉；氨芐青霉素酞酯鹽酸鹽；替考拉寧；鹽酸替馬氟沙星；替莫西林；四環素；鹽酸四環素；四環素磷酸復鹽；四氧普林；甲砜霉素；Thiphencillin鉀；羧噻吩青霉素甲苯酯鈉；替卡西林二鈉；替卡西林單鈉；替克拉酮；氯化喬多；妥布霉素；硫酸妥布霉素；托氟沙星；甲氧芐啶；硫酸甲氧芐啶；三磺嘧啶；醋竹桃霉素；硫酸托哌霉素；短桿菌素；萬古霉素；鹽酸萬古霉素；維吉霉素；佐爾博霉素。
本發明的方法可以治療或預防的真菌病包括但不限于曲霉病，隱球菌病(crytococcosis)，孢子絲菌病，球孢子菌病，副球孢子菌病，組織胞漿菌病，芽生菌病，接合菌病和念珠菌病。
可以與本發明的復合物組合使用的抗真菌化合物包括但不限于多烯類(例如，兩性霉素b，克念菌素，美帕曲星，那他霉素和制霉菌素)，烯丙胺(例如，布替萘芬和萘替芬)，咪唑(例如，聯苯芐唑，布康唑，氯登妥因，氟曲馬唑，異康唑，酮康唑和蘭諾康唑)，硫代氨基甲酸酯(例如，托西拉酯，托林達酯和托萘酯)，三唑(例如，氟康唑，伊曲康唑，沙泊那唑和特康唑)，溴柳氯苯胺，丁氯柳胺，丙酸鈣，氯苯甘醚，環己吡酮乙醇胺，重氮絲氨酸，灰黃霉素，寡霉素，十一烯酸新霉素，吡咯尼林，西卡寧，殺結核菌素和綠膠霉素。抗真菌化合物的其它實例包括但不限于吖啶瑣辛(Aerisorcin)；安布替星；兩性霉素B；阿查那唑；重氮絲氨酸；巴西芬凈(Basifungin)；聯苯芐唑；鹽酸苯柳胺酯；Bispyrithione Magsulfex；硝酸布康唑；十一烯酸鈣；克念菌素；卡寶品紅；氯登妥因；環己吡酮乙醇胺；環吡酮胺；西洛芬凈(Cilofungin)；順科拉唑；克霉唑(Clotrimazole)；銅邁克星；地奴真菌素；Bipyrithione；杜康唑；益康唑；硝酸益康唑；恩康唑；硝酸萘唑酸酯；硝酸芬康唑；菲律平；氟康唑；氟胞嘧啶；真菌霉素；灰黃霉素；哈霉素；異康唑；伊曲康唑；卡內霉素；酮康唑；洛蒙霉素；利地霉素；美帕曲星；咪康唑；硝酸咪康唑；莫能星；莫能星鈉；鹽酸萘替芬；十一烯酸新霉素；硝呋拉太；硝呋美隆；硝拉明；制霉菌素；辛酸；硝酸奧可拉唑；硝酸奧昔康唑；鹽酸澳克付精；鹽酸帕康唑；擬念珠菌素；碘化鉀；丙氯醇；吡硫鋅；吡咯尼林；蘆他霉素；血根氯銨(Sanguinarium Chloride)；沙泊那唑；吸水真菌素；二硫化硒；西奈芬近；硝酸硫康唑；特比萘芬；特康唑；雙硫胺甲酰；替克拉酮；噻康唑；托西拉酯；托林達酯；托萘酯；三醋酸甘油酯；Triafuigin；十一烯酸；Viridoflilvin；十一烯酸鋅和鹽酸澤羅拉唑。
本發明的方法可以治療或預防的寄生物病包括但不限于阿米巴病，瘧疾，利什曼病，球蟲，賈第蟲病，隱孢子蟲病，弓形體病和錐蟲病。還包括各種蠕蟲的感染，例如但不限于蛔蟲病，鉤蟲病，鞭蟲病，類圓線蟲病，弓蛔蟲病，旋毛蟲病，盤尾絲蟲病，絲蟲病和惡絲蟲病。還包括各種吸蟲的感染，例如但不限于血吸蟲病，肺吸蟲病和支睪吸蟲病。根據它們是胞內的還是胞外的，可以對能造成這些病的寄生物進行分類。如本文所使用的，“胞內寄生物”是指其整個生活周期都是胞內的寄生物。人胞內寄生物的實例包括利什曼原蟲屬物種、瘧原蟲屬(Plasmodium)物種、克魯氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、岡氏弓形蟲(Toxoplasma gondii)、巴貝西蟲屬(Babesia)物種和旋毛線蟲(Trichinella spiralis)。如本文所使用的，“胞外寄生物”是指其整個生活周期都是胞外的寄生物。能感染人類的胞外寄生物包括痢疾內變形蟲(Entamoeba histolytica)，表吮賈第蟲(Giardia lamblia)，比氏腸胞蟲(Enterocytozoon bieneusi)，納氏蟲屬(Naegleria)和棘變形蟲屬(Acanthamoeba)以及大多數蠕蟲。另一類寄生物定義為主要是胞外的，但是在它們的生活周期的關鍵階段是專性胞內存在的。這樣的寄生物在本文中稱作“專性胞內寄生物”。這些寄生物可能在它們生命的大部分或僅僅在它們生命的小部分中存在于胞外環境，但是它們在它們的生活周期中都具有至少一個專性胞內階段。該后一類寄生物包括羅得西亞錐蟲(Trypanosoma rhodesiense)和岡比亞錐蟲(Trypanosoma gambiense)，等孢球蟲屬(Isospora)物種，隱孢子蟲屬(Cryptosporidium)物種，艾美球蟲屬(Eimeria)物種，新孢子蟲屬(Neospora)物種，肉孢子蟲屬(Sarcocystis)物種和血吸蟲屬(Schistosoma)物種。
可以與本發明的復合物組合使用治療寄生物病的抗原生動物的化合物的許多實例是本領域已知的，包括但不限于奎寧，氯喹，甲氟喹，氯胍，乙胺嘧啶，班硝唑，糠酸二氯尼特，替硝唑，兩性霉素，葡酸銻鈉，曲莫沙唑和依西酸噴他脒。可以與本發明的復合物組合使用治療寄生物病的抗寄生物藥是本領域已知的，包括但不限于甲苯咪唑，左旋咪唑，氯硝柳胺，吡喹酮，丙硫咪唑，伊維菌素，枸櫞酸乙胺嗪和噻苯達唑。抗寄生物化合物的其它實例包括但不限于醋氨苯砜；鹽酸阿莫地喹；胺喹甲酯；阿替夫林(Arteflene)；氯喹；鹽酸氯喹；磷酸氯喹；雙羥萘酸環氯胍；磷酸恩哌羅林(Enpiroline Phosphate)；鹽酸鹵泛群；硫酸羥氯喹；鹽酸甲氟喹；環己辛萘酮；鹽酸米林可霉素；磷酸伯氨喹；乙胺嘧啶；硫酸奎寧和替布喹(Tebuquine)。
在較低優選的實施方案中，本發明的復合物可以與基于非-HSP和非-α2M的疫苗組合物組合使用。這樣的人用疫苗的實例記載在TheJordan Report 2000，Accelerated Development of Vaccines，NationalInstitute of Health，其在這里整體引作參考。許多用于治療非-人脊椎動物的疫苗記載在Bennett，K.Compendium of Veterinary Products，第3版.North American Compendiums，Inc.，1995，其在這里整體引作參考。
5.8.3 靶向其它疾病除了癌癥和傳染病以外，本發明的方法也可以治療或預防其它疾病，包括但不限于貧血、生長激素缺乏、酶缺乏病和免疫抑制狀況。
貧血可能由多種原因造成，例如，它可能由鐵缺乏、葉酸缺乏、慢性病(例如，慢性感染或炎癥、癌癥、肝病、慢性腎衰竭)、化療等造成。
生長激素由人的垂體前葉腺分泌。成年期的生長激素缺乏會造成輕微的至中度的肥胖、無力和降低的心輸出量。可以通過重組的DNA技術合成人生長激素。用人生長激素可以治療患有垂體功能減退和嚴重生長激素缺乏的患者。
有許多不同種類的酶缺乏病。非限制性實例是Debrancher酶缺乏(也稱作Cori氏病或Forbes氏病)、糖原貯積病(例如，糖原脫支酶缺乏)，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)缺乏、半乳糖神經酰胺酶缺乏(Krabbe病)等。
不受任何理論的限制，本發明的分子復合物或包含本發明的分子復合物的藥物組合物在治療或預防疾病例如貧血、生長激素缺乏和酶缺乏病方面的治療或預防作用的一種可能的解釋是，與未低聚化的糖蛋白相比，對這樣的疾病具有治療或預防作用的免疫學和/或生物學活性的糖蛋白的低聚可以提高糖蛋白的治療或預防作用。例如，低聚化的糖蛋白可以更容易地定位到所需的位點或所需的細胞類型，例如，通過使復合物中的凝集素結合到細胞表面糖蛋白受體上。因此，凝集素優選地在復合物中摩爾過量。或者，通過受體介導的事件或非-受體介導的事件，低聚化的糖蛋白可以被其靶細胞更容易地攝入。
可以根據本發明使用本領域已知的用于治療或預防疾病(例如但不限于貧血、激素缺乏或酶缺乏)的激素和酶。天然產生的糖蛋白的激素和酶(例如，紅細胞生成素)可以在有凝集素存在的情況下形成低聚物，并根據本發明使用。可以將非天然產生的糖蛋白的激素和酶工程改造成添加一種或多種碳水化合物基團，并根據本發明使用。在一個實施方案中，本發明提供了治療貧血的方法，包括給需要的受試者施用包含一種或多種分子復合物的組合物，其中每種復合物包含凝集素和紅細胞生成素(EPO)。優選地，受試者是人，且施用的EPO是人EPO。EPO是主要由腎小管周圍毛細血管內皮細胞生產的糖蛋白激素，并負責調節紅細胞的生產。在另一個實施方案中，本發明提供了治療酶缺乏病的方法，包括施用包含凝集素和葡糖腦苷脂酶的組合物。優選地，要治療的酶缺乏病是Gaucher病。
免疫抑制狀況可能由多種原因造成，包括但不限于癌癥(例如，胸腺瘤，何杰金病)，獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)，結節病和化療。可以根據本發明使用已知能刺激免疫系統的蛋白來治療或預防免疫抑制狀況。在一個實施方案中，本發明提供了治療或預防免疫抑制狀況的方法，包括給需要的受試者施用包含一種或多種分子復合物的組合物，其中每種復合物包含凝集素和粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)。在另一個實施方案中，本發明提供了治療或預防免疫抑制狀況的方法，包括給需要的受試者施用包含一種或多種分子復合物的組合物，其中每種復合物包含凝集素和粒細胞集落刺激因子(G-CSF)。
5.8.4 自體的實施方案HSP的特異性的免疫原性不是源自HSP本身，而是源自結合到它們上的抗原蛋白。在本發明的一個優選實施方案中，用作癌癥疫苗的本發明的組合物中的復合物是自體的復合物，由此避開了癌癥免疫療法的2個最難以處理的障礙。第一個是人癌癥(類似于實驗動物的癌癥)存在抗原性差異的可能性。為了避開該障礙，在本發明的一個優選實施方案中，將凝集素-HSP復合到抗原蛋白上，并用復合物治療蛋白所來源的相同受試者的癌癥。其次，癌癥免疫療法的大多數現有方案集中在確定癌細胞系的CTL-識別表位。該方法需要獲得細胞系和針對癌癥的CTL。這些試劑對于絕大多數人癌癥是不可得到的。在本發明的一個指向使用自體抗原蛋白的實施方案中，癌癥免疫療法不再依賴于獲得細胞系或CTL，也不需要定義癌細胞的抗原表位。這些優點使得結合到自體抗原蛋白上的凝集素-HSP的復合物成為有吸引力的癌癥免疫原。
在一些實施方案中，可以從來自與要施用復合物的受試者異源的受試者的相同類型癌癥的癌組織制備治療性或預防性的復合物中的抗原蛋白。
5.9.藥物制劑和施用方法可以將本發明分子復合物和藥物組合物以治療有效劑量施用給患者，以治療或改善疾病或紊亂(例如，癌癥、傳染病、貧血、免疫抑制狀況、酶缺乏或激素缺乏)。治療有效劑量是指足以改善這樣的紊亂的癥狀的復合物的量。當組合使用另一種治療用藥程式時，復合物的有效劑量可以是不同的。本領域已知治療用藥程式(例如化療劑、輻射治療和生物/免疫治療劑，例如細胞因子)的適當的和推薦的劑量、制劑和施用途徑(例如，如Physicians′Desk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)等文獻所述)，或者可以根據生產商的說明書或指導使用。
5.9.1 有效劑量通過細胞培養物或實驗動物中的標準藥物方法，可以確定本發明的分子復合物的毒性和治療功效，例如，為了確定LD50(對50％群體致死的劑量)和ED50(在50％群體中治療上有效的劑量)。毒性和治療作用之間的劑量比是治療指數，可以將其表達為比率LD50/ED50。優選能表現出較大治療指數的復合物。盡管可以使用會表現出毒副作用的復合物，但應當小心地設計將這樣的復合物靶向到效應組織位點處的遞送系統，以使對未感染的細胞的潛在損害最小化，并由此減少副作用。
在一個實施方案中，可以在制定人用劑量范圍時使用從細胞培養測定和動物實驗得到的數據。復合物的劑量優選地在包含ED50且具有較低或沒有毒性的循環濃度范圍內。依賴于采用的劑型和使用的施用途徑，可以在該范圍內改變劑量。對于在本發明的方法中使用的任何復合物，可以初步從細胞培養測定估計治療有效劑量。可以在動物模型中確定劑量，以達到包含在細胞培養物中確定的IC50(即達到半數最大抑制癥狀的實驗化合物的濃度)的循環血漿濃度范圍。可以使用這樣的信息來更精確地確定在人類中的有用劑量。可以測量血漿水平，例如，通過高效液相層析。
在另一個實施方案中，對于人患者，包含施用給受試者的凝集素和Hsp96-抗原分子復合物的本發明的分子復合物的量是在約1ng至約600μg的范圍內。優選的人劑量與在25g小鼠中使用的相同，即在約1-10ng、約20ng、約30ng、約40ng、約50ng、約70ng、約100ng、約200ng、約300ng、約400ng、約500ng、約600ng、約700ng、約800ng、約900ng、約1μg、約10μg，約25μg、約50μg、約100μg、約200μg、約300μg、約400μg、約500μg或約600μg的范圍內。包含與任何其它HSP復合物結合的凝集素的本發明的分子復合物在人患者中的劑量范圍為約5-5,000μg，優選的劑量為100μg。這些劑量優選皮內地、皮下地、肌內地、靜脈內地或腹膜內地施用。這些劑量可以一次或重復施用，例如每日一次、每隔一天一次、每周一次、每兩周一次或每月一次。優選地，每周施用一次復合物，持續約4-6周，優選地在每次施用時改變施用模式或位點。因而，通過實例且非限制性的方式，第一次注射可以在左臂皮下施用，第二次在右臂施用，第三次在左腹施用，第四次在右腹施用，第五次在左股施用，第六次在右股施用，等。在間隔一次或多次注射后，可以重復相同的位點。另外，可以進行分離注射(split injection)。因而，例如，可以將半劑施用在一個位點，另一半在同一天施用在另一個位點。或者，依次改變施用模式，例如，依次皮內地、肌內地、皮下地、靜脈內地或腹膜內地每周一次進行注射。優選地，每周一次的劑量持續施用4周。4-6周后，優選地以2周的間隔進行其它注射，持續1個或幾個月，或者直到用完復合物。依賴于患者的臨床發展和對免疫療法的反應性，可以修改后面的注射的速率。在一個優選的實例中，進行皮內施用，依次改變每次的施用位點。
因此，本發明提供了預防和治療受試者的癌癥或傳染病的方法，包括施用能刺激宿主個體的免疫活性和引起針對腫瘤前細胞和/或贅生性細胞或感染細胞的特異性免疫的組合物。
在一個具體的實施方案中，在聯合治療過程中，以次最優量施用本發明的分子復合物(例如，包含凝集素和HSP的分子復合物)，例如，當在沒有通過本領域已知的方法確定的治療用藥程式的情況下施用時，該量不會表現出可檢測到的治療益處。在這樣的方法中，給接受治療用藥程式的受試者施用這樣次最優量的本發明的分子復合物會總體上改善治療的有效性。在另一個具體的實施方案中，在聯合治療過程中，以次最優量施用不包含包含本發明的分子復合物的治療用藥程式。在這樣的方法中，給接受本發明的分子復合物的受試者施用這樣次優量的治療用藥程式會總體上改善治療的有效性。
在一個實施方案中，以不會導致腫瘤退化或癌癥緩解的量，或者以當在沒有另一種治療用藥程式的情況下施用所述的分子復合物時，癌細胞沒有顯著減少或已經增加的量，施用一種或多種本發明的分子復合物。在另一個實施方案中，給接受治療用藥程式的受試者施用次最優量的本發明的分子復合物，由此改善治療的總體有效性。這些用本發明的分子復合物治療的受試者是接受化療或放療的那些。通過適當的動物實驗，可以確定次最優量。通過動物實驗的外推法，可以確定在人類中的這樣的次最優量。
在一個實施方案中，一種或多種本發明的分子復合物包含與糖蛋白和抗原分子結合的凝集素，其中糖蛋白不是熱激蛋白。例如，本發明的分子復合物可以包含紅細胞生成素(EPO)。當將EPO用作單一藥物時，常用的起始劑量是25-30單位/kg注射物，每周2次或3次。(平均5000-6000單位/周)。有些患者可以每周一次或者甚至每兩周一次進行皮下注射。靜脈內的EPO需要至少每周2或3次。其它的劑量方案可以在Physician′s Desk References(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中找到。
在另一個實施方案中，本發明的分子復合物可以包含組織纖溶酶原激活物(tPA)，例如阿替普酶(Activase，Genentech)。阿替普酶是純化的527個氨基酸的糖蛋白。阿替普酶用于控制和治療急性心肌梗死(AMI)、急性缺血性發作和肺栓塞。靜脈內施用Activase。為了控制和治療AMI，有兩種劑量方案加速輸注和3-小時輸注。在加速輸注中，對于重量超過67kg的患者，施用100mg，其中靜脈內快速輸注15mg，隨后經30分鐘輸注50mg，然后經60分鐘輸注35mg。對于體重小于或等于67kg的患者，推薦劑量的施用方法是，靜脈內快速輸注15mg，隨后經30分鐘輸注0.75mg/kg且不超過50mg，然后經60分鐘輸注0.5mg/kg且不超過35mg。在3-小時輸注中，推薦劑量是100mg，其在第1小時施用60mg，經第2小時施用20mg，經第3小時施用20mg。在Physician′s Desk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中還可以發現阿替普酶在治療其它病時的劑量方案，其在這里引作參考。
在另一個實施方案中，本發明的分子復合物可以包含粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)，例如Leukine(Berlex)。可以使用Leukine，例如，在誘導化療后用于急性骨髓性白血病，在移植自體的外周血祖先細胞后用于動員，在自體骨髓移植后用于骨髓重建，在異源骨髓移植后用于骨髓重建，和用于骨髓移植失敗或移入延遲。對于不同病的劑量方案可以改變。在一個實例中，當在外周血祖細胞移植后使用Leukine時，推薦劑量是250mcg/m2/天，經24小時靜脈內(IV)施用，或每日一次皮下(SC)施用，其在祖先細胞融合后馬上開始，持續到達到連續3天的ANC＞1500細胞/mm3。在Physician′sDesk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中可以發現其它的劑量方案。
在另一個實施方案中，本發明的分子復合物可以包含粒細胞集落刺激因子(G-CSF)，例如Neupogen。可以使用Neupogen，例如，用于接受骨髓抑制化療的癌癥患者，用于接受誘導或強力化療的急性髓性白血病患者，用于接受骨髓移植的癌癥患者，用于經歷外周血祖先細胞收集和治療的患者，和用于嚴重慢性嗜中性白細胞減少癥的患者。劑量方案在不同的疾病中有所區別。在一個實例中，可以給接受骨髓移植的癌癥患者施用10mcg/kg/天，作為靜脈內輸注4或24小時，或作為連續的24-小時皮下輸注。在Physician′s Desk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中可以發現其它的方案。
在另一個實施方案中，本發明的分子復合物可以包含酶，例如葡糖腦苷脂酶(Genzyme的Cerezyme)，其用于酶缺乏病例如Gaucher病。Cerezyme是通過靜脈內輸注1-2小時來施用。劑量應當針對每位患者而異。初始劑量范圍為2.5U/kg體重、每周3次至60U/kg每2周一次。在Physician′s Desk Reference(第56版，2002，第57版，2003和第58版，2004)中可以發現其它的方案。
在各種實施方案中，與根據本發明的凝集素的低聚可以降低所述藥物的有效劑量，例如，降低1，5，10，20，50，100倍或更多。當藥物劑量不是按照重量單位給出時，根據生產商的說明書或本領域已知的任何方法，可以將其轉化成重量單位，然后可以相應地計算出分子復合物中對應的凝集素的量。
5.9.2 治療方案對于上述的用于治療或預防病(例如，癌癥、傳染病、貧血、免疫抑制狀況、酶缺乏或激素缺乏)的任意聯合療法，本發明的復合物可以在施用基于非-凝集素-糖蛋白的用藥程式之前、同時或之后施用。基于非-凝集素-糖蛋白的用藥程式可以是上述的用于治療或預防癌癥或傳染病的任何一種用藥程式(或對于治療或預防目標疾病所需的任意其它治療用藥程式)。
在一個實施方案中，本發明的復合物基本上與其它用藥程式同時施用給受試者。該方法前提是，2次施用是在彼此相距小于1分鐘至約5分鐘、約60分鐘、約2小時、約3小時、約4小時、約6小時、約8小時或最多12小時的時間段內進行的，例如在同一醫生巡視時。
在另一個實施方案中，本發明的復合物和用藥程式精確地同時施用。在另一個實施方案中，本發明的復合物和用藥程式依次在一定時間間隔內施用，使得本發明的復合物和用藥程式可以一起作用，以提供比單獨施用它們時更大的益處。在另一個實施方案中，本發明的復合物和用藥程式是在足夠接近的時間內施用的，以提供所需的治療性或預防性的結果。每一種可以同時或分開地以任何適當的形式和任何合適的途徑施用。在一個實施方案中，本發明的復合物和用藥程式是通過不同的施用途徑施用的。在一個替代實施方案中，每種通過相同的施用途徑施用。可以在相同或不同的位點施用本發明的復合物，例如臂和腿。當同時施用時，本發明的復合物和用藥程式可以是或不是混合地或通過相同的施用途徑在相同施用位點施用的。
在一個優選的實施方案中，根據5.9.1部分所述的方案施用本發明的復合物。在各種實施方案中，本發明的復合物和另一種用藥程式是在相隔小于1小時、在相隔約1小時、在相隔1小時至2小時、在相隔2小時至3小時、在相隔3小時至4小時、在相隔4小時至5小時、在相隔5小時至6小時、在相隔6小時至7小時、在相隔7小時至8小時、在相隔8小時至9小時、在相隔9小時至10小時、在相隔10小時至11小時、在相隔11小時至12小時、在相隔不超過24小時或不超過48小時時施用。在其它的實施方案中，本發明的復合物和另一種用藥程式是在相隔2至4天、在相隔4至6天、在相隔1周、在相隔1至2周、在相隔2至4周、在相隔1個月、在相隔1至2個月或2個或更多個月時施用。在優選的實施方案中，本發明的復合物和另一種用藥程式是在二者仍然是有活性的時間段內施用的。通過確定每種施用的組分的半衰期，本領域的技術人員能夠確定這樣的時間段。
在一個實施方案中，本發明的復合物和另一種用藥程式是在同一次患者巡視時施用。在一個具體的優選實施方案中，在施用另一種用藥程式之前施用本發明的復合物。在一個替代的具體實施方案中，在施用另一種用藥程式之后施用本發明的復合物。
在某些實施方案中，給受試者周期性地施用本發明的復合物和一種或多種其它用藥程式。周期性治療包括施用本發明的復合物一段時間，然后施用另一種用藥程式一段時間，并重復該順序施用。周期性治療可以減少發生對一種或多種療法的抗性，避免或減少一種療法的副作用，和/或改善治療的功效。在這樣的實施方案中，本發明預期交替施用本發明的復合物，隨后在4至6天后、優選2至4天后、更優選1至2天后施用另一種用藥程式，其中這樣的循環可以根據需要重復多次。在某些實施方案中，在小于3周、每2周一次、每10天一次或每周一次的周期內交替施用本發明的復合物和一種或多種其它用藥程式。在一個具體的實施方案中，在施用另一種用藥程式后的1小時至24小時的時間段內，給受試者施用本發明的復合物。如果使用了緩釋或連續釋放類型的用藥程式遞送系統，則該時間段可以再延長幾天或更久。
5.9.3 制劑和用途使用一種或多種生理上可接受的載體或賦形劑，可以以常規方式配制出用于根據本發明的用途的藥物組合物。
因此，可以配制出用于通過吸入或吹入(通過嘴或鼻子)、經口地、經口腔地、腸胃外地、皮內地、粘膜地、皮下地、靜脈內地、直腸地或經皮地施用的復合物和它們的生理上可接受的鹽和溶劑化物。
為了經口施用，藥物組合物可以采取下述形式，例如，片劑或膠囊，其通過常規方式與藥學上可接受的賦形劑例如粘合劑(例如，預凝膠化的玉米淀粉、聚乙烯吡咯烷酮或羥丙基甲基纖維素)；填充物(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如，硬脂酸鎂、滑石或硅石)；崩解劑(例如，馬鈴薯淀粉或羥基乙酸淀粉鈉)；或潤濕劑(例如，十二烷基硫酸鈉)一起制備。通過本領域熟知的方法，可以對片劑涂覆。經口施用的液體制劑可以采取下列形式，例如，溶液、糖漿或懸浮液，或者將它們制成可以在使用前與水或其它合適載體構建的干產品。這樣的液體制劑可以通過常規方式與藥學上可接受的添加劑例如懸浮劑(例如，山梨糖醇糖漿、纖維素衍生物或氫化的食用脂肪)；乳化劑(例如，卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如，杏仁油、油脂、乙醇或分級分離的植物油)；和防腐劑(例如，甲基或丙基對羥基苯甲酸鹽或山梨酸)一起制備。根據需要，制劑還可以含有緩沖鹽、調味劑、著色劑和增甜劑。
可以將經口施用的制劑合適地配制成能控釋活性復合物。
為了經口腔施用，組合物可以采用以常規方式配制的片劑或糖錠的形式。
為了吸入施用，以應用合適的推進劑(例如，二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其它合適的氣體)的壓縮包或霧化器呈遞的氣溶膠噴霧形式，方便地遞送用于本發明的用途的復合物。在壓縮的氣溶膠情形下，通過提供一個遞送計量的量的閥門，可以確定劑量單位。膠囊和藥筒(例如，用于吸入器或吹入器的明膠的)可以配制成含有復合物和合適的粉末基質(例如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
可以將復合物配制成腸胃外注射施用的形式，例如，單次快速靜脈注射或連續輸注。注射制劑可以制成添加有防腐劑的單位劑量形式，例如，在安瓿或多劑量容器中。組合物可以采用在油性或水性載體中的懸浮液、溶液或乳狀液的形式，且可以含有配制劑(formulatoryagent)，例如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑。或者，活性成分可以是用于在使用前與合適的載體(例如，無菌的無致熱原的水)配制的粉末形式。
還可以將復合物配制成直腸組合物例如栓劑或保留灌腸劑，例如，含有常規的栓劑基質，例如可可油或其它甘油酯。
除了前述的制劑外，還可以將復合物配制成貯存制劑(depotpreparation)。這樣的長效制劑可以通過植入(例如皮下地或肌內地)或通過肌內注射來施用。因而，例如，可以用合適的聚合的或疏水的材料(例如作為在可接受的油中的乳狀液)或離子交換樹脂配制復合物，或制成難溶的衍生物，例如難溶的鹽。
如果需要，可以將組合物置于包或分配裝置中，所述裝置可以含有一個或多個含有活性成分的單位劑量形式。該包可以例如包含金屬或塑料箔，例如泡形包裝(blister pack)。該包或分配裝置可以伴有施用說明書。
還包括佐劑與本發明的復合物的組合或混合使用。預期的佐劑包括但不限于無機鹽佐劑或無機鹽凝膠佐劑、顆粒佐劑、微粒佐劑、粘膜佐劑和免疫刺激性佐劑，例如在5.8部分所述的那些。佐劑可以作為與本發明的復合物的混合物施用給受試者，或與在5.9.2部分所述的復合物組合使用。
還預期腺苷二磷酸(ADP)與本發明的復合物(優選gp96復合物)的組合或混合使用。
5.9.4 試劑盒本發明還提供了用于實現本發明的治療方案的試劑盒。這樣的試劑盒包含裝在一個或多個容器中的治療或預防有效量的藥學上可接受形式的本發明的分子復合物。本發明的試劑盒的瓶中的分子復合物可以是藥學上可接受的溶液的形式，例如與無菌鹽水、葡萄糖溶液、或緩沖液或其它藥學上可接受的無菌流體組合。或者，可以凍干或干燥復合物；在該情況下，試劑盒還任選地包含裝在容器中的藥學上可接受的溶液(例如，鹽水、葡萄糖溶液等)、優選無菌的，以重配復合物，形成注射用的溶液。
在另一個實施方案中，本發明的試劑盒還包含用于注射復合物的針或注射器，優選包裝在無菌形式中，和/或包裝的酒精墊。任選地包括關于醫生或患者施用本發明的分子復合物的說明書。
在一些實施方案中，本發明提供了包含多個容器的試劑盒，每個容器包含藥物制劑或組合物，其含有足以實現一次治療性或預防性施用劑量的本發明的分子復合物。本發明還提供了包含一個裝有免疫學和/或生物學活性的糖蛋白或其復合物的容器和一個裝有凝集素的容器的試劑盒。任選地，試劑盒中可以包括關于根據本發明的方法配制低聚復合物的說明書。
在一個具體的實施方案中，試劑盒包含裝有純化的分子復合物的第一個容器和裝有不同治療用藥程式的第二個容器，當在施用第一個容器中的分子復合物之前、同時或之后施用時，所述治療用藥程式的量能有效地將總體治療有效性提高到超過單獨施用每種組分時的有效性，或者能有效地降低治療的副作用(例如，與單獨使用每種組分時觀察到的副作用相比)。在一個優選的具體實施方案中，本發明提供了一種試劑盒，其在第一個容器中裝有包含從哺乳動物癌組織得到的且在有ConA存在的情況下低聚化的大量非共價肽復合物的純化的本發明的分子復合物，在第二個容器中裝有包含純化的癌癥化療劑的組合物，且在第三個容器中裝有包含純化的細胞因子的組合物。
5.10.監控治療過程中的效果通過本領域的技術人員已知的任意方法，可以監控本發明的分子復合物的治療效果。例如，癥狀和/或實驗室結果的改善或惡化、成像技術或各種生化測定的變壞都可以用于監控治療效果。
通過本領域的技術人員已知的任意方法，可以監控本發明的分子復合物對腫瘤病的發展和進展的治療效果，所述方法包括但不限于檢測a)遲發型超敏反應，作為對細胞免疫的估計；b)溶細胞的T-淋巴細胞的體外活性；c)腫瘤特異性抗原例如癌胚抗原(CEA)的水平；d)使用諸如計算層析X射線照相術(CT)掃描的技術，檢測腫瘤的形態學變化；e)高危受試者中特定癌癥風險的推定生物標記的水平的變化，和f)使用聲波圖檢測腫瘤形態學的變化。
5.10.1 遲發型超敏反應皮膚實驗遲發型超敏反應皮膚實驗在總體免疫活性和對抗原的細胞免疫中具有重要價值。將不能與一組普通皮膚抗原反應稱作無反應性(Sato，T.，等，1995，Clin.Immunol.Pathol.，7435-43)。
皮膚實驗的適當技術要求，抗原應當無菌、避光地儲藏在4℃，在使用前迅速重配。用25-或27-規格的針確保皮內、而不是皮下地施用抗原。在皮內施用抗原后的24和48小時，用標尺測量紅斑和硬結的最大尺寸。通過使用更高濃度的抗原，或在模糊情形下通過中間實驗的重復實驗，確認了對任何特定抗原或抗原組的活動減退。
5.10.2 細胞毒性T細胞的體外活化使用在3ml含有10％胎牛血清的RPMI培養基中的4×104絲裂霉素C處理的腫瘤細胞，重新刺激通過Ficoll-Hypaque離心梯度技術分離出的8×106外周血衍生的T淋巴細胞。在一些實驗中，將33％二次混合的淋巴細胞培養物上清液或IL-2包含在培養基中，作為T細胞生長因子源。
為了測量免疫后的細胞毒性T-淋巴細胞的原發反應，在沒有刺激物腫瘤細胞的情況下培養T細胞。在其它的實驗中，用抗原性不同的細胞重新刺激T細胞。6天后，在4小時51Cr-釋放測定中測試培養物的細胞毒性。靶的自發的51Cr-釋放應當達到小于20％的水平。對于抗-MHC I類阻斷活性，以12.5％的終濃度向實驗物中加入10倍濃縮的W6/32雜交瘤上清液(Heike M.，等，J.Immunotherapy，15165-174)。
5.10.3 腫瘤特異性抗原的水平盡管不太可能檢測所有腫瘤上的獨特腫瘤抗原，但許多腫瘤表現出了能將它們與正常細胞區別開的抗原。單克隆抗體試劑已經允許分離和生化地表征抗原，且已經非常重要地在診斷上用于區別轉化的和未轉化的細胞和定義轉化細胞的細胞譜系。最好地表征的人腫瘤相關抗原是瘤胚抗原。這些抗原在胚胎發生的過程中表達，但是在正常的成體組織中不存在或非常難以檢測到。原型抗原是癌胚抗原(CEA)，它是在胎兒腸和人結腸癌細胞中發現的糖蛋白，但是在正常的成體結腸細胞中不存在。由于CEA源自結腸癌細胞、且在血清中發現，所以最初認為該抗原在血清中的存在可以用于篩選結腸癌患者。但是，其它腫瘤(例如胰腺癌或乳腺癌)的患者的CEA血清水平的也有所升高。因此，監控經歷治療的癌癥患者中的CEA水平的降低和升高，在預測腫瘤發展和對治療的反應方面具有經證實的作用。
幾種其它的瘤胚抗原已經用于診斷和監控人腫瘤，例如已經在肝和生殖細胞腫瘤患者的血清中發現了甲胎蛋白(一般由胎兒肝和卵黃囊細胞分泌的α-球蛋白)，且可以用作疾病狀態的標記物。
5.10.4 計算層析X射線照相術(CT)掃描CT仍是確定癌癥的精確病期的選擇技術。已經證實了CT比檢測轉移的任何其它成像技術更靈敏和更有特異性。
5.10.5 推定的生物標記物的測量測量特定癌癥的推定的生物標記物的水平，以監控本發明的分子復合物的效果。例如，在處于高前列腺癌風險的受試者中，通過Brawer，M.K.，等，1992，J.Urol.，147841-845和Catalona，W.J.，等，1993，JAMA，270948-958所述的方法，測量了血清前列腺-特異性的抗原(PSA)；或者在處于結腸直腸癌風險的受試者中，如上面5.10.3部分所述測量了CEA；在處于高乳腺癌風險的受試者中，通過Schneider，J.等，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，793047-3051所述的方法，測量了雌二醇的16-羥基化。
5.10.6 聲波圖聲波圖仍是確定癌癥的精確病期的替代選擇技術。
6.實施例1人GP96-肽復合物批次中持續升高水平的CON A制備了來自4個獨立的人腎腫瘤樣品的組織勻漿物(A至D)，并通過Con A柱層析進行處理。分離Con A洗脫物，一半材料備用。剩余的樣品緩沖液更換為PBS(PD-10柱)，然后經分離DEAE柱進一步純化2種樣品，生成2種勻漿物匹配的終產物——1種在Con A和DEAE柱之間沒有緩沖液更換(無Bx)，1種在兩柱之間有緩沖液更換步驟(Bx)。然后用檢測Con A的靈敏ELISA來確定這些分離的gp96-肽樣品中的Con A濃度。
伴刀豆球蛋白A特異性的ELISA材料伴刀豆球蛋白A購自Sigma，目錄號C7275。捕獲抗體小鼠抗Con A目錄號MAB 158 Maine Biotechnology，第一抗體兔抗Con A目錄號C7401 Sigma；檢測抗體山羊抗兔IgG-HRP目錄號111-035-144 Jackson ImmunoResearch.0.1M NaHCO3pH 9.6。洗滌緩沖液PBST PBS+0.05％ Tween 20。封閉緩沖液在洗滌緩沖液(PBST)中的2％脫脂奶粉。甲基α-D-吡喃型甘露糖苷(α-MM)，USB目錄號19115。樣品稀釋劑PBS+1％ BSA和10％ MMP。TMB Microwell基質，目錄號50-76-05 KPL。停止溶液，目錄號50-85-05 KPL。
方法用2μg/mL溶于0.1M NaHCO3pH 9.6中的小鼠抗-Con A涂覆平板，并在4℃溫育過夜。洗滌平板(PBS-Tween)，隨后在37℃封閉(1％ BSA/PBS)1小時，然后洗滌。在樣品稀釋劑中制備樣品和標準品，以100μl/孔一式兩份地應用到孔中，溫育(37℃，1小時)，并洗滌平板。加入溶于1％BSA+10％ α-MM中的兔抗-Con A，在37℃溫育平板1小時，然后洗滌。加入在封閉緩沖液中的1∶5000的檢測抗體山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶，在室溫(RT)溫育平板0.5小時，然后洗滌。然后向每個孔中加入TMB基質，溫育平板(室溫，10分鐘)，加入停止溶液，并在450nm讀平板。
結果使用包含緩沖液更換步驟的方法從普通勻漿物中純化出的gp96具有比對應的省略緩沖液更換步驟生成的勻漿物匹配的gp96樣品更高水平的Con A(圖1)。
7.實施例2CON A存在于低聚化的分子復合物中制備了來自化學誘導的鼠纖維肉瘤(Meth A)組織的普通勻漿物，并通過Con A柱層析進行處理。分離Con A洗脫物，一半材料備用。剩余的樣品緩沖液更換為PBS，然后經分離DEAE柱進一步純化2種樣品，生成2種勻漿物匹配的終產物——1種在Con A和DEAE柱之間沒有緩沖液更換(無Bx)，1種在有緩沖液更換步驟(Bx)。在Superdex200柱(分別為上、中、下)上通過SEC一起分級分離2種樣品和游離Con A(5μg、50μg/mL)的樣品。通過SDS-PAGE分析收集的級分的gp96(級分1至8；插圖)，通過針對Con A的直接ELISA評價單獨級分的Con A含量(級分1至14；覆蓋圖)(關于針對Con A的直接ELISA，見實施例1)。在無Bx-gp96的制劑中只有少量Con A，但是顯示級分1至5中的用Bx生產的gp96具有Con A。游離Con A洗脫得更晚，表明Bx-gp96樣品中的Con A不是游離的，而是與更高分子量的物質結合的。
為了證實gp96是與Con A低聚化的，制備了來自Meth A誘導的鼠纖維肉瘤組織的普通勻漿物，并通過包括Con A和DEAE柱層析的方法進行處理。將最終純化的gp96制劑分成2份。向一半材料中加入外源的con A，至終濃度50μg/mL；向另一半中只加入緩沖液作為對照，將2份樣品在37℃溫育2小時，然后通過SEC(Superdex 200)分級分離。通過SDS-PAGE、gp96-和con A-特異性的ELISA分析各級分。沒有緩沖液更換步驟時生產的材料的分析數據顯示在左圖中；其中加入了con A的圖在右邊。在左圖中，gp96的峰在級分5中，且通過特異性的ELISA檢測到的con A水平較低。在右圖(加入了con A)中，如通過SDS-PAGE(插圖；峰級分3(箭標)和5)和gp96 ELISA(級分3和5)以及集中在級分3中的Con A的不同峰所證實的，2個gp96峰都是明顯的。Con A介導了gp96的洗脫位置的移動。
8.實施例3低聚反應與體外和體內效力相關聯8.1.人gp96樣品中的Con A含量與體外效力相關聯如上所述從4個獨立的人腎腫瘤樣品(A至D)制備了gp96樣品(見圖1)，生成了4對差別僅僅在于包括或省略了Con A和DEAE柱之間的緩沖液更換步驟的樣品。使用CD71系統，測定所有8個樣品的con A含量(圖A；也見圖1)和體外抗原重新呈遞(圖B)。在每種情況下，與從匹配腫瘤勻漿物生成并通過省略了緩沖液更換步驟的步驟制備的樣品相比，通過包含緩沖液更換步驟(且含有高水平的Con A)的方法制備的材料具有更高的體外重新呈遞活性。
CD71 體外重新呈遞實驗材料在這些實驗中使用呈遞抗原細胞系RAW264.7(ATCC號TIB-71)。它是Abelson鼠白血病病毒轉化的巨噬細胞細胞系，其源自BALB/c品系(H-2d)。通過融合對人CD719聚體特異性的BALB/c T細胞和BWαβ-胸腺瘤細胞，生成了T細胞雜交瘤。通過PEG，使T細胞與BWαβ-細胞融合，并在HAT培養基中選擇。然后通過抗原刺激后HT-2細胞的增殖，測量IL-2生產，篩選得到的T-T雜交瘤細胞的CD71 9聚體特異性。使用的培養基是RPMI 1640(Gibco-BRL)。使用緩沖液更換和無緩沖液更換的方法和如(Arnold-Schild等，同上)所述的scFv-柱方法，從人腎腫瘤純化出了人gp96。將使用相同的純化方法從CT26腫瘤純化的鼠gp96-CT26作為實驗樣品，鼠CD719聚體肽(TYEALTQKV)作為陰性抗原對照。人CD71 9聚體(TYKELIERI)用作陽性抗原對照。
人腫瘤衍生的gp96的制備從人腎腫瘤純化了人衍生的gp96。簡而言之，將腫瘤勻漿，并通過離心澄清。對無細胞的上清液進行50％硫酸銨沉淀。使用ConA和DEAE層析，進一步純化得到的上清液。對蛋白進行過濾除菌(0.22μm)，等分試樣，并儲存在-80±20℃待用。
重新呈遞實驗在96-孔平底平板中，將人CD71-特異性的T細胞雜交瘤(5×104)與RAW264.7細胞(5×104)共培養。一式三份地加入所需濃度的人gp96，從150μg/ml開始，并向下滴定。加入合適的陽性和陰性對照，并將培養基的體積調至終體積為200μl。除了含有T細胞雜交瘤和APC的實驗平板外，加入只含有T細胞雜交瘤或APC的平板作為對照。通過輕打來輕微攪拌平板，然后置于37℃、5％ CO2培養箱中20小時。溫育后，在1000 RPM、4℃沉淀細胞5分鐘。將上清液轉移到96-孔圓底平板中，通過ELISA(R & D)測試IL-2生產。
8.2.鼠CT 26系統中的Con A含量與體內效力相關聯如上面關于人腫瘤衍生的樣品所述(見圖1)，從2個獨立的鼠CT26腫瘤樣品(制劑A和B)制備了gp96樣品。使用CT26系統測定了所有4個樣品的con A含量(圖A)和體外抗原重新呈遞(圖B)。在每種情況下，與從匹配腫瘤勻漿物生成并通過省略了緩沖液更換步驟的步驟制備的樣品相比，通過包含緩沖液更換步驟(且含有增加量的Con A)的方法制備的材料具有更高的體外重新呈遞活性。
CT26 體外抗原重新呈遞實驗材料在這些實驗中使用呈遞抗原細胞系RAW264.7(ATCC號TIB-71)。它是Abelson鼠白血病病毒轉化的巨噬細胞細胞系，其源自BALB/c品系(H-2d)。細胞毒性T淋巴細胞(CTL)從University ofConnecticut Medical Center得到了對CT26腫瘤肽特異性的T細胞。這些T細胞是對AH1表位、氨基酸序列SPSYVYHQF特異性的。用AH1 9聚體肽加輻照的BALB/c脾細胞，每周一次重新刺激這些CTL。使用了AIM V(Gibco-BRL)組織培養基。它是無血清的不含蛋白酶的培養基。蛋白酶是不希望的，因為它們會將長肽消化為更小的尺寸，后者能表面裝載到誘導獨立于抗原重新呈遞的CTL反應的MHC分子上。使用緩沖液更換和無緩沖液更換的方法，從小鼠腫瘤純化出了CT26衍生的gp96。加入單獨的AH1 19聚體(RVTYHSPSYVYHQFERRAK)以及源自正常小鼠器官的gp96作為陰性對照。將能表面裝載和引發CTL識別的AH1 9聚體(SPSYVYHQF)用作陽性對照。另外的陽性對照包含與AH1 19聚體肽復合的小鼠衍生的gp96。
方法CT26衍生的gp96的制備從實體瘤純化出了CT26衍生的gp96。將小鼠腫瘤勻漿，并通過離心澄清。對無細胞的上清液進行50％硫酸銨沉淀。使用ConA和DEAE層析，進一步純化得到的上清液。對蛋白進行過濾除菌(0.22μm)，等分試樣，并儲存在-80±20℃待用。
gp96-AH1 19聚體復合物(復合物陽性對照樣品)的制備將溶解在H2O中的AH119聚體肽以50∶1摩爾比加入gp96中。在15ml錐形管中，依賴于要復合的蛋白的量，將樣品簡單地混合到約1-2ml的體積中，并在37℃放置0.5小時。溫育后，使用30K MWCO Centricon自旋過濾器裝置(Millipore)，用5ml PBS洗滌樣品4次，并通過Bradford測定分析蛋白濃度。
AH1-9聚體(測定陽性對照樣品)的制備AH1 9聚體可以直接裝載到MHC I分子上，因此用作陽性對照來直接刺激未經APC加工的T細胞。
陰性對照樣品包括以相同的摩爾濃度溶解在PBS中的未復合的gp96或裸19聚體肽。
重新呈遞測定洗滌AH1肽-特異性的T細胞(刺激后8天)3次，以去除APC，并以2×105細胞/ml重新懸浮到AIM V培養基中。將RAW264.7細胞用作APC，并在AIM V中以2×105細胞/ml重新懸浮之前，在DMEM加10％ FCS中洗滌一次。在96-well圓底平板中，一式四份地加入CT26衍生的gp96樣品，并進行2倍系列稀釋(200μg/ml-6.25μg/ml)。加入適當的陽性和陰性對照，以及達到250μl終體積所需量的AIM V。在每個孔中，將1×104T細胞與等數目的APC共培養。將僅僅含有T細胞的平板用作對照。在37℃和5％ CO2溫育平板18小時。
溫育后，在1000rpm、4℃沉淀細胞5分鐘。將上清液轉移到96-孔平底平板中進行ELISA，并儲存在-20℃。通過ELISA(R & D Systems)測量IFN-γ水平。
8.3.Con A含量與在體外Meth A重新呈遞測定和體內鼠Meth A腫瘤保護模型中的效力相關聯從普通腫瘤勻漿物(上述)制備了2份分開的Meth A gp96制劑，生成一對差別僅僅在于包括或缺少Con A和DEAE柱之間的緩沖液更換步驟的樣品。通過Con A ELISA，測定了這些樣品的Con A含量(圖A)，在Meth A重新呈遞測定中的體外活性(圖B)和以10μg的劑量在meth A腫瘤保護測定中的體內活性(圖C)。與通過缺少緩沖液更換步驟的方法制備的樣品相比，通過包含Con A和DEAE柱之間的緩沖液更換步驟的方法制備的Meth A gp96具有更高的Con A含量、更高的體外抗原重新呈遞和更高的體內腫瘤保護活性。
Meth A體外抗原重新呈遞材料輻照的BALB/c脾細胞用作呈遞抗原細胞(APC)。使用了Meth A-特異性的CD4+T細胞克隆24D3。它們是MHCII分子I-Ed限制的，且是對包含在序列EYELRKHNFSDTG中的抗原肽特異性的。用在該測定中的培養基是RPMI 1640(Gibco-BRL)。使用緩沖液更換和無緩沖液更換的方法，從小鼠Meth A腫瘤純化出了gp96。野生型的L11肽(EYELRKNNFSDTG)用作陰性對照，且突變型L11肽(EYELRKHNFSDTG)用作陽性對照。
方法Meth A衍生的gp96的制備從實體瘤純化出了Meth A衍生的gp96。將小鼠腫瘤勻漿，并通過離心澄清。對無細胞的上清液進行50％硫酸銨沉淀。使用ConA和DEAE層析，進一步純化得到的上清液。對蛋白進行過濾除菌(0.22μm)，等分試樣，并儲存在-80±20℃待用。
重新呈遞實驗在96孔平底平板中，以200μl的終體積，在有各種濃度的來自Meth A或其它來源的gp96存在的情況下(100、50、25、12.5、6.25μg/ml終濃度)，將2×104Meth A特異性的CD4+T細胞克隆(24D3)與5×105輻照的BALB/c脾APC一起溫育48-72小時。在重復的孔中加入野生型核糖體蛋白L11肽和突變的核糖體蛋白L11肽，并分別用作陰性對照或陽性對照。在37℃、5％ CO2溫育48-72小時后，取出100μl上清液，通過ELISA測量IL-5生產。
體內Meth A腫瘤抑制測定體內Meth A生長抑制測定在第0天和第7天，用10或50μg gp96在脅腹皮內免疫BALB/c小鼠(n＝30/組)。在研究的第14天，用總體積為100μl的1×105Meth A細胞皮內攻擊小鼠。在隨后的4周中，監控生長的腫瘤。在研究的第41天，完成最后的腫瘤測量后，使所有的動物安樂死。將數據記錄為在研究的第41天沒有腫瘤的動物的百分比。對照組包括未免疫的(稀釋劑-陰性對照)和用輻照的Meth A細胞免疫的(陽性對照)。
9.實施例4外源的Con A會增加CD71體外重新呈遞測定中的gp96活性將人肝組織勻漿并離心，生成11K上清液，將其分成3等份樣品，并通過不同的方法進行處理。
通過Con A柱層析處理2份樣品(見5.13部分)，分離Con A洗脫物，一半材料備用。剩余的樣品緩沖液更換為PBS(見5.13部分)，然后經分離DEAE柱純化2種樣品，生成2種勻漿物匹配的終產物一-1種在Con A和DEAE柱之間沒有緩沖液更換(無Bx-樣品A)，1種在兩柱之間有緩沖液更換步驟(Bx-樣品B)(圖7)。
使用Arnold-Schild等，Cancer Research，2000，60(15)4175-4178(在下文中稱作“Arnold-Schild”，其在這里整體引作參考)所述的gp96-特異性的scFv柱，將剩余的11K上清液用于純化gp96。純化如下進行將5mg scFv抗-gp96偶聯到0.5mg CNBr-活化的瓊脂糖凝膠(Pharmacia)上(關于scFv抗-gp96的生產，見Arnold-Schild，或者可以通過本領域熟知的任何方法制備)。將該11K上清液應用到scFv抗-gp96柱上。用PBS充分洗滌后，用PBS、1.3M NaCl、10mM醋酸鈉(pH 7.2)洗脫gp96。
通過con A特異性的ELISA(將外源的con A(7.5ng con A/μg總蛋白)加入2種樣品A和D中，直到與樣品B中的水平相同)，分析所有樣品的con A濃度，和在75μg/mL的蛋白濃度時CD71系統中的體外抗原重新呈遞。關于匹配的樣品對，通過包含緩沖液更換步驟的方法生產的材料(樣品#1；con A含量7.5ng/μg總蛋白)比通過省略了緩沖液更換步驟的方法生產的材料(樣品A；con A含量0.43ng/μg總蛋白)更具有體外活性(圖7)。通過沒有使用Con A柱純化步驟的一步方法生產的材料(scFv gp96；0ng/μg)具有類似于樣品A的低體外活性(圖7)。向樣品A和C中添加外源的Con A至與在樣品B中相同的水平(7.5ng con A/μg總蛋白)，會將特異性的體外抗原重新呈遞活性增加到與樣品B中相似的水平(圖7)。該Con A水平對T細胞自身無影響。
10.實施例5低聚物種類是甲基α-D-吡喃型甘露糖苷(α-MM)靈敏的通過包括Con A和DEAE層析的標準純化方法，純化了meth Agp96樣品，并通過使用superose 6柱(Pharmacia)的分析型SEC分析了蛋白，其表明蛋白制劑主要含有二聚體的gp96(gp96 T＝0)。向該gp96樣品(濃度500μg/ml)的等分試樣中加入Con A(最終50μg/mL)，在室溫溫育樣品，每小時一次取樣(T＝1至T＝5)，并進行SEC分析。還進行了只含有con A的樣品。con A的加入會介導gp96二聚體峰在洗脫位置中的移動，它在第一個時間點后僅僅有輕微變化。gp96自身在該時間段內不能改變(gp96 T＝5)。在最后的時間點后，取出最后5小時樣品的2份獨立的等分試樣，加入等體積的PBS或含有10％ α-MM的PBS。然后通過SEC重新分析每份樣品。其中加入了PBS的樣品沒有明顯變化(未顯示)。α-MM的加入離解了高分子量復合物(gp96+con A T＝5+α-MM)，產生與原始gp96樣品(gp96 T＝0或T＝5)類似的SEC圖。
11.實施例6低Con Agp96化學計量會介導gp96洗脫位置的SEC靈敏性移動通過包含Con A和DEAE層析的標準純化方法純化了人腎腫瘤gp96，使用superose 6柱(Pharmacia)，通過分析型SEC分析了蛋白。向gp96(180μg/mL)中加入Con A至終濃度為0.005-50μg/mL，在室溫溫育樣品1小時，并進行SEC分析。約1 Con A10gp96的化學計量能產生gp96洗脫位置的SEC靈敏性移動。
12.實施例7甲基α-D-吡喃型甘露糖苷的加入會造成CT26體外抗原重新呈遞活性的濃度依賴性的降低在稀釋(1∶5)進含有RAW264.7 APC細胞和AH1特異性的T-細胞的微量滴定板孔之前，在存在50、100或400mM α-MM的情況下，將CT26-衍生的gp96的樣品(通過Bx方法制備)和陽性對照9聚體肽(SPSYVYHQF)溫育30分鐘。將樣品溫育過夜，通過INF-γ特異性的ELISA分析得到的上清液。α-MM造成了CT26抗原重新呈遞的劑量依賴性的降低，且對陽性對照9聚體肽的T細胞識別沒有影響。該水平的α-MM沒有影響APC或T細胞的生存力。
13.實施例8Con A會增加HSPPC-96的腫瘤排斥活性13.1.在純化gp96的過程中加入的Con A會增加純化的終產物的活性通過在純化過程中加入Con A，制備了在終產物中含有不同水平的Con A的Meth A衍生的gp96。通過Con A ELISA測定了所有樣品的Con A含量(為每個樣品測量的Con A濃度以ng Con A/μg為單位，顯示在圖中)和體內腫瘤排斥。圖11顯示了Meth A體內腫瘤排斥測定的結果。過程中(in process)加入Con A會造成HSPPC-96的腫瘤排斥活性的可滴定的增加。
方法Meth A衍生的gp96的制備和Con A的過程中添加將Meth A腫瘤的樣品勻漿(含有2mM MgCl2和2mM AEBSF的30mM磷酸鈉緩沖液pH 7.2)，通過離心澄清，加入固體硫酸銨至50％，再次離心樣品，并將上清液直接應用到Con A柱上。在該階段，將Con A洗脫物緩沖液更換為磷酸緩沖鹽水(“PBS”)，并分成6等份樣品。將一份樣品通過裝載到二乙氨乙基(“DEAE”)柱上，用10mM磷酸鈉、260mM NaCl洗滌該樣品，并用10mM磷酸鈉、700mM NaCl洗脫(標準方法)，來對其立即進行處理。向剩余的5份中，加入外源的Con A(1-5的水平分別為3μg/ml，10μg/ml，30μg/ml，100μg/ml和300μg/ml)。然后如上所述，經DEAE柱純化所有樣品。隨后將全部DEAE洗脫物緩沖液更換為9％蔗糖-磷酸鉀緩沖液pH 7.4。
體內Meth A生長抑制測定在第0天和第7天，用10μg gp96在脅腹皮內免疫BALB/c小鼠(n＝10/組)。在研究的第14天，用總體積為100μl的1×105Meth A細胞皮內攻擊小鼠。在隨后的4周中，監控生長的腫瘤。在研究的第41天，完成最后的腫瘤測量后，使所有的動物安樂死。將數據記錄為在研究的第41天沒有腫瘤的動物的百分比。對照組包括未免疫的(稀釋劑-陰性對照)和用輻照的Meth A細胞免疫的(陽性對照)。
13.2.在純化gp96的過程中或在純化gp96后加入的Con A會增加純化的終產物的活性通過在純化過程中(在30μg/ml和300μg/ml的水平)或在純化后(在30μg/ml的水平)加入Con A，制備了在終產物中含有不同水平的Con A的Meth A衍生的gp96。通過Con A ELISA測定了所有樣品的Con A含量(為每個樣品測量的Con A濃度以ng Con A/μg為單位，顯示在圖中)和體內腫瘤排斥。圖12(A)顯示了過程中加入Con A的Meth A體內腫瘤排斥測定的結果，且圖12(B)顯示了向終產物中加入Con A的結果。過程中加入Con A或在純化gp96后加入Con A會造成HSPPC-96的腫瘤排斥活性的增加。
方法Meth A衍生的gp96的制備和Con A的添加將Meth A腫瘤的樣品勻漿(含有2mM MgCl2和2mM AEBSF的30mM磷酸鈉緩沖液pH7.2)，通過離心澄清，加入固體硫酸銨至50％，再次離心樣品，并將上清液直接應用到Con A柱上。在該階段，將Con A洗脫物緩沖液更換為PBS，并分成3份樣品。將一份樣品通過DEAE柱立即處理，以得到gp96(標準方法)。向剩余的2份中，加入外源的Con A(分別為30和300μg/mL)，然后經DEAE柱純化樣品。隨后對全部DEAE洗脫的樣品進行最終的緩沖液更換，更換為9％蔗糖-磷酸鉀緩沖液pH7.4。向一份通過標準方法純化的gp96等分試樣中加入ConA(30μg/mL)。分析樣品的Con A含量和體內腫瘤排斥。當過程中加入(圖12(A))或向最終純化的gp96蛋白(圖12(B))中加入時，Con A都會造成gp96的腫瘤排斥活性的增加。
體內Meth A生長抑制測定在第0天和第7天，用10μg gp96在脅腹皮內免疫BALB/c小鼠(n＝10/組)。在研究的第14天，用總體積為100μl的1×105Meth A細胞皮內攻擊小鼠。在隨后的4周中，監控生長的腫瘤。在研究的第41天，完成最后的腫瘤測量后，使所有的動物安樂死。將數據記錄為在研究的第41天沒有腫瘤的動物的百分比。對照組包括未免疫的(稀釋劑-陰性對照)和用輻照的Meth A細胞免疫的(陽性對照)。
在另一個實驗中，使用抗-gp96 scFv免疫親和柱，制備了Meth A衍生的gp96。將純化的gp96緩沖液更換為PBS，并分成幾等份。向一等份試樣中加入Con A。通過Con A ELISA分析樣品(為每個樣品測量的Con A濃度以ng Con A/μg為單位，顯示在圖中)和體內腫瘤排斥。結果顯示在圖13中。在每種情況下，Con A的加入都會增加gp96的腫瘤排斥活性。
方法Meth A衍生的gp96的制備和Con A的添加將Meth A腫瘤的樣品勻漿(含有2mM MgCl2和2mM AEBSF的30mM磷酸鈉緩沖液pH7.2)，通過離心澄清，并過濾(0.45μM)。將得到的澄清勻漿物應用到1mL抗-gp96 scFv免疫親和柱上。用10柱體積的PBS洗滌柱，隨后用5柱體積的含有1.3M NaCl的PBS洗脫gp96。將柱洗脫物緩沖液更換為PBS。
體內Meth A生長抑制測定在第0天和第7天，用0.3或3μg單獨的gp96或與Con A組合在脅腹皮內免疫BALB/c小鼠(n＝10/組)。在研究的第14天，用總體積為100μl的1×105Meth A細胞皮內攻擊小鼠。在隨后的4周中，監控生長的腫瘤。在研究的第41天，完成最后的腫瘤測量后，使所有的動物安樂死。將數據記錄為在研究的第41天沒有腫瘤的動物的百分比。對照組包括未免疫的(稀釋劑-陰性對照)和用輻照的Meth A細胞免疫的(陽性對照)。
14.實施例9HSV-2感染的免疫療法通過本領域已知的許多方法，培養2型單純皰疹病毒(“HSV-2”)，并分離病毒顆粒(見例如，Principles of Virology，Molecular Biology，Pathgenesis，and Control，Flint等，編，ASM Press，(2000))。通過幾種普通方法中的一種，提取病毒顆粒，離心得到的樣品并過濾，以得到富含病毒蛋白的級分。可以定量最初收集的可溶化的病毒蛋白，并加入化學計量過量的Con A(或其它凝集素)。或者，通過伴刀豆球蛋白A(或其它固定化的凝集素)柱上的層析，還可以進一步富集可溶的蛋白提取物中的病毒-特異性糖蛋白。使用凝集素-特異性的抑制劑(例如針對Con A的甲基α-吡喃型甘露糖苷)，可以從柱上特異性地洗脫下糖蛋白。使用許多緩沖液更換方法，可以去除抑制劑。然后可以定量富集的糖蛋白樣品，并加入化學計量過量的Con A。或者，使用酶促的或化學的方法，可以進一步加工富集的糖蛋白樣品，以生產糖蛋白的更小的肽片段。可以將這些更小的片段直接與化學計量過量的ConA(或其它凝集素)混合，或通過層析和從Con A柱(或其它固定化的凝集素柱)洗脫，進一步進行純化。可以定量富集的糖肽級分，并加入化學計量過量的Con A(或其它凝集素)。使用預防(鼠HSV-2)或治療(豚鼠HSV-2)模型，可以評價樣品和適當對照物的生物學活性。
可以進行類似的方法，以生成用于評價癌癥免疫療法的實驗材料。
等同方案和引用的文獻在本文中為所有目的引用的全部文獻在這里都整體引作參考，其程度與為所有目的具體地和個別地整體引用單個的出版物或專利或專利申請作為參考相同。
如本領域的技術人員所明白的，可以對本發明進行許多修飾和變化，而不偏離其精神和范圍。本文所述的具體實施方案僅僅是作為實例予以提供。
序列表<110>Antigenics，Inc.
<120>凝集素在促進糖蛋白和抗原分子的低聚反應中的用途<130>8449-330-228<150>60/450,721<151>2003-02-28<160>6<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>9<212>PRT<213>鼠白血病病毒表位<400>1Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe1 5<210>2<211>9<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>2Thr Tyr Glu Ala Leu Thr Gln Lys Val1 5<210>3<211>9<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>3
Thr Tyr Lys Glu Leu Ile Glu Arg Ile1 5<210>4<211>19<212>PRT<213>鼠白血病病毒表位<400>4Arg Val Thr Tyr His Ser Pro Ser Tyr Val Tyr His Gln Phe Glu Arg1 5 10 15Arg Ala Lys<210>5<211>13<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>5Glu Tyr Glu Leu Arg Lys His Asn Phe Ser Asp Thr Gly1 5 10<210>6<211>13<212>PRT<213>小鼠(Mus Musculus)<400>6Glu Tyr Glu Leu Arg Lys Asn Asn Phe Ser Asp Thr Gly1 5 10
權利要求
1.一種或多種非共價復合物，每種復合物包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素，其中所述的熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg熱激蛋白。
2.如權利要求1的復合物，其中所述的復合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是50ng凝集素/μg熱激蛋白至1000ng凝集素/μg熱激蛋白。
3.如權利要求1的復合物，其中所述的復合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是100ng凝集素/μg熱激蛋白至500ng凝集素/μg熱激蛋白。
4.一種或多種非共價復合物，每種復合物包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素，其中所述的熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的復合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg熱激蛋白。
5.如權利要求4的復合物，其中所述的復合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是0.1ng凝集素/μg熱激蛋白至1ng凝集素/μg熱激蛋白。
6.如權利要求4的復合物，其中所述的復合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是0.5ng凝集素/μg熱激蛋白至1ng凝集素/μg熱激蛋白。
7.如權利要求1-6中的任一項的復合物，其中所述的凝集素是能結合甘露糖的凝集素。
8.如權利要求7的復合物，其中所述的能結合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。
9.如權利要求1-6中的任一項的復合物，其中所述的熱激蛋白是gp96。
10.如權利要求1-6中的任一項的復合物，其中非共價復合物是純化的。
11.制備大量包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素的非共價復合物的方法，其中所述的熱激蛋白是糖基化的，所述的方法包括下述步驟a)使所述的凝集素結合到所述的熱激蛋白上；和b)使所述的熱激蛋白復合到抗原分于上。
12.制備大量包含熱激蛋白、抗原分子和凝集素的非共價復合物的方法，其中所述的熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，所述的方法包括使凝集素結合到一種或多種復合物上，每種復合物包含熱激蛋白和抗原分子，其中所述的凝集素未結合到固相上。
13.如權利要求12的方法，還包括在使所述的復合物結合到凝集素上之前，通過基于凝集素的親和層析分離所述的熱激蛋白和抗原分子的復合物。
14.如權利要求12的方法，還包括在使所述的復合物結合到所述的凝集素上之前，通過基于非-凝集素的層析分離所述的熱激蛋白和抗原分子的復合物。
15.如權利要求14的方法，其中所述的基于非-凝集素的層析是基于抗體的親和層析。
16.一種或多種分子復合物，其是權利要求11-14中的任一項的方法的產物，其中所述的組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg熱激蛋白。
17.一種或多種分子復合物，其是權利要求11-15中的任一項的方法的產物，其中所述的組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg熱激蛋白。
18.如權利要求11-15中的任一項的方法，其中所述的凝集素是能結合甘露糖的凝集素。
19.如權利要求18的方法，其中所述的能結合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。
20.如權利要求11-15中的任一項的方法，其中所述的熱激蛋白是gp96。
21.如權利要求12-15中的任一項的方法，其中所述的熱激蛋白和抗原分子的復合物是從癌組織得到的。
22.純化的權利要求16或17的分子復合物。
23.一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載體和一種或多種熱激蛋白、抗原分子和凝集素的復合物，其中所述的熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量大于40ng/μg熱激蛋白。
24.如權利要求23的藥物組合物，其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是50ng凝集素/μg熱激蛋白至1000ng凝集素/μg熱激蛋白。
25.一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載體和一種或多種熱激蛋白、抗原分子和凝集素的復合物，其中所述的熱激蛋白和/或抗原蛋白是糖基化的，且其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量小于5ng/μg熱激蛋白。
26.如權利要求25的藥物組合物，其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是0.1ng凝集素/μg熱激蛋白至1ng凝集素/μg熱激蛋白
27.如權利要求23-26中的任一項的藥物組合物，其中分子復合物以能有效地治療或預防癌癥或傳染病的量存在。
28.如權利要求23-26中的任一項的藥物組合物，其中所述的凝集素是能結合甘露糖的凝集素。
29.如權利要求28的藥物組合物，其中所述的能結合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。
30.如權利要求23-26中的任一項的藥物組合物，其中所述的熱激蛋白是gp96。
31.預防或治療一類癌癥或傳染病的方法，包括給患有癌癥或傳染病的受試者施用治療有效量的包含大量非共價復合物的組合物，每種復合物包含熱激蛋白、能表現出對所述的癌癥的抗原或所述的傳染病因子的抗原的抗原性的抗原分子和凝集素，其中所述的熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg熱激蛋白。
32.如權利要求31的方法，其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是50ng凝集素/μg熱激蛋白至1000ng凝集素/μg熱激蛋白。
33.預防或治療一類癌癥或傳染病的方法，包括給患有癌癥或傳染病的受試者施用治療有效量的包含大量非共價復合物的組合物，所述復合物包含熱激蛋白、能表現出對所述的癌癥的抗原或所述的傳染病因子的抗原的抗原性的抗原分子和凝集素，其中所述的熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的，且其中所述的組合物中的凝集素的量相對于熱激蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg熱激蛋白。
34.如權利要求33的方法，其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是0.1ng凝集素/μg熱激蛋白至1ng凝集素/μg熱激蛋白。
35.預防或治療一類癌癥或傳染病的方法，包括給患有癌癥或傳染病的受試者施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載體和一種或多種熱激蛋白、能表現出對所述的癌癥的抗原或所述的傳染病因子的抗原的抗原性的抗原分子和凝集素的復合物，其中所述的熱激蛋白和/或抗原蛋白是糖基化的，且其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量大于或等于40ng/μg熱激蛋白。
36.如權利要求35的方法，其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是50ng凝集素/μg熱激蛋白至1000ng凝集素/μg熱激蛋白。
37.預防或治療一類癌癥或傳染病的方法，包括給患有癌癥或傳染病的受試者施用治療有效量的藥物組合物，所述藥物組合物包含藥學上可接受的載體和一種或多種熱激蛋白、能表現出對所述的癌癥的抗原或所述的傳染病因子的抗原的抗原性的抗原分子和凝集素的復合物，其中所述的熱激蛋白和/或抗原蛋白是糖基化的，且其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量小于或等于5ng/μg熱激蛋白。
38.如權利要求37的方法，其中所述的組合物中的凝集素相對于熱激蛋白的量是0.1ng凝集素/μg熱激蛋白至1ng凝集素/μg熱激蛋白。
39.如權利要求31-38中的任一項的方法，其中所述的凝集素是能結合甘露糖的凝集素。
40.如權利要求39的方法，其中所述的能結合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。
41.如權利要求31-38中的任一項的方法，其中所述的熱激蛋白是gp96。
42.如權利要求31-38中的任一項的方法，其中所述的受試者是哺乳動物。
43.如權利要求42的方法，其中所述的哺乳動物是人。
44.如權利要求31-38中的任一項的方法，其中所述的熱激蛋白和所述的抗原分子是從癌組織分離出的純化的非共價復合物。
45.如權利要求31-38中的任一項的方法，其中分子復合物是純化的。
46.試劑盒，其包含(a)第一容器，其裝有包含大量非共價復合物的組合物，每種復合物包含熱激蛋白和抗原分子，其中熱激蛋白和/或抗原分子是糖基化的；和(b)裝有純化的凝集素的第二容器。
47.如權利要求46的試劑盒，其中抗原分子表現出對一類癌癥的抗原或傳染病因子的抗原的抗原性。
48.如權利要求46的試劑盒，其中凝集素是能結合甘露糖的凝集素。
49.如權利要求48的試劑盒，其中能結合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。
50.如權利要求46的試劑盒，其中熱激蛋白是gp96。
51.一種或多種非共價復合物，每種復合物包含凝集素和生物學活性的糖蛋白，其中所述的復合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg糖蛋白。
52.如權利要求51復合物，其中所述的復合物中的凝集素相對于糖蛋白的量是50ng凝集素/μg糖蛋白至1000ng凝集素/μg糖蛋白。
53.一種或多種非共價復合物，每種復合物包含凝集素和生物學活性的糖蛋白，其中所述的復合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg糖蛋白。
54.如權利要求53復合物，其中所述的復合物中的凝集素相對于糖蛋白的量是0.1ng凝集素/μg糖蛋白至1ng凝集素/μg糖蛋白。
55.如權利要求51-54中的任一項的復合物，其中所述的糖蛋白是抗原分子，其能表現出對一種或多種需要在受試者中發生針對它們的免疫反應的抗原決定簇。
56.如權利要求51-54中的任一項的復合物，其中所述的凝集素是能結合甘露糖的凝集素。
57.如權利要求56復合物，其中所述的能結合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。
58.如權利要求51-54中的任一項的復合物，其中非共價復合物是純化的。
59.一種藥物組合物，其包含藥學上可接受的載體和一種或多種權利要求51-54中的任一項的復合物。
60.如權利要求59的藥物組合物，其中復合物以能有效地治療或預防癌癥、傳染病、貧血、生長激素缺乏紊亂、酶缺乏紊亂或免疫抑制狀況的量存在。
61.向受試者的所需位點或所需細胞類型中遞送糖蛋白的方法，包括施用一種或多種分子復合物，其中每種復合物包含凝集素和糖蛋白，且其中所述的復合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量大于或等于40ng凝集素/μg糖蛋白。
62.向受試者的所需位點或所需細胞類型中遞送糖蛋白的方法，包括施用一種或多種分子復合物，其中每種復合物包含凝集素和糖蛋白，且其中所述的復合物中的凝集素的量相對于糖蛋白的量小于或等于5ng凝集素/μg糖蛋白。
63.如權利要求61或62的方法，其中所述的糖蛋白是抗原分子，其能表現出對一種或多種需要在受試者中發生針對它們的免疫反應的抗原決定簇。
64.如權利要求61或62的方法，其中所述的凝集素是能結合甘露糖的凝集素。
65.如權利要求64的方法，其中所述的能結合甘露糖的凝集素是伴刀豆球蛋白A(Con A)。
66.如權利要求61或62的方法，其中分子復合物是純化的。
67.如權利要求61或62的方法，其中受試者是人。
68.純化的復合物，其包含凝集素和生物學活性的糖蛋白，前提條件是所述的糖蛋白不包括熱激蛋白。
69.一種藥物組合物，其包含治療有效量的權利要求68的復合物和藥學上可接受的載體，其中所述的生物學活性的糖蛋白是治療劑。
70.向患者遞送治療劑的方法，包括給患者施用權利要求69的藥物組合物。
全文摘要
本發明涉及凝集素或凝集素樣分子在促進糖蛋白或含有糖蛋白的免疫學和/或生物學活性的復合物的低聚反應中的應用。更具體地，本發明提供了包含凝集素分子和免疫學和/或生物學活性分子的分子復合物的組合物。還提供了制備這樣的分子復合物的方法，使用包含這樣的分子復合物的組合物預防和治療疾病、特別是癌癥和傳染病，以及在受試者中引起免疫反應的方法。
文檔編號A61K39/00GK1780850SQ200480011420
公開日2006年5月31日 申請日期2004年2月27日 優先權日2003年2月28日
發明者J·R·扎布雷基, S·A·蒙克斯 申請人:抗基因公司