專利名稱：用于缺血性心臟病的細胞療法的內皮氧化氮合酶轉錄增強劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及增強內皮氧化氮合酶(eNOS)轉錄的化合物用于在患有缺血性心臟病如冠心病或缺血性心肌病的患者的細胞療法中處理干細胞和祖細胞的用途。在施用之前將這類例如可由骨髓分離得到的細胞用eNOS轉錄增強劑進行處理可提高它們的功能活性并改善心臟的新血管形成和心臟再生。
在患有缺血性心臟病如冠心病或缺血性心肌病的患者中，梗塞后心力衰竭仍然是發病率和死亡率的主要原因。雖然被阻塞動脈的迅速再灌注已經顯著降低了早期的死亡率，但是在急性心肌梗塞幸存的患者中，以梗塞區域的進行性擴大和左心室腔的擴張為特征的心室重塑過程常常造成心力衰竭的發生。逆轉該重塑的主要目標是刺激新血管形成以及促進梗塞區域內心肌細胞的再生。
近期研究的結果已經表明，內皮干細胞和祖細胞在出生后的新血管形成和心臟再生中發揮重要作用。在嚴重缺血后增加新血管形成是一種重要的治療選擇，例如，在諸如心肌梗塞或肢體缺血等事件之后。直到近期，人們認為成年人缺血組織的新血管形成局限于成熟內皮細胞的遷移和增殖—一個被稱為血管生成的過程。同時，越來越多的證據表明循環的內皮祖細胞(EPC)尋靶至缺血部位并促進新血管的形成(C.Kalka等人，用于治療性新血管形成的離體擴增的內皮祖細胞移植，Proc.Natl.Acad.Sci.USA2000，973422-7)。與源自原始內皮祖細胞(成血管細胞)的血管的胚胎發育類似，該過程被稱為血管發生。循環祖細胞募集的遺傳抑制可抑制腫瘤血管生成這一事實證明了它們的重要性。血管內皮生長因子(VEGF)或基質細胞源因子(SDF)-1可使EPC從骨髓轉移到循環中。在缺氧組織中VEGF和SDF-1均被大量上調，這表明在嚴重缺血后VEGF和SDF-1構成了尋靶信號以募集循環的祖細胞，從而促進內皮修復機制(S.H.Lee等人，在急性心肌缺血和梗塞中血管生成因子的早期表達，N.Engl.J.Med.2000，342626-33)。
近期的實驗研究證明由骨髓或血液獲得的祖細胞有助于梗塞心肌的再生并促進缺血心肌的新血管形成(A.A.Kocher等人，缺血心肌通過人骨髓源成血管細胞的新血管形成可預防心肌細胞凋亡、減少重塑和增強心臟功能，Nat.Med.2001，7430-6；D.Orlic等人，骨髓細胞使梗塞心肌再生，Nature 2001，410701-5；S.Fuchs等人，在無選擇的晚期冠狀動脈病患者中進行的基于導管的自體骨髓心肌注射可行性研究，J.Am.Coll.Cardiol.2003，411721-4)。此外，在實驗誘導的心肌梗塞后和在慢性缺血性心臟病患者中靜脈內輸注或心肌內注射成人祖細胞均產生心臟功能的持續改善。在臨床上已經證實，在急性心肌梗塞患者和慢性缺血性心肌病患者中冠脈內輸注成人干細胞和祖細胞均是可行的且安全的(B.Assmus等人，祖細胞移植和在急性心肌梗塞中的再生促進作用(TOPCARE-AMI)，Circulation2002，1063009-17；B.E.Strauer等人，在人中通過自體冠狀動脈內單核骨髓細胞移植修復梗塞的心肌，Circulation 2002，1061913-8)。這類在患者中進行的自體細胞治療形式的細胞療法可顯著地改善局部和整個左心室的功能。
缺血性心臟病患者細胞療法成功的必要條件是被移植細胞尋靶并從而移入心臟的靶區域，尤其是當選擇血管內施用途徑時。雖然在缺血性心臟病患者和健康對照者中各種類型的骨髓干細胞和祖細胞如間充質和造血干細胞和祖細胞的數量是相似的，但不幸的是缺血性心臟病患者的干細胞和祖細胞的功能活性受損并且它們的尋靶能力降低。來自冠心病患者的干細胞和祖細胞的這種功能受損限制了它們在臨床細胞療法中的治療潛能。當使用血管內施用途徑時尤其如此，所述血管內施用途徑要求祖細胞逆化學引誘物梯度外滲以便進入并尋靶至缺血組織。干細胞和祖細胞的功能活性和尋靶能力可通過測定它們的集落形成能力或遷移活性來評價，例如響應于VEGF和SDF-1的集落形成能力或遷移活性。在進行細胞療法之前監測干細胞和祖細胞的遷移活性或集落形成活性可用作替代實驗以確定可從細胞療法中獲得更大利益的患者。另一方面，最近已有報道，由來自健康小鼠供體的全功能骨髓得到的EPC在新血管形成受損的鼠類模型中可恢復衰老宿主的心臟血管生成(J.M.Edelberg等人，年輕成年骨髓源內皮前體細胞可恢復衰老受損的心臟血管生成功能，Circ.Res.2002，90e89-e93)。因此，如果通過適宜的方法、例如通過在施用前進行藥理學或基因學操作能使缺血性心臟病患者的功能受損的干細胞和祖細胞的活性被恢復并從而使患者從細胞療法中獲得的益處增加將是有利的。
令人驚奇的是，現已發現缺血性心臟病患者的干細胞和祖細胞的受損的功能可通過與內皮氧化氮合酶轉錄增強劑一起進行孵育而被大大改善。在重新施用之前將患者的細胞用eNOS轉錄增強劑進行離體處理，由此產生的內皮氧化氮合酶表達增加可提高或恢復這些細胞的功能活性，這一點已經用遷移測定法(transmigration assay)在體外和用如下所述的鼠后肢缺血模型在體內得到了證實。在后者的模型中，通過血流量測定法測定了股動脈結扎后的新血管形成，并且已經發現如果將來自缺血性心臟病患者的干細胞和祖細胞用eNOS轉錄增強劑預處理后再進行施用，則有益作用大大增加。所觀察到的作用確實是由于內皮氧化氮合酶的活性提高所導致的，并且已經通過抵消已知為eNOS和NO形成抑制劑的NG-一甲基-L-精氨酸(L-NMMA)的作用證實了NO的形成。在存在eNOS轉錄增強劑和L-NMMA的條件下對來自缺血性心臟病患者的干細胞和祖細胞進行孵育不會導致功能活性提高。
因此，本發明的主題是內皮氧化氮合酶轉錄增強劑用于在缺血性心臟病患者的細胞療法中處理干細胞和/或祖細胞的用途，以及內皮氧化氮合酶轉錄增強劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于在缺血性心臟病患者的細胞療法中處理干細胞和/或祖細胞，和制備用于在缺血性心臟病患者的細胞療法中處理干細胞和/或祖細胞的藥物的方法，該方法包括使用內皮氧化氮合酶轉錄增強劑，以及在缺血性心臟病患者的細胞療法中處理干細胞和/或祖細胞的方法，該方法包括用內皮氧化氮合酶轉錄增強劑處理細胞。
內皮NO合酶(eNOS，NOS-III)屬于通過氧化精氨酸而產生信使分子氧化氮(NO)的三種同功酶組成的組。源于內皮的NO在許多關鍵的心血管機制中非常重要。它具有血管舒張作用，并且抑制血小板聚集、白細胞對內皮的粘附和內膜平滑肌細胞的增殖。內皮NO合酶在轉錄水平上和在轉錄后水平上均受到生理和病理生理調節。eNOS表達在內皮細胞中的上調是治療和預防包括心血管疾病如冠心病和動脈粥樣化形成在內的各種病癥的有效手段。增強eNOS轉錄的化合物在例如WO 02/064146、WO 02/064545、WO 02/064546和WO 02/064565中有描述。在這些參考文獻中沒有述及在缺血性心臟病患者的細胞療法中通過對干細胞和祖細胞進行離體處理而產生的對這類細胞功能的有益作用。關于eNOS對干細胞和祖細胞從骨髓移入循環系統中的重要性，近期已有報道(A.Aicher等人，內皮氧化氮合酶在干細胞和祖細胞移動中的重要作用，Nat.Med.2003；91370-1376)。
在本發明的一個優選實施方案中，使用了WO 02/064146、WO02/064545、WO 02/064546和WO 02/064565以及相應的專利文件如US2003/0008915、US 2003/0022935、US 2003/0022939和US 2003/0055093中所公開的eNOS轉錄增強劑，將這些文獻的內容引入本文作為參考。在本發明的一個更優選的實施方案中，使用了式I的eNOS轉錄增強劑， 其中n為1、2或3；R為苯基或Hetar基團，二者均是未被取代的或帶有1、2、3或4個相同或不同的取代基，所述取代基選自F；Cl；Br；C1-C3-烷基；C1-C3-烷氧基甲基；2-氨基-3，3，3-三氟丙基-；CF3；C3-C5-烷二基；苯基；雜芳基；芐基；雜芳基-甲基-；OH；C1-C3-烷氧基；苯氧基；三氟甲氧基；2，2，2-三氟乙氧基；(C1-C4-烷基)COO；(C1-C3-烷基)巰基；苯基巰基；(C1-C3-烷基)磺酰基；苯基磺酰基；NH2；(C1-C4-烷基)氨基；二(C1-C4-烷基)氨基；(C1-C3-烷基)-CONH-；(C1-C3-烷基)-SO2NH-；(C1-C3-烷基)-CO；苯基-CO；-OCH2O-；-OCF2O-；-CH2CH2O-；COO(C1-C4-烷基)；-CONH2；-CONH(C1-C4-烷基)；-CON(二(C1-C4-烷基))；CN；-SO2NH2；-SO2NH(C1-C4-烷基)；-SO2N(二(C1-C4-烷基))；吡咯烷基；哌啶基；嗎啉基；和硫代嗎啉基；其中任選地存在于所述苯基或所述Hetar基團的所述取代基中的所有雜芳基、苯基、含雜芳基和含苯基的基團是未被取代的或被1、2、3或4個相同或不同的選自F、Cl、Br、CN、C1-C3-烷基、OH、C1-C3-烷氧基和CF3的取代基取代；雜芳基和Hetar基團彼此獨立地為5-元至10-元的、芳族的、含有1、2、3或4個相同或不同的選自N、O和S的雜原子的單環或二環雜環；其為任何立體異構形式或它們任何比例的混合物，或其可藥用鹽。
如果在式I化合物中基團或取代基如例如苯基、雜芳基、烷基等可以出現多次，則它們都彼此獨立地具有所給出的含義，因此在每種情況下可以彼此相同或不同。一個實例為二(C1-C4-烷基)氨基，其中的烷基取代基可以相同或不同。
烷基殘基可以是直鏈的或支鏈的、非環狀的或環狀的。當它們為其它基團例如烷氧基、烷氧基羰基或氨基的一部分時或者當它們被取代時，這也是適用的。
烷基的實例有甲基、乙基、丙基、丁基、這些殘基的正異構體、異丙基、異丁基、仲丁基、叔丁基。本文中的術語烷基還特別包括含有至少三個碳原子的環烷基殘基和環烷基-烷基-殘基(被環烷基取代的烷基)。這類環烷基殘基的實例有環丙基和環丁基。環烷基可以被一個或多個相同或不同的(C1-C4)-烷基殘基、特別是甲基取代。此外，除非另有說明，否則本文的術語烷基也包括未被取代的烷基殘基以及被一個或多個、例如1、2、3或4個相同或不同的殘基例如苯基取代的烷基殘基。在被取代的烷基殘基例如苯基烷基中，取代基可以存在于任何所需的位置。
C3-C5-烷二基的實例有-CH2CH2CH2-、-CH2-CH(CH3)-、-CH2CH2CH2CH2-和-CH2CH2CH2CH2CH2-基團。
除非另有說明，否則上述的苯基殘基和包括雜芳基殘基在內的雜環基殘基可以是未被取代的或者可以帶有1、2、3或4個在以上定義中給出的取代基，所述取代基可以存在于任何所需的位置上。在單取代的苯基殘基中，取代基可以在2-位、3-位或4-位，在二取代的苯基殘基中，取代基可以在2，3-位、2，4-位、2，5-位、2，6-位、3，4-位或3，5-位。在三取代的苯基殘基中，取代基可以在2，3，4-位、2，3，5-位、2，3，6-位、2，4，5-位、2，4，6-位或3，4，5-位。在四取代的苯基殘基中，取代基可以在2，3，4，5-位、2，3，4，6-位或2，3，5，6-位。
除非另有說明，否則雜芳基殘基和雜環基殘基如Hetar基團優選衍生自含有1、2或3個相同或不同雜原子的雜環，更優選衍生自含有1或2個相同或不同雜原子的雜環。雜環基的環優選是5-元環、6-元環或7元環，更優選是5-元環或6-元環。可衍生得到式I化合物中出現的殘基的單環和二環雜環系統的實例有吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、吡唑、1，2，3-三唑、1，2，4-三唑、1，3-間二氧雜環戊烯、1，3-唑(＝唑)、1，2-唑(＝異唑)、1，3-噻唑(＝噻唑)、1，2-噻唑(＝異噻唑)、四唑、吡啶、噠嗪、嘧啶、吡嗪、吡喃、噻喃、1，4-二烯、1，2-嗪、1，3-嗪、1，4-嗪、1，2-噻嗪、1，3-噻嗪、1，4-噻嗪、1，2，3-三嗪、1，2，4-三嗪、1，3，5-三嗪、1，2，4，5-四嗪、氮雜、1，2-二氮雜、1，3-二氮雜、1，4-二氮雜、1，3-氧氮雜、1，3-硫氮雜、吲哚、苯并噻吩、苯并呋喃、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并間二氧雜環戊烯、喹啉、異喹啉、噌啉、喹唑啉、喹喔啉、酞嗪、噻吩并噻吩、1，8-萘啶和其它萘啶、喋啶或酚噻嗪，它們各自為飽和形式(全氫化形式)或為部分不飽和形式(例如二氫化形式或四氫化形式)或為最大不飽和形式，只要各個形式是已知的和穩定的并包含在化合物的定義內。本文所用的術語雜芳基包括其中兩個環均是芳族環的二環殘基以及其中只有一個環是芳族環的二環殘基。獨立地，這也適用于Hetar基團。適宜的雜環包括例如飽和的雜環吡咯烷、哌啶、嗎啉和硫代嗎啉。不飽和的雜環可以在環系統內包含例如1、2或3個雙鍵。5-元環和6-元環特別也可以是芳族環。
可由這些雜環衍生得到的取代基可以通過任何適宜的碳原子連接。由在環氮原子上帶有氫原子或取代基的氮雜環例如吡咯、咪唑、吡咯烷、嗎啉、哌嗪衍生得到的殘基也可以通過環氮原子連接，特別是當各雜環殘基與碳原子連接時。例如，噻吩殘基可以以2-噻吩基或3-噻吩基的形式存在，呋喃殘基可以以2-呋喃基或3-呋喃基的形式存在，吡啶殘基可以以2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基的形式存在，哌啶殘基可以以1-哌啶基(＝哌啶子基)、2-哌啶基、3-哌啶基或4-哌啶基的形式存在，(硫代)嗎啉殘基可以以2-(硫代)嗎啉基、3-(硫代)嗎啉基或4-(硫代)嗎啉基(＝硫代嗎啉代基)的形式存在。通過碳原子連接的由1，3-噻唑或咪唑衍生得到的殘基可以通過2-位、4-位或5-位連接。
如果雜環基是被取代的，它可以帶有1、2、3或4個相同或不同的取代基。雜環的取代基可以存在于任何所需的位置，例如在2-噻吩基或2-呋喃基中可存在于3-位和/或4-位和/或5-位，在3-噻吩基或3-呋喃基中可存在于2-位和/或4-位和/或5-位，在2-吡啶基中可存在于3-位和/或4-位和/或5-位和/或6-位，在3-吡啶基中可存在于2-位和/或4-位和/或5-位和/或6-位，在4-吡啶基中可存在于2-位和/或3-位和/或5-位和/或6-位。適宜的氮雜環也可以以N-氧化物或以含有衍生自可藥用酸的抗衡離子的四價鹽的形式存在。例如，吡啶基可以以吡啶-N-氧化物的形式存在。
本發明包括式I化合物的所有立體異構形式。式I化合物中存在的不對稱中心均可以彼此獨立地具有S構型或R構型。本發明包括所有可能的對映體和非對映體以及兩種或更多種立體異構體的混合物，例如對映體和/或非對映體的所有比例的混合物。因此，本發明所用的可以以對映體形式存在的化合物可以以對映體純的形式存在，既可以是左旋對映體也可以是右旋對映體；可以以外消旋物的形式存在；和可以以兩種對映體的所有比例的混合物形式存在。如果存在順/反異構現象，本發明包括順式和反式兩種形式以及這些形式的所有比例的混合物。所有這些形式均包括在本發明之內。如果需要，可以進行單個立體異構體的制備，制備方法有用常規方法例如色譜法或結晶法對混合物進行分離，使用立體化學結構相同的起始原料進行合成，或者進行立體選擇性合成。任選地，可以在分離立體異構體之前進行衍生化。立體異構體混合物的分離可以在式I化合物階段或在合成中的中間體階段進行。本發明也包括式I化合物的所有互變異構形式。
如果式I的化合物含有一個或多個酸性或堿性基團，則本發明還包括它們相應的藥學上或毒理學上可接受的鹽，特別是它們的可藥用鹽。因此，含有酸性基團的式I化合物可以以這些基團的形式存在，并且根據本發明，可以以例如堿金屬鹽、堿土金屬鹽或銨鹽的形式被使用。這類鹽的更具體的實例包括鈉鹽、鉀鹽、鈣鹽、鎂鹽或與氨或有機胺如乙胺、乙醇胺、三乙醇胺或氨基酸的鹽。根據本發明，含有一個或多個堿性基團、即可被質子化的基團的式I化合物可以以它們與無機或有機酸的加成鹽形式存在并且可以以該形式被使用。適宜的酸的實例包括鹽酸、氫溴酸、磷酸、硫酸、硝酸、甲磺酸、對甲苯磺酸、萘二磺酸、草酸、乙酸、酒石酸、乳酸、水楊酸、苯甲酸、甲酸、丙酸、新戊酸、二乙基乙酸、丙二酸、琥珀酸、庚二酸、富馬酸、馬來酸、蘋果酸、氨基磺酸、苯基丙酸、葡糖酸、抗壞血酸、異煙酸、檸檬酸、己二酸以及本領域技術人員已知的其它酸。如果式I化合物在分子中同時含有酸性或堿性基團，則除了所述的鹽形式外，本發明還包括內鹽或內銨鹽(兩性離子)。各個鹽可以通過本領域技術人員已知的常規方法由式I化合物制得，例如通過使它們與有機或無機酸或堿在溶劑或分散劑中接觸或通過與其它鹽進行陰離子交換或陽離子交換而制得。
本發明還包括式I化合物的溶劑合物例如水合物或與醇的加合物、式I化合物的活性代謝物、含有生理可耐受的和可裂解的基團的式I化合物的衍生物和前體藥物例如酯、酰胺以及式I中的N-H基團被N-烷基如N-甲基或被N-酰基如N-乙酰基或N-精氨酰基(包括在N-酰基中存在的官能團上所形成的可藥用鹽)代替的化合物的用途，條件是當在適于離體處理干細胞和祖細胞的條件下根據本發明進行使用時，它們表現出所需的活性。
特別優選地，本發明使用的式I化合物中的一個或多個變量具有以下給出的優選含義，所有優選含義的組合均為本發明的主題。對于所有優選的式I化合物，本發明還包括它們的所有立體異構形式和其所有比例的混合以及它們的可藥用鹽的用途。
n、即多亞甲基鏈(CH2)n中CH2基團的數量優選為1或3。在本發明的一個實施方案中，在所使用的式I化合物中n為1，即式R-COOH的酸的茚滿-2-基酰胺。在本發明的另一個實施方案中，在所使用的式I化合物中n為3，即式R-COOH的酸的6，7，8，9-四氫-5H-苯并環庚烯-6-基酰胺。
R優選選自4-氟苯基、4-氯苯基、4-溴苯基、4-(C1-C3-烷氧基)苯基、4-三氟甲氧基苯基、2-溴-4-氟苯基、2-氯-4-氟苯基、3，4-二甲基苯基、2，4-二甲基苯基、4-氯-2-甲基苯基、2-羥基-4-甲基苯基、2-羥基-4-乙氧基苯基、2-甲氧基-4-甲基苯基、4-苯氧基苯基、3-氟-4-甲基苯基、苯并[1，3]間二氧雜環戊烯-5-基、2，2-二氟苯并[1，3]間二氧雜環戊烯-5-基、2，3-二氫苯并呋喃-5-基、1-(4-氯苯基)-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基、1-(4-氟苯基)-3，5-二甲基-1H-吡唑-4-基、1H-苯并三唑-5-基、1H-吲哚-4-基、1H-吲哚-6-基、1-異丙基-2-三氟甲基-1H-苯并咪唑-5-基、1-甲基-3-氧代-1，2，3，4-四氫-喹喔啉-6-基、1-苯基-5-三氟甲基-1H-吡唑-4-基、2-(2-羥基吡啶-4-基)-1H-苯并咪唑-5-基、2-(4-氰基苯基)-1H-苯并咪唑-5-基、2，4-二甲基唑-5-基、2，4-二甲基嘧啶-5-基、2，4-二甲基噻唑-5-基、2，5-二甲基-1H-吡咯-3-基、2，5-二甲基-1-苯基-1H-吡咯-3-基、2，5-二甲基-1-吡啶-4-基甲基-1H-吡咯基、2，5-二甲基-2H-吡唑-3-基、2，6-二氯吡啶-3-基、2，6-二甲氧基吡啶-3-基、2，6-二甲基吡啶-3-基、2-氨基-4，6-二甲基吡啶-3-基、2-氨基-6-氯吡啶-3-基、2-氨基-吡啶-3-基、2-氯-6-甲基吡啶-3-基、2-氯吡啶-4-基、2-環丙基-4-甲基-噻唑-5-基、2-二甲基氨基-4-甲基-噻唑-5-基、2-二甲基氨基吡啶-4-基、2-乙基-5-甲基-2H-吡唑-3-基、2-羥基-6-甲基吡啶-3-基、2-甲基-1H-苯并咪唑-5-基、2-甲基-3H-苯并咪唑-5-基、2-甲基吡啶-3-基、2-甲基-6-三氟甲基吡啶-3-基、2-甲基噻唑-5-基、2-(嗎啉-4-基)吡啶-4-基、2-(嗎啉-4-基)嘧啶-5-基、2-(吡咯烷-1-基)吡啶-4-基、3，5-二甲基-1H-吡唑-4-基、3-氨基-5，6-二甲基吡嗪-2-基、3-氨基-5-甲基吡嗪-2-基、3-氨基吡嗪-2-基、3-二甲基氨基-4-甲基苯基、3-二甲基氨基苯基、3H-苯并咪唑-5-基、1H-苯并咪唑-5-基、3-甲磺酰基氨基-2-甲基苯基、3-甲磺酰基氨基苯基、3-甲基-異唑-4-基、3-(嗎啉-4-基)苯基、3-(哌啶-1-基)苯基、3-(吡咯烷-1-基)苯基、4-(2，2，2-三氟乙氧基)苯基、4，6-二甲基吡啶-3-基、4-氨基-2-乙硫基嘧啶-5-基、4-氨基-2-甲基嘧啶-5-基、4-氯-3-甲磺酰基氨基-苯基、4-氯-3-氨磺酰基苯基、4-甲基-3-甲基氨基苯基、4-甲基噻唑-5-基、吡啶-2-基、5，6，7，8-四氫喹啉-3-基、5-氨基-1-苯基-1H-吡唑-4-基、5-甲磺酰基-2-甲基苯基、5-甲基-1-苯基-1H-吡唑-4-基、5-甲基異唑-3-基、5-甲基吡啶-3-基、5-甲基吡嗪-2-基、6-氯吡啶-3-基、6-氰基吡啶-3-基、6-二甲基氨基吡啶-3-基、6-乙炔基吡啶-3-基、6-甲氧基甲基吡啶-3-基、6-甲氧基吡啶-3-基、6-甲基-2-甲基氨基吡啶-3-基、6-甲基氨基吡嗪-2-基、6-甲基吡啶-3-基、6-(嗎啉-4-基)吡啶-3-基、6-(吡咯烷-1-基)吡啶-3-基、咪唑并[1，2-a]吡啶-2-基、6-三氟甲基吡啶-3-基和嘧啶-4-基。
雜芳基優選為5-元至10-元地、芳族的、含有1、2或3個、更優選1或2個相同或不同的選自N、O和S的雜原子的單環或二環雜環。雜芳基最優選選自呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、異噻唑基、唑基、異唑基、吡唑基、咪唑基、噠嗪基、吡嗪基、吡啶基、嘧啶基、苯并間二氧雜環戊烯基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、喹啉基、異喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基和吲唑基。
Hetar基團優選為5-元至10-元的、芳族的、含有1、2或3個、更優選1或2個相同或不同的選自N、O和S的雜原子的單環或二環雜環。Hetar基團最優選選自呋喃基、吡咯基、噻吩基、噻唑基、異噻唑基、唑基、異唑基、吡唑基、咪唑基、噠嗪基、吡嗪基、吡啶基、嘧啶基、苯并間二氧雜環戊烯基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并唑基、喹啉基、異喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、吲哚基、苯并呋喃基、苯并噻吩基和吲唑基。
在本發明的一個尤其優選的實施方案中，以其任何立體異構形式或它們的任何比例的混合物或其可藥用鹽的形式使用式I化合物，在所述的式I化合物中n的數值為1，且基團R具有上述R優選選自其中的各含義中的一種。在本發明另一個尤其優選的實施方案中，以其任何立體異構形式或它們的任何比例的混合物或其可藥用鹽的形式使用式I化合物，在所述的式I化合物中n的數值為3，且基團R具有上述R優選選自其中的各含義中的一種。這類尤其優選的式I化合物的實例有4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺和2，2-二氟苯并[1，3]間二氧雜環戊烯-5-甲酸茚滿-2-基酰胺。
本發明所用的化合物、特別是式I化合物和它們的前體可以用文獻中所述的或與本領域技術人員已知的方法相類似的方法合成。例如，式I化合物可以由式R-COOH的各個酸或其衍生物和各個胺通過形成酰胺鍵而合成。為了達到此目的，可以將各個胺溶解在惰性溶劑例如水、異丙醇、二氯甲烷、四氫呋喃、甲苯或二烷中，并且在存在堿如例如三乙胺或氫氧化鈉的條件下與適當的羧酸衍生物例如酰氯反應，例如在室溫下反應。式I化合物也可以通過使各個胺與各個酸在存在堿如例如二異丙基乙基胺和適當偶聯試劑如例如碳二亞胺如二環己基碳二亞胺或TOTU的條件下在惰性溶劑如例如四氫呋喃、二烷或二甲基甲酰胺中進行偶聯反應、例如在室溫下進行偶聯反應而得到。如果需要，然后可將獲得的酰胺官能化以獲得其它化合物。合成式I化合物的所有反應本身均是本領域技術人員所公知的，所述反應可在文獻中描述的標準條件下或者根據與文獻中所述的方法相類似的方法來進行，所述文獻例如Houben-Weyl，Methoden derOrganischen Chemie(有機化學方法)，Thieme-Verlag，Stuttgart，或Organic Reaction，John Wiley & Sons，紐約。根據個例的情況，為了避免式I化合物合成中的副反應，通過引入保護基臨時性地阻斷官能團并在合成的后期階段將它們去保護或者以前體基團的形式引入官能團、例如氨基的前體硝基并在后期的反應步驟中將其轉化成所需的官能團可能是必需的或有利的。在個例中適用的這類合成策略和保護基以及前體基團是本領域技術人員所公知的。如果需要，可以通過常規的純化方法例如重結晶法或色譜法對式I化合物進行純化。用于制備式I化合物的起始化合物可商購獲得或者可根據文獻中的方法或與之類似的方法制備。
用本發明的eNOS轉錄增強劑處理的成人干細胞和祖細胞的分離和進一步處理可根據文獻中所述的標準方法或與文獻中所述方法相類似的方法進行，所述方法是本領域技術人員已知的。所采用的細胞可由患者的骨髓獲得，所述骨髓是通過常規抽吸法獲取的，因此所采用的細胞可以是骨髓干細胞和祖細胞或源于骨髓的干細胞和祖細胞。用常規方法對骨髓進行處理，所述方法可包括用密度梯度離心法進行分級以分離出單核細胞。洗滌后，將細胞混懸在常規的細胞培養基中，例如可商購獲得的X-Vivo培養基(Cambrex，East Rutherford，New Jersey，USA)，所述培養基是不含血清的培養基，適合用于人。作為細胞可混懸于其中以備將來進行處理、適合用于實驗研究的另一種細胞培養基，可提及的是可商購獲得的RPMI 1640培養基(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)。一般而言，所獲得的細胞混懸液由包括造血祖細胞在內的不同細胞群組成。可以將獲得的細胞混懸液定性，例如通過標準技術如流式細胞術分析使用常規抗體鑒別造血和間充質干細胞和祖細胞群。細胞的功能活性可以例如用集落形成單位測定法或通過測定它們響應于VEGF或SDF-1的遷移能力來評價，所述方法在上文中有提及并且在下文中有更詳細的描述。細胞混懸液含有為內皮祖細胞或可發育為內皮祖細胞的細胞，而內皮祖細胞又可發育成內皮細胞并導致新血管的形成，即促進梗塞區域的新血管形成。除了來自骨髓外，本發明所用的祖細胞也可用類似方法例如由患者的脂肪組織或循環血獲得，從而分別得到源于脂肪組織或源于循環血的祖細胞。由血液獲得的細胞群通常在重新施用前離體培養數天。由于體循環中存在的內皮祖細胞源于骨髓細胞，所以諸如“源于骨髓的”等術語可恰當地用來表示由患者的骨髓獲得的細胞以及由采集的血液獲得的細胞。
可以在細胞培養的標準條件下對所獲得的缺血性心臟病患者的干細胞和祖細胞的混懸液進行離體處理以改善它們的受損的功能活性和尋靶能力并因此在重新施用后改善新血管形成。細胞在混懸液中的濃度可以為約100000個/毫升至約5000000個/毫升，例如約1000000個/毫升，所述混懸液可以是在適宜培養基如X-Vivo中的混懸液，所述培養基是完全配方，不需要加入其它物質。在用eNOS表達增強劑進行的處理中所用培養基的pH一般為約6.5至約7.5，特別是約6.8至約7.3，整個細胞處理過程中的pH也是如此。將細胞混懸液與eNOS轉錄增強劑在適宜的可藥用溶劑中的溶液混合，所述溶劑例如水或有機溶劑如醇例如乙醇或聚二醇(polyglycol)如聚丙二醇或二甲亞砜或這類溶劑的混合物。eNOS轉錄增強劑的溶液也可以含有可藥用的助劑，如鹽、緩沖物質或增溶劑。eNOS轉錄增強劑在所得混合物中的濃度一般為約1nM至約1mM，特別是約0.1μM至約100μM，例如約1μM至約10μM，如約5μM。然后，將混合物例如在無菌條件下、于通常為約37℃的溫度下、在可以由含約5％二氧化碳的空氣組成的潮濕氣氛中進行孵育。孵育時間取決于個例的情況，例如所采用的eNOS轉錄增強劑的有效性。一般而言，孵育時間為約6小時至約48小時，例如約12小時至約24小時，如約18小時。如果本發明使用的是由循環血獲得的祖細胞，則在上述的通常用這類細胞進行的培養中可實施與eNOS轉錄增強劑一起進行的孵育。可將獲得的混合物不經后處理直接施用于患者，因為所含有的eNOS轉錄增強劑是一種在體內也發揮有益作用的藥用物質。或者，可以將經處理的細胞首先通過離心法從獲得的混合物中分離出來、洗滌例如用緩沖液洗滌、重新混懸例如重新混懸在培養基如X-Vivo中，并且將該混懸液施用于患者。
本發明的另一個主題是前述的通過用eNOS轉錄增強劑進行處理來制備具有提高的功能活性的干細胞和/或祖細胞的方法，即，制備具有提高的功能活性的干細胞和祖細胞的方法，其包括用內皮氧化氮合酶的轉錄增強劑處理來自缺血性心臟病患者的干細胞和祖細胞。本發明的主題還有用于在缺血性心臟病患者的細胞療法中處理干細胞和祖細胞的藥物(或藥物組合物或藥物制劑)，其包含eNOS轉錄增強劑，例如式I化合物和/或其可藥用鹽，以及任選地一種或多種助劑，如鹽或緩沖物質或增溶劑；用于這類處理的套藥盒和套藥包，其含有所述藥物以及用于這類用途的其它物品，例如用于溶解固態eNOS轉錄增強劑的適宜溶劑或介質和使用說明書。所述藥物可以例如包含置于瓶、安瓿或小瓶中的固態eNOS轉錄增強劑，然后在將eNOS轉錄增強劑加入細胞混懸液中之前將其溶解；或包含可直接加入細胞混懸液中的eNOS轉錄增強劑溶液。
用eNOS轉錄增強劑處理后獲得的干細胞和/或祖細胞的混懸液可以例如通過靜脈內注射或輸注施用于患者，或者通過心肌內注射或冠脈內注射或輸注直接施用入心臟或靠近心臟的血管。直接施用入梗塞的心肌或冠脈血管的施用可在手術過程中進行或通過導管插入法進行，其在下文有更詳細的描述。合適的施用方法是本領域中已有的并且是本領域技術人員所公知的。
本文所用的術語“缺血性心臟病”應理解為包括其中心肌的一個或多個區域出現或已經出現供血不足或其中醫生希望改善新血管形成或新血管生成的任何心臟病，包括的疾病有例如冠心病、冠狀動脈病、急性冠狀動脈綜合征、心絞痛、心肌梗塞、缺血性心肌病和充血性心力衰竭，后者可以是由于缺血而導致的。可根據本發明治療的缺血性心臟病可以是急性或慢性疾病。
實施例eNOS轉錄增強劑的合成4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺將43.70g(258mmol)鹽酸2-氨基茚滿和53.43g(528mmol)三乙胺加入250ml四氫呋喃中，加入42.89g(270mmol)4-氟苯甲酰氯，將該混合物在室溫下攪拌2小時。然后，將所得的混合物倒在冰/HCl混合物上，過濾獲得的沉淀物，將其用NaHCO3溶液和水洗滌并真空干燥。使粗產物從甲醇中結晶。產率47.8g(73％)白色晶體。
熔點167℃質譜256.1[M+H+]1H-NMR譜(300MHz，d6-DMSO)2.96(dd，2H，H1/3)，3.25(dd，2H，H3/1)，4.70(六重峰，1H，H2)，7.12-7.19(m，2H，H4，7/5，6)，7.20-7.28(m，2H，H5，6/4，7)，7.30(t，2H，H3′，5′)，7.95(dd，2H，H2′，6′)，8.68(d，1H，NH)根據諸如以下舉例性的通用方法A、B和C等方法合成了其它式I化合物。
方法A將0.5mmol(96mg)1-乙基-3-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亞胺鹽酸鹽和0.5mmol(87μl)二異丙基乙基胺(DIPEA)溶解在2.5ml二氯甲烷(DCM)中，將其加入0.5mmol各個酸在2.5ml DCM中的溶液中，在室溫下攪拌10分鐘。然后，加入0.7mmol各個胺并繼續攪拌過夜。然后，將所得的溶液用2N HCl洗滌2次，用飽和KHCO3溶液洗滌1次，用MgSO4干燥并過濾。將蒸發至干后所獲得的殘余物用乙酸乙酯/己烷或甲醇/乙醚混合物進行結晶或用HPLC法進行純化。
方法B向在5ml四氫呋喃中的0.75mmol各個酸和271μl(1.575mmol)DIPEA中加入271mg(0.825mmol)O-[(氰基-乙氧基羰基-亞甲基)氨基]-N，N，N′，N′-四甲基脲四氟硼酸鹽(TOTU)(溶解在1ml二甲基甲酰胺(DMF)中)。在室溫下攪拌15分鐘后，加入0.9mmol各個胺的鹽酸鹽和172μl(1mmol)DIPEA在1ml DMF中的混合物。攪拌6小時后，將混合物過濾并蒸發。將殘余物用乙酸乙酯吸收并相繼用20ml 1N HCl和20ml 5％碳酸氫鈉溶液洗滌。將所得的有機相蒸發并用制備型HPLC純化(RP 18，乙睛/水)。
方法C將2.5mmol各個胺與550mg三乙胺和5ml二烷混合，然后加入2.5mmol各個酰氯，將該混合物在室溫下攪拌2小時。然后，將所得的混合物倒在冰/HCl混合物上，將獲得的沉淀物用乙酸乙酯萃取，用硫酸鈉干燥并濃縮。將如此獲得的殘余物用制備型HPLC進行分級分離。
以下提及的是所制得的化合物的一個實例。
2，2-二氟苯并[1，3]間二氧雜環戊烯-5-甲酸茚滿-2-基酰胺熔點147.5℃質譜318.2[M+H+]1H-HMR譜(400MHz，d6-DMSO)2.91-2.99(m，2H，H-1/H-3)，3.22-3.30(m，2H，H-3/H-1)，4.69(六重峰，1H，H-2)，7.13-7.19(m，2H，H-4，H-7或H-5，H-6)，7.21-7.28(m，2H，H-4，H-7或H-5，H-6)，7.50(d，1H，H-6′/H7′)，7.80(d，1H，H-7′/H6)，7.88(s，1H，H4’)，8.71(d，1H，NH)。
eNOS轉錄活化的測定eNOS轉錄的活化如Li等人，蛋白激酶Cα和/或ε的活化增強人內皮氧化氮合酶基因的轉錄，Mol.Pharmacol.1998，53630-637中所詳細描述的那樣進行測定。簡言之，將eNOS基因的起始密碼子的3.5kB長的片段5’進行克隆、測序并克隆在螢火蟲螢光素酶表達質粒中以通過報道基因活性來監測eNOS啟動子的活化。在化合物測定中使用被穩定轉染并表達該啟動子報道基因構建體的人內皮細胞系。將細胞與化合物一起孵育18小時。所有化合物均事先被溶解在無菌二甲亞砜(DMSO)中。使DMSO在完全培養基中的終濃度為0.5％。根據生產商的說明書用標準螢光素酶測定系統(Promega，Madison，Wisconsin，USA；目錄號E150)測定這些細胞中報道基因表達的誘導。將與化合物一起孵育的細胞中的螢光素酶誘導與只與溶劑一起孵育的細胞中的螢光素酶誘導進行比較。將兩者活性的比值(轉染誘導比，TIR)作為化合物濃度的函數進行作圖。通常，在低濃度下TIR值從比值1開始，這表明化合物沒有作用，TIR值不斷升高至最大值TIR(max)，這表明eNOS轉錄增加。作為化合物濃度的函數，用作圖法確定轉錄誘導比的EC50值。
骨髓細胞的分離由年齡為18至75歲的共計9名健康對照者和25名患有穩定冠心病和有心肌梗塞史的患者采集骨髓抽出物。患者必須具有局部室壁運動異常、開放的天然血管、冠狀動脈旁路移植物或副動脈。由于已知心肌缺血使源自骨髓的祖細胞發生移動，所以在過去4周中發生過誘導性或靜息性心肌缺血的患者被排除在外。其它的排除標準還有存在活動性或慢性感染、在過去兩個月內進行過手術或有過創傷、有惡性疾病的跡象、存在活動性胃腸道出血、超過160/100mm Hg的不可控的高血壓、在過去兩年內發生過中風、AV-動脈瘤、腎或肝功能不全、血小板計數＜100000/μ的血小板減少、血紅蛋白＜8.5g/dl的貧血、精神發育遲緩、參加了另一個臨床試驗或不愿參加本試驗。妊娠和絕經前婦女也被排除在外。德國法蘭克福JohannWolfgang Goethe大學醫院的倫理委員會批準了本研究方案，并且本研究按照赫爾辛基宣言進行。獲得了每名患者的書面知情同意。
由每名參加者獲得共計50ml骨髓抽出物。通過密度梯度離心法分離出骨髓干細胞和祖細胞。在兩步洗滌后，將細胞重新混懸在10ml X-vivo 10培養基(無慶大霉素和酚紅；Cambrex，East Rutherford，New Jersey，USA)中。細胞混懸液由包括造血祖細胞在內的不同細胞群組成。
將骨髓干細胞和祖細胞用流式細胞術進行分析。對于造血和間充質干細胞和祖細胞群的鑒別而言，使用直接軛合的針對人CD45(BectonDiclinson，Franklin Lakes，New Jersey，USA)、CD34(FITC-標記的；BDPharmingen，San Diego，California，USA)、CD133(APC-標記的；BDPharmingen)、CD14(FITC-標記的；BD Pharmingen)、CXCR4(APC-標記的，BD Pharmingen)和CD49d(APC-標記的；BD Pharmingen)的抗體。Lineage panel從BD Pharmingen獲得(含有FITC-標記的CD3、CD14、CD16、CD19、CD20和CD56)并通過另外使用直接FITC軛合的針對CD15的抗體和血型糖蛋白A(均來自BD Pharmingen)來完成。
用eNOS轉錄增強劑進行的骨髓細胞的處理對于與eNOS轉錄增強劑4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺一起進行的孵育而言，將1ml 1000000個干細胞和祖細胞在1ml X-Vivo 10細胞培養基中的混懸液與1μl 4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺在二甲亞砜(DMSO)中的溶液混合，所述溶液是通過將1.275mg 4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺溶解在1mlDMSO中制得的。4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺在所得混合物中的濃度為5μM。對于與eNOS轉錄增強劑4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺和eNOS抑制劑NG-一甲基-L-精氨酸(L-NMMA)一起進行的孵育而言，除了4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺以外，還向細胞混懸液中加入L-NMMA(Sigma，St.Louis，Missouri，USA)，從而得到4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺濃度為5μM且L-NMMA濃度為1mM的混合物。所述孵育在37℃的溫度下、于含有5％二氧化碳空氣的氣氛下進行18小時。將細胞通過離心法進行分離、用PBS洗滌兩次并重新混懸在X-Vivo 10中。
骨髓細胞的功能活性的測定為了評價集落形成活性，將骨髓干細胞和祖細胞(1×105/皿)接種在甲基纖維素板中(包含干細胞因子、粒細胞集落刺激因子、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子、白介素-3、白介素-6的Methocult GF H4535；CellSystems，St.Katharinen，德國)。將所述板用相差顯微鏡術進行研究，孵育14天后，對集落形成單位粒細胞-巨噬細胞(CFU-GM；集落＞50個細胞)進行計數。
為了評價骨髓干細胞和祖細胞的遷移能力，將共計1×106個骨髓干細胞和祖細胞重新混懸在250μl X-Vivo 10中并將其置于充滿基質膠(BioCoat侵入測定法，孔徑8μm，Becton Dickinson Labware，Two Oak Park，Bedford，Massachusetts，USA)的改良Boyden室的上側室中。然后，將所述室放在24-孔培養皿中，所述培養皿中含有500μl內皮基礎培養基(EBM)，其補充有磷酸緩沖鹽水(PBS)、50ng/ml VEGF或100ng/ml SDF-1。在37℃下孵育24小時后，對遷移的細胞進行計數。
體內小鼠后肢缺血模型用體重為18至22g的8至10周齡無胸腺NMRI裸鼠(The JacksonLaboratory，Bar Harbor，Maine，USA)在鼠后肢缺血模型中研究了骨髓干細胞和祖細胞的新血管形成能力。用7-0號絲質縫合線結扎股動脈的近端部分(包括淺表和深部分支)以及隱動脈的遠端部分。用電凝固器阻塞結扎之間的所有動脈分支。用三個手術用U形針將上覆的皮膚閉合。24小時后，靜脈內注射骨髓干細胞和祖細胞在X-Vivo 10中的混懸液(5×104、5×105或5×106個細胞/小鼠；n＝5/組)。兩周后測定肢的灌注。具體地，用激光多普勒血流測定儀(Laser Doppler Perfusion Imager System，MoorLDI-Mark 2，Moor Instruments，Wilmington，Delaware，USA)測定缺血(右)肢/正常(左)肢的血流比。開始掃描前，將小鼠放在37℃的加熱板上以將溫度變化減至最小。在兩次記錄激光多普勒彩色圖像后，根據彩色的直方圖象素計算缺血和非缺血肢的平均灌注。為了將包括環境光和溫度在內的變量減至最小，將所計算的灌注以缺血與非缺血后肢灌注之比來表示。
對于組織學評價，用缺血和非缺血肢的內收肌和半膜肌的5μm冷凍切片測定組織的血管形成。將內皮細胞用直接針對CD146的FITC-標記的單克隆抗體(Chemicon，Temecula，California，USA)染色。以毛細血管/肌細胞的數量來表示毛細血管密度。通過用HLA-DR-APC-標記的抗體(BDPharmingen，San Diego，California，USA)和CD146-FITC-標記的抗體進行共染色來鑒別人骨髓干細胞和祖細胞。
將骨髓細胞施用于患者用eNOS轉錄增強劑處理的骨髓細胞對患者的施用可通過以下關于祖細胞移植的導管插入法來進行。將一個尺寸大0.5mm的over-the-wire球囊導管推入預先植入的支架中。為了使注入的細胞通過內皮進行粘附和可能的遷移，將球囊低壓膨脹至完全阻斷血流3分鐘，同時將3.3ml祖細胞混懸液通過球囊導管的中心通路從遠端注入阻塞球囊。將該操作重復3次以便可注入總計10ml的祖細胞混懸液，操作之間通過將球囊放氣使血液回流3分鐘，以將廣泛缺血減至最低。在冠脈內細胞移植完成后，重復進行冠脈血管造影，以確定血管開放并且無造影劑滯留。
用標準方法進行統計學分析。除非另有說明，否則連續變量的結果用均值±標準差表示。對于有兩個以上亞組的實驗，用t檢驗(雙側)或方差分析對組間比較進行分析。用帶有Bonferroni調整的t檢驗(雙側)進行Posthoc范圍檢驗和兩兩多重比較。通過Pearson χ2檢驗產生類變量比較。在對骨髓干細胞和祖細胞的體外特性進行盲法評價后，將檢驗結果與來自體內研究的結果合并。為了確定骨髓干細胞和祖細胞在體外新血管形式方面的體外決定因素，進行多變量線性回歸分析。P值＜0.05被認為具有統計學意義。所有分析均用SPSS 11.5(SPSS Inc.，Chicago，Illinois，USA)進行。
獲得了以下結果。
eNOS轉錄活化的測定化合物4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺在螢光素酶測定中對eNOS轉錄的活化表現出的EC50值為0.8μM，TIR(max)值為4.10。
化合物2，2-二氟苯并[1，3]間二氧雜環戊烯-5-甲酸茚滿-2-基酰胺在螢光素酶測定中對eNOS轉錄的活化表現出的EC50值為0.14μM，TIR(max)值為2.7。
骨髓細胞的功能活性的測定來自患者的骨髓干細胞和祖細胞的集落形成活性為37.3±25.0CFU-GM/皿，而來自健康對照者的所述細胞的集落形成活性為113.8±70.4CFU-GM/皿(P＝0.009)。
來自患者的骨髓干細胞和祖細胞對VEGF的遷移響應為34.0±24.2×1000個遷移細胞，而來自健康對照者的所述細胞對VEGF的遷移響應為54.8±29.3×1000個遷移細胞(P＝0.027)。
來自患者的骨髓干細胞和祖細胞對SDF-1的遷移響應為46.3±26.2×1000個遷移細胞，而來自健康對照者的所述細胞對SDF-1的遷移響應為108.6±40.4×1000個遷移細胞(P＜0.001)。
來自健康對照者的骨髓干細胞和祖細胞在用PBS處理18小時后對SDF-1的遷移響應為126.53±41.7×1000個遷移細胞，而來自健康對照者的所述細胞在用4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺(5μM)處理18小時后對SDF-1的遷移響應為111.2±38.5×1000個遷移細胞(P＜0.01)。
來自患者的骨髓干細胞和祖細胞在用PBS處理18小時后對SDF-1的遷移響應為38.0±13.7×1000個遷移細胞，而來自患者的所述細胞在用4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺(5μM)處理18小時后對SDF-1的遷移響應為74.0±20.7×1000個遷移細胞(P＜0.01)。
來自患者的骨髓干細胞和祖細胞在用4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺(5μM)和NG-一甲基-L-精氨酸(L-NMMA)(1mM)處理18小時后對SDF-1的遷移響應為23.9±7.4×1000個遷移細胞，而來自健康對照者的所述細胞在用4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺(5μM)處理18小時后對SDF-1的遷移響應為74.3±21.5×1000個遷移細胞(P＜0.01)。
體內小鼠后肢缺血模型在5×105個細胞/小鼠的濃度下比較干細胞和祖細胞的作用，在該濃度下來自健康對照者的骨髓干細胞和祖細胞達到最大治療作用。
在各個試驗組中，在如所述的那樣施用骨髓干細胞和祖細胞后，用激光-多普勒血流測定儀測得了以下的相對血流值(以百分比表示的缺血(右)肢/正常(左)肢的血流比)。
無細胞 21.9±10.8％n＝11來自健康對照者的細胞72.7±18.7％n＝24來自患者的細胞，未經處理40.7±12.2％n＝24來自患者的細胞，用5μM 4-氟-N-(茚滿-2- n＝24基)苯甲酰胺處理18小時 59.1±11.6％*來自患者的細胞，用5μM 4-氟-N-(茚滿-2- n＝18基)苯甲酰胺和1mM的L-NMMA處理18小時39.7±10.3％*與來自患者的未經處理的細胞相比，P＜0.001。
權利要求
1.內皮氧化氮合酶轉錄增強劑在制備藥物中的用途，所述藥物用于在缺血性心臟病患者的細胞療法中處理干細胞和/或祖細胞。
2.根據權利要求1所述的用途，其中內皮氧化氮合酶轉錄增強劑是式I的化合物， 其中n為1、2或3；R為苯基或Hetar基團，二者均是未被取代的或帶有1、2、3或4個相同或不同的取代基，所述取代基選自F；Cl；Br；C1-C3-烷基；C1-C3-烷氧基甲基；2-氨基-3，3，3-三氟丙基-；CF3；C3-C5-烷二基；苯基；雜芳基；芐基；雜芳基-甲基-；OH；C1-C3-烷氧基；苯氧基；三氟甲氧基；2，2，2-三氟乙氧基；(C1-C4-烷基)COO；(C1-C3-烷基)巰基；苯基巰基；(C1-C3-烷基)磺酰基；苯基磺酰基；NH2；(C1-C4-烷基)氨基；二(C1-C4-烷基)氨基；(C1-C3-烷基)-CONH-；(C1-C3-烷基)-SO2NH-；(C1-C3-烷基)-CO；苯基-CO；-OCH2O-；-OCF2O-；-CH2CH2O-；COO(C1-C4-烷基)；-CONH2；-CONH(C1-C4-烷基)；-CON(二(C1-C4-烷基))；CN；-SO2NH2；-SO2NH(C1-C4-烷基)；-SO2N(二(C1-C4-烷基))；吡咯烷基；哌啶基；嗎啉基；和硫代嗎啉基；其中任選地存在于所述苯基或所述Hetar基團的所述取代基中的所有雜芳基、苯基、含雜芳基和含苯基的基團是未被取代的或被1、2、3或4個相同或不同的選自F、Cl、Br、CN、C1-C3-烷基、OH、C1-C3-烷氧基和CF3的取代基取代；雜芳基和Hetar基團彼此獨立地為5-元至10-元的、芳族的、含有1、2、3或4個相同或不同的選自N、O和S的雜原子的單環或二環雜環；其為任何立體異構形式或它們任何比例的混合物，或其可藥用鹽。
3.根據權利要求1和/或權利要求2所述的用途，其中內皮氧化氮合酶轉錄增強劑選自4-氟-N-(茚滿-2-基)苯甲酰胺和2，2-二氟苯并[1，3]間二氧雜環戊烯-5-甲酸茚滿-2-基酰胺。
4.根據權利要求1至3中一項或多項所述的用途，其中干細胞和/或祖細胞是由患者的骨髓獲得的。
5.根據權利要求1至4中一項或多項所述的用途，其中干細胞和/或祖細胞被與內皮氧化氮合酶轉錄增強劑一起孵育6小時至48小時。
6.根據權利要求1至5中一項或多項所述的用途，其中缺血性心臟病是冠心病、冠狀動脈病、急性冠狀動脈綜合征、心絞痛、心肌梗塞、缺血性心肌病或充血性心力衰竭。
7.根據權利要求1至6中一項或多項所述的用途，其中經處理的干細胞和/或祖細胞被通過靜脈內、冠脈內或心肌內注射或輸注施用于患者。
8.制備用于在缺血性心臟病患者的細胞療法中處理干細胞和/或祖細胞的藥物的方法，所述方法包括使用內皮氧化氮合酶轉錄增強劑。
9.制備具有提高的功能活性的干細胞和/或祖細胞的方法，所述方法包括用內皮氧化氮合酶轉錄增強劑處理來自缺血性心臟病患者的干細胞和/或祖細胞。
10.用于在缺血性心臟病患者的細胞療法中處理干細胞和/或祖細胞的藥物，其包含內皮氧化氮合酶轉錄增強劑。
全文摘要
本發明涉及增強內皮氧化氮合酶(eNOS)轉錄的化合物用于在患有缺血性心臟病如冠心病或缺血性心肌病的患者的細胞療法中處理干細胞和祖細胞的用途。在施用之前將這類從骨髓中分離得到的細胞例如用eNOS轉錄增強劑進行處理可提高它們的功能活性并改善心臟的新血管形成和心臟再生。
文檔編號A61P9/10GK1878544SQ200480032846
公開日2006年12月13日 申請日期2004年10月22日 優先權日2003年11月6日
發明者A·蔡赫爾, S·迪梅勒, C·黑申, H·呂滕 申請人:塞諾菲-安萬特德國有限公司