減毒痘苗病毒天壇株載體及制備方法和應用的制作方法

專利名稱：減毒痘苗病毒天壇株載體及制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種減毒痘苗病毒天壇株載體，它衍生于痘苗病毒天壇株，它的特征是失去或降低了在動物細胞中的繁殖復制能力，減少了對細胞的毒性；在動物體內顯示了高度減毒的特性，尤其是痘苗病毒特有的神經毒性急劇下降。本發明同時還涉及減毒痘苗病毒天壇株載體的制備方法。本發明的高度減毒痘苗病毒載體將比野生痘苗病毒天壇株具有更高的安全性，可用于構建人或動物的活病毒載體疫苗；該減毒痘苗病毒載體還可進一步用于研制腫瘤基因治療或預防的藥物；或用作外源基因的表達載體，大規模生產目的蛋白；或用于表達外源病原體抗原制備病原體檢測和診斷試劑。
背景技術：
痘苗病毒(Vaccinia Virus)屬于痘病毒科正粘病毒屬，曾被用作預防天花感染的疫苗而在世界范圍內得到廣泛應用，使得天花成為第一個被人類完全滅絕的惡性傳染病(Riva，G.et al.，1979.A milestone in the history of mankind.Eradication of smallpox.MMW Munch Med Wochenschr，121(50)，1669-70)。近二十年來，隨著基因工程技術的快速發展，痘苗病毒被用于研究設計基因表達載體，或用于重組活病毒疫苗的研究(Moss，B.1996.Genetically engineeredpoxviruses for recombinant gene expression，vaccination，and safety.ProcNatl Acad Sci USA 93(21)，11341-8；Paoletti，E.et al.，1996.Applications ofpox virus vectors to vaccinationan update.Proc Natl Acad Sci USA 93(21)，11349-53)。已有多種重組痘苗病毒疫苗可以成功地表達狂犬病毒、日本腦炎病毒等病毒的抗原并用于動物傳染病的防治(Kieny，M.P.et al.，1984.Expressionof rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus Nature312(5990)，163-6；Konishi，E.et al.，1992.A highly attenuated hostrange-restricted vaccinia virus strain，NYVAC，encoding the prM，E，and NS1genes of Japanese encephalitis virus prevents JEV viremia in swine.Virology190(1)，454-8)。人用重組活病毒疫苗也取得許多重要進展，已對包括麻疹、EBV、HAV、HBV、HPV、HIV及狂犬病毒等進行了初步的人體免疫觀察(郭斐等，2001，非復制重組痘苗病毒天壇株C-K缺失區表達載體的構建及重組病毒生物學性狀的研究。病毒學報17(1)，24-28；McMichael，A.et al.，2002.The quest for anAIDS vaccineis the CD8+ T-cell approach feasible？Nat Rev Immunol 2(4)，283-91；Moss，B.1996.Genetically engineered poxviruses for recombinantgene expression，vaccination，and safety.Proc Natl Acad Sci USA 93(21)，11341-8；Zhu，J.H.et at.，1996.Immunogenicity and relative attenuation ofdifferent vaccinia-rabies virus recombinants.Arch Virol 141(6)，1055-65)。
痘苗病毒天壇株(Tian Tan，TT)是中國特有的痘苗病毒毒株，曾作為預防天花傳染的疫苗株在中國大量人群中長期使用過，具有相對毒力較弱、使用安全的特點，是研制適用于中國應用的基因工程病毒載體和重組活疫苗的理想毒株。然而，痘苗病毒產生的盡管罕見但卻十分嚴重的副作用，是痘苗病毒作為載體使用的一個重要的安全性障礙(Wollenberg，A.at al.，2004.Smallpox，vaccinationand adverse reactions to smallpox vaccine.Curr Opin Allergy Clin Immunol4(4)，271-5.)，應用基因工程的方法對天壇株進一步減毒，以降低它在動物細胞中(in Vitro)及動物體內(in Vivo)的毒性(virulence)是解決這一問題的根本途徑。
痘苗病毒的血凝素(Hemagglutinin，HA)是病毒的一種糖基化非結構蛋白，分子量為85KD。HA基因(A56R)的表達受早期和晚期兩個啟動子的控制，但其表達的有血凝功能的85KD蛋白通常積累于病毒基因表達的晚期(Brown，C.K.et al.，1991.Molecular characterization of the vaccinia virus hemagglutiningene.J Virol 65(7)，3598-606)。HA蛋白主要表達于被感染細胞的表面，同時也出現在痘苗病毒的胞外包膜病毒(Extracellular enveloped virus，EEV)的外膜上(Payne，L.G.et al.，1979.Identification of the vaccinia hemagglutininpolypeptide from a cell system yielding large amounts of extracellularenveloped virus.J Virol 31(1)，147-55；Payne，L.G.et al.，1985.Extracellularrelease of enveloped vaccinia virus from mouse nasal epithelial cells in vivo.JGen Virol 66 (Pt 3)，643-6)。HA基因是痘苗病毒在細胞中復制的非必需基因，已被證實可以作為外源基因的插入位點，插入該位置的外源基因在體內和體外都能得到穩定的表達(Antoine，G.et al.，1996.Characterization of the vacciniaMVA hemagglutinin gene locus and its evaluation as an insertion site forforeign genes.Gene 177(1-2)，43-6)。HA基因在痘苗病毒生活周期中的確切功能和作用并不十分清楚，但有實驗表明，失活HA基因可以導致痘苗病毒WR株在動物體內減毒(Flexner，C.et al.，1987.Prevention of vaccinia virus infectionin immunodeficient mice by vector-directed IL-2 expression.Nature 330(6145)，259-62)。Shida等也證實，缺失HA基因可以造成痘苗病毒Lister株(LO)或其衍生的LC16mO株減毒，但其減毒的程度遠低于WR株(Shida，H.et al.，1988.Effects and virulences of recombinant vaccinia viruses derived from attenuatedstrains that express the human T-cell leukemia virus type I envelope gene.JVirol 62(12)，4474-80)。由此可見，不同痘苗病毒株系間遺傳背景的差異，有可能導致減毒效果上的巨大差別。
中國痘苗病毒天壇株的全基因組測序于1997年完成，它為研究和闡明痘苗病毒天壇株獨特的生物學特性及進行基因工程改造提供了重要的背景資料(金奇等，1997，痘苗病毒天壇株全基因組結構特點的分析。中國科學(C輯)27(6)，562-567)。對天壇株基因結構的研究表明，它與其它痘苗病毒毒株WR株及Copenhagen株等存在較大的差異，這些差異主要分布在其基因組的外側區(Hind III的B和C片段)，在A片段上也發現有重大變異的現象(陳南海等，1992，我國痘苗病毒天壇株與WR株基因組的差異主要分布在其外側區。病毒學報8(4)，303-308)。天壇株的這些變異的程度和范圍是目前所研究的幾種痘苗病毒中所沒有的。對天壇株的HA基因(A56R)的序列分析發現，相對于WR株，它在核苷酸水平上存在1.2％的結構基因的變異，在氨基酸水平上有2.5％的變異率(黎志良等，1989.我國痘苗病毒天壇株血凝素基因全序列分析。病毒學報5(1)，2-9)。天壇株基因組結構的變異顯示了它不同于其它痘苗病毒毒株的獨特的遺傳背景，這種獨特的遺傳背景有可能導致包括毒力在內的各種生物學特性的變化。
早在十多年前，天壇株已經被研究用于改造成表達載體表達不同的外源基因(高峰等，1992，甲型肝炎重組痘苗病毒(VMS11HAV25)的構建極其某些生物學特性。病毒學報8(2)，110-117；馬海倫等，1999，同時表達多種外源基因的非復制型重組痘苗病毒的構建。病毒學報15(1)，21-28；徐水嬋等，1998，麻疹病毒融合蛋白(F)和血凝素(HA)在痘苗病毒中的表達。病毒學報9(4)，301-307；谷淑燕等，1988，表達乙型肝炎病毒表面抗原和Epstein-Barr病毒膜抗原的雙價痘苗病毒的組建。病毒學報4(1)，1-8；阮力等，1992，呼吸道合胞病毒糖蛋白F和G在同一個重組痘苗病毒中的表達。病毒學報8(2)，101-109；郭斐等，2001。非復制重組痘苗病毒天壇株C-K缺失區表達載體的構建及重組病毒生物學性狀的研究。病毒學報17(1)，24-28)。用于插入外源基因的位點主要包括胸苷激酶基因(TK)、HA基因和Hind III的C～K片段區等。其中，已有多種HIV-1的基因被插入到天壇株的HA基因位點，實驗結果表明插入天壇株該位點的外源基因在體內和體外均能得到有效和穩定的表達(王玉紅等，2000，重組痘苗病毒中共表達HIV-1env與hL-6基因。中國人獸共患病雜志，16(4)，22-24；王玉紅等，1999，HIV-1env與hL-2基因在重組痘苗病毒中的共表達研究。免疫學雜志15(4)，217-219；毛春生等，1996，HIV-1 gag基因重組痘苗病毒的構建和高效表達。中國獸醫學報16(6)，562-569)，但有關重組病毒對生物體的毒性和其作為潛在疫苗使用的安全性未有研究和實驗證明。同時，至今也未有任何其它實驗結果或研究，表明通過失活或缺失HA可以導致痘苗病毒天壇株在體內和體外減毒。
為了獲得更為安全的起源于天壇株的痘苗病毒載體，我們針對痘苗病毒天壇株的HA基因，在其編碼區序列引入遺傳序列的變化，導致HA基因失去功能，獲得了高度減毒的天壇痘苗病毒體。我們還同時，第一次系統的研究了減毒天壇痘苗病毒載體在動物細胞中復制的生物學特性，及其在體內(動物模型中)的毒性，由此提供該減毒病毒作為載體安全使用的重要的和科學的依據。高度減毒的天壇痘苗病毒將是更為安全的、理想的病毒載體，可廣泛用于構建人和動物的活病毒載體基因工程疫苗，及其包括癌癥在內的人類疾病的基因治療；此外，該載體還可用作外源基因的表達載體，大規模生產目的蛋白，或用于表達外源病原體抗原，制備病原體檢測和診斷試劑。

發明內容
本發明的目的在于提供一種減毒痘苗病毒天壇株載體，該載體具有有限的宿主范圍，在多數細胞中包括人源化細胞中顯示繁殖復制能力降低，擴散水平下降，對細胞的毒性減輕。體內實驗顯示該載體在動物體內毒性下降，在動物中樞神經系統中復制水平顯著降低，以及痘苗病毒特有的神經毒性急劇下降。因此，該載體比野生天壇病毒更為安全可靠，能有效地控制針對痘苗病毒產生的副作用，包括接種后腦炎的發生；同時也能有效防止病毒載體在人群和環境中的隨機擴散，以保護未接種人群和防止環境污染。
本發明的另一個目的在于提供一種制備減毒痘苗病毒天壇株載體的方法，該方法簡便，操作方便，易于獲得安全、高度減毒的痘苗病毒載體。同時，用該方法獲得的減毒痘苗病毒載體在連續傳代中還顯示了外源基因插入和表達的高度穩定性。
本發明還涉及減毒痘苗病毒天壇株載體在制備治療或預防傳染病性疾病的疫苗中的應用。
本發明還涉及減毒痘苗病毒天壇株載體在制備治療或預防腫瘤的藥物中的應用。
本發明還涉及減毒痘苗病毒天壇株載體在表達外源基因中的應用。
本發明還涉及減毒痘苗病毒天壇株載體在表達外源病原體抗原制備病原體檢測和診斷試劑中的應用。
為了實現上述任務，本發明的一個優選實施方案中提供了新的痘苗病毒，它衍生自痘苗病毒天壇株。痘苗病毒天壇株在中國有幾十年的應用歷史，自從上世紀20年代中國開始生產牛痘苗，一直使用天壇株作痘苗毒種。本發明使用的原始痘苗病毒毒種是中國生產的人用疫苗株天壇761。本發明提供的新的痘苗病毒，由于在其基因組中HA基因的編碼區序列引入至少一處基因序列上的改變，導致HA基因功能的失活；新的痘苗病毒在多數動物細胞中具有降低的有限的復制能力，或完全失去復制能力，和/或降低了對動物細胞的毒性；在模型動物小鼠中顯示了高度減毒的特征，尤其顯示在動物中樞神經系統中復制水平顯著降低，痘苗病毒的神經毒性急劇下降；在連續傳代中它還顯示了外源基因插入和表達的高度穩定性。本發明還提供了可以獲得高度減毒的天壇痘苗病毒的方法，和該減毒痘苗病毒進一步作為一種安全性的載體應用于人或動物疫苗的構建，或作為安全性的基因轉移載體應用于腫瘤的基因治療，或用作外源基因的表達載體大規模生產目的蛋白，或用于表達外源病原體抗原制備病原體檢測和診斷試劑。
已將獲得的新的痘苗病毒載體高度減毒痘苗病毒(TT.WHU.ZCI)，保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址中國.武漢.武漢大學，保藏日期2004年9月17日，保藏編號CCTCC NOV200417。在本文中TT.WHU.ZCI簡寫為ZCI。
本發明還發現，將外源核苷酸序列插入天壇病毒HA基因的編碼區序列的不同位點，或使HA基因編碼區序列缺失，都可以獲得與ZCI特征相同的高度減毒痘苗病毒；而且，同時失活或缺失HA基因的早、晚期啟動子，也可獲得與ZCI特征相同的高度減毒痘苗病毒。因此，無論是對HA基因的編碼區序列進行遺傳改造，或對HA基因的兩啟動子進行遺傳改造，使得HA基因功能失活均可得到高度減毒的痘苗病毒。
術語“遺傳改造”是指，通過基因工程的方法對原有物種的核苷酸序列進行增加、減少或改變遺傳順序等操作。
為了便于研究和描述痘苗病毒在細胞中的復制特征，首先對實驗的幾個具體指標進行以下的介紹。
病毒的復制能力是指病毒的繁殖復制能力，通常按照以下方法計算病毒感染細胞后在一定時間內產生的病毒量與感染細胞的輸入病毒量之比，即為病毒在細胞中的增殖倍數。本發明以病毒感染細胞后72小時的產量(病毒的滴度，titre)比上感染細胞的輸入病毒量作為判斷病毒在該細胞中復制能力的標準，并用Moss B的方法對細胞進行分類(Carroll，M.W.，and Moss，B.1997.Host rangeand cytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia viruspropagation and generation of recombinant virusesin a nonhumanmammalian cell line.Virology 238(n)，198-211)，即非允許細胞(nonpermissive cell，NP)＜1倍的病毒復制增長倍數，病毒在該細胞中缺乏繁殖性復制能力；半允許細胞(semipermissive cell，SP)1～25倍的病毒復制增長倍數，病毒在該細胞中具有有限的繁殖性復制能力；允許細胞(permissive cell，P)＞25倍的病毒復制增長倍數。病毒在該細胞中具有繁殖性復制能力。
病毒在細胞間擴散的能力是病毒在細胞中復制生長的一種重要特性。用免疫染色的方法測定了野生天壇株病毒及其衍生的減毒天壇病毒載體在動物細胞中的擴散速度，進一步獲得了減毒痘苗病毒在動物細胞中不同于野生天壇病毒的復制特性。對病毒在細胞中的擴散速度做了如下的規定，以便更好的描述和區分病毒在細胞中擴散能力的差異以0.01MOI(Multiplicity of infection，MOI)的病毒量感染細胞，在不同的時間點(24小時、48小時和72小時)終止感染，對細胞進行免疫染色，觀察病毒在細胞中感染和擴散的進程。病毒在細胞中的擴散按Moss B的方法分類，即以病毒感染后的72小時內能夠染色的細胞數來判斷病毒的擴散能力(Carroll，M.W.，and Moss，B.1997.Host range andcytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia viruspropagation and generation of recombinant viruses in a nonhumanmammalian cell line.Virology 238(2)，198-211)- 72小時內沒有細胞被染色，該細胞不能被感染，+ ＜5個細胞被染色，病毒僅有很低的擴散能力，++5～25個細胞被染色，病毒在細胞中具有有限的擴散能力，+++ ＞25個細胞被染色，病毒在細胞中具有較高的擴散能力。
病毒在細胞中復制時對細胞產生的毒性被稱為致細胞病變效應(cytopathiceffects，CPE)。病毒對細胞的毒性是病毒在細胞中復制的一個重要特性，與病毒在動物體內的毒性直接相關。在細胞水平產生較少CPE的病毒通常對動物毒性(virulence)更低。因此，在研究病毒的擴散速度的同時觀察了病毒在細胞中形成CPE的能力，包括病毒在細胞中形成噬斑(plaque)的能力。同時，還特別的觀察了病毒在高感染復數(5.0MOI)下，在動物細胞中形成CPE的情況，并通過以下的方法予以描述- 接種細胞與未感染病毒的對照細胞沒有區別+ ＜25％的細胞出現CPE++ 25％～50％的細胞出現CPE+++50％～75％的細胞出現CPE++++ ＞75％的細胞出現CPE本發明研究了衍生于痘苗病毒天壇株的減毒痘苗病毒載體ZCI在動物細胞中的復制特性，包括病毒復制的動力學曲線、病毒在細胞中的擴散速度和病毒對細胞的毒性等；在相同條件下對其親本痘苗病毒天壇株進行了比較性實驗，由此獲得了優選減毒天壇病毒在動物細胞中不同于野生天壇病毒的獨特的復制特性。
為更明確的了解改良天壇病毒的復制特征，首先概括痘苗病毒天壇株在動物細胞中的復制特性。其特性為1.痘苗病毒天壇株具有廣泛的宿主范圍(host range)，它在所測試的11種動物細胞中均具有很好的繁殖復制能力，這些細胞都是痘苗病毒天壇株復制的允許細胞。
2.痘苗病毒天壇株在所測試的動物細胞中均表現出較快的細胞間擴散的速度和相當嚴重的對細胞的毒性。
高度減毒的痘苗病毒顯示了與野生天壇病毒完全不同的復制特性，其在動物細胞中復制的基本特征為高度減毒痘苗病毒在動物細胞中具有有限的宿主范圍；在多數動物細胞中(包括人源化細胞中)具有有限的或降低的復制水平；具有更低的細胞到細胞間的擴散能力和/或更小的細胞毒性；僅在非洲綠猴腎細胞Vero和COS-7中，具有與野生天壇病毒相同水平的復制能力、相似的細胞間擴散水平和相當程度的對細胞的毒性。
高度減毒痘苗病毒在動物細胞中的復制特征具體描述如下1.具有有限的宿主范圍(host range)和在多數細胞中包括人源化細胞中有限的或降低的繁殖性復制水平減毒的痘苗病毒載體在多種動物細胞中只能進行有限的復制或完全失去復制能力，因而具有比野生天壇病毒更為有限的宿主范圍。具體的，高度減毒痘苗病毒ZCI在兔腎細胞系RK-13(ATCC CCL-37)、狗腎細胞系MDCK(ATCC CCL-34)中完全失去繁殖性復制能力，其在RK-13細胞中的病毒增殖倍數小于0.001，比野生病毒在該細胞中復制增殖倍數低40000倍以上，在MDCK細胞中的增殖倍數小于0.01，比野生病毒在該細胞中復制增殖倍數低4000倍以上。
減毒痘苗病毒在多種動物細胞中僅具有有限的繁殖復制能力，這些細胞包括鼠腦神經膠質瘤細胞系C6(ATCC CCL-37)、豬腎細胞系PK(15)(ATCC CCL-33)和幼年倉鼠腎細胞系BHK-21(ATCC CCL-10)。具體的，高度減毒痘苗病毒ZCI在C6、PK(15)和BHK-21細胞中僅具有大于1倍而小于25倍的復制增殖能力，其復制能力分別是野生天壇病毒的2.4％、3.4％和9.1％。因而C6、PK(15)和BHK-21是減毒病毒ZCI復制的半允許細胞。
優選的減毒痘苗病毒在兩種人源化細胞系293T(ATCC CRL11268)和MRC-5(ATCC CCL-171)中也顯示了明顯下降的復制水平，盡管病毒的復制增殖倍數顯示這兩種細胞系是減毒病毒的允許細胞。其中ZCI在人胚腎細胞系293T中的復制倍數只有天壇株在293T中的36.8％，而在人胚肝細胞系MRC-5中，ZCI的復制倍數為天壇株的28％。
減毒痘苗病毒在原代雞胚細胞(Chick embryo fibriblasts，CEF，自制)、人宮頸癌細胞系HeLa(ATCC CCL-2)、兩種非洲綠猴腎細胞Vero和COS-7中的復制能力與野生天壇株相比沒有顯著差異，以上三種細胞是野生天壇病毒和減毒痘苗病毒的允許細胞。
2.具有更低的細胞到細胞間的擴散水平經測試，野生天壇病毒在測試的11種動物細胞中都有很強的擴散能力，其72小時內均有大于25個細胞被染色，因此野生天壇病毒在這些細胞中的擴散速度均被計為+++。
在RK-13、MDCK中，優選的高度減毒痘苗病毒ZCI在72小時內只有單個的細胞被染色，表明減毒病毒ZCI能感染這兩種細胞，但其細胞到細胞間的擴散嚴重受阻。在PK(15)中，優選的減毒病毒ZCI只有少于5個細胞被染色，表明在PK(15)中僅具有很低的擴散能力。
在另兩種細胞C6和293T中，優選減毒痘苗病毒ZCI的擴散速度也低于野生天壇病毒，72小時內只有少于25個細胞被感染。此外，ZCI還顯示在人源化細胞HeLa中的擴散速度比野生病毒顯著減慢，ZCI在HeLa中僅有有限的擴散能力(++)。
盡管在BHK-21、MRC-5和原代CEF細胞中，優選的減毒痘苗病毒ZCI均有較高的擴散能力(+++)，但在相同時間內，被ZCI感染的細胞數仍明顯少于被野生天壇病毒感染的細胞，表明減毒痘苗病毒在BHK-21、MRC-5和CEF中的擴散速度比野生病毒仍有明顯的下降。
減毒痘苗病毒ZCI僅在非洲綠猴腎細胞Vero和COS-7中具有與野生病毒相似的擴散速度，表明Vero、COS-7均能有效的支持野生天壇病毒及改良天壇病毒的繁殖性復制。
痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒在動物細胞中的復制增殖倍數見表1。痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒在動物細胞中的擴散見表2。
表1痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒載體在動物細胞中的復制

*0.05MOI的病毒感染成片的動物細胞，分別在0、24、48和72小時收集樣品，在Vero細胞中測定病毒的滴度。病毒的增殖倍數是以病毒感染細胞后72小時的產量比上感染細胞的輸入病毒量。圖中，細胞分為非允許細胞、半允許細胞和允許細胞NP＜1倍的病毒復制增長倍數SP1～25倍的病毒復制增長倍數P ＞25倍的病毒復制增長倍數表2痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒載體在動物細胞中的擴散

*以0.01MOI的病毒感染成片的動物細胞，分別在24、48和72小時終止感染，對細胞進行免疫染色。細胞的擴散根據72小時內能夠染色的細胞數- 72小時內沒有細胞被染色+ ＜5個細胞被染色++5～25個細胞被染色+++ ＞25個細胞被染色
3.具有更小的對細胞的毒性(Cytopathicity)高感染復數(5.0MOI)下，減毒痘苗病毒ZCI在多數被測試的動物細胞中具有比野生天壇病毒更少的CPE，這表現在CEF、BHK-21、C6、MDCK、RK13、PK(15)和人源化的細胞293T中；或者出現CPE的時間比野生天壇病毒更晚，如在人源化細胞HeLa中。表明減毒痘苗病毒比野生天壇病毒具有更低的細胞水平的毒性。
在MRC-5和非洲綠猴腎細胞Vero、COS-7中，減毒痘苗病毒未顯示與野生天壇病毒明顯的細胞毒性的差異，它們在這三種細胞中均能形成與野生天壇病毒相似嚴重程度的CPE現象。
減毒痘苗病毒減小的細胞毒性還表現在噬斑的形成上。免疫染色的結果顯示，在原代CEF、293T、C6、MDCK及RK13中，野生天壇病毒均能產生明顯的噬斑，尤其是在鼠的神經膠質瘤細胞C6和兔腎細胞RK13中，野生天壇病毒在病毒感染的早期即能形成典型的噬斑，在病毒感染的48小時后，幾乎所有的細胞都被感染并且大量脫落死亡；而減毒痘苗病毒ZCI在CEF、293T、C6、MDCK和RK13細胞中均不形成明顯的噬斑，只顯示經免疫染色而形成的被病毒感染的Foci(CEF、293T、C6)或被感染的單個細胞(MDCK和RK13)，表明減毒痘苗病毒對上述細胞的毒性明顯減小。
痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒ZCI在動物細胞中的CPE見表3。
表3痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒載體在動物細胞中的CPE*

*以5.0MOI的病毒感染細胞，分別在12和24小時觀察接種細胞中出現CPE的情況+ 接種細胞與未感染病毒的對照細胞沒有區別++＜25％的細胞出現CPE+++25％～50％的細胞出現CPE++++ 50％～75％的細胞出現CPE
++++ ＞75％的細胞出現CPE安全有效的病毒載體必須具有穩定的生物學性狀，其外源基因插入和表達的穩定性尤為重要。將已插入外源GFP基因(綠色熒光蛋白基因)的高度減毒痘苗病毒以0.01MOI在Vero細胞中進行連續六次傳代。將第一代和第六代的減毒痘苗病毒感染Vero細胞，48小時后首先在熒光顯微鏡下對產生綠色熒光的噬斑進行計數，然后對培養皿中的感染細胞進行免疫染色，對顯示病毒感染的噬斑再次進行計數，與產生綠色熒光的噬斑數進行比較。實驗發現，經免疫染色觀察到的噬斑與顯示綠色熒光的噬斑數完全相同，表明外源基因(GFP)已穩定插入減毒痘苗病毒載體并可連續傳代和表達。
減毒痘苗病毒中外源基因GFP插入的遺傳穩定性表4

將第一代和第六代的減毒痘苗病毒以5.0MOI感染Vero細胞，24小時后收獲被感染的細胞和上清液，未感染的Vero細胞作為陰性對照。取相同體積的樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉膜后經Western blot用抗GFP的抗體檢測不同代數病毒GFP的表達產量。結果顯示，六次傳代前后GFP的表達量相似(見圖3)。表明高度減毒載體可穩定表達插入的外源目的蛋白。
總之，高度減毒痘苗病毒在動物細胞中具有有限的宿主范圍，在多數細胞中包括人源化細胞中顯示了降低的繁殖復制能力，而且具有更低的細胞到細胞間的擴散水平，和/或具有更小的對細胞的毒性。減毒痘苗病毒在動物細胞中的這些特性將有助于控制病毒在目標動物或人體內的復制水平和擴散速度，降低病毒對生物體毒性，同時也為防止病毒在人群和環境中的隨機擴散提供了有效的屏障。此外，本發明獲得的高度減毒痘苗病毒載體還顯示了外源基因插入和表達的高度穩定性，為該載體的進一步應用提供了有效的保障。
在一個優選實施方案中，本發明的減毒痘苗病毒載體還具有在體內高度減毒的體內特征。在體內減毒的特征包括1)鼻腔接種途徑(intranasal route，IN)的減毒；2)顱腔接種途徑(intracranail route，IC)的減毒；3)動物腦中樞神經系統復制的降低。‘在體內減毒’是指，病毒可在SPF級別的近交系封閉群BALB/c小鼠中進行毒力測定，并且在通過鼻腔接種途徑時，可以顯著減少免疫小鼠體重的下降；在通過顱腔接種途徑時，能顯著降低免疫小鼠的死亡率。具體的特征如下1)鼻腔途徑的減毒對5周齡的BALB/c小鼠分別接種106PFU和105PFU的野生天壇病毒，在10天的觀察期內，可分別最多造成小鼠體重下降28.6％和18.3％。而接種改良天壇病毒ZCI時，106PFU和105PFU的病毒均未能引起小鼠體重下降，接種小鼠在觀察期內一直保持與接種同體積的PBS的對照小鼠相同的體重增長。表明改良天壇病毒ZCI經過鼻腔途徑檢測具有高度減毒的體內特性。
2)顱腔接種途徑的減毒痘苗病毒是嗜神經病毒，顱腔接種可直接造成病毒對中樞神經系統的毒害，并可由此引起急性腦炎的發生，這是接種痘苗病毒引起的較為嚴重的并發癥之一。因而小鼠顱內注射半致死劑量(IC LD50)能很靈敏的反映病毒神經毒性的強弱。
對3周齡的BALB/c小鼠接種系列稀釋的野生天壇病毒和改良天壇病毒，在兩周(14天)的觀察期內觀察并記錄各組小鼠的死亡率，按Reed-Muench方法計算顱腔途徑的半數致死量IC LD50。經測試，野生天壇病毒的IC LD50是103.46PFU(3.46Log10單位)。改良天壇病毒ZCI未能測出IC LD50。當接種劑量達到3.5×106PFU/小鼠時(最高劑量組)，ZCI在觀察期內未能引起小鼠死亡。進一步延長觀察時間至60天，改良天壇病毒ZCI仍然不能致小鼠死亡，接種小鼠生長正常，沒有小鼠發生接種后腦炎或出現其它的病癥。實驗結果表明減毒病毒ZCI的神經毒性比野生天壇病毒下降至少1000倍。
3)減毒病毒在腦中樞神經系統中復制痘苗病毒是嗜神經病毒，病毒在動物腦神經系統中的復制水平與病毒對中樞神經組織的毒害直接相關。
對3周齡的BALB/c小鼠分別接種104PFU的減毒痘苗病毒ZCI和野生痘苗病毒天壇株，從接種后的次日起連續5天取小鼠的腦組織測定病毒的滴度，以確定病毒在動物顱內中樞神經系統中的復制水平。在實驗中，野生痘苗病毒天壇株在顱內顯示迅速復制和滴度上升，最高滴度達到1.7×104PFU/動物腦。由于野生痘苗病毒產生的毒性，兩只實驗小鼠在接種后第5天死亡。而接種減毒痘苗病毒ZCI的實驗小鼠，其顱內的病毒滴度顯示有緩慢的增長，最高滴度為1.2×102PFU/動物腦，比野生天壇病毒的顱內病毒滴度低約140倍，這表明，減毒痘苗病毒在動物顱內中樞神經系統中復制水平比野生天壇病毒有顯著的下降，這是減毒痘苗病毒神經毒性急劇下降的一個重要原因。
由此，無論是鼻腔接種途徑，還是顱腔接種途徑，都證實改良天壇病毒ZCI在體內高度減毒的體內特性。因此，以上改良天壇病毒將是更為安全的載體，在進一步應用于新型藥物或試劑的研制或活病毒載體疫苗的開發時，將具有更高的安全性。
總之，優選本發明的改良天壇病毒具有下述八種特性1)具有有限的宿主范圍和在多數動物細胞中具有比野生天壇病毒更低的繁殖性復制能力；2)在多數動物細胞中具有比野生天壇病毒更低的細胞到細胞間的擴散水平；3)在多數動物細胞中具有比野生天壇病毒更小的對細胞的毒性；4)在動物中樞神經系統中具有比野生天壇病毒顯著下降的復制水平；5)在非洲綠猴腎細胞Vero和COS-7中具有與野生天壇病毒相似水平的復制能力、相似的細胞間擴散水平和相似的細胞毒性；6)具有經鼻腔途徑接種在體內高度減毒的體內特征；7)具有經顱腔接種顯示神經毒性比野生天壇病毒急劇下降的體內特征；8)減毒痘苗病毒載體同時具有外源基因穩定插入和表達的特征。
本發明的研究人員已知如何獲得具有以上特征的高度減毒痘苗病毒。獲得高度減毒天壇病毒的方法包括以下的步驟1)構建穿梭質粒，該質粒包含痘苗病毒特異性的啟動子序列(如pSYN和pH5)。該質粒含與痘苗病毒天壇株HA基因編碼區序列或編碼區外側序列同源的側翼序列，該質粒側翼序列間可插入異源核苷酸序列(如標記基因GFP)，并使其處于痘苗病毒啟動子控制之下；2)在痘苗病毒的允許細胞中(如Vero或CEF)使穿梭質粒與痘苗病毒天壇株同源重組(同源重組可用脂質體轉染試劑盒(Qiagen)進行轉染，方法見轉染試劑盒說明書)，以使痘苗病毒HA基因失去功能，達到對痘苗病毒進行高度減毒的目的；3)通過篩選標記(如GFP的綠色熒光)，對重組病毒進行單斑篩選，以分離獲得純的高度減毒痘苗病毒；對以上獲得的減毒重組痘苗病毒可進一步進行細胞學和動物學的鑒定。包括在動物細胞中分析確定重組病毒的復制特性，如病毒復制動力學曲線、病毒在細胞中的擴散速度、病毒在細胞中的CPE等，以驗證重組病毒在細胞水平減毒。在動物模型中通過不同的接種途徑，如鼻腔途徑、顱內途徑，分析鑒定重組病毒在動物體內的毒力，以驗證重組病毒在體內減毒的特征。
術語“重組病毒”是指病毒基因組中含有至少一種“異源”的核酸序列，即通常并非與所述病毒密切相關的核酸序列的任意組合。
本研究發明的減毒痘苗病毒載體可用于構建候選疫苗，預防和/或治療人類或動物的傳染性疾病；該減毒痘苗病毒載體還可進一步用于研制腫瘤基因治療或預防的藥物；該載體還可用作外源基因的表達載體，在大規模生產中更為安全；此外，減毒痘苗病毒可用于表達外源病原體抗原制備病原體檢測和診斷試劑。
1.減毒痘苗病毒用于構建候選疫苗1)構建含目的外源DNA序列的穿梭質粒，其兩側的側翼序列與用于重組獲得減毒痘苗病毒ZCI的穿梭質粒的側翼序列同源，并使外源DNA序列處于痘苗病毒啟動子的控制之下。
2)在痘苗病毒的允許細胞中(如Vero)使穿梭質粒與減毒痘苗病毒天壇株ZCI同源重組，使目的外源DNA序列替換減毒痘苗病毒ZCI中的標記基因(如GFP)，以使外源目的DNA序列插入到痘苗病毒基因組的預定位置。
3)在允許細胞(如Vero細胞)中篩選失去特定標記(如失去GFP熒光)的重組病毒，獲得可表達目的外源DNA序列的高度減毒的重組病毒作為候選疫苗，用于預防和治療人類或動物的傳染性疾病。
2.減毒痘苗病毒用于構建基因轉移的載體應用于腫瘤基因治療1)構建含外源DNA序列的穿梭質粒，其兩側的側翼序列與用于重組獲得減毒痘苗病毒ZCI的穿梭質粒的側翼序列同源。該外源DNA序列可置于痘苗病毒啟動子的調控之下，以保證需要表達的外源DNA序列能夠有效表達。此外源DNA序列是能表達抑制或有助于殺死腫瘤細胞的DNA序列，也可以是不表達的外源DNA序列，與減毒痘苗病毒天壇株ZCI同源重組后獲得高度減毒的痘苗病毒基因轉移載體。
2)構建的穿梭載體在痘苗病毒的允許細胞中(如Vero細胞)與減毒痘苗病毒天壇株ZCI同源重組，使目的外源DNA序列替換減毒痘苗病毒ZCI中的標記基因(如GFP)，以使外源目的DNA序列插入到痘苗病毒的HA基因處，獲得可表達抑制或有助于殺死腫瘤細胞成分的減毒痘苗病毒基因轉移載體。
3)通過基因工程的方法，進一步使以上減毒痘苗病毒的胸苷激酶(thymidine kinase，TK)基因失活，產生TK-的重組減毒痘苗病毒。該重組病毒由于無法正常表達胸苷激酶，可高選擇性的在分裂旺盛的腫瘤細胞中進行感染和復制(McCart，J.A.et al.，2001，Systemic cancer therapy with a tumor-selective vaccinia virusmutant lacking thymidine kinase and vaccinia growth factor genes.Cancer Research，61(24)，8751-7)，而在正常細胞中則由于HA基因失活而高度減毒。由此該減毒痘苗病毒基因轉移載體可高靶向性感染腫瘤細胞，抑制或殺死腫瘤細胞，而對正常人體組織則相對安全。
3.減毒痘苗病毒用作外源基因的安全表達載體1)構建含目的外源DNA序列的穿梭質粒，其兩側的側翼序列與用于重組獲得減毒痘苗病毒ZCI的穿梭質粒的側翼序列同源，并使外源目的基因的DNA序列處于痘苗病毒啟動子的控制之下。
2)在痘苗病毒的允許細胞中使穿梭質粒與減毒痘苗病毒天壇株ZCI同源重組，使目的外源基因的DNA序列替換減毒痘苗病毒ZCI中的標記基因(如GFP)，以使外源目的DNA序列插入到痘苗病毒的HA基因的預定位置。
3)在允許細胞中篩選失去特定標記(如失去GFP熒光)的重組病毒，獲得可表達目的外源DNA序列的高度減毒的重組病毒，用于外源目的蛋白的表達和生產。由于該載體高度減毒，因而在應用該載體表達外源基因進行目的蛋白大規模生產時將具有更高的安全性，可減少生產過程中對接觸人員可能產生的潛在危害和對環境的污染。
4.減毒痘苗病毒用于表達外源病原體抗原制備病原體檢測和診斷試劑1)構建含目的外源DNA序列的穿梭質粒，其兩側的側翼序列與用于重組獲得減毒痘苗病毒ZCI的穿梭質粒的側翼序列同源，并使要表達的外源病原體抗原的DNA序列處于痘苗病毒啟動子的控制之下。
2)在痘苗病毒的允許細胞中使穿梭質粒與減毒痘苗病毒天壇株ZCI同源重組，使目的外源病原體抗原的DNA序列替換減毒痘苗病毒ZCI中的標記基因(如GFP)，以使外源病原體抗原的DNA序列插入到痘苗病毒的HA基因的預定位置。
3)在允許細胞中篩選失去特定標記(如失去GFP熒光)的重組病毒，獲得可表達目的外源病原體抗原的高度減毒的重組病毒，用于制備病原體的檢測和診斷試劑。由于痘苗病毒載體系統比其它表達系統(如細菌或酵母)制備的產物具有更好的抗原性和免疫原性，因而用該載體的表達產物制備的檢測和診斷試劑(檢測病原體抗原或相應抗體)將具有更高的特異性和敏感性，可廣泛用于畜、禽、水生生物和人的病原學、流行病學、診斷學及病原體感染的預防控制。同時，由于該減毒痘苗病毒載體高度減毒，因而在應用該載體表達外源基因進行目的蛋白大規模生產時將具有更高的安全性，可減少生產過程中對接觸人員可能產生的潛在危害和對環境的污染。
本發明與現有技術相比具有以下優點1)對天壇株HA基因的遺傳改造使得痘苗病毒天壇株在動物細胞中復制降低、毒性下降，在模型動物體內高度減毒，因此無論是以該痘苗病毒載體構建疫苗，或作為腫瘤基因治療載體，或用該載體大量表達外源蛋白將更為安全可靠。尤其是減毒痘苗病毒的神經毒性急劇下降，將有效防止被接種者或接觸者發生痘苗病毒相關的并發癥如腦炎等。此外，應用該載體表達外源基因進行目的蛋白大規模生產時將具有更高的安全性，可減少生產過程中對接觸人員可能產生的潛在危害和對環境的污染。
2)痘苗病毒載體比其它類型的載體具有更大的外源基因容量，可插入總量達25Kb的外源基因；存在包括TK、HA在內的多個非必需區，因此可同時插入多種外源基因，實現多種有效抗原成分或生物成分的組合，提高疫苗免疫或腫瘤基因治療的效果。


圖1痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒在動物細胞中的復制動力學。細胞接種0.05MOI的不同病毒，分別在0、24、48和72小時收集病毒樣品，在Vero細胞中測定病毒的滴度。
圖2痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒在動物細胞中的擴散。細胞接種0.01MOI的不同病毒，分別在24、48和72小時終止感染，對細胞進行免疫染色，觀察病毒在細胞中感染和擴散的進程，并在倒置顯微鏡下拍照。
圖3減毒痘苗病毒載體中外源基因表達的穩定性。含外源基因GFP的P1代和P6代的高度減毒痘苗病毒以5.0MOI感染Vero細胞，24小時收獲被感染細胞和上清。未感染的Vero細胞作為陰性對照。取相同體積的樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜后經Western blot用抗GFP的抗體檢測GFP的表達產量。
圖4痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒在模型動物中的毒力(鼻腔途徑)。5周齡的BALB/c小鼠，分別經鼻腔接種30ulPBS稀釋的106PFU的病毒(A)和105PFU的病毒(B)，在10天的觀察期內記錄每天小鼠體重的變化。
圖5痘苗病毒天壇株及減毒痘苗病毒在模型動物腦中樞神經系統中的復制。
圖6重組env減毒痘苗病毒在允許細胞Vero中的表達。分別以env重組痘苗病毒(A)和減毒痘苗病毒ZCI(B)感染Vero細胞(0.01MOI)，24小時后用來自艾滋病人的抗血清為一抗進行免疫染色。
具體實施例方式
以下實施例將進一步舉例說明本發明。
實施例1在動物細胞中減毒痘苗病毒的復制動力學和病毒復制相關特性。
1)病毒在動物細胞中的復制動力學為了了解減毒痘苗病毒在動物細胞中的復制能力，選擇了來自不同種類、不同組織的動物細胞，包括來自人的細胞系，進行了病毒復制動力學的研究實驗。同時，在相同條件下研究了親本病毒天壇株在這些細胞中的復制動力學曲線，以便能夠與減毒痘苗病毒的復制特性進行比較。
比較的病毒為高度減毒痘苗天壇病毒ZCI，野生天壇痘苗病毒TT。所選擇的動物細胞及其種類、來源和細胞類型見表1。其中原代雞胚細胞CEF為自制細胞，盡管在本文中注明是原代，但在使用中為前三代的傳代細胞。Vero和C6細胞引自中國科學院典型培養物保藏委員會(Type Culture Collection of ChineseAcademy of Sciences，CTCCCAS)；293T引自美國細胞培養物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)；COS-7、PK(15)、RK13、HeLa、MDCK、MRC-5和BHK-21引自中國典型培養物保藏中心(China Centerfor Type Culture Collection，CCTCC)。有關細胞的培養方法均按照美國ATCC和中國CCTCC的要求培養和傳代。
以下以COS-7為例介紹傳代細胞的培養細胞在含10％新生牛血清(NCS)的DMEM培養基中培養生長至成片(37℃，5％CO2)，吸掉培養液，用PBS洗1次。加入適當體積的0.25％的胰酶消化細胞。待細胞回縮間隙變大、細胞開始從瓶壁脫落時加入新鮮的培養基，吹勻，按1∶3的比例分裝到新的培養瓶中，置于37℃、5％CO2的培養箱培養。
原代雞胚細胞CEF的制備和培養方法如下取9～11天的雞胚消毒后置于蛋架上，用剪刀敲開雞胚的鈍頭，挑出殼膜，取出雞胚置于無菌的平皿中，去除頭、翅、腿、內臟等并剪碎。用不含血清的培養基洗兩次，10ml注射器抽取雞胚至成糜狀。加100ml0.25％的胰酶(預冷)于37℃消化15分鐘。紗布過濾，濾液加入10％終體積的NCS中止反應。紗布上剩余的組織碎片重復消化一次。合并濾液，1500rpm 4℃離心10分鐘。棄上清，細胞沉淀用含10％NCS的培養基重懸，1500rpm離心10分鐘。用含10％NCS的新鮮培養基重懸沉淀后分裝到培養瓶，置于37℃5％CO2培養箱中培養。傳代方法同COS-7細胞，在三代之前使用。
測定病毒在細胞中的復制動力學曲線的方法如下在感染病毒前約24小時將適量的不同細胞接于24孔板，待細胞長至單層，在備用孔中對細胞進行計數，去除培養基，按0.05MOI分別接入各種痘苗病毒，24孔板置于37℃培養箱吸附病毒90分鐘。從培養板中移去上清，并用培養基洗脫未吸附的病毒。加入含3％胎牛血清(FBS，GIBCO)和1％雙抗(青霉素、鏈霉素)的新鮮培養基DMEM、MEM，于37℃、5％CO2的培養箱中培養。0小時的樣品在完成病毒吸附后即收獲，此后于24、48和72小時分別收取樣品。細胞使用的培養基按其引入單位的要求，如美國ATCC和中國CCTCC或中國科學院CTCCCAS。收獲的不同時間的病毒復制樣品凍化三次，以釋放病毒。收獲的病毒在Vero細胞中測定滴度。
病毒的滴定在24孔板中接入Vero細胞，待長至單層(約24小時)后，吸出培養基，接入系列稀釋的病毒樣品，37℃吸附90分鐘。吸附完成后從培養板中移去上清，并用培養基洗脫未吸附的病毒。加入新鮮的半固定培養基(2倍的MEM培養基(GIBCO)和1％的瓊脂糖1∶1，培養基含終濃度為3％的新生牛血清NCS(GIBCO)及1％的雙抗)，于37℃、5％CO2的培養箱中培養48～72小時。用結晶紫對感染細胞進行染色，沖去結晶紫和瓊脂糖，對細胞中產生的噬斑計數，根據噬斑數和稀釋倍數計算病毒的滴度。
病毒在細胞中復制倍數的確定及細胞的分類以病毒的72小時的滴度(PFU)除病毒的輸入滴度(Input)，為病毒在該細胞中的繁殖復制倍數。參照Moss B的方法對細胞進行分類(Carroll，M.W.，and Moss，B.1997.Host rangeand cytopathogenicity of the highly attenuated MVA strain of vaccinia viruspropagation and generation of recombinant viruses in a nonhumanmammalian cell line.Virology 238(2)，198-211)，即非允許細胞(nonpermissive cell，NP)＜1倍的病毒復制增長倍數，半允許細胞(semipermissive cell，SP)1～25倍的病毒復制增長倍數，允許細胞(permissive cell，P)＞25倍的病毒復制增長倍數。
野生天壇病毒和減毒痘苗病毒ZCI在動物細胞中的復制增長倍數詳見表1，復制動力學曲線見圖1。實驗結果顯示，11種動物細胞中，包括原代雞胚細胞(CEF)，3種人類細胞(293T、Hela和MRC-5)，2種非洲綠猴腎細胞(Vero和COS-7)，2種鼠細胞(BHK-21和C6)及三種其它動物腎細胞(MDCK、PK(15)和RK13)，對于天壇病毒TT來說都是允許細胞。這個結果表明，天壇株具有極其廣泛的宿主范圍，可以在絕大多數動物細胞中很好地增殖。
測試的減毒痘苗病毒在動物細胞中顯示了與野生TT極為不同的復制及生長特征，它們具有更小的宿主范圍，在大多數測試細胞中都有程度不同的復制水平的下降。ZCI在兩種腎細胞MDCK和RK13中完全喪失了繁殖性復制能力，其復制水平分別低于TT在MDCK和RK13中的4000倍和40000倍。在另兩種鼠細胞(BHK-21和C6)和豬腎細胞PK(15)中，ZCI的復制都受到了很大程度的限制，它在這些細胞中通常只能維持野生TT復制能力的2％～9％。盡管病毒復制增長倍數顯示293T和MRC-5是減毒痘苗病毒復制的允許細胞，但減毒痘苗病毒在它們中的復制水平仍然顯示了很大程度的降低，其中ZCI在293T中的復制倍數是天壇株的36.8％，而在人胚肝細胞系MRC-5中的復制倍數只有天壇株的28％。在CEF、Hela和兩種非洲綠猴腎細胞Vero、COS-7中，兩種減毒痘苗病毒的復制能力未顯示與野生TT有明顯區別，以上四種細胞均能支持減毒痘苗病毒進行有效的復制。
2)病毒在動物細胞中對細胞的毒性(CPE)及病毒在細胞中的擴散在6孔細胞培養板中每孔接種不同細胞至形成單層(約需24h)，按0.01MOI的感染復數接入病毒感染細胞，于細胞培養箱中吸附90分鐘。從培養板中移去上清，并用培養基洗脫未吸附的病毒。補加含3％FBS和1％雙抗的培養基，置于細胞培養箱中繼續培養，分別于24、48和72小時取出細胞培養板，進行免疫染色。免疫染色方法如下吸出培養板中的培養基上清，PBS洗一次。用1∶1的甲醇∶異丙酮溶液固定細胞，加入按一定效價比例稀釋的兔抗痘苗病毒血清(一抗)，室溫下作用2小時。吸出一抗，用PBS洗一次，加入按一定效價比例稀釋的二抗蛋白-A(HRP標記)，室溫下作用1小時。吸出二抗，用PBS洗一次，然后用新鮮配制的染色液(10mlPBS+200ul鄰苯茴香胺在100％乙醇的飽和溶液+15ul新鮮配制的H2O2)顯色。待出現清晰的紅棕色Foci，吸出顯色液，用PBS終止顯色反應，在倒置顯微鏡下用數碼相機拍攝細胞擴散結果。病毒在細胞中的擴散按Moss B的方法分類，即72小時內被染色的細胞數
- 沒有細胞被染色，表明該細胞不能感染+ ＜5個細胞被染色，細胞可以被感染，但僅有很低的擴散能力++5～25個細胞被染色，在細胞中具有有限的擴散能力+++ ＞25個細胞被染色，在細胞中具有較高的擴散能力病毒在細胞中的擴散見附圖2和表2。
病毒對細胞的毒性稱為致細胞病變效應(CPE)。在進行免疫染色的同時觀察了在低感染復數(0.01MOI)下細胞中出現CPE的情況及病毒在細胞中是否形成噬斑。此外，還觀察了高感染復數下病毒對細胞的毒性。實驗方法如下在感染病毒前約24小時將適量的不同細胞接于24孔板，待細胞長成單層，去除培養基，按5.0MOI分別接入野生天壇病毒TT和改良天壇病毒ZCI，24孔板置于37℃培養箱吸附病毒90分鐘。從培養板中移去上清，并用培養基洗脫未吸附的病毒。加入含3％胎牛血清(FBS，GIBCO)和1％雙抗(青霉素、鏈霉素)的新鮮培養基，置于37℃、5％CO2的培養箱中培養。于12小時、24小時觀察細胞中出現的CPE，在倒置顯微鏡下拍照。參照Moss B的方法，將病毒對細胞的毒性按CPE出現的程度分為五類- 接種細胞與未感染病毒的對照細胞沒有區別+ ＜25％的細胞出現CPE++ 25％～50％的細胞出現CPE+++50％～75％的細胞出現CPE++++ ＞75％的細胞出現CPE高感染復數下病毒在動物細胞中的CPE見表2。
免疫染色的結果顯示，野生TT病毒在測試的11種動物細胞中都有很強擴散能力，可以迅速地從被感染的細胞擴散至鄰近細胞，盡管它在部分細胞系中擴散稍慢，如在PK(15)、293T和Hela細胞中。還發現，野生天壇病毒不僅能在細胞中快速擴散，而且在大多數動物細胞中都能形成典型的噬斑，其中在Vero、COS-7、RK13、C6、MDCK中在感染的早期即能形成很大的噬斑。此外在高感染復數(5.0MOI)下，野生天壇病毒在所有測試的細胞中都顯示了嚴重的CPE現象。
在多數動物細胞中優選的高度減毒痘苗病毒顯示細胞間的擴散下降。其中ZCI在RK-13和MDCK中顯示失去細胞間的擴散能力；在PK(15)中，ZCI僅具有很低的擴散能力；在另兩種細胞C6和293T中，ZCI具有有限的擴散能力，72小時內有少于25個細胞被感染；此外，ZCI還顯示在人源化細胞HeLa中的擴散速度比野生病毒顯著減慢，ZCI在HeLa中僅有有限的擴散能力。
盡管在BHK-21、MRC-5和原代CEF細胞中，優選的減毒痘苗病毒ZCI仍有較高的擴散能力(+++)，但在相同時間內，被ZCI感染的細胞數仍明顯少于被野生天壇病毒感染的細胞，表明減毒痘苗病毒在BHK-21、MRC-5和CEF中的擴散速度比野生病毒仍有明顯的下降。
減毒痘苗病毒ZCI僅在非洲綠猴腎細胞Vero和COS-7中具有與野生病毒相似的擴散速度，表明Vero、COS-7均能有效的支持野生天壇病毒及減毒天壇病毒的繁殖性復制。
高感染復數(5.0MOI)下，減毒痘苗病毒ZCI在多數被測試的動物細胞中具有比野生天壇病毒更少的CPE，這表現在CEF、BHK-21、C6、MDCK、RK13、PK(15)和人源化的細胞293T中；或者出現CPE的時間比野生天壇病毒更晚，如在人源化細胞HeLa中，表明減毒痘苗病毒比野生天壇病毒具有更低的細胞毒性。
在MRC-5和非洲綠猴腎細胞Vero、COS-7中，減毒痘苗病毒未顯示與野生天壇病毒明顯的細胞毒性的差異，它們在這三種細胞中均能形成與野生天壇病毒相似嚴重程度的CPE現象。
減毒痘苗病毒減小的細胞毒性還表現在噬斑的形成上。免疫染色的結果顯示，在原代CEF、293T、C6、MDCK及RK13中，野生天壇病毒均能產生明顯的噬斑，尤其是在C6和RK13中，野生天壇病毒在病毒感染的早期即能形成典型的噬斑，在病毒感染的48小時后，幾乎所有的細胞都被感染并且大量脫落死亡。而減毒病毒ZCI在以上細胞中均不形成明顯的噬斑，只顯示經免疫染色而產生的被病毒感染的Foci(CEF、293T和C6)或被感染的單個細胞(MDCK及RK13)，表明減毒痘苗病毒對上述細胞的毒性明顯減小。
實施例2高度減毒痘苗病毒中外源基因插入和表達的遺傳穩定性安全有效的病毒載體必須具有穩定的生物學性狀，其外源基因插入和表達的穩定性尤為重要。將高度減毒痘苗病毒(HA基因編碼區已插入外源GFP基因)以0.01MOI感染單層Vero細胞，吸附90分鐘后去除培養基，用含10％NCS的DMEM培養基洗細胞一次，補加含10％NCS的新鮮培養基于37℃、5％CO2的培養箱中培養48小時，收獲病毒感染的細胞和上清，凍化三次，樣品在Vero細胞中測定病毒的滴度。然后以同樣的MOI感染Vero細胞。以此方法使減毒痘苗病毒在Vero細胞中進行6次連續傳代。將第一代和第六代的減毒痘苗病毒感染培養于350mm培養皿的Vero細胞中，48小時后首先在熒光顯微鏡下對產生綠色熒光的噬斑進行計數，然后對培養皿中的感染細胞進行免疫染色(方法見免疫染色)，對顯示病毒感染的噬斑再次進行計數，與產生綠色熒光的噬斑數進行比較。實驗結果見表4。實驗發現，免疫染色顯示的噬斑與顯示綠色熒光的噬斑數完全相同，表明外源基因(GFP)已穩定插入減毒痘苗病毒載體并可連續傳代，這為該載體的進一步應用提供了有效的保障。
將第一代和第六代的減毒痘苗病毒以5.0MOI感染Vero細胞，24小時收獲感染細胞和上清，未感染的細胞作為陰性對照。將收獲的樣品于4000轉離心10分鐘，沉淀用PBS洗兩次，重懸沉淀于PBS中，經-70℃和室溫反復凍化三次后，樣品保存于-70℃。取相同體積的不同樣品經沸水浴3分鐘后進行SDS-PAGE電泳分離蛋白(12％的分離膠，5％的濃縮膠)。得到分離的蛋白凝膠轉移至NC膜，用含3％牛血清白蛋白(BSA)的PBST(含0.2％土溫20的PBS緩沖液)室溫封阻2小時。PBST洗膜后按1∶1000加入抗GFP的特異性抗體(BD公司)，室溫作用2小時后洗膜。按1∶5000加入過氧化物酶標記的二抗(HRP標記的羊抗兔抗體)，室溫作用1小時后洗膜。用DAB進行顯色(9mlTris，1ml NiCl2，6mg DAB，10ul H2O2)，待特異帶顯色后用PBS中止反應。結果顯示，插入GFP的高度減毒痘苗病毒載體第一代和第六代病毒表達的GFP蛋白量相似。表明高度減毒載體可穩定表達插入的外源目的蛋白。
實施例3在模型動物小鼠中減毒痘苗病毒載體和野生天壇病毒的毒性比較為了鑒定減毒痘苗病毒在體內毒力減小的特性，采用BALB/c小鼠模型系統，通過鼻腔和顱腔兩種不同的途徑分別測定了高度減毒痘苗病毒ZCI及其親本病毒野生天壇株TT在小鼠中的毒力。BALB/c小鼠系統是國際上廣泛使用的動物模型系統，已被證實對痘苗病毒敏感(Betakova et al.，2000，The vaccinia virusA14.5L gene encodes a hydrophobic 53-amino-acid virion membrane proteinthat enhances virulence in mice and is conserved among vertebratepoxviruses.J Virol，74(9)，4085-92；Lee，M.S.et al.，Molecular attenuation ofvaccinia virusmutant generation and animal characterization.J Virol，66(5)，2617-30；Zhang.W.H.et al.，Vaccinia virus F12L protein is required for actintail formation，normal plaque size，and virulence.J Virol，74(24)，11654-62)，被大量用于痘苗病毒的毒性和感染性實驗。
1)鼻腔接種途徑的毒力實驗將5周齡的BALB/c小鼠分組，每組5只，從鼻腔途徑分別接種用PBS稀釋的106PFU和105PFU的改良天壇病毒ZCI和野生天壇病毒；用相同體積的PBS(30ul)鼻腔接種另一組小鼠作為對照組。在連續10天的觀察期中，每天測定各組小鼠的體重，并以小鼠平均體重相當于起始體重的百分比作縱坐標對觀察天數作圖。不同病毒在BALB/c小鼠中的毒性見圖4，其中圖4A為接種106PFU劑量病毒對小鼠體重的影響，圖4B為接種105PFU劑量病毒對小鼠體重的影響。
接種任何一組病毒的小鼠在試驗期間都沒有死亡，但卻出現了不同的體重變化。接種106PFU TT病毒的小鼠發生嚴重的體重下降，到第九天時，體重減少約30％；在接種105PFU TT的小鼠中體重減輕也十分明顯，在接種后的第八天，體重下降了約20％。而所有接種ZCI的小鼠(劑量從105到106PFU)，都沒有出現體重的減輕，小鼠在觀察期間一直保持與PBS對照組相似的體重增長(圖4A、B)。實驗結果表明改良天壇病毒ZCI在動物體內高度減毒。
2)顱腔接種途徑的毒力實驗將3周齡的BALB/c小鼠分組，每組6只，從顱腔途徑分別接種10ul用PBS系列稀釋的純化改良天壇病毒和野生天壇病毒。在注射24小時內死亡的小鼠不計入實驗結果。在連續14天的觀察期中，每天觀察小鼠接種后的反應，并記錄小鼠的死亡情況，用Reed-Muench方法計算病毒的半數致死劑量LD50。
術語‘半數致死劑量’(LD50)是指，導致50％實驗對象死亡的接種病毒的劑量。通常用Reed-Muench方法計算，公式為半數致死劑量(LD50)＝50％感染率的高臨界稀釋度倒數的對數+距離比×稀釋系數的對數，式中，距離比＝(50％的高臨界感染率-50％)/(50％高臨界感染率-50％的低臨界感染率)。
野生天壇病毒的IC LD50是103.46PFU(3.46 Log10單位)，而改良天壇病毒ZCI未能測出IC LD50，當接種我們能得到的最大劑量的ZCI病毒(3.5×106PFU/10μl)時，ZCI在觀察期內未能引起小鼠死亡，甚至未能造成接種小鼠體重下降。由于在14天的觀察期內，ZCI未能造成小鼠死亡，因此進一步的延長觀察時間至60天，改良天壇病毒ZCI仍然不能致小鼠死亡，因此改良天壇病毒對小鼠的最大耐受量至少為3.5×106PFU。由于痘苗病毒是嗜神經性病毒，有可能導致種痘后的急性腦炎等嚴重并發癥，而顱腔接種則可直接造成病毒對中樞神經系統的毒害，因而小鼠顱內注射半致死劑量(IC LD50)與病毒的神經毒性密切相關。顱腔途徑接種病毒的實驗結果表明，減毒病毒ZCI的神經毒性比野生天壇病毒下降至少1000倍。
3)病毒在動物顱內的復制痘苗病毒是嗜神經病毒，病毒在動物顱腔神經系統中的復制將對中樞神經組織產生直接的毒害。因此研究病毒在顱內的復制動力學將為鑒定病毒是否在體內減毒提供重要的依據。
將3周齡的BALB/c小鼠分為兩組，每組十只，分別經顱腔接種1.1×104PFU的野生天壇病毒和減毒痘苗病毒(病毒懸于10ul無菌PBS中)，從接種后的第二天起連續五天檢測小鼠腦內病毒的滴度。其方法為，每天每實驗組取兩只小鼠，處死后迅速在超凈臺中消毒解剖，完整取出腦組織，用PBS在玻璃勻漿器中勻漿，定容到相同的體積。樣品凍化三次后，經2000rpm離心20分鐘，去除細胞沉淀，上清在Vero中測定病毒的滴度。每個腦組織分別測定滴度，每天的兩只小鼠滴度平均后對測定天數作動力學曲線(圖5)。
實驗結果顯示，接種野生痘苗病毒的小鼠顱內病毒滴度呈迅速上升，其病毒滴度最高達到1.7×104PFU/動物腦。第五天，由于野生痘苗病毒產生的毒性，兩只實驗小鼠死亡，因而未能獲得第五天的數據。接種減毒痘苗病毒的實驗小鼠，其顱內的病毒滴度僅顯示有緩慢的增長，最高滴度為1.2×102PFU/動物腦，比接種野生天壇病毒小鼠的腦內病毒滴度低140倍。該結果表明，減毒痘苗病毒在動物腦中樞神經系統中的復制水平顯著下降，這是減毒痘苗病毒神經毒性急劇下降的一個重要原因。
實驗結果證實，無論是鼻腔接種，還是進行直接的顱內注射，高度減毒痘苗病毒ZCI都顯示出在體內高度減毒和痘苗病毒特有的嗜神經毒性極度降低的特征，減毒痘苗病毒在動物中樞神經系統中復制水平的下降是該病毒在體內減毒的重要原因之一。因此，以高度減毒痘苗病毒為載體構建人或動物的活病毒載體疫苗，或將其用于癌癥等人類疾病的基因治療及預防性藥物的開發，或用于表達外源基因或抗原都將具有更高的安全性。
實施例4高度減毒痘苗病毒在構建安全的人用候選艾滋疫苗中的應用自1985年中國首次報告艾滋病病例以來，艾滋病在中國的流行呈逐年上升趨勢，到目前已進入艾滋病發病的快速增長期。迅速采取有效措施遏制HIV-1的擴散和對AIDS患者進行有效的治療，是中國政府和醫療科研人員刻不容緩的責任。國外學者提出的高效抗逆轉錄病毒治療能夠有效地抑制HIV-1的復制和延長AIDS患者的壽命，然而其昂貴的費用使得發展中國家望而卻步。與此同時，AIDS疫苗作為有潛力的預防手段而使全世界寄以厚望。曾作為預防天花病毒疫苗的痘苗病毒，由于其諸多的優點而被改造成活病毒載體表達外源基因或構建基因工程疫苗，預防和治療多種人類和動物的傳染性疾病。痘苗病毒天壇株曾在中國廣泛使用，有著很好的免疫原性和相對安全的特征，但由于其仍保留一定的對生物體的毒性，可能引起包括腦炎在內的各種并發癥，尤其是有可能對免疫抑制的人群，如艾滋病病人或HIV病毒攜帶者產生嚴重的影響，因而不適合直接用作構建疫苗的載體。
本發明的減毒痘苗病毒，由于失活HA基因而導致高度減毒，尤其是其神經毒性的急劇降低，使得該載體具有更高的安全性，可用于構建針對中國人群使用的艾滋病治療或預防性疫苗。
1)對在華中地區流行的HIV-1進行分子流行病學調查，確定此地區的主要流行株為HIV-1泰國B亞型毒株(B’)(Su et al.，2003，HIV-1 subtype B′dictates the AIDS epidemic among paid blood donors in the Henanand Hubei provinces of China.AIDS，17(17)，2515-20)。
2)據此構建了代表華中地區流行株的全長分子克隆，以此為基礎，克隆流行株中的相應基因作為外源目的基因，以構建針對該地區艾滋病流行的預防和治療性疫苗。
3)構建含目的外源基因HIV-1包膜蛋白Env的DNA序列的穿梭質粒，位于其兩側的側翼序列與用于重組獲得減毒痘苗病毒ZCI的穿梭質粒的側翼序列相同，并使外源DNA序列處于痘苗病毒啟動子的控制之下。
4)在痘苗病毒的允許細胞中(如Vero)使穿梭質粒與減毒痘苗病毒天壇株ZCI同源重組，使env序列插入減毒痘苗病毒ZCI中替換出標記基因GFP。
5)在允許細胞Vero中反向篩選失去GFP熒光標記的重組病毒，獲得可表達Env的高度減毒的重組病毒，并在Vero細胞中擴大和純化。
6)env減毒重組痘苗病毒在允許細胞Vero中的表達將含env基因的減毒重組痘苗病毒以0.01MOI接種成片的Vero細胞，吸附90分鐘，更換新鮮的含10％NCS的DMEM培養基繼續培養24小時。按本文前述的方法進行免疫染色，其中一抗為艾滋病患者血清，從一名小于20歲的艾滋病患者血樣中分離獲得。在陰性對照實驗中，用相同MOI的減毒重組痘苗病毒ZCI接種Vero細胞，以相同的艾滋病患者血清為一抗進行免疫染色。env重組痘苗病毒感染產生的噬斑均顯示棕紅色(圖6A)，而重組痘苗病毒ZCI感染產生的噬斑不能被染色(圖6B)。該結果表明，env已成功重組到減毒痘苗病毒的基因組中，并能有效表達。
7)在該重組病毒的其它非必需基因區可進一步用同源重組的方法插入其它一種或幾種來自艾滋病中國流行株的基因或其它刺激機體免疫的有效成分的基因，構建不同組合的多價艾滋病候選疫苗，以提高疫苗的預防或治療效果。
權利要求
1.一種減毒痘苗病毒天壇株載體，痘苗病毒載體為高度減毒痘苗病毒(TT.WHU.ZCl).CCTCCV200417。
2.一種用于實現權利要求1所述的一種減毒痘苗病毒天壇株載體的制備方法，它包括下列步驟A.構建穿梭質粒，該質粒包含與痘苗病毒天壇株HA基因編碼區序列或編碼區外兩側序列同源的側翼序列，或該質粒包含與痘苗病毒天壇株HA基因啟動子序列或其兩側序列同源的側翼序列；B.在痘苗病毒的允許細胞中使穿梭質粒與痘苗病毒天壇株同源重組，以使痘苗病毒HA基因失去功能，達到對痘苗病毒進行高度減毒的目的，獲得具有以上特征的減毒痘苗病毒；C.通過篩選標記，對重組病毒進行單斑篩選，以分離獲得純的高度減毒痘苗病毒。
3.一種減毒痘苗病毒天壇株載體在制備治療或預防傳染性疾病的疫苗中的應用。
4.一種減毒痘苗病毒天壇株載體在制備治療或預防腫瘤的藥物中的應用。
5.一種減毒痘苗病毒天壇株載體在表達外源基因中的應用。
6.一種減毒痘苗病毒天壇株載體在表達外源病原體抗原制備病原體檢測和診斷試劑中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種減毒痘苗病毒天壇株載體及制備方法和應用，高度減毒痘苗病毒(TT.WHU.ZCI)，CCTCCV200417；A.構建穿梭質粒，該質粒包含與痘苗病毒天壇株HA基因編碼區序列或編碼區外側序列同源的側翼序列，或該質粒包含與痘苗病毒天壇株HA基因啟動子序列或其外側序列同源的側翼序列；B.使穿梭質粒與痘苗病毒天壇株同源重組，以使痘苗病毒HA基因失去功能，達到對痘苗病毒天壇株高度減毒的目的。該減毒痘苗病毒天壇株載體在制備治療或預防傳染性疾病的疫苗中的應用。
文檔編號A61P35/00GK1654666SQ200510018130
公開日2005年8月17日 申請日期2005年1月11日 優先權日2005年1月11日
發明者陳志偉, 張林琦, 方清, 田波 申請人:武漢大學