專利名稱：一種含多種靈芝活性成分的中藥組合物及其制備方法
技術領域：
本發明屬中藥領域，涉及中藥組合物，具體涉及一種含多種靈芝活性成分的中藥組合物及其制備方法。
背景技術：
在我國悠久的傳統中草藥寶庫中，靈芝以其具有的藥用價值及其滋補強壯、扶正固本、延年益壽等獨特功效馳名中外。靈芝為靈芝科靈芝屬(Ganoderma Karst)真菌，靈芝孢子粉是靈芝生長過程中所萌發的一種孢子。目前市場多以單一靈芝或以靈芝與靈芝孢子粉所組成的產品存在，產品成分標示物僅為單一成分多糖含量、單一成分三萜含量或三萜和多糖二成分作為控制指標，其制備工藝均為通用的多功能提取、烘箱干燥法工藝。由于多功能提取設備對活性成分選擇性提取效率低、提取所得浸膏長期處于高溫烘箱內干燥，故活性成分易受分解。經對比研究發現其中活性成分特別是多糖肽受熱易分解為多糖和氨基酸，導致對藥效有所影響。
研究證實靈芝和靈芝孢子粉內含有效活性成分為三萜、多糖和多糖肽。
1、靈芝中的三萜類化合物主要為靈芝酸、靈芝孢子酸、赤芝孢子內酯等四環、五環三萜等甾烷衍生物，共計發現了103種三萜類化合物中。三萜類化合物是靈芝中極為重要的具有明顯生理活性的一類化合物，具有抑制腫瘤細胞和抗病毒活性等多種生理活性，如靈芝酸(gamoderiC acid)A，B，C和D能抑制小鼠肌肉細胞組胺的釋放，靈芝酸F(gamoderiC acidF)具有很強的抑制血管緊張素酶的活性，赤芝抱子酸A(ganospOreric acidA)則對Ccl4和半乳糖胺及丙酸桿菌造成的小鼠轉氨酶升高有降低作用；除此之外還具有保肝作用、抗腫瘤作用、抗HIV-1及HIV-1蛋白酶活性、抑制膽固醇合成、鎮痛作用、對血小板聚集的影響、對蛋白金合歡酯轉移酶的抑制作用和抗氧化作用的十大藥理作用。表現出明顯的免疫抗腫瘤作用外，對一些體外培養的腫瘤細胞系如人的宮頸癌Hela細胞、肝癌細胞Hepq、白血病細胞HL60等有直接的毒害作用。
2、靈芝內含大量的多糖成分，以β-葡聚糖組分的β(1-3)葡萄糖苷主鏈上每12個殘基通過β(1-6)連接一個單核苷支鏈的代表性成分顯示顯著的抗S180腫瘤活性，50％抑瘤率劑量為0.74mg/kg；而α-葡聚糖僅具有α(1-6)支鏈，其抗瘤作用非常微小。另外，多糖的三維螺旋結構參與其抗腫瘤活性，破壞此結構則影響活性。被認為是靈芝具有抗腫瘤、調節免疫、抗衰老、扶正固本的主要有效成分之一，它能增強細胞、體液的免疫調節作用，調節核酸和蛋白質的代謝平衡，清除氧自由基，延長體外傳代細胞分裂代數的能力。
3、靈芝多糖肽(Ganoderma lucidum polysaccharides peptide GLPP)由16種氨基酸構成，研究表明GLPP對體內、外氧自由基損傷均有明顯保護作用，特別是激光共聚焦顯微鏡時間序列程序掃描實驗結果顯示，GLPP體外給藥，在加藥瞬間可迅速減少靜息狀態小鼠腹腔巨噬細胞氧自由基含量，表明GLPP能對已經存在的自由基有直接清除作用，使細胞內總的自由基水平迅速降低。在PMA引起的巨噬細胞“呼吸爆發”引起的氧自由基的含量增加時，GLPP也能使其含量迅速減少。
發明內容
本發明的目的是提供一種含多種靈芝活性成分的中藥組合物。本發明的另一目的是提供所述中藥組合物的制備方法。
本發明組合物以總三萜含量，多糖含量和多糖肽含量為控制指標的靈芝提取物和靈芝孢子粉作為活性成分制備組合物；所述靈芝提取物和靈芝孢子粉的重量比例為0.5～1.5∶0.5～1.5；所述組合物中的總三萜含量為0.2～0％，多糖含量為3～50％，多糖肽含量0.1～15％。
本發明通過下述方法和步驟制備本發明的提取方法不同于傳統靜態提取方法，傳統靜態提取方法是將靈芝粉碎成粗粉，加乙醇加熱回流提取3次，濾過(藥渣備用)，合并濾液，減壓回收乙醇，并濃縮成浸膏，備用；藥渣加水煎煮3次，合并煎液，濾過，濾液減壓濃縮至浸膏，備用；合并上述兩種浸膏，烘箱干燥，配以靈芝孢子所形成的組成物。
本發明采用中藥材靈芝，進行動態提取、噴霧干燥后，檢測其中靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝多糖肽的含量及靈芝浸膏得率，加入破壁的靈芝孢子，制備組合物，進一步制成散劑、膠囊劑、片劑和軟膠囊等制劑；再檢測其中靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝多糖肽的含量，以此為指標，調控本發明動態提取靈芝的質量標準，使靈芝發揮最佳的藥效作用。
本發明所用中藥材靈芝采用福建產或安微產多孔菌科真菌赤芝Gano-derma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst.的干燥子實體。
將所述靈芝粉碎成小粒，投入JVYZ-5002型3m3固液渦流式動態提取罐中，添加水，加熱保持微沸狀態，攪拌下提取，濾過，濾液備用；藥渣再以加乙醇攪拌微沸狀態下提取，濾過，濾液備用，藥渣再加水提取后，藥渣與溶劑一同排入離心機中，過濾收集濾液，合并濾液，濃縮成浸膏在進風溫度為140-180℃、出風溫度為40-80℃條件下噴霧干燥，過篩形成混合物。經檢測，其中活性組分總三萜含量為0.2-8％、多糖含量為3-40％、多糖肽含量0.01-6。再配以經3-25分鐘粉碎的靈芝孢子粉，將上述混合物與靈芝孢子以0.5-1.5∶0.5-1.5的比例混合制成本發明藥物組合物。檢測其中的活性成分為總三萜含量為0.2-10％、多糖含量為3-50％、多糖肽含量0.1-15％。進一步按常規方法制備成散劑、膠囊劑、片劑或軟膠囊。
測定靈芝多糖的含量1、制備對照品溶液精密稱取105℃干燥至恒重的無水葡萄糖60mg，置100ml量瓶中，加水溶解并稀至刻度，搖勻即得，每1ml含無水葡萄糖0.6mg。
2、制備標準曲線精密量取對照品葡萄糖溶液0.0ml、1.0ml、1.5ml、2.0ml、2.5ml、3.0ml分別置50ml量瓶中，加水至刻度，搖勻。精密量取上述溶液各2ml，置具塞試管中，分別加4％苯酚溶液1ml，混勻，迅速加入硫酸7.0ml，搖勻，于40℃水浴中保溫30分鐘，取出，置冰浴中5分鐘，取出，以第一份為空白，照分光光度法(中國藥典2000年版一部附錄V B)，在489nm的波長處測定吸收度，以吸收度為縱坐標，濃度為橫坐標，繪制標準曲線。
3、測定法取靈芝組合物1g，精密稱定，置研缽中，加熱水少量研勻，移置100ml量瓶中，研缽用熱水洗滌數次，洗滌液并入量瓶中，水浴加熱30分鐘，冷卻后，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，精密量取續濾液2ml，加乙醇8ml，攪拌，離心，取沉淀加水溶解，置50ml量瓶中，并稀釋至刻度，精密量取2ml，照標準曲線的制備項下的方法，自“加4％苯酚溶液1ml”起，依法測定吸收度，從標準曲線上讀出供試品溶液中靈芝多糖的重量(μg)，計算，即得。
測定三萜含量1、制備標準曲線①標準溶液制備精密稱取齊墩果酸標準品10mg，以三氯甲烷溶解并定容至100ml。其濃度為0.1mg/ml。
②標準曲線測定分別吸取標準溶液0、0.10、0.20、0.50、1.00、1.50ml于試管中，水浴加熱揮去溶劑，冷卻加入香草醛溶液0.5ml，硫酸溶液5ml混勻后，置于60℃水浴中保溫30min，取出后冰浴放置15min，用1ml的比色皿，以空白試劑作為參比調零，于波長550±2nm處測定吸光值，繪制標準曲線。
2、樣品處理稱取靈芝組合物0.2000g于25ml納式比色管中，加三氯甲烷近刻度，超聲1h，冷卻后用三氯甲烷定容至25ml，搖勻，過濾，濾液備用。
3、樣品測定精密吸取濾液0.5ml于玻璃試管中，水浴加熱揮去溶劑，冷卻加入香草醛溶液0.5ml，硫酸溶液5ml混勻后，置于60℃水浴中保溫30min，取出后冰浴放置15min，用1ml的比色皿，以空白試劑作為參比調零，于波長550±2nm處測定吸光值。從標準曲線上找出相應的含量數值。
測定多糖肽含量1、制備標準曲線①標準溶液制備精確稱取對照品多糖肽25mg，置100ml容量加，少許水攪勻，60℃超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成500μg/mg。
②標準曲線測定精密吸取上述溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0分別置于10ml的容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。即成0、50、100、150、200μg/ml。精密量取上述液各1ml分別加蛋白試劑5ml搖勻，放置2分鐘，在分光光度計605nm的處測定吸收度。以濃度為橫坐標，吸收值為縱坐標，繪制標準曲線。
2、樣品制備稱取靈芝組合物0.2000g于25ml水，超聲，冷卻后用四氯甲烷定容至25ml，搖勻，收集水層濃縮，加水稀釋定容至25ml，備用。
3、樣品測定
精確量取上述液0.5ml加水0.5ml混勻，加入5ml蛋白試劑，2分鐘后在分光光度計605nm處讀取吸收度，計算含量。
經藥理實驗證實本發明組合物采用固液渦流式動態提取噴霧干燥再組配破壁靈芝孢粉不僅能選擇性地提高多糖、三萜和多糖肽的含量，而且還有助于降低生產過程的能耗，提高工時效力。經對實驗性高血糖小鼠血糖濃度抑制、對小鼠移植H22肝癌細胞的抑瘤試驗、對小鼠移植H22肝癌細胞的抑瘤試驗、對荷瘤小鼠減輕放、化療副作用反應的藥理模型對比實驗，結果顯示，本發明的組合物藥效作用明顯優于已知產品。
表1是不同的提取方法及其所制備的組合物內含成分及能耗等比較。
表1
本發明組合物進行了動物實驗1、對實驗性高血糖小鼠血糖濃度的影響取昆明種小鼠，雄性，體重18-20g，小鼠56只，隨機分為(1)正常對照組；(2)高血糖模型對照組；(3)-(5)本發明組合物組；(6)為靜態提取烘箱干燥工藝組成的組合物；(7)為動態提取烘箱干燥工藝組成的組合物。高血糖模型對照組與各序號組加腹腔注射四氧嘧啶(Alloxan)(ip)200mg/kg體重。72h后測定空腹血糖濃度。隨后，對正常對照組和高血糖模型對照組灌胃(ig)生理鹽水700mg/kg體重，本發明組分別給予不同劑量的本發明組合物生理鹽水溶液，連續給藥6d，第6次灌胃后6h及12h分別采血，采用葡萄糖氧化酶法(試劑盒由北京中生生物工程高技術公司提供)測定血中葡萄糖含量。實驗結果顯示本發明的組合物對實驗性高血糖小鼠血糖濃度有明顯的下降趨勢。
表2是不同方法制備的組合物對實驗性高血糖小鼠血糖濃度的影響(x±s)。
表2
其中ap＜0.05，bp＜0.01與對照組比較；cp＜0.05，dp＜0.01與AIloxan組比較2、對小鼠移植H22肝癌細胞的抑瘤試驗昆明小鼠70只，體重18-25g，♂♀各半，分7組試驗，每組10只，對小鼠腋部皮下接種H22肝癌細胞，24小時后。試驗組灌胃給藥劑量分別為0.8g/Kg(1)3-5為本發明組合物實例1-3，6為靜態提取烘箱干燥工藝組成的組合物；7為動態提取烘箱干燥工藝組成的組合物。(2)對照組實體癌蒸餾水組。(3)實體癌環磷酰胺(20mg/Kg/日)陽性對照組。各序號組每日給藥一次，連續給出藥10d。試驗結果，均有顯著差異。實驗結果顯示本發明組合物對小鼠H22肝癌生長抑制率明顯高。
表3是不同制備方法的組合物對小鼠H22肝癌生長的影響比較。
表3
3、對荷瘤小鼠減輕放、化療副作用的反應試驗組組合物劑量分別為0.8g/Kg序號4-6為本發明組合物實例1-3，序號7為靜態提取烘箱干燥工藝組成的組合物；序號8為動態提取烘箱干燥工藝組成的組合物，各組每日給藥三次，連續灌胃給出藥10d。觀察荷瘤小鼠用60Co(500拉德)全身照射損傷的拮抗作用。試驗表明，服用本發明組合物對荷瘤小鼠減毒作用明顯強。表4是不同制備方法的組合物對荷瘤小鼠60Co照射后血象及骨髓有核細胞的影響。
表4
其中***為與荷瘤對照組比較p＜0.01、**為與荷瘤對照組比較p＜0.05本發明的特點在于采用靈芝破碎成小粒，進行固液渦流式動態提取后噴霧干燥，再以提取的活性成分組配破壁靈芝孢子粉制備組合物；以組合物中含靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝多糖肽及靈芝浸膏得率為指標，調控本發明動態提取靈芝的質量標準；經活性成分含量和藥效作用的比較，證實了本發明方法及制備的組合物的優勢。
本發明與靜態提取方法工藝及其產品進行比較，結果顯示具有如下優點①三種活性物質的相對含量高，②干浸膏收率高而穩定，③生產用工時間縮短，④生產能耗低，⑤產品外觀質量好。
具體實施例方式
實施例1取靈芝1000克粉碎成小粒，投入JVYZ-5002型3m3固液渦流式動態提取罐中，添加水，加熱保持微沸狀態，攪拌下提取，濾過，濾液備用；藥渣再以加乙醇攪拌微沸狀態下提取，濾過，濾液備用，藥渣再加水提取后，藥渣與溶劑一同排入離心機中，過濾收集濾液，合并濾液，濃縮成浸膏在進風溫度為150℃、出風溫度為70℃條件下噴霧干燥，過篩，測得總三萜含量為0.8％、多糖含量為20％、多糖肽含量0.08％活性多組分的混合物，再配以經15分鐘粉碎的靈芝孢子粉，按混合物與靈芝孢子0.8∶1.2組成組成物，按已知方法制成散劑，經檢測得活性成分總三萜含量為1.5％、多糖含量為40％、多糖肽含量0.5％。
實施例2取靈芝1000克粉碎成小粒，投入JVYZ-5002型3m3固液渦流式動態提取罐中，添加水，加熱保持微沸狀態，攪拌下提取，濾過，濾液備用；藥渣再以加乙醇攪拌微沸狀態下提取，濾過，濾液備用，藥渣再加水提取后，藥渣與溶劑一同排入離心機中，過濾收集濾液，合并濾液，濃縮成浸膏在進風溫度為160℃、出風溫度為70℃條件下噴霧干燥，過篩，測得總三萜含量為0.3％、多糖含量為20％、多糖肽含量1.2％活性多組分的混合物，再配以經20分鐘粉碎的靈芝孢子粉，按混合物與靈芝孢子1∶1組成經測得形成活性成分為總三萜含量為0.5％、多糖含量為30％、多糖肽含量4％的組成物，并制成片劑。
實施例3取靈芝1000克粉碎成小粒，投入JVYZ-5002型3m3固液渦流式動態提取罐中，添加水，加熱保持微沸狀態，攪拌下提取，濾過，濾液備用；藥渣再以加乙醇攪拌微沸狀態下提取，濾過，濾液備用，藥渣再加水提取后，藥渣與溶劑一同排入離心機中，過濾收集濾液，合并濾液，濃縮成浸膏在進風溫度為150℃、出風溫度為50℃條件下噴霧干燥，過篩，測得總三萜含量為0.3％、多糖含量為15％、多糖肽含量1.6％活性多組分的混合物，再配以經5分鐘粉碎的靈芝孢子粉，按混合物與靈芝孢子1.4∶0.8組成經測得形成活性成分為總三萜含量為5％、多糖含量為20％、多糖肽含量5.5％的組成物，并制成膠囊。
實施例4取靈芝1000克粉碎成小粒，投入JVYZ-5002型3m3固液渦流式動態提取罐中，添加水，加熱保持微沸狀態，攪拌下提取，濾過，濾液備用；藥渣再以加乙醇攪拌微沸狀態下提取，濾過，濾液備用，藥渣再加水提取后，藥渣與溶劑一同排入離心機中，過濾收集濾液，合并濾液，濃縮成浸膏在進風溫度為160℃、出風溫度為60℃條件下噴霧干燥，過篩，測得總三萜含量為5％、多糖含量為3％、多糖肽含量6％活性多組分的混合物，再配以經10分鐘粉碎的靈芝孢子粉，按混合物與靈芝孢子1∶1.2組成經測得形成活性成分為總三萜含量為7.9％、多糖含量為5％、多糖肽含量8.7％的組成物，并制成軟膠囊。
實施例5將上述實施例1-4的組合物與已知產品對小鼠H22肝癌抑制率藥效試驗比較取昆明小鼠80只，體重18-25g，♂♀各半，分8組試驗，每組10只，對小鼠腋部皮下接種H22肝癌細胞，24小時后，各試驗組灌胃給藥劑量分別為0.8g/Kg(1)序號3-6為本發明組合物實例1-3，序號7-8為已知產品。(2)對照組實體癌蒸餾水組。(3)實體癌環磷酰胺(20mg/Kg/日)陽性對照組。各序號組每日給藥一次，連續給出藥10d。結果顯示本發明的含多種靈芝活性成分的中藥組合物對小鼠H22肝癌抑制率較已知產品抑制率高。表4是對小鼠H22肝癌抑制率藥效試驗結果。
表4
權利要求
1.一種含多種靈芝活性成分的中藥組合物，其特征是以總三萜含量，多糖含量和多糖肽含量為控制指標的靈芝提取物和靈芝孢子粉作為活性成分；所述靈芝提取物和靈芝孢子粉的重量比例為0.5～1.5∶0.5～1.5；所述組合物中的總三萜含量為0.2～10％，多糖含量為3～50％，多糖肽含量為0.1～15％。
2.按權利要求1所述的含多種靈芝活性成分的中藥組合物，其特征是所述靈芝提取物和靈芝孢子粉的重量比例為0.8∶1.2，所述組合物中的總三萜含量為1.5％，多糖含量為40％，多糖肽含量為0.5％。
3.按權利要求1所述的含多種靈芝活性成分的中藥組合物，其特征是所述靈芝提取物和靈芝孢子粉的重量比例為1∶1，所述組合物中的總三萜含量為0.5％，多糖含量為30％，多糖肽含量為4％。
4.按權利要求1所述的含多種靈芝活性成分的中藥組合物，其特征是所述靈芝提取物和靈芝孢子粉的重量比例為1.4∶0.8，所述組合物中的總三萜含量為5％，多糖含量為20％，多糖肽含量為5.5％。
5按權利要求1所述的含多種靈芝活性成分的中藥組合物，其特征是所述靈芝提取物和靈芝孢子粉的重量比例為1∶1.2，所述組合物中的總三萜含量為7.9％，多糖含量為5％，多糖肽含量為8.7％。
6.權利要求1所述的含多種靈芝活性成分的中藥組合物的制備方法，其特征是采用中藥材靈芝，經固液渦流式動態提取、噴霧干燥后，檢測其中靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝多糖肽的含量及靈芝浸膏得率，加入破壁的靈芝孢子粉，制備組合物。
7.如權利要求書6所述的方法，其中所述的噴霧干燥的進風溫度為140-180℃，出風溫度為40-80℃。
8.如權利要求書6所述的方法，其中所述的破壁的靈芝孢子粉的破壁時間為3-25分鐘。
9.如權利要求書6所述的方法，其中所述的檢測提取物中的靈芝多糖、靈芝三萜、靈芝多糖肽的含量分別為三萜0.2-8％、多糖3-40％、多糖肽0.01-6％。
10.按權利要求1所述的含多種靈芝活性成分的中藥組合物，其特征所述組合物是散劑、膠囊劑、片劑或軟膠囊。
全文摘要
本發明屬中藥領域，具體涉及一種含多種靈芝活性成分的中藥組合物及其制備方法。本發明采用中藥材靈芝，進行動態提取、噴霧干燥后，檢測其中多種靈芝活性成分的含量及靈芝浸膏得率，加入破壁的靈芝孢子，以其中靈芝多糖3～50％、三萜0.2～10％、多糖肽0.1～15％的含量為指標，調控本發明動態提取靈芝的質量標準，制備組合物，制成散劑、膠囊劑、片劑和軟膠囊等制劑；本發明能選擇性地提高多糖、三萜和多糖肽的含量，降低生產過程的能耗，提高工時效力。經動物實驗結果顯示，能抑制小鼠血糖濃度和H
文檔編號A61K9/14GK1891240SQ20051002746
公開日2007年1月10日 申請日期2005年7月1日 優先權日2005年7月1日
發明者劉梅英, 吳云鳴, 李寶棣, 王峰 申請人:西安綠谷制藥有限公司, 綠谷(集團)有限公司