專利名稱：黃連、吳茱萸藥對提取物在制備防治癌癥藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥技術領域。具體涉及黃連、吳茱萸的藥對提取物在制備防治癌癥藥物中的應用。
背景技術：
結腸腺癌是西方國家和發達國家惡性腫瘤中引起死亡的第二大殺手。在美國，每年約有5-6萬人死于結腸腺癌和15萬的新患者。目前，中國隨著經濟的高速發展，人們生活環境的改變，飲食結構的變化以及工作節奏的加快，結腸腺癌的發病率逐年遞增，已成為威脅人們健康的主要病種之一，對其進行深入的研究和提出防治策略，是人們關注的問題。
黃連、吳茱萸兩味藥構成的藥對，配比不同，其組成的復方亦各不相同。黃連、吳茱萸構成比例為6∶1時，組成左金丸《丹溪心法》；其構成比例為1∶1時，組成戊己丸《古今醫統》、抑青丸《張氏醫通》和赤龍丹《圣濟總錄》。左金丸的主要功效為清肝瀉火，降逆止嘔；主治肝郁化火，胃失和降，吞酸嘈雜，嘔吐脅痛等；現代臨床主要用于治療胃和十二指腸潰瘍、急慢性胃炎、食道炎和腹瀉等。許多實驗研究已證明黃連、吳茱萸兩味藥組成的左金丸對胃潰瘍和胃炎具有良好的止酸作用。戊己丸、抑青丸和赤龍丹的主要功效為調和肝脾、運化水濕；主治胃痛吞酸、腹痛泄瀉等。最近，本發明人研究了黃連、吳茱萸兩味藥總提物、總生物堿不同配伍對胃粘膜、結腸粘膜分泌和胃腸平滑肌的作用，證明黃連、吳茱萸具有很強的抑制結腸分泌和松弛胃腸平滑肌的功能以及抑制受體激活造成的胃粘膜酸分泌的增加，這些作用潛在地說明了黃連吳茱萸具有抗結腸腺癌的作用。
對中藥黃連的化學研究表明，黃連中的所含的主要有效成分為小檗堿、巴馬丁堿、藥根堿、黃連堿、甲基黃連堿等，其抗癌作用可能是上述成分的總合作用。目前，美國已將黃連水提物投放I期臨床，旨在通過黃連水提物對各種癌癥病人腫瘤活檢組織周期素B1表達的下調作用結果的觀察和分析，制定抑制細胞周期特異性激酶從而達到阻制腫瘤細胞生長的抗腫瘤新藥的研發戰略。對黃連有效成分的研究表明，小檗堿能夠抑制人結腸癌細胞株COX-2轉錄活性；誘導人白血病HL-60細胞的凋亡，其凋亡可能涉及到細胞周期S期停滯xx。對原小檗堿型生物堿的研究表明表小檗堿(epiberberine)和groenlandicine具有抑制哺乳動物中DNA拓撲異構酶I的活性。9-去甲小檗堿對DNA拓撲異構酶II具有抑制作用。由此表明，原小檗堿型生物堿是一類DNA拓撲異構酶I、II抑制劑。Kang MR和Chung IK發現berberrubine(小檗紅堿)是DNA拓撲異構酶IIα抑制劑，能夠明顯地下調結腸腺癌細胞(AMC5)DNA拓撲異構酶IIα基因表達。綜上所述，黃連提取物和有效成分原小檗堿型生物堿抑制細胞增殖的作用是多方面的，但確切的機制仍有待于進一步的揭示。
對中藥吳茱萸的化學研究表明，吳茱萸中所含的有效成分主要為檸檬苦素、吳茱萸內脂、吳茱萸堿、羥基吳茱萸堿和吳茱萸次堿等。對吳茱萸有效成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿的研究表明，僅有吳茱萸堿能夠抑制26-L5結腸癌細胞株、B16-F10黑素瘤細胞株和Lewis肺癌細胞株侵入和轉移，其作用可能與吳茱萸堿在N-14位具有甲基團和C13b位具有存在1個氫原子有關。對吳茱萸有效成分吳茱萸堿、吳茱萸次堿和吳茱萸胺的研究表明，吳茱萸堿能夠抑制HeLa和黑素瘤A375-S2細胞株的增殖和誘導其凋亡，對這兩種細胞，吳茱萸堿誘導調亡的機制是不同的；在HeLa細胞，吳茱萸堿誘導caspase-3，8依賴性調亡與細胞周期G2/M期停滯相關；而在A375-S2細胞，吳茱萸堿誘導caspase-3，8依賴性調亡涉及到MAPK-介導的壞死xx。吳茱萸堿抑制人前列腺癌細胞株LNCap的研究表明，吳茱萸堿加速細胞周期的G2/M期和誘導細胞凋亡。由此可見，在不同的細胞，吳茱萸堿誘導細胞凋亡的機制是不同的。新近的報道認為吳茱萸次堿是一種新的COX-2抑制劑，但是否能夠抑制腫瘤細胞特別是結腸癌細胞COX-2的表達，目前是不清楚的，有待于進一步的探討。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在于研究設計黃連、吳茱萸在制備防治癌癥藥物中的應用。
為解決上述問題，本發明人應用二甲肼(1，2-dimethylhydrazine)誘發的大鼠異變結腸腸腺病灶(aberrant crypt foci，ACF)的形成，即公認的結腸癌癌前病損，觀察到由1∶1組成的黃連吳茱萸藥對能夠較強地抑制結腸腺癌的生成。當前的研究已證明黃連、吳茱萸均具有抑制腫瘤的作用。黃連提取物具有抑制氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)誘導的ACF形成。對胃、乳腺和結腸癌細胞株的生長抑制的研究證明黃連提取物抑制的靶點可能為細胞周期的G2/M期中周期素-依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1)；在同一研究中，發現小檗堿抑制癌細胞生長的作用遠弱于黃連提取物，說明黃連通過抑制G2/M期中周期素-依賴性激酶1(cyclin-dependent kinase 1)和抑制周期素B1(cyclinB1)蛋白而間接完成癌細胞生長的有效成分并非是小檗堿，而是黃連提取物中各種成分的總合作用。
本發明人設計了具體的實驗方案如下應用二甲肼(1，2-dimethylhydrazine、DMH，Fluka)誘發大鼠結腸上皮增殖與凋亡以及結腸腺癌癌前病變(異變腸腺病灶)；觀察1)黃連吳茱萸對藥水提物對二甲肼誘發大鼠結腸上皮增殖與凋亡的作用，2)對異常腸腺病灶(ACF)形成的抑制作用；說明黃連吳茱萸藥對抑制大鼠結腸癌癌前病變的作用，闡明黃連吳茱萸藥對治療結腸腺癌的應用前景和開發的價值。
一、實驗材料與方法1.實驗材料1)實驗動物雄性Wistar大鼠，體重125-150g，飼養條件為室溫21℃，晝夜各12小時，動物喂藥的時間控制在上午9:00至11:30。喂藥結束后，動物處死的時間同樣控制在上午9:00至下午1:30。所有的動物編號，喂養的籠子亦編號。喂藥動物每周稱重1次，記錄在案。動物購入后，飼養1周，開始實驗。
2)實驗用藥從市場購置黃連(產地為四川)、吳茱萸(產地為貴州)兩味藥，經水提后，過濾濾液。濃縮至干品，按水提物(g)/生藥(g)換算。
黃連、吳茱萸兩味藥的臨床用藥劑量為黃連3.0g，吳茱萸3.0g。按60公斤計算，黃連為0.05g/kg，吳茱萸為0.05g/kg。由于以上是飲片的劑量，藥物經水提后，再進行計算。
根據人的臨床用藥，推算大鼠的用藥劑量如下黃連3.0g÷60公斤×6倍＝0.3g/kg，吳茱萸3.0g÷60公斤×6倍＝0.3g/kg。
以0.3g/kg的黃連、吳茱萸作為中劑量，0.9g/kg作為大劑量，0.1g/kg作為小劑量。
3)藥物制備黃連、吳茱萸水提物制備黃連、吳茱萸經水煎、濃縮和冷凍干燥制成水提物，以水提物(g)/生藥(g)定量地表示實驗中的用藥含量。
黃連經水提后，得到水提物(0.238g)/生藥(g)。吳茱萸經水提后，得到水提物(0.472g)/生藥(g)。黃連、吳茱萸水提物HPLC檢測分析其含量、成分等。
2.實驗設計實驗1雄性Wistar大鼠，自購入后，飼養1周，喂藥1周后，按30mg/kg的DMH經皮下注入大鼠的頸背，1周后注入第2次DMH。在第2次注入DMH后24、48小時，處死動物，觀察藥物對腸腺細胞增殖和凋亡的影響。正常對照組和模型組動物數各5個，中劑量用藥組動物數各為10個，其中5個在24小時時處死，另5個在48小時時處死，動物總數為40個。
DMH溶解于25mM EDTA+137mM NaCl溶液中，重量/容積比為3mg/ml，pH為6.4。
實驗2雄性Wistar大鼠，自購入后，飼養1周，在第2周和第3周的第1天，按30mg/kg的DMH經皮下注入大鼠的頸背，制作異常腸腺病灶(aberrant crypt foci，ACF)模型。在飼養的第4周的第1天開始給藥，共給藥6周。整個實驗周期為9周。本實驗每組的動物數為10-15個，其中對照組、模型組、中劑量組動物數各為15個，10個作ACF的測定，另5個作分子生物學測定。大、小劑量組動物數各為10個，僅作ACF的測定。
3.實驗分組實驗1的動物數共為40只。實驗2的動物數共為105只。
正常組每天灌胃2ml蒸餾水1次。
模型組造模后，給予與正常組等劑量的蒸餾水。
黃連灌胃的藥量溶解于2ml蒸餾水中。造模后4周給藥。
劑量(大)黃連0.9g/kg，劑量(中)黃連0.3g/kg，劑量(小)黃連0.1g/kg。
吳茱萸灌胃的藥量溶解于2ml蒸餾水中。造模后4周給藥。
劑量(大)吳茱萸0.9g/kg，劑量(中)吳茱萸0.3g/kg，劑量(小)吳茱萸0.1g/kg。
黃連吳茱萸1∶1藥對組灌胃的藥量溶解于2ml蒸餾水中。造模后4周給藥。
劑量(大)黃連0.9g/kg，吳茱萸0.9gkg。
劑量(中)黃連0.3g/kg，吳茱萸0.3g/kg劑量(小)黃連0.1g/kg，吳茱萸0.1g/kg4.實驗方法1)結腸腸腺增殖與凋亡的分析動物喂藥結束后，腹腔注射25％烏拉坦(0.5ml/100g體重)麻醉。剖腹，切斷盲結腸交界處和肛直腸處，取出結腸，用Krebs-Ringer液(mMNaCl 115，NaHCO3 25，K2HPO4 2.4，KH2PO4 0.4，CaCl2 1.2，MgCl2 1.2，葡萄糖10)清洗，測量結腸全長，沿著縱軸剖開整段結腸，使粘膜面朝上，以升結腸為起點，以降結腸末端為終點。在結腸的55％處和90％處，取1cm長的結腸一段，分別定為中段結腸、降結腸標本，所有標本的厚度為0.5cm。平整地鋪在濾紙上，用乙醇∶乙酸(75∶25)液固定過夜，標本逐次編號。
應用形態學的方法測定經過細微分離獲得的完整腸腺內凋亡細胞和有絲分裂細胞的頻率和空間分布。通過乙醇∶乙酸(75∶25)液固定的標本經50％乙醇和蒸餾水重新水合后，用60℃的1M HCl脫水7分鐘。然后，用Fuelgen試劑(15mM堿性品紅、45mM焦亞硫酸鉀、5％1N HCl溶解于雙蒸水中)染色標本30分鐘，保存在45％乙酸溶液中。在體視顯微鏡下，用精細的鑷子將結腸標本的肌層分離掉，將去肌層的粘膜平鋪在載玻片上，通過微細的分針將粘膜中的腸腺撥開。隨后，用蓋玻片輕輕地蓋在粘膜條上，顯示出各自分離的腸腺。每個動物隨機地挑選10-20條腸腺進行測定。腸腺的長度通過已校正的顯微鏡目鏡測微尺計算，在光學顯微鏡(放大倍數×400)下，計算每條腸腺中凋亡核和有絲分裂狀的數目。有絲分裂狀細胞的特征為所有處于分裂早期、中期、后期和末期的核都歸屬于有絲分裂細胞。凋亡細胞的特征為呈現密集的橢圓形或月牙形凋亡小體，或者出現微小的、排列不規則的顆粒，這些顆粒表示凋亡后期由于吞噬作用和溶酶體消化呈現出的固縮核染質。利用顯微鏡目鏡測微尺測定腸腺中凋亡核和有絲分裂核的位置，每條腸腺的縱向長度從底部至開口處，被分成10個等份，計算每個等份中的凋亡核和有絲分裂核的數目。
2)異變腸腺病灶(aberrant cryptfoci，ACF)的測定動物喂藥結束后，腹腔注射25％烏拉坦(0.5ml/100g體重)麻醉。剖腹，取出整段結腸，用Krebs-Ringer液(mMNaCl 115，NaHCO3 25，K2HPO4 2.4，KH2PO4 0.4，CaCl2 1.2，MgCl2 1.2，葡萄糖10)清洗，測量結腸全長，沿著縱軸剪開整段結腸，使粘膜面朝上，平整地鋪在濾紙上，用10％中性福爾馬林固定，并逐次編號。若干天后，將固定的結腸，撤去濾紙，用0.2％甲基藍(methylene blue)染色結腸6分鐘，然后，移至載璃片上，使結腸的粘膜面朝上。在光學顯微鏡(放大倍數×40)下，觀察ACF數量。ACF區別于臨近的非累及腸腺的特征是具有裂紋樣開口，染色變深，腸腺和腸腺周帶增大。記錄每條結腸中每一個ACF中的腸腺(有些ACF中包含了多個腸腺)。所有的結腸通過盲法由一個觀察者計算，并由另一個觀察者復核。
二、實驗結果實驗1黃連吳茱萸藥對水提物對二甲肼誘發大鼠結腸上皮增殖的影響正常動物飼養24小時和48小時中結腸腸腺細胞增殖數分別為1.96±0.46(均數±標準誤，下同)和1.72±0.26，DMH組的動物分別為5.1±0.22和5.24±0.65，黃連組分別為2.56±0.51和3.2±0.42，吳茱萸組分別為2.76±0.43和3.26±0.21，藥對組分別為1.62±0.26和2.22±0.23；以上各組與DMH組比較，存在明顯的差異。
正常動物飼養24小時和48小時降結腸腸腺細胞增殖數分別為1.14±0.33和1.56±0.18，DMH組的動物分別為4.56±0.34和4.24±0.73，黃連組分別為2.42±0.75和2.16±0.29，吳茱萸組分別為1.84±0.36和2.22±0.13，藥對組分別為1.42±0.13和2.18±0.22；以上各組與DMH組比較，存在明顯的差異(圖1)。與DMH組比較*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001(2)黃連吳茱萸藥對水提物對二甲肼誘發大鼠結腸上皮凋亡的影響正常動物飼養24小時和48小時的中結腸腸腺細胞凋亡數分別為1.24±0.22和1.22±0.13，DMH組的動物分別為1.22±0.13和1.46±0.25，黃連組分別為1.32±0.29和1.38±0.13，吳茱萸組分別為2.26±0.09和2.10±0.12，藥對組分別2.62±0.15和2.18±0.19；吳茱萸組和藥對組與DMH組比較，存在明顯的差異。
正常動物飼養24小時和48小時的降結腸腸腺細胞凋亡數分別為0.86±0.23和1.1±0.14，DMH組的動物分別為1.4±0.19和1.44±0.27，黃連組分別為1.16±0.23和1.16±0.15，吳茱萸組分別為1.68±0.15和1.48±0.29，藥對組分別2.44±0.15和1.92±0.11；吳茱萸組和藥對組與DMH組比較，存在明顯的差異(圖2)。
與DMH組比較*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001實驗2黃連吳茱萸藥對抑制大鼠結腸癌癌前病變(ACF)的作用黃連吳茱萸藥對抑制大鼠結腸癌癌前病變的結果(圖3、表1)表明在大劑量和中劑量時，無論黃連、吳茱萸、還是藥對，與DMH組比較，都具有明顯地抑制ACF形成的作用(P＜0.01)。在小劑量時，僅有黃連組與DMH組比較，存在顯著性差異(P＜0.05)。從整個研究結果證明藥對組的效果明顯優于黃連組和吳茱萸組。
表1.黃連吳茱萸藥對抑制大鼠結腸癌癌前病變(ACF、X±SE)的作用組別 n 劑量(mg/kg) ACF數量對照 10--DMH10-37.7±2.6黃連水提物(S) 10100 28.3±2.6*黃連水提物(M) 9 300 26.8±2.6**黃連水提物(L) 10900 22.5±2.5**吳茱萸水提物(S)10100 30.6±2.9吳茱萸水提物(M)10300 26.4±2.4**吳茱萸水提物(L)9 900 16.9±2.3**黃連吳茱萸水提物藥對(S)10100 33.4±3.7黃連吳茱萸水提物藥對(M)9 300 16.7±1.2**黃連吳茱萸水提物藥對(L)9 900 15.6±1.5**與DMH組比較*P＜0.05、**P＜0.01小結本研究證明致癌劑二甲肼能夠促進大鼠結腸粘膜上皮增殖，黃連、吳茱萸和黃連吳茱萸藥對均有抑制二甲肼所致的結腸粘膜上皮增殖，其中藥對的作用優于黃連或吳茱萸單味藥。在促進凋亡方面，發現黃連基本無促進凋亡的作用，而吳茱萸單味藥和黃連吳茱萸藥對具有明顯的促進結腸上皮凋亡的作用，藥對的作用優于吳茱萸單味藥，以上結果表明盡管黃連單味藥無促進細胞凋亡作用，但能夠配合吳茱萸增強促進細胞凋亡的作用。
黃連、吳茱萸和藥對抑制大鼠結腸癌癌前病變的結果表明黃連、吳茱萸和藥對具有劑量-依賴性抑制二甲肼所致的異變腸腺病灶(ACF)的形成，其中，藥對的作用明顯優于黃連或吳茱萸單味藥，提示臨床如果應用藥對治療腫瘤，其作用將明顯超過單味藥的作用。本發明人第一次提出應用黃連吳茱萸藥對治療結腸癌。可進一步開發成用于治結腸癌的藥物組合物。
圖1黃連、吳茱萸藥對水提物對二甲肼誘發大鼠結腸上皮增殖的影響。
圖1A為中結腸，圖1B為降結腸，■表示24小時數據，□表示48小時數據。
與DMH組比較*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001圖2黃連、吳茱萸藥對水提物對二甲肼誘發大鼠結腸上皮凋亡的影響。
圖2A為的數據為中結腸，圖2B的數據為降結腸。
■表示24小時數據，□表示48小時數據。
與DMH組比較*P＜0.05、**P＜0.01、***P＜0.001圖3黃連、吳茱萸藥對水提物對二甲肼誘發大鼠結腸上皮癌癥前病變的影響。
■表示大劑量，□表示中劑量， 表示小劑量。
與DMH組比較*P＜0.05、**P＜0.01上述實驗結果表明黃連、吳茱萸藥對水提物具有抑制大鼠結腸癌癌前病變的作用，因此可以開發黃連、吳茱萸藥對提取物用于制備防治癌癥藥物中的新用途。
權利要求
1.一種黃連、吳茱萸的藥對提取物在制備防治癌癥藥物中的應用。
2.根據權利要求1所述的一種黃連、吳茱萸的藥對提取物在制備防治癌癥藥物中的應用，其特征在于其中所述的提取物為黃連、吳茱萸的藥對水提物。
3.根據權利要求1所述的一種黃連、吳茱萸的藥對提取物在制備防治癌癥藥物中的應用，其特征在于其中所述的藥物為抑制結腸癌的藥物。
全文摘要
本發明公開了黃連、吳茱萸的藥對水提物具有抑制結腸癌癥生成作用，因此黃連、吳茱萸的藥對水提物可用于制備防治癌癥的藥物。尤其可用于制備抑制結腸癌癥前變的藥物，有較好的臨床前景。
文檔編號A61P35/00GK1733097SQ200510029128
公開日2006年2月15日 申請日期2005年8月26日 優先權日2005年8月26日
發明者吳大正, 周吉燕, 胡之璧 申請人:上海中醫藥大學