專利名稱：菌根真菌誘導子提高液體培養鐵皮石斛原球莖質量的方法
技術領域：
本發明屬于生物工程技術領域。具體說涉及一種提高懸浮培養的鐵皮石斛原球莖多糖和總生物堿含量的實用技術。
背景技術：
鐵皮石斛(Dedrobium candidum Wall.ex Lindl)，又名耳環石斛或黑節草，是藥用石斛中的珍品。在我國石斛屬60多種植物中，鐵皮石斛是《中國藥典》收錄的僅有的5種石斛之一。經過一定工藝加工而制成的鐵皮石斛的生藥——楓斗是國內外著名的昂貴補品。然而，由于鐵皮石斛的生長條件限制性較高，野生資源有限，加上近年來過分的采挖，已經造成鐵皮石斛野生資源的枯竭。鐵皮石斛已被列入中國瀕危植物目錄。
鐵皮石斛是蘭科(Orchidaceae)植物，采用合軸生長的方式進行繁殖在匍匐的根狀莖的節上長出新芽。新芽經過一個季節的生長成熟，發展成為新的植株。這些新植株先長出幼莖，稱為假鱗莖，然后在假鱗莖上長出葉片，最終長成完整的植株。原球莖(Protocorm)是鐵皮石斛種子萌發過程中，原胚萌動膨大，突破種皮后形成的淺黃色小圓錐形胚性組織。鐵皮石斛的外植體葉尖、莖尖、基尖等經過誘導也可以形成類似于原球莖的胚性組織。原球莖可以進一步發育成為假鱗莖，然后長出根和葉，形成完整的植株。但原球莖形成成熟植株受很多因素限制，所需時間也比較長。鐵皮石斛的原球莖生長快速，自我分生旺盛，活力持久，是一種理想的鐵皮石斛藥材的替代品。可是由于原球莖是幼嫩的植物體，含有較少的次生代謝產物，離真正成為鐵皮石斛的替代藥材還有一定的距離。
鐵皮石斛是與真菌共生的植物。真菌誘導子(elicitor)是指將分離培養的真菌菌絲體制備成的滅菌溶液，它可以促進植物的生長或誘導植物產生和積累次生代謝產物。近年來的研究表明利用來自真菌的誘導子成分，可以誘導植物懸浮培養細胞或植物幼苗產生或提高體內相關有效成分。現代生物技術應用誘導子可以大幅度提高人工組織細胞培養的藥用植物包括紅豆杉、長春花和紫草中的有效成分。
發明內容
本發明的目的是提供真菌誘導子制備方法、鐵皮石斛原球莖液體懸浮培養方法和真菌誘導子與鐵皮石斛原球莖混合培養方法，該方法工藝簡單、成本低、周期短、可用于大規模工業化生產鐵皮石斛原球莖。
本發明的另一目的在于提供優質的鐵皮右斛原球莖，主要是提高鐵皮石斛原球莖的有效成分石斛堿類生物堿和多糖含量，以便大規模生產的鐵皮石斛原球莖能夠替代鐵皮石斛藥材，解決鐵皮石斛藥用資源緊缺的問題。
為實現上述目的，本發明采用的技術是先培養鐵皮石斛原球莖，在其生長后期加入真菌誘導子，共同培養一段時間。本發明提供的真菌誘導子制備方法是采用真菌MF24(Mycena sp.)發酵培養，再制備誘導子。本發明采用的真菌由野生鐵皮石斛根中分離得到，經培養鑒定為小菇屬真菌MF24(Mycena sp.)，該菌種于2005年4月20日在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏單位地址北京市海淀區中關村北一條13號，中國科學院微生物研究所，保藏編號為CGMCC No.1350。保藏和存活證明見附件。
具體地說，本發明所述的技術步驟如下1.真菌的培養將上述真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉接于含PDA培養基的平皿中，于25℃恒溫培養18-26天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養基進行培養和發酵。
真菌液體培養的培養基為葡萄糖1.5-4％，KH2PO40.1-0.4％，MgSO40.1-0.3％；天然物麥麩1-5％(煮汁)，以上組分均按重量百分含量計算，培養基pH5.0-6.5，三角瓶或其他容器振蕩培養真菌。容器裝量30-60％。高壓滅菌后接入上述真菌。培養條件振蕩轉速100-130轉/分鐘；22-26℃暗培養18-25天收獲。
2.真菌誘導子的制備上述真菌經發酵培養后，用80-120目尼龍網過濾，分離菌絲體和發酵液，按下列方法制備成不同真菌誘導子；(1)混合誘導子30-60g菌絲體兌入1L本身的發酵液，勻漿后121℃滅菌20分鐘，制得混合誘導子(2)菌絲體誘導子30-60g菌絲體兌入1L鹽溶液，勻漿后121℃滅菌20分鐘，制得菌絲體誘導子。鹽溶液組成及濃度NaNO3(8-15mM)，KCl(0.8-1.5mM)，Na2SO4(0.8-1.5mM)，MgSO4(0.8-1.5mM)，CaCl2(0.8-1.5mM)。
3.鐵皮石斛原球莖的液體懸浮培養取在1/2MS土豆固體培養基上生長10-18周的鐵皮石斛原球莖種源，繼代于1/2MS土豆液體培養基中，接種量2-8％(W/V)；于23-26℃光照培養30-45天，光照強度1500-6000Lux，光照時間8-12小時/天，震蕩培養速度100-130轉/分鐘。
鐵皮石斛原球莖種源的培養基土豆150-250g/L(煮20分鐘，取汁)，1/2MS培養基，蔗糖20-40g/L，肌醇80-120mg/L，pH5.0-6.5，瓊脂粉6-9g/L，培養容器裝量10％-50％。
鐵皮石斛原球莖液體懸浮培養的培養基土豆150-250g/L(煮20分鐘，取汁)，1/2MS培養基，蔗糖20-40g/L，肌醇80-120mg/L，pH5.0-6.5，培養容器裝量10％-50％。
4.鐵皮石斛原球莖與真菌誘導子共同培養向生長30-45天的鐵皮石斛原球莖液體培養基中，加入任意一種滅菌的真菌誘導子，加入劑量為3-20％(V/V)。
5.鐵皮石斛原球莖的收獲鐵皮石斛原球莖加入誘導子后繼續振蕩光照培養2-8天收獲，收獲時80-120目尼龍網過濾去除培養基，原球莖沖洗干凈，陰干或50-60℃烘干供藥用。
具體實施例方式
實施例1.真菌的培養(1)將小菇屬真菌(Mycena sp.)自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉接于φ90mmPDA平皿中，25℃恒溫培養24天后，用φ9mm的打孔器分別在平皿中的菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養基進行培養和發酵。
(2)真菌液體培養的培養基葡萄糖20克/升，KH2PO43克/升，MgSO41.5克/升；天然物麥麩30克/升(煮汁)，pH5.6。
(3)培養條件上述培養基500mL搖床培養瓶裝量200mL，121℃滅菌30分鐘，接入小菇屬真菌(Mycena sp.)。其培養條件搖床轉速120轉/分鐘，溫度25℃，暗培養21天收獲。
2.真菌誘導子的制備小菇屬(Mycena sp.)真菌發酵培養結束后，用100目尼龍網過濾，分離菌絲體和發酵液，菌絲體稱重，50克菌絲體兌入1L本身的發酵液，勻漿后121℃滅菌20分鐘，制成混合誘導子。
3.鐵皮石斛原球莖的液體懸浮培養(1)鐵皮石斛原球莖種源的固體培養基1/2MS，蔗糖30克/升，肌醇100毫克/升；天然物土豆200克/升(去皮，煮20分鐘，取汁)，pH5.8，瓊脂粉7.5克/升。
(2)鐵皮石斛原球莖液體培養的培養基1/2MS，蔗糖30克/升，肌醇100毫克/升；天然物土豆200克/升(去皮，煮20分鐘，取汁)，pH5.8。
(3)上述液體培養基250mL三角瓶裝量100mL，121℃滅菌20分鐘，接入于固體培養基上生長15周的鐵皮石斛原球莖，接種量5克左右/瓶，于24-26℃光照培養40天，光照強度2000Lux，光照時間10小時/天，震蕩培養速度120轉/分鐘。
4.鐵皮石斛原球莖與真菌誘導子共同培養向生長40天的鐵皮石斛原球莖培養基中加入滅菌的混合誘導子，加入劑量為10mL/瓶，加入混合誘導子后繼續以原條件光照震蕩培養。
5.鐵皮石斛原球莖的收獲鐵皮石斛原球莖加入混合誘導子后繼續培養6天后收獲，用100目尼龍網過濾，分離培養基和鐵皮石斛原球莖，原球莖沖洗干凈后，于55℃烘干。
比較例1.真菌誘導子對液體懸浮培養的鐵皮石斛原球莖生長的影響MF24真菌(Mycena sp.)接種到有PDA培養基的平皿中，25℃恒溫培養24天后，轉入液體培養基中培養21天收獲。分離發酵液和菌絲體，菌絲體稱重，50菌絲體兌入1L本身的發酵液，勻漿后滅菌，制成混合誘導子。
固體培養的鐵皮石斛原球莖轉接到含有1/2MS液體培養基100mL的三角瓶中，接種量為5克/瓶。接種的原球莖于24-26℃光照培養，光照強度2000Lux，光照時間10小時/天，震蕩培養速度120轉/分鐘。培養40天后，向鐵皮石斛原球莖培養基中加入滅菌的混合誘導子，加入劑量為10mL/瓶。加入混合誘導子后繼續以原條件光照震蕩培養6天，收獲。以加入蒸餾水培養的原球莖為對照。收獲的鐵皮石斛原球莖稱鮮重，樣品55℃干燥后稱干重。經統計分析，結果表明，MF24真菌混合誘導子對液體懸浮培養的鐵皮石斛原球莖的生長沒有影響。
2.真菌誘導子對液體懸浮培養的鐵皮石斛原球莖多糖含量的影響MF24真菌(Mycena sp.)接種到有PDA培養基的平皿中，25℃恒溫培養24天后，轉入液體培養基中培養21天收獲。分離發酵液和菌絲體，菌絲體稱重，50菌絲體兌入1L本身的發酵液，勻漿后滅菌，制成混合誘導子。
固體培養的鐵皮石斛原球莖轉接到含有1/2MS液體培養基100mL的三角瓶中，接種量為5克/瓶。接種的原球莖于24-26℃光照培養，光照強度2000Lux，光照時間10小時/天，震蕩培養速度120轉/分鐘。培養40天后，向鐵皮石斛原球莖培養基中加入滅菌的混合誘導子，加入劑量為10mL/瓶。加入混合誘導子后繼續以原條件光照震蕩培養6天，收獲。以加入蒸餾水培養的原球莖為對照。收獲的鐵皮石斛原球莖55℃干燥。以葡萄糖為標準品，用苯酚-硫酸法測定鐵皮石斛原球莖中多糖的含量。實驗結果表明與對照組相比，MF24真菌混合誘導子處理的鐵皮石斛原球莖多糖含量提高了40％。
3.真菌誘導子對液體懸浮培養的鐵皮石斛原球莖總生物堿含量的影響MF24真菌(Mycena sp.)接種到有PDA培養基的平皿中，25℃恒溫培養24天后，轉入液體培養基中培養21天收獲。分離發酵液和菌絲體，菌絲體稱重，50菌絲體兌入1L本身的發酵液，勻漿后滅菌，制成混合誘導子。
固體培養的鐵皮石斛原球莖轉接到含有1/2MS液體培養基100mL的三角瓶中，接種量為5克/瓶。接種的原球莖于24-26℃光照培養，光照強度2000Lux，光照時間10小時/天，震蕩培養速度120轉/分鐘。培養40天后，向鐵皮石斛原球莖培養基中加入滅菌的混合誘導子，加入劑量為10mL/瓶。加入混合誘導子后繼續以原條件光照震蕩培養6天，收獲。以加入蒸餾水培養的原球莖為對照。收獲的鐵皮石斛原球莖55℃干燥。以石斛堿為標準品，用酸性染料比色法測定鐵皮石斛原球莖中總生物堿的含量。實驗結果表明與對照組相比，MF24真菌混合誘導子處理的鐵皮石斛原球莖總生物堿含量提高了58.2％。
4.真菌誘導子對液體懸浮培養的鐵皮石斛原球莖促淋巴細胞增殖作用的影響MF24真菌(Mycena sp.)接種到有PDA培養基的平皿中，25℃恒溫培養24天后，轉入液體培養基中培養21天收獲。分離發酵液和菌絲體，菌絲體稱重，50菌絲體兌入1L本身的發酵液，勻漿后滅菌，制成混合誘導子。
固體培養的鐵皮石斛原球莖轉接到含有1/2MS液體培養基100mL的三角瓶中，接種量為5克/瓶。接種的原球莖于24-26℃光照培養，光照強度2000Lux，光照時間10小時/天，震蕩培養速度120轉/分鐘。培養40天后，向鐵皮石斛原球莖培養基中加入滅菌的混合誘導子，加入劑量為10mL/瓶。加入混合誘導子后繼續以原條件光照震蕩培養6天，收獲。以加入蒸餾水培養的原球莖為對照。收獲的鐵皮石斛原球莖55℃干燥。用鐵皮石斛原球莖的水提取浸膏做雞淋巴T細胞增殖實驗，結果表明與對照組相比，MF24真菌混合誘導子處理的鐵皮石斛原球莖促進雞淋巴T細胞增殖作用明顯地提高。
權利要求
1.一種制備鐵皮石斛原球莖的方法，包括步驟(1)真菌的培養將小菇屬真菌自低溫保藏的斜面試管菌種活化后，轉接于含PDA培養基的平皿中，于25℃恒溫暗培養18-26天，分別在菌落邊緣打孔成菌片，并以小碎塊接入液體培養基進行培養和發酵；真菌液體培養培養基組成為葡萄糖、KH2PO4、MgSO4、麥麩；三角瓶或其他容器振蕩培養真菌；(2)真菌誘導子的制備上述真菌經發酵培養后，按下列方法制備成不同真菌誘導子；①混合誘導子菌絲體兌入本身的發酵液，勻漿后滅菌，制成混合誘導子；②菌絲體誘導子菌絲體按比例兌入用蒸餾水配制的鹽溶液中，勻漿，鹽溶液過濾，滅菌，制成菌絲體誘導子溶液；(3)鐵皮石斛原球莖的液體懸浮培養在1/2MS土豆固體培養基中生長的鐵皮石斛原球莖種源，接入1/2MS土豆液體培養基中，振蕩光照培養；固體培養基組成為土豆、1/2MS培養基、蔗糖、肌醇、瓊脂；液體培養基組成為土豆、1/2MS培養基、蔗糖、肌醇；(4)鐵皮石斛原球莖與真菌誘導子共同培養向正在生長的鐵皮石斛原球莖液體培養基中，加入一種滅菌的真菌誘導子，與其共同培養；(5)鐵皮石斛原球莖的收獲鐵皮石斛原球莖加入誘導子后繼續振蕩光照培養2-8天，收獲；原球莖沖洗干凈，陰干或50～60℃烘干。
2.如權利要求1所述的培養方法，其中所述的小菇屬真菌為小菇屬真菌MF24(Mycena sp.)，保藏編號CGMCC No.1350。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于真菌液體培養的培養基的組分按重量計為葡萄糖1.5-4％，KH2PO40.1-0.4％，MgSO40.1-0.3％；天然物為麥麩1-5％(煮汁)，培養基pH 5.0-6.5，真菌液體培養的條件為三角瓶或其他容器振蕩培養，容器裝量30-60％；滅菌后接入上述真菌，振蕩轉速100-130轉/分鐘；22-26℃暗培養18-25天收獲。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于30-60g菌絲體兌入1L本身的發酵液，勻漿后滅菌，制成混合誘導子。
5.如權利要求1所述的方法，其特征在于30-60g菌絲體兌入1L鹽溶液，勻漿后滅菌，制成菌絲體誘導子；鹽溶液組成及濃度NaNO3(8-15mM)，KCl(0.8-1.5mM)，Na2SO4(0.8-1.5mM)，MgSO4(0.8-1.5mM)，CaCl2(0.8-1.5mM)。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于制備鐵皮石斛原球莖種源的培養基為土豆150-250g/L(煮20分鐘，取汁)，1/2MS培養基，蔗糖20-40g/L，肌醇80-120mg/L，pH5.0-6.5，瓊脂粉6-9g/L，培養容器裝量10％-50％；鐵皮石斛原球莖液體懸浮培養的培養基為土豆150-250g/L(煮20分鐘，取汁)，1/2MS培養基，蔗糖20-40g/L，肌醇80-120mg/L，pH5.0-6.5，培養容器裝量10％-50％。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于取在1/2MS土豆固體培養基上生長10-18周的鐵皮石斛原球莖，接種于1/2MS土豆液體培養基中，接種量2-8％(W/V)；于23-26℃光照培養30-45天，光照強度1500-6000Lux，光照時間8-12小時/天，震蕩培養速度100-130轉/分鐘。
8.如權利要求1所述的方法，其特征在于在無菌條件下，向生長30-45天的鐵皮石斛原球莖液體培養基中，任意加入一種滅菌的真菌誘導子與原球莖共同培養，加入劑量為3-20％(V/V)。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于鐵皮石斛原球莖加入誘導子后繼續震蕩光照培養2-8天收獲，收獲時80-120目尼龍網過濾去除培養基，原球莖沖洗干凈，陰干或50-60℃烘干供藥用。
10.用于任一權利要求1-9所述方法的小菇屬真菌MF24(Mycena sp.)保藏編號CGMCC No.1350。
全文摘要
一種利用菌根真菌提高液體培養的鐵皮石斛原球莖藥用品質的應用技術，所用的菌根真菌為小菇屬真菌MF24(Mycena sp.)；先分別培養真菌和鐵皮石斛原球莖，再將培養的真菌制成誘導子，加入鐵皮石斛原球莖中共同培養。該項新技術可以快速、大規模地生產鐵皮石斛原球莖作為鐵皮石斛的替代藥材。采用該技術生產的鐵皮石斛原球莖中，有效成分多糖和石斛堿類生物堿含量顯著提高、免疫活性明顯增強。
文檔編號A61K36/8984GK1872995SQ200510073048
公開日2006年12月6日 申請日期2005年5月31日 優先權日2005年5月31日
發明者郭順星, 侯丕勇, 王春蘭, 陳曉梅, 孟志霞, 肖培根 申請人:中國醫學科學院藥用植物研究所