專利名稱：具抗血栓作用的日本七鰓鰻口腔腺kgd模體蛋白的基因克隆與表達的制作方法
技術領域：
具抗血栓作用的日本七鰓鰻口腔腺KGD模體蛋白的基因克隆與表達屬于生物技術領域，涉及到日本七鰓鰻口腔腺中一條具KGD模體蛋白的cDNA序列及克隆、與之對應的蛋白質序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達，及其與血小板細胞膜上糖蛋白gpIIb/IIIa專一性結合而競爭性拮抗纖維蛋白原與血小板的結合，防止了血小板的活化和GPIIb/IIIa受體構象的改變，阻斷受體與多種配體的結合，從而抑制血小板聚集的最終共同通路，阻斷血栓形成的生物學活性。
背景技術：
稱為“抗血小板藥物”的一類藥物已經被作為治療血栓性疾病的有效手段在臨床上得到廣泛應用。正常情況下，體內止血、凝血系統與纖溶系統處于生理性平衡，保持正常血流狀態。但在一些病理情況下，如血管內膜損傷或靜脈血流阻滯時，由于血小板活化并粘附到內皮下組織，進而引發一系列止血、凝血過程，最后形成了血栓。血小板在血栓形成，特別是動脈血栓形成過程中起著重要作用。當血管內皮損害暴露內皮下組分時，血小板就會被活化，發生血小板的粘附和聚集。血栓的主要成分是由活化的血小板和纖維蛋白組成。因此，特異的抗活化血小板和抗纖維蛋白的藥品可以作為血栓導向劑。目前所研制的抗血小板抗體主要是針對活化血小板上兩個主要位點而制備的①GPIIb/IIIa②GMP140。而最有效的抗血小板藥物就是GPIIb-IIIa拮抗劑，因為不管通過什么受體，什么代謝途徑，最后必須通過GPIIb-IIIa復合物的纖維蛋白原受體，血小板才能發生“聚集”而形成血栓(Huang TF et al.，1987)(Shebuski RJ et al.，1989)。
KGD(1-2)序列能特異性與血小板細胞膜上糖蛋白GPIIb/IIIa特異性結合而競爭性拮抗纖維蛋白原與血小板的結合，防止了血小板的活化和GPIIb/IIIa受體構象的改變，阻斷受體與多種配體的結合，從而抑制血小板聚集的最終共同通路，阻斷血栓的形成。由于KGD模體蛋白為血小板糖蛋白GPIIb/IIIa抑制劑，其憑借所具有的KGD模體專一與血小板糖蛋白GPIIb/IIIa結合而與血管內皮細胞表面表達的整合素αVβ3的結合能力卻極低或沒有，這個特性將使KGD模體蛋白具有強效抗凝功能，而卻無溶血等副作用。由此可見，KGD序列多肽將成為GPIIb/IIIa拮抗劑中的主力軍，具有抗血栓藥物開發的重要價值。
目前在自然界只在毒蛇中發現了兩種具KGD模體的天然蛋白美國響尾蛇蛇毒barbourin(1)和烏蘇里蝮蛇毒Ussurista(2)，而本項目的日本七鰓鰻口腔腺KGD模體蛋白Lampetrin4的cDNA序列及其蛋白序列及功能在國內外尚無人研究和報道，本發明在世界上尚屬首次發現。
參考文獻1.Scarborough RM，Rose JW，Hsu MA，Phillips DR，Fried VA，Campbell AM，Nannizzi L，et al.Barbourin，a GPIIb-IIIa-specificintegrin antagonist from the venom of sistrurus m.barbouri.J Biol Chem，1991，266(15)9359-93622.Oshikawa K and Terada S.Ussuristatin2，a novel KGD-bearing disintegrin from Agkistrodon ussuriensis venom.J Biol Chem，1999，125.
發明內容
日本七鰓鰻(Lampetra japonica)屬圓口綱(Cyclostomata)、七鰓鰻目、七鰓鰻科、七鰓鰻屬，是迄今發現的最古老的無頜脊椎動物。其為海洋洄游性魚類，成體生活在海洋，經常用吸盤附在其它魚體上吸食其血與肉，使被吸附的魚血流不止。日本七鰓鰻的這種獨特生活習性暗示著其口腔腺中必定具有強效抗凝物質。
本發明在于從日本七鰓鰻口腔腺cDNA文庫中發現了一條能翻譯出KGD(Lys-Gly-Asp)模體的開放閱讀框，經對其mRNA全長的進行釣取、測序、生物信息學分析后發現，這條基因為在自然界首次發現，為來源于日本七鰓鰻的KGD多肽新基因。經對其進行cDNA克隆后，對其重組蛋白在大腸桿菌中進行了高效誘導表達。此KGD重組蛋白的生物學活性涉及到抗血小板聚集進而抗血栓形成之功能。
本發明涉及日本七鰓鰻口腔腺中一條具KGD模體蛋白的cDNA序列及克隆、與之對應的蛋白質序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達，及其抑制血小板聚集的最終共同通路從而阻斷血栓形成的生物學活性。
本發明從日本七鰓鰻口腔腺中分離提取mRNA，利用從前期構建的cDNA文庫、EST文庫中獲得的生物學信息及mRNA全長釣取的測序結果選取開放閱讀框設計引物，采用RT-PCR方法獲得了一條KGD蛋白的cDNA及其序列，本發明還提供了其在人腸桿菌BL21中成功表達的蛋白及其序列，此KGD模體重組蛋白具抗血小板聚集的作用，可作為抗血栓藥物進一步開發。
KGD模體蛋白Lampetrin4的cDNA序列381bp長，其蛋白質由127個氨基酸組成，含一個KGD模體，蛋白分子量為12,954Da。其GDNA序列及由其推導的蛋白質氨基酸序列為1 atggcctccaggctgcttctacgagcgtctctcaacgccggccgtM A S R L L L R A S L N A G R46 cgtgtcgcggccgtcgggagcgtgagaccggcgatgcgagccatgR V A A V G S V R P A M R A M91 gcgagcggaggtggcatccccactgatgaagaacaggccacgggcA S G G G I P T D E E Q A T G136 ttggagaggttgaccatggaggctaagaaaaaaggcactgaccccL E R L T M E A K K K G T D P181 tggagcattgagccacccaagacttacgcaggaaccaaggaagatW S I E P P K T Y A G T K E D226 ccacacattgtgccgtccattggtgaaaagcggctgatcggctgcP H I V P S I G E K R L I G C271 atctgtgaggaggacaacacagctgtggtgtggttctggctgcacI C E E D N T A V V W F W L H316 aagggtgactgccagcgctgcccttcttgtggtgcctcctacaagK G DC Q R C P S C G A S Y K361 ctcgttccccacgagctgccgcactga 387L V P H E L P H *于大腸桿菌中表達的重組KGD模體蛋白Lampetrin4具有抑制由ADP誘導的人血小板聚集的作用，其作用的IC50為6.4μmol/L。
圖1為本發明實驗步驟流程示意圖；圖2為重組KGD模體蛋白Lampetrin4對ADP誘導的人血小板聚集抑制作用曲線圖。
具體實施例方式
下面結合附圖對本發明做進一步的描述.
1.總RNA的提取采用GIBCO BRL的Trizol試劑。具體如下(1)取日本七鰓鰻口腔腺迅速置于液氮中保存；(2)稱取0.2g毒腺組織，加1ml TRIzol試劑制備毒腺勻漿，4℃孵育5min；(3)加0.2ml氯仿，蓋緊蓋后用力振搖15sec，然后置于冰上5min；
(4)4℃，12000xg，離心15min；(5)將上層水相移入另一離心管，加0.5ml異丙醇，并在冰上孵育10min；(6)4℃，12000xg，離心15min；(7)棄上清，在沉淀(含RNA)中加1ml 75％乙醇洗滌，旋渦混勻；(8)4℃，10000xg離心5min，得到RNA沉淀；(9)空氣干燥后，用適量TE或無Rnase水溶解備用。
2.以自行設計的引物進行RT-PCR擴增，以獲得日本七鰓鰻口腔腺KGD模體蛋白的cDNA；按以下條件進行反轉錄反應42℃ 20min，99℃ 5min，5℃ 5min引物序列如下P15’-XXcatatggcctccaggctgcttctacga-3’P25’-XXaagcttgtgcggcagctcgtggggaac-3’3.將獲取的目的cDNA與pET23b載體相連接，轉化入克隆菌DH5a后進行陽性轉化子的篩選鑒定；為產生帶有組氨酸標簽的融合蛋白，選擇pET-23b(+)做為基因克隆的載體，克隆具體操作如下(1)目的基因的回收與測序目的基因的回收采用TaKaRa PCR Fragment Recovery Kit進行；對回收DNA進行測序，此項工作由大連寶生物工程有限公司完成。
(2)質粒的提取采用寶生物的質粒提取試劑盒進行。
(3)目的基因DNA片段與載體pET23b的連接由于所設計的引物分別帶有Nde I和Hind III酶切位點，而這兩個酶切位點也是pET23b的多克隆位點，這使得將目的基因DNA片段與載體pET23b的連接成為可能。
(4)將連接產物CaCl2法轉化至克隆菌E.coli BL21中。
(5)陽性轉化子的篩選鑒定利用T7通用引物法和雙酶切法進行陽性轉化子的篩選鑒定。
(6)對陽性重組子進行終濃度為1mmol/L的IPTG誘導表達。誘導表達條件為30℃過夜誘導。表達產物命名為Lampetrin4；4.對表達的重組蛋白進行組氨酸親和層析純化。
(1)10000g離心10min收獲菌體，棄上清，并使殘液盡量流出。以每100ml的原培養液加4ml冰冷的1X Binding buffer的比例重懸細胞。
(2)將上述樣品置于冰上超聲裂解細胞，直至溶液不再粘稠。
(3)14000g離心20min以去除細胞碎片。
(4)上清以0.45μm的濾膜過濾。
(5)吸去His.Bind Colum上室的貯液，并打開下面管口；(6)用10ml的1xBinding Buffer對柱子進行平衡；(7)將過濾好的上清液上樣；(8)用10ml的1xBinding Buffer洗柱；(9)用10ml的1xWash Buffer洗柱；(10)用5ml的1xElute Buffer洗脫目的蛋白。
5.運用LBY-NJ2型血液凝聚儀利用人富含血小板血漿(PRP)系統進行血小板聚集實驗。
(1)人富含血小板血漿(PRP)與貧血小板血漿(PPP)的制備A)采集人空腹全血加入裝有3.28％枸椽酸鈉的塑料離心管中，血液與枸椽酸鈉的比例為9∶1。
B)1000rpm室溫離心5min，取米黃色上清即為人富含血小板血漿(PRP)；C)將余液繼續以4000g室溫離心10min，取上清即為人貧含血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)。
(2)測定重組蛋白對ADP誘導的人血小板聚集的抑制作用A)取2只比色杯，分別加入PPP和PRP各300μl，置于聚集儀中37℃預熱5min，用PPP校零，測定PRP中的血小板數。然后用PPP稀釋PRP，調整血小板數至3×105/μl；B)將PPP、用PPP調整后的加入30ul的PBS或不同濃度Lampetrin4的PRP置于LBY-NJ2型血液凝聚儀中37℃溫育3min；C)以PPP調零；D)將PRP樣品加入終濃度為3μmol/L的ADP啟動血小板的凝聚反應；E)比濁法測定Lampetrin4對血小板聚集的抑制作用，測定PAG1(1min聚集度)、PAG3(3min聚集度)、PAG5(5min聚集度)、MA(最大聚集度)。取對最大聚集度的抑制率作為參數作圖。
權利要求
1.一種來源于日本七鰓鰻口腔腺的KGD(Lys-Gly-Asp)模體蛋白的cDNA序列及由其推導的蛋白質氨基酸序列，其特征在于cDNA序列381bp長，其蛋白質由127個氨基酸組成，含一個KGD(Lys-Gly-Asp)模體，蛋白分子量為12,954Da。此KGD模體蛋白被命名為Lampetrin4，其cDNA序列及由其推導的蛋白質氨基酸序列為1 atggcctccaggctgcttctacgagcgtctctcaacgccggccgtM A S R L L L R A S L N A G R46 cgtgtcgcggccgtcgggagcgtgagaccggcgatgcgagccatgR V A A V G S V R P A M R A M91 gcgagcggaggtggcatccccactgatgaagaacaggccacgggcA S G G G I P T D E E Q A T G136 ttggagaggttgaccatggaggctaagaaaaaaggcactgaccccL E R L T M E A K K K G T D P181 tggagcattgagccacccaagacttacgcaggaaccaaggaagatW S I E P P K T Y A G T K E D226 ccacacattgtgccgtccattggtgaaaagcggctgatcggctgcP H I V P S I G E K R L I G C271 atctgtgaggaggacaacacagctgtggtgtggttctggctgcacI C E E D N T A V V W F W L H316 aagggtgactgccagcgctgcccttcttgtggtgcctcctacaagK G DC Q R C P S C G A S Y K361 ctcgttccccacgagctgccgcactga 387L V P H E L P H *
2.根據權利要求1所述的來源于日本七鰓鰻口腔腺的KGD(Lys-Gly-Asp)模體蛋白的cDNA連接于任何類型載體的基因克隆產品(重組質粒)及其表達的重組蛋白。其特征在于基因克隆的外源基因為Lampetrin4基因，所表達之得重組蛋白含有KGD模體。
3.根據權利要求2所述的來源于日本七鰓鰻口腔腺的KGD(Lys-Gly-Asp)模體蛋白的cDNA的基因克隆產品連接于任何類型載體所表達的重組蛋白之抗血栓功能的應用。其特征在于KGD多肽為血小板糖蛋白GPIIb/IIIa抑制劑，其憑借所具有的KGD模體特異性與血小板糖蛋白GPIIb/IIIa結合，競爭性拮抗纖維蛋白原與血小板的結合，防止了血小板的活化和GPIIb/IIIa受體構象的改變，阻斷GPIIb/IIIa受體與多種配體的結合，從而抑制了血小板聚集的最終共同通路，阻斷血栓的形成。這個特性使Lampetrin4具有強效低毒的抗凝、抗血栓功能。
4.根據權利要求1所述的來源于日本七鰓鰻口腔腺的KGD(Lys-Gly-Asp)模體蛋白的cDNA點突變或堿基插入或缺失的基因改造之產品及其表達的重組蛋白。
全文摘要
“具抗血栓作用的日本七鰓鰻口腔腺KGD模體蛋白的基因克隆與表達”屬于生物技術領域，涉及到日本七鰓鰻口腔腺中一條具KGD模體蛋白的cDNA序列及克隆、與之對應的蛋白質序列及其在大腸桿菌或畢赤酵母中的表達，及其與血小板細胞膜上糖蛋白gpIIb/IIIa結合而競爭性拮抗纖維蛋白原與血小板的結合，從而抑制血小板聚集的最終共同通路，阻斷血栓形成的生物學活性。其具有抗血栓藥物開發價值。
文檔編號A61P7/00GK1757727SQ200510083438
公開日2006年4月12日 申請日期2005年7月13日 優先權日2005年7月13日
發明者李慶偉 申請人:遼寧師范大學