專利名稱：新的水溶性富勒烯、其生產方法和含有該富勒烯的活性氧發生器的制作方法
技術領域：
本發明涉及新的水溶性富勒烯、其生產方法和含有該富勒烯的活性氧發生器。更具體的說，本發明涉及通過使水溶性聚合物與在分子中帶有官能基的富勒烯通過該官能基連接而獲得新的水溶性富勒烯、其生產方法和含有該富勒烯的活性氧發生器。
背景技術：
活性氧，諸如單線態氧或超氧負離子可以通過可見光等照射各種活性氧發生器，諸如富勒烯類和卟啉衍生物而產生。這種活性氧為高度反應性的并且表現出細胞毒性，諸如裂解細胞中的DNA，抑制細胞生長，抑制蛋白水解酶活性，且由此，例如可預計它對各種疾病的作用，諸如癌、病毒感染、胞內寄生蟲感染、肺纖維化、肝硬化、慢性腎炎、動脈硬化、糖尿病性視網膜病、老年性黃斑變性和血管收縮損害。
就作為活性氧發生器之一的富勒烯而言，已知存在諸如純碳物質這類化合物，諸如C60和C70，這取決于n的數量和含有金屬或金屬氧化物的碳群(非專利對比文件1)。由于富勒烯自身為水不溶性的，所以難以將其給藥入活體。同時，大分子物質更易于遷移并且與在正常組織中相比因組織結構差異而趨向于在癌組織中停留延長的時間(非專利對比文件2)。由于這些原因，已經研究了將各種水溶性聚合物與富勒烯連接以便獲得水溶性以及特別遷移至癌組織并且保留在那里和由此緩解因活性氧對正常組織的細胞毒性而產生的副作用的特性。就這類水溶性聚合物而言，已經提示了聚乙二醇、聚乙烯醇、葡聚糖、支鏈淀粉、淀粉和這些聚合物的衍生物(非專利對比文件3，專利對比文件1)。
此外，已知與富勒烯連接的取代基的數量確實對產生的活性氧的量起顯著作用(非專利對比文件4)。
在癌組織中蓄積的光增敏劑因光照射而產生具有高度反應性的單線態氧并且僅選擇性破壞其周圍的癌組織。這類合并光增敏劑與光照射的癌癥療法稱作光動力療法。作為用于這種光動力療法的光增敏劑，已知與在一端上帶有甲基，而在另一端上帶有氨基的多個聚乙二醇直接連接的富勒烯(專利對比文件1)。
此外，當用超聲波照射液體時，液體中產生氣泡(空泡形成)，并且在這些氣泡塌陷時，在局部產生熱量和壓力。這就會產生基團(·OH等)，并且在它們重新組合或從激發態轉換成基態時，這些基團主要發射波長在300-600nm范圍的光。這種現象稱作聲致發光(非專利對比文件5)。已知用于超聲間動電流(Sonodynamic)療法的活性氧發生器含有使用它與在一端上帶有甲基，而在另一端上帶有氨基的多個聚乙二醇直接連接的富勒烯(專利對比文件2)。
專利對比文件1JP-A-9-235235專利對比文件2JP-A-2002-241307非專利對比文件1Kagaku(Chemistry)，50(6)，1995非專利對比文件2Matsumura等，Gan-Kagakuryohou(JapaneseJournal of Cancer and Chemotherapy)，Vol.14，No.3，p821-829，1987非專利對比文件3BIOINDUSTRY，Vol.14，No.7，p30-37，1997非專利對比文件4Toxicology in vitro，Vol.16，p41-46，2002非專利對比文件5Science，Vol.247，p1439-1445，1990本發明的公開內容盡管已經獲得了如上所述與諸如聚乙二醇這類多個水溶性聚合物連接的富勒烯類，但是所連接的聚乙二醇的數量并不恒定。即所連接的水溶性聚合物的數量不能得到控制并且由此在產生的活性氧的量方面發生變化，這取決于結合的數量，并且在應用于醫療應用時產品的標準化是困難的。
本發明的一個目的在于提供在所連接的水溶性聚合物的數量方面受到控制的水溶性富勒烯，即與修飾分子的數量受控制的水溶性聚合物連接的水溶性富勒烯。除此之外，本發明的另一個目的還在于提供生產這類水溶性富勒烯的方法和含有它的活性氧發生器。
本發明涉及水溶性富勒烯，其中該富勒烯在其分子上帶有官能基并且通過該官能基連接水溶性聚合物。
此外，本發明涉及生產水溶性富勒烯的方法，其特征在于使水溶性聚合物與在分子上帶有官能基的富勒烯的官能基反應。
此外，本發明涉及含有上述水溶性富勒烯或通過上述生產方法生產的水溶性富勒烯的活性氧發生器。
本發明可以獲得在連接的水溶性聚合物的數量方面受到控制的水溶性富勒烯。當用光照射本發明的水溶性富勒烯時，產生從220nm-可見光區(380-780nm)范圍的寬波長的O2-(超氧負離子)。特別地，它在260-450nm波長范圍內表現出高O2-產生能力并且由此可以應用于癌癥的光動力療法。此外，由于因超聲照射導致的聲致發光而產生的光主要具有300-600nm范圍的波長，所以本發明的水溶性富勒烯產生由它產生的O2-。本發明的水溶性富勒烯適合于光動力療法。
附圖簡述附
圖1表示通過使實施例1中獲得的一種分子PEG-連接的富勒烯進行高效液相色譜而測定分子量的結果；附圖2表示通過使按照JP-A-9-235235的實施例1中所述方法合成的富勒烯-水溶性聚合物共軛物進行高效液相色譜而測定分子量的結果；附圖3表示通過光散射法測定實施例1和實施例2中獲得的本發明水溶性富勒烯類的粒子直徑的結果；附圖4表示通過對實施例2中獲得的本發明水溶性富勒烯進行光照射產生的活性氧的量的測定結果；附圖5表示通過對實施例2中獲得的本發明水溶性富勒烯進行光照射測定體外癌細胞生長抑制活性的結果；附圖6表示通過對實施例1中獲得的本發明水溶性富勒烯進行光照射測定體內抗癌活性的結果；附圖7表示通過對實施例2中獲得的本發明水溶性富勒烯進行超聲照射測定活性氧豐度的結果；和附圖8表示通過對實施例1中獲得的本發明水溶性富勒烯進行超聲照射測定體外癌細胞生長抑制活性的結果。
本發明的最佳實施方式本發明的水溶性富勒烯的特征在于水溶性聚合物與在其分子上帶有官能基的富勒烯通過該官能基連接。
對用于本發明的富勒烯的類型沒有特別地限定并且產生活性氧的任意類型的富勒烯均可以使用。特別可以使用C60富勒烯，它是一種帶有60個碳原子的純碳；C70富勒烯，即為純碳物質的納米管富勒烯類；各種高級富勒烯類。這些不同的富勒烯類為商購的，并且例如可以獲自Honjo Chemical Co.，Ltd.；Mitsubishi Corporation，TokyoKasei Kogyo Co.，Ltd.等(產品名C60富勒烯、C70富勒烯、多壁納米管、單壁納米管等)。從供給和易于操作的觀點來看，尤其優選使用C60富勒烯。
與富勒烯連接的官能基的實例包括羧基、氨基、羥基、氰基和硫氫基。結合的數量優選為1-5并且更優選1。特別優選在分子上帶有一個羧基的富勒烯。這類在分子上帶有一個羧基的富勒烯可商購，并且例如可以獲自諸如Science Laboratories Co.，Ltd.這類試劑公司。此外，它可以通過對比文件“Tetrahedron Letters vol.36，No.38，p.6,843,1995”中所述的方法合成。
對用于本發明的水溶性聚合物沒有特別地限定，但可以使用具有1,000-1,000,000,優選4,000-50,000分子量的那些水溶性聚合物。
對用于本發明的水溶性聚合物沒有特別地限定，并且可以使用各種商購的水溶性聚合物。尤其是可以使用非離子水溶性合成聚合物，諸如聚乙二醇、聚丙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮；葡聚糖；支鏈淀粉；離子或非離子多糖類，諸如淀粉、羥乙基化淀粉和羥丙基淀粉；其改性的物質；這些水溶性聚合物中的兩種或三種組分的共聚物或復合物；透明質酸、脫乙酰殼多糖、甲殼質衍生物等。尤其可以優選使用具有通常用于富勒烯的溶劑、僅在分子末端上的參與與富勒烯的連接反應的官能基和單一化學結合類型的聚乙二醇。特別優選使用4,000-15,000的聚乙二醇。
作為用于本發明的水溶性聚合物，通常可以使用那些帶有可以與富勒烯的官能基反應的反應基團的水溶性聚合物。反應基團的實例包括羧基、氨基、羥基、氰基和硫醇基。尤其優選具有脫水縮合反應性的反應基團，諸如氨基、羥基，并且更優選氨基。在本文中，反應基團可以通過C1-C6烷基與水溶性聚合物連接。這類反應基團可以位于水溶性聚合物分子中的任意位置上，只要該位置適合于連接富勒烯，而在考慮連接便利性時優選位于水溶性聚合物的末端。當使用不帶有這類反應基團的水溶性聚合物時，有必要在連接富勒烯前首先引入反應基團。
作為用于本發明的水溶性聚合物，優選那些在一端上帶有非活性基團，而在另一端上帶有反應基團的水溶性聚合物。非活性基團的實例包括C1-C6烷基、C1-C6烷氧基、芐基和其它通常用作保護基的基團。當將聚乙二醇用作水溶性聚合物時，優選C1-C6烷基。C1-C6烷基的實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、正己基，并且從可用性來看，優選甲基。
作為用于本發明的水溶性聚合物，優選在一端上帶有非活性基團，而在另一端上帶有反應基團的聚乙二醇，并且特別地，優選在一端上帶有C1-C6烷基，而在另一端上帶有氨基并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇。另外優選在一端上帶有非活性基團并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇和帶有可以與富勒烯的官能基反應的反應基團的化合物的復合物，并且特別優選在一端上帶有C1-C6烷基，而在另一端上帶有氨基并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇與諸如天冬氨酸這類氨基酸的反應產物。
本發明的水溶性富勒烯僅必須具備能夠對活體給藥的水溶性。考慮到轉移至組織，諸如癌并且在其中蓄積和轉移至正常細胞的便利性來看，與水溶性聚合物連接的富勒烯優選形成聚集物并且該聚集物的大小優選在20-400nm左右并且更優選在30-200nm左右。形成這類聚集物所需的水溶性聚合物的分子量隨所用水溶性聚合物的類型和它們連接富勒烯的數量的不同而改變。例如，就每個分子帶有一個氨基的聚乙二醇而言，優選2,000-30,000的分子量，并且優選4,000-15,000的范圍。
用于生產本發明水溶性富勒烯的方法的特征在于使水溶性聚合物與在分子上帶有官能基的富勒烯的官能基反應。可以通過使用在分子上帶有官能基的富勒烯控制所連接的水溶性聚合物的數量。例如，當使用在分子上帶有一個官能基的富勒烯時，獲得了帶有一個水溶性聚合物的富勒烯，而當使用在分子上帶有兩個官能基的富勒烯時，獲得了帶有兩個水溶性聚合物的富勒烯。例如，就在分子上帶有羧基的富勒烯與在一端上帶有C1-C6烷基，而在另一端上帶有反應基團的水溶性聚合物進行縮合反應的情況而言，所用的在分子上帶有羧基的富勒烯與在一端上帶有C1-C6烷基，而在另一端上帶有反應基團的水溶性聚合物之比在后者的約0.1-10mol前者的1mol，優選后者的約2mol前者的0.5mol，并且更優選后者的約1-1.1mol前者的1mol。
反應的實例包括產生化學鍵的眾所周知的反應，諸如縮合反應、加成反應、取代反應。例如，就縮合反應而言，當水溶性聚合物的反應基團為氨基時，該反應通過常規的肽縮合反應來進行。就肽縮合反應而言，與富勒烯連接的官能基為羧基，并且該反應在有脫水縮合試劑存在下進行。所述的脫水縮合試劑包括碳二亞胺類，諸如二環己基碳二亞胺、二異丙基碳二亞胺、1-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺、鏻鹽，諸如苯并三唑-1-基-三(二甲氨基)磷鎓六氟磷酸鹽、二苯基磷酰基氮化物，并且優選為二異丙基碳二亞胺。所用脫水縮合試劑的量就富勒烯的羧基而言為0.5-10mol當量，并且優選其為1-2mol當量。該反應在有或沒有加成試劑存在下進行，并且所述的加成試劑包括N-羥基琥珀酰亞胺、1-羥基苯并三唑、4-硝基苯酚、五氟苯酚，并且優選其為1-羥基苯并三唑。所用的加成試劑的量就富勒烯的羧基而言為0.5-10mol當量，并且優選其為1-2mol當量。
有機溶劑用于該反應。對所述的有機溶劑沒有特別地限定，只要反應能夠進行，且其實例包括芳族烴類，諸如苯、甲苯、二甲苯；鹵代烴，諸如二氯甲烷、氯仿、1，2-二氯乙烷、氯苯、溴苯、1，2-二氯苯；醚類，諸如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃、二噁烷、二甲氧基乙烷、二甘醇二甲醚；腈類，諸如乙腈、丙腈；酰胺類，諸如二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、六甲基磷酸三酰胺；脲，諸如N，N-二甲基咪唑烷酮；和這些溶劑的混合溶劑，并且優選其為甲苯、氯苯、溴苯、1，2-二氯苯以及二噁烷與二氯甲烷的1∶1混合溶劑，并且更優選其為溴苯。反應溫度在-20-100℃，優選0-50℃，且更優選室溫-37℃，并且反應時間為1-72小時且優選3-24小時。優選在光屏蔽下進行該反應。可以分離獲得的反應產物并且通過本身公知的分離方式，例如通過真空濃縮、溶劑提取、結晶、色譜、透析、凍干等進行純化。
對水溶性聚合物沒有特別地限定，并且可以使用上述各種商購的水溶性聚合物。在本文中，就水溶性聚合物而言，通常使用那些帶有反應基團，諸如如上所述的氨基的水溶性聚合物以便能夠使它與富勒烯連接。當使用不帶有反應基團的水溶性聚合物時，必須在連接富勒烯前首先引入反應基團。例如，在帶有羧基的水溶性聚合物中，通過使用N-羥基琥珀酰亞胺和碳二亞胺、碳二亞胺或氯碳酸乙酯進行羧基與氨基化合物的結合反應將氨基引入聚合物鏈。例如，為了將氨基引入聚乙二醇，將在一端上帶有羧基的聚乙二醇溶于pH5.0的磷酸鹽緩沖液(10％重量)，并且對一個羧基加入3-倍摩爾量的水溶性碳二亞胺，且在室溫下通過進行攪拌1小時活化羧基。然后對一個羧基加入10-倍摩爾量的乙二胺并且使其在室溫下反應6小時。可以通過將獲得的反應液體對水透析而獲得在一端上引入了氨基的聚乙二醇。一端為氨基丙基，而另一端為甲基的聚乙二醇，即CH3(OCH2CH2)nO(CH2)3NH2(n代表約90-300的整數)也購自Nippon Oil & Fats Co.，Ltd。
如上所述，所述的水溶性聚合物還可以為在一端上帶有非活性基團的聚乙二醇，和帶有與富勒烯的官能基反應的反應基團的化合物的復合物，并且帶有與富勒烯的官能基反應的反應基團的化合物包括氨基酸，并且優選酸性氨基酸，諸如天冬氨酸和谷氨酸。例如，如下生產該復合物。使帶有被保護氨基的酸性氨基酸與在一端上帶有C1-C6烷基，而在另一端上帶有被氨基取代的C1-C6烷基的聚乙二醇在有脫水縮合試劑存在下的有機溶劑中反應。反應條件可以與肽縮合反應(其中上述水溶性聚合物的反應基團為氨基且富勒烯的官能基為羧基)的情況相似。可以通過使所得的反應劑根據保護基進行反應基的脫保護反應獲得水溶性聚合物，其為與在一端上帶有C1-C6烷基的聚乙二醇連接的氨基酸衍生物。特別地，如下述實施例3中所示。
本發明的活性氧發生器含有如上所述獲得的與水溶性聚合物連接的水溶性富勒烯，并且將其作為水溶性或含水溶劑的溶液使用。當用光照射這種水溶性富勒烯時，O2-產生220nm-可見光區(380-780nm)范圍的寬波長。特別地，它在260-450nm范圍波長內表現出高O2-產生能力。因此，它可以應用于通過光照射的癌癥的光動力療法。此外，由于因超聲照射導致的聲致發光而產生的光主要具有300-600nm范圍的波長，所以本發明的活性氧發生器適合于超聲間動電流療法。
在本發明的活性氧發生器產生的活性氧中包括單線態氧(1O2)、超氧負離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基(·OH)。
本發明的水溶性富勒烯在含水溶劑中形成一定大小的聚集物。含水溶劑的實例包括水和水-乙腈。由于本發明的活性氧發生器為與水溶性聚合物連接的富勒烯，所以它具有足夠的水溶性以便對活體給藥，且此外，由于它形成一定大小的聚集物，所以推定它具有高的遷移至癌組織和炎癥組織和在其中保留的特性。推定這種聚集物為保持連接的水溶性聚合物數量并且采取聚合物膠束結構的富勒烯聚集物。
由于本發明活性氧發生器中包含的富勒烯通過經超聲照射導致的聲致發光產生的光產生活性氧，諸如單線態氧或在含水溶劑中的超氧負離子而表現出細胞毒性，所以它可以由于治療包括癌癥的如下所述的各種疾病。作為照射的超聲波，可以優選使用約100KHz-20MHz，特別是約1-3MHz的頻率。照射優選在約0.1-5瓦/cm2，優選約2瓦/cm2的輸出下進行。照射時間隨所用頻率、照射輸出的不同而改變，并且約為5-300秒，且優選約為30-120秒，且就脈沖照射而言，其工作期約為1-100％，優選約10％。
本發明的活性氧發生器可有效治療任意類型的活性氧表現出細胞毒性所針對的癌癥、病毒感染、胞內寄生蟲感染、肺纖維化、肝硬化、慢性腎炎、動脈硬化、糖尿病性視網膜病、老年性黃斑變性和血管收縮損害等。癌癥的實例包括在器官表面和內部出現的各種實體癌，諸如肺癌、肝癌、胰腺癌、胃腸癌、膀胱癌、腎癌和腦瘤。尤其是當本發明的活性氧發生器用于光動力學治療時，它可有效地用于這類光照射不能并且癌的光動力療法通常不能達到的體內深度癌癥的治療。就其它疾病而言，由于損害或感染的細胞或受侵害的細胞位于器官的內部，所以可以通過用適合于所述部位的方法且然后用來自外部的光或超聲蓄積活性氧發生器來治療它們。
可以將本發明的活性氧發生器制成任意的藥物劑型，諸如注射劑、分散劑、液體劑、固體粉末。例如，當將其制成注射劑時，可以將本發明的活性氧發生器與各種添加劑，諸如緩沖劑、生理鹽水、防腐劑、常用于注射劑的蒸餾水合并，以便形成注射劑。可以通過靜脈內、動脈內、肌內、皮下或皮內給予本發明的活性氧發生器，并且劑量取決于給藥途徑、患者的年齡和性別、疾病的類型和情況，但對每個成年人而言，每天給予1次-分成幾次給予約1-10mg/kg的本發明水溶性富勒烯。
如上所述，與正常組織相比，聚合物材料易于遷移至癌組織和炎癥組織并且在其中蓄積。因此，當對活體給予含有與水溶性聚合物連接的富勒烯的本發明活性氧發生器時，與正常組織相比，它蓄積在癌組織和炎癥組織中，并且與正常組織相比，它長期以高濃度保留在癌組織和炎癥組織中。另一方面，由于本發明的活性氧發生器從正常組織比從癌組織和炎癥組織中排泄更快，所以在將它對活體給藥后一定長時間內，本發明活性氧發生器的濃度顯著高于它在正常組織中的濃度，并且本發明的活性氧發生器特別以高濃度分布在癌癥和炎癥組織中。因此，如果用光或超聲照射活體，那么在對活體給予本發明的活性氧發生器后，活性氧發生器即刻因光或超聲照射導致的聲致發光產生的光產生活性氧，諸如單線態氧，并且特別在癌組織和炎癥組織中表現出抗癌活性和抗炎活性。另一方面，由于本發明活性氧發生器的濃度在正常組織中低，所以在正常組織中的細胞毒性不會比在癌組織和炎癥組織中高，且由此預計在正常組織中的副作用可以降低。
對人體給藥后，在本發明活性氧發生器于癌組織和炎癥組織中的濃度變得顯著高于正常組織中這一時間過程的長度、以及光或超聲照射，變得可能隨所治療個體患者的部位中的代謝情況和活性氧發生器分布的時程變化而改變，而一般優選在給藥后在約0.1-48小時，特別是約24小時內進行光或超聲照射。當對人進行超聲波照射時，具有上述頻率的超聲波以如上所述的輸出和時間長度照射。因此，為了使用本發明的活性氧發生器治療患者，例如，以注射劑的藥物劑型的形式給予本發明的活性氧發生器，并且使用光照射設備或超聲產生設備在約0.1-48小時內進行照射。可以根據患者的年齡、體重、性別、疾病的類型和情況確定給藥/照射的劑量和頻率、給藥時間。
本發明的活性氧發生器不會特別遷移至癌組織和炎癥組織并且在其中蓄積，但能夠通過使用將本發明活性氧發生器遞送至靶組織或細胞的任意方法，例如通過使用應用遞藥系統的具體遞送方法使其在靶組織或細胞中具有展現出的細胞毒性。這類方法包括將本發明的活性氧發生器直接注入靶組織或細胞的方法(例如，通過使用內窺鏡能夠遞送至體內的大部分區域)和將與細胞識別因子，諸如抗體、凝集素、細胞粘著因子和糖鏈連接的本發明的活性氧發生器遞送至靶組織或細胞的方法。此外，還能夠僅在所需點上產生活性氧以展現出細胞毒性，這可通過在對活體給予本發明的活性氧發生器后僅需要產生活性氧的點上進行照射光或超聲來進行。此外，可以通過聚焦光或超聲波改善展現出細胞毒性區域的選擇性。
下面參照實施例、參比例和試驗例更詳細地描述本發明，但本發明的范圍并不限于它們。
參比例1(1，2-亞甲基[60]富勒烯)-61-羧酸的合成將通過“Tetrahedron Letters vol.36，No.38，p.6843，1995”中所述的方法獲得的(1，2-亞甲基[60]富勒烯)-61-羧酸的叔丁酯(540mg，0.65mmol)溶于甲苯(380mL)，加入4-甲苯磺酸一水合物(222mg，1.17mmol)并且在回流狀態下加熱10小時。過濾沉積的棕色沉淀并且依次用甲苯、蒸餾水和乙醇洗滌并且在減壓下干燥且得到(1，2-亞甲基[60]富勒烯)-61-羧酸(338mg，產率67％)，為棕色結晶。
FAB-MS(正模式)m/z779(M+H)+；1H-NMR(CDCl3/DMSO-d6(1∶1)，ppm)5.15(1H，s)。
實施例1與一個PEG分子(分子量5000)連接的富勒烯的合成將14.7mL 0.33mM(1，2-亞甲基[60]富勒烯)-61-羧酸的溴苯溶液加入到含有1摩爾當量(a molar equralent)聚乙二醇的2mL溴苯溶液中，所述的聚乙二醇在一端上帶有甲基，而在另一端上帶有氨基丙基(PEG，分子量5000，Nippon Oil & Fats的產品)，加入2摩爾當量的1-羥基苯并三唑和N，N’-二異丙基碳二亞胺并且在室溫和光屏蔽條件下攪拌24小時。用相同量的蒸餾水提取反應液體。使水層通過陽離子交換樹脂柱(SP-Toyopearl 650M，H+-型)且然后冷凍干燥流出液并且獲得與1個分子的PEG連接的富勒烯(分子量5000)(24.4mg)。
薄層色譜法(洗脫液20％甲醇-二氯甲烷)相對遷移率(Rf)0.75。
實施例2與一個PEG分子(分子量12000)連接的富勒烯的合成使用在一端上帶有甲基，而在另一端上帶有氨基丙基并且具有12000分子量而不是5000分子量的PEG(Nippon Oil & Fats的產品)并且以與實施例1中的存在步驟相同，獲得與1個分子的PEG(分子量12000)連接的富勒烯(47.4mg)。
薄層色譜法(洗脫液20％甲醇-二氯甲烷)相對遷移率(Rf)0.73。
試驗例1實施例1中合成的與1個分子的PEG(分子量5000)連接的富勒烯的分子量分析使用高效液相色譜系統8020(Tosoh Co.，Ltd.)與TSKgelG3000PWXL(Tosoh Co.，Ltd.)對通過用等量蒸餾水提取實施例1中的反應液體獲得的級分和使水層通過陽離子交換樹脂柱后的級分的分子量進行測定。將含有20％乙腈和0.3M氯化鈉的50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.9)用作流動相，其中流動相的流速為0.5mL/分鐘，并且在富勒烯的紫外吸收下進行檢測。結果如附圖1中所示。將具有已知分子量的聚乙二醇類(分子量94,000和5,000)用作分子量標記且保留時間如附圖1中所示。
作為比較對照，使用在一端上帶有甲基，而在另一端上帶有氨基丙基并且具有5000分子量的PEG，并且按照JP-A-09-235235實施例1中所述的方法對按照1∶10摩爾比合成的富勒烯-水溶性聚合物共軛物的分子量進行測定。將含有0.3M氯化鈉的50mM磷酸鹽緩沖液(pH6.9)用作流動相，其中流動相的流速為1mL/分鐘，并且在富勒烯的紫外吸收下進行檢測。結果如附圖2中所示。將具有已知分子量的聚乙二醇類(分子量94,000、46,000和5,000)用作分子量標記且保留時間如附圖2中所示。
從這些結果中可以看出，具有約5,800分子量的實施例1的化合物通過自裝配形成了具有約100,000分子量的聚集物，并且證實尺寸變大。此外，甚至在溶液組合物不同的條件下也形成了具有良好再現性的聚集物，并且因為所連接的水溶性聚合物的數量恒定而顯示出分子量分布的小單峰。另一方面，按照JP-A-9-235235的實施例1中所述的方法合成的富勒烯-水溶性聚合物共軛物具有低于46,000分子量的主要成分，且分子量分布較寬，且觀察到了多個峰，并且由此已經證實可以通過控制所連接的水溶性聚合物的數量而獲得均勻的聚集物。
已知與富勒烯連接的取代基的數量顯著影響活性氧產生的量(對比文件Toxicology in vitro，Vol.16，p41-46，2002)，并且從遞藥系統靶向和活性氧的產生量來看，帶有1個取代基的衍生物，如實施例1的化合物比常規的富勒烯水溶性聚合物共軛物有用。
試驗例2實施例1中合成的與1個分子的PEG(分子量5000)連接的富勒烯的粒子大小的測定通過光散射法對本發明的水溶性富勒烯進行粒子大小測定。將實施例1合成的水溶性富勒烯溶于蒸餾水，使得終濃度可以為1mg/mL和100μg/mL。使用光散射測定設備DLS-7000(Otsuka Electronics Co.，Ltd.)測定該溶液。測定結果如附圖3中所示。
測定結果表明實施例1的化合物為具有約50nm粒子直徑的聚集物，該粒子直徑相對均勻，并且實施例2的化合物為具有約100nm粒子直徑的聚集物，該粒子直徑相應地分布稍寬。認為這些粒子直徑大至足以表現出EPR作用(增強的滲透和保留作用)，與正常組織相比，這些聚合物材料易于遷移至癌組織并且趨向于在癌組織中長期保留。
試驗例3
實施例2中合成的與1個分子的PEG(分子量12000)連接的富勒烯產生的活性氧的量的測定通過細胞色素法測定活性氧產生的量(超氧負離子O2-)。將細胞色素c(Nacalai Tesque Corporation)溶于Hanks’平衡鹽溶液(HBSS，pH7.4，Lifetech Oriental Company)，使得終濃度可以為50μM，取200μL該溶液；將實施例2中制備的與1個分子PEG(分子量12000)連接的富勒烯的溶于HBSS，使得終濃度可以為200μM，取200μL該溶液，將上述兩種溶液混合。在30℃下使用熒光分光光度計F-2000(Hitachi，Ltd.)用不同波長(220-800nm)的光將該混合溶液照射20分鐘。在照射后，使用分光光度計DU-650(Beckmann Company)測定溶液在550nm處的吸光度。每分鐘產生的O2-的量如附圖4中所示，推定在30℃和光屏蔽條件下20分鐘的溶液為對照品。
當用光照射實施例2的水溶性富勒烯時，在從紫外光到可見光區的寬波長范圍內觀察到產生了O2-，并且在260-450nm的寬波長范圍內看到了特別顯著的產生。因此，已經證實能夠通過光照射應用于癌癥的光動力療法。此外，由于因超聲照射導致的聲致發光而產生的光主要具有300-600nm的波長范圍，所以已經證實本發明的化合物適合于超聲間動電流療法。
實施例3富勒烯與水溶性聚合物連接的水溶性富勒烯的合成，在所述的水溶性聚合物中，兩個PEG(分子量5000)與L-天冬氨酸的羧基發生酰胺連接實施與實施例1中相同的操作步驟并且獲得水溶性富勒烯，其中富勒烯的羧基與水溶性聚合物相連，所述水溶性聚合物各自在一端上帶有甲基，而在另一端上帶有氨基丙基的兩個PEG分子(分子量5000)與L-天冬氨酸的兩個羧基發生酰胺連接。
將50mM Boc-L-天冬氨酸(Wako Pure Chemical的產品)的5mL N，N-二甲基甲酰胺溶液加入到含有3-倍摩爾量的聚乙二醇(PEG，分子量5000，Nippon Oil & Fats的產品)的10mL N，N-二甲基甲酰胺溶液，其中所述的聚乙二醇在一端上帶有甲基，而在另一端上帶有氨基丙基，加入3-倍摩爾量的1-羥基苯并三唑和N，N’-二異丙基碳二亞胺，并且在室溫和光屏蔽條件下攪拌24小時。將二異丙醚加入到反應液體中并且獲得沉淀。在將沉淀溶于蒸餾水后，使其通過陰離子交換樹脂柱(DEAE-TOYOPEARL 650M，Cl--型)和陽離子交換樹脂柱(SP-TOYOPEARL650m，H+-type)，并且冷凍干燥流出液且獲得與兩個PEG分子(分子量5000)在羧基上發生酰胺連接的Boc-L-天冬氨酸。將1g獲得的化合物溶于5mL三氟乙酸并且在室溫下進行脫保護1小時。向反應液體中加入二異丙醚，并且通過在減壓下干燥沉淀獲得與兩個PEG分子(分子量5000)在羧基上發生酰胺連接的L-天冬氨酸。
使用與兩個PEG分子(分子量5000)在羧基上發生酰胺連接的L-天冬氨酸而不是實施例1中的在一端上帶有甲基，而在另一端上帶有氨基丙基并且具有5000分子量的聚乙二醇，且進行與實施例1中相同的操作步驟并且獲得與2個PEG(分子量5000)分子連接的富勒烯。
試驗例4用光照射實施例2的水溶性富勒烯時對癌細胞生長的抑制活性的測定測定通過光照射在體外的癌細胞生長抑制活性。將Rlmale1細胞(由Kyoto Pasteur Laboratory提供)用作癌細胞并且使用100mm平皿將這些細胞在37℃和5％CO2，95％空氣培養條件下的RPMI 1640培養基(Sigma Company，含有10％胎牛血清)中溫育，直到它們達到80％的融合。在光屏蔽下將實施例2的水溶性富勒烯溶于與癌細胞培養物中使用相同組成的培養基中并且在將濃度調整至250μM后，將其滅菌并且過濾。用培養基將250μM的滅菌溶液依次稀釋以便制備125μM和62.5μM的溶液。將由此制備的各類溶液10μL分配入96-孔平板中的每個孔中并且僅將不含實施例2的化合物的10μL培養基分配入對照孔。將上述變成80％融合的細胞制成5×104個細胞/mL的細胞混懸液并且取100μL配入上述各孔中。在用振蕩器輕度攪拌96孔平板后，將其保留在8W看片燈(Fuji Coor Sales)下20分鐘或40分鐘并且用光照射。在光照射后，用鋁箔遮蔽平板并且在保溫箱(37℃，5％CO2)中培養3天。就不用光照射的對照組而言，在攪拌后立即用鋁箔遮蔽平板并且保溫3天。在培養3天后，將10μL每種活細胞計數測定試劑SF(Nacalai Tesque Corporation)各自加入到各孔中，并且在保溫箱中保持溫熱80分鐘后，使用微量平板讀出器VERSAmax(JapaneseMolecular Device Company)測定450nm處的吸光度。測定癌細胞存活率，將不添加實施例2的化合物情況下450nm處的吸光度推定為100％并且結果如附圖5中所示。
已經證實當用光照射40分鐘時，實施例2的水溶性富勒烯在其添加量增加時顯著降低了癌細胞的存活率。
試驗例5用光照射時實施例1的水溶性富勒烯的抗癌活性的測定改變給藥途徑并且比較通過光照射體內的抗癌活性。通過以下步驟準備患有癌的小鼠取出腫瘤塊，并且將條片移植在CDF1小鼠(雌性，Charles River Laboratories Japan，Inc.)背部皮下組織上，所述的腫瘤塊已經從通過皮下植入BALA/c-nn(雌性，Charles RiverLaboratories Japan，Inc.)的小鼠結腸癌Colon26細胞(由CancerChemotherapy Center of Cancer Research Society提供)傳代。在植入后5天內將患有癌的小鼠用于本實驗，其中在皮下組織中形成具有約5mm直徑的癌。將實施例1的化合物溶于磷酸緩沖生理鹽水溶液，使得它可以為6mg/mL并且在給藥后5分鐘內使用藍相(VivadentCompany)用光在腫瘤部位上照射皮下區腫瘤或腫瘤內給予100μL所述溶液的組。照射條件為使用具有8mm直徑的探頭與650w/cm的輸出功率進行4分鐘照射。將該操作連續進行3天。就靜脈內給藥組而言，將實施例1的化合物溶于磷酸緩沖生理鹽水溶液，使得它可以為6mg/mL并且對小鼠尾靜脈給予100μL所述溶液且在給藥后24小鼠內使用藍相用光照射腫瘤部位。照射條件與皮下組織腫瘤內給藥組的條件相同并且將該操作連續進行3天。
將不給予水溶性富勒烯并且不用光照射的患有癌的小鼠用作對照組并且對每只小鼠測量隨時間變化的皮下區腫瘤大小。通過用滑動測徑器實際測量癌的長軸和短軸來測量癌的大小并且使用Winn報導的計算公式計算(Nalt.Cancer Inst Monogr.，Vol.2，p113-138(1960))。結果如附圖6中所示。
當給予實施例1的水溶性富勒烯并且合并光照射時，腫瘤體積的增加受到抑制，并且這種抑制作用增加的順序為皮下給藥<腫瘤內給藥<靜脈內給藥。由于靜脈內給藥組盡管在24小時后用光照射仍然表現出最有效的結果，所以已經證實就本發明的水溶性富勒烯而言，通過血管給予是最佳注射方法，這提示了EPR作用產生的可能性。
試驗例6用超聲波照射實施例2的水溶性富勒烯時對癌細胞生長的抑制活性的測定使用活細胞計數測定試劑SF，參照Ukeda的報告(DOJIN NEWS，No.96，pl-6，2000)測定超聲照射產生的活性氧的量(超氧負離子O2-)。將實施例2的水溶性富勒烯溶于Hanks’平衡鹽溶液，使得它可以為200μM，取750μL該溶液配入35mm平皿。將該溶液與600μL Hanks’平衡鹽溶液和150μL活細胞計數測定試劑SF混合，并且在攪拌的同時使用超聲間動電流療法裝置US-700(Ito Ultrashort Wave Company)用具有1MHz頻率、輸出模式(工作期)30％的不同輸出(1.5、2.0、2.5和3.0W/cm2)的超聲波從液體表面照射5分鐘。照射后，使用分光光度計DU-60測定450nm處的吸光度。將使用超聲波照射，但不添加化合物的溶液的在450nm處的吸光度推定為對照組并且每分鐘產生的O2-的量如附圖7中所示。
已經證實當用超聲波照射實施例2的水溶性富勒烯時，活性氧的量隨輸出的增加而增加。
試驗例7用超聲波照射實施例1的水溶性富勒烯時對癌細胞生長的抑制活性的測定測定超聲波照射的體外抗癌活性。將RLmale1細胞按照與試驗例4中類似的方式使用。在光屏蔽條件下將實施例1的水溶性富勒烯溶于與癌細胞培養中使用相同組成的培養基中，并且在將濃度調整至500μM后，將其滅菌并且過濾。由無菌的500μM溶液制備250μM溶液。取由此制備的溶液200μL配入6孔平板的各孔，并且僅將不含實施例1的水溶性富勒烯的200μL培養基配入對照孔。將RLmalel細胞調整至1×105個細胞/mL并且獲得細胞混懸液且取2mL配入上述各孔。在使用移液管將孔中的細胞輕度混合后，使用超聲間動電流療法儀US-700在2.0W/cm2輸出功率，20％的輸出模式下通過導電膏從平板的基底部開始用具有1MHz或3MHz頻率的超聲波照射2分鐘。在超聲照射后，用鋁箔遮蔽平板并且在保溫箱(37℃，5％CO2)中培養3天。就不使用超聲波照射的對照組而言，在混合后立即用鋁箔遮蔽平板并且按照相同方式培養3天。在培養3天后，將來自各孔的100μL細胞混懸液各自配入96-孔平板并且將10μL活細胞計數測定試劑SF各自加入到各孔中，在保溫箱中保持溫熱45分鐘后，使用全自動定量繪圖酶標儀VERAmax測定450nm處的吸光度。測定癌細胞存活率，將不添加實施例1的化合物情況下450nm處的吸光度推定為100％存活率并且結果如附圖8中所示。
已經在超聲照射中證實，在與試驗例4中相同的方式中，癌細胞的存活率隨著本發明化合物的添加量增加而下降。就這種作用而言，1MHz比3MHz頻率更為顯著。因此，已經證實本發明的水溶性富勒烯可以用于使用超聲照射的超聲間動電流療法和使用光照射的癌癥的光動力療法。
工業實用性正如上文詳細描述的，可以按照本發明獲得所連接的水溶性聚合物數量受控的水溶性富勒烯。當用光照射本發明的水溶性富勒烯時，O2-在從220nm-可見光區(380-780nm)的寬波長范圍內產生。它特別在260-450nm波長范圍內表現出了高O2-產生能力。此外，因超聲照射導致的聲致發光而產生的光主要具有300-600nm范圍的波長，并且當用超聲波照射本發明的水溶性富勒烯時，O2-也會產生。除此之外，本發明的水溶性富勒烯高度蓄積在癌組織和炎癥組織中。因此，本發明的水溶性富勒烯可以用作活性氧發生器并且可以應用于癌癥的光動力療法或超聲間動電流療法。
權利要求
1.水溶性富勒烯，其中該富勒烯在其分子上帶有官能基并且通過所述的官能基連接水溶性聚合物。
2.權利要求1所述的水溶性富勒烯，帶有1-5個官能基。
3.權利要求1或2所述的水溶性富勒烯，帶有1個官能基。
4.權利要求1-3中任一項所述的水溶性富勒烯，其中所述的官能基為羧基。
5.權利要求1-4中任一項所述的水溶性富勒烯，其中該富勒烯為C60富勒烯。
6.權利要求1-5中任一項所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物的分子量為1,000-1,000,000。
7.權利要求1-6中任一項所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物為選自非離子水溶性合成聚合物、非離子或離子多糖類、其改性物質、這些水溶性聚合物中的兩種或三種組分的共聚物或復合物、透明質酸、脫乙酰殼多糖和甲殼質衍生物的水溶性聚合物。
8.權利要求1-7中任一項所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物為在一端上帶有非活性基團，而在另一端上帶有與富勒烯的官能基反應的反應基團的水溶性聚合物。
9.權利要求8所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物為在一端上帶有非活性基團，而在另一端上帶有與富勒烯的官能基反應的反應基團并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇。
10.權利要求9中所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物為在一端上帶有C1-C6烷基，而在另一端上帶有被氨基取代的C1-C6烷基并且具有4000-15000分子量的聚乙二醇。
11.權利要求8所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物為聚乙二醇與化合物的復合物，所述的聚乙二醇在一端上帶有非活性基團并且具有4000-15000分子量，所述的化合物帶有與富勒烯的官能基反應的反應基團。
12.權利要求11所述的水溶性富勒烯，其中所述的水溶性聚合物為在一端上帶有C1-C6烷基，而在另一端上帶有被氨基取代的C1-C6烷基的聚乙二醇與氨基酸的反應產物。
13.權利要求1-12中任一項所述的水溶性富勒烯，其中該水溶性富勒烯為聚集物形式。
14.權利要求13所述的水溶性富勒烯，其中所述的聚集物具有20-400nm大小。
15.權利要求1-14中任一項所述的水溶性富勒烯，其中該水溶性富勒烯或其聚集物為水溶液形式。
16.生產水溶性富勒烯的方法，其特征在于使水溶性聚合物與在分子上帶有官能基的富勒烯的官能基反應。
17.權利要求16所述的生產水溶性富勒烯的方法，其中所述的水溶性聚合物為權利要求6-12中任一項所述的水溶性聚合物。
18.權利要求16或17所述的生產水溶性富勒烯的方法，其中所述的富勒烯的官能基為一個羧基。
19.活性氧發生器，含有權利要求1-15中任一項的水溶性富勒烯或通過權利要求16-18中任一項的生產方法生產的水溶性富勒烯。
20.權利要求19所述的活性氧發生器，用于光動力療法或超聲療法。
21.權利要求19所述的活性氧發生器，用于抑制細胞增殖。
22.權利要求21所述的活性氧發生器，其中所述的細胞為癌細胞。
23.權利要求19-22中任一項所述的活性氧發生器，用于治療癌癥。
全文摘要
可以通過使水溶性聚合物與分子上帶有官能基的富勒烯通過該官能基偶聯而獲得結合的水溶性聚合物的數量已經得到調節的水溶性富勒烯。這種水溶性富勒烯可以通過將其用作活性氧發生器而用于癌癥的光動力療法或超聲療法。
文檔編號A61K33/00GK1961027SQ20058001322
公開日2007年5月9日 申請日期2005年3月31日 優先權日2004年3月31日
發明者田畑泰彥, 山田正敏, 增田亮 申請人:日本化藥株式會社, 田畑泰彥