專利名稱：生物學上穩定的銀納米顆粒的抗微生物活性的制作方法
技術領域：
本發明涉及抗微生物制劑。
根據本發明涉及含有銀的抗微生物制劑。
背景技術：
銀作為抗微生物劑的用途長久以來為人類所知。幾千年來，銀被全世界的文明社會用作愈合和抗微生物劑。其醫學、防腐和恢復能力可以追溯至古希臘和羅馬帝國。在現代藥物學發展之前的很長時間里，銀被用作殺菌劑和抗生素●希臘人使用銀容器來使水和其它液體保鮮。著作《Herodotus》(希臘的哲學家和歷史學家)表明銀的使用先于基督誕生。
●羅馬帝國將酒儲存在銀缸中來防止腐敗。
●在古印度和古埃及的著作中提到了銀的用途。
●在中世紀，銀器用來保護貴族免受瘟疫的全部侵襲。
●現代殺菌劑和抗生素誕生之前，人們就已知致病的病原體在銀存在時不能存活。因此，銀被用于餐具、飲用容器和進食器皿中。
●具體而言，貴族們使用銀容器存儲和食用他們的食物來防止細菌生長。
●中國的皇帝和他們的大臣使用銀質筷子進食。
●Druids留有他們使用銀的證據。
●澳大利亞內地的移民在他們的水缸中懸浮銀器來防止腐敗。
●長途跋涉穿越美國西部的先驅者發現，如果他們將銀幣或者銅幣放在他們的飲水桶中，那么它會保持水不長細菌、藻類等。
●都沿著該邊沿，人們將銀質美元放在牛奶中來使其保持新鮮。
●第一次世界大戰期間，軍隊保持用銀葉來抵抗傷口感染。
●在引入抗生素之前，膠體銀在醫院中廣泛使用，并且其作為殺細菌劑至少已經知道1200年。
●19世紀早期，醫生在外科創傷中使用銀質縫線取得了非常成功的結果。
●在Ayurvedic醫學中，使用少量的銀作為由于年齡或疾病而虛弱的病人的補劑、酏劑或恢復劑。
直到19世紀后期，東方的科學家才再次發現數千年來已知的銀是非常強大的病菌抵抗劑。隨后，才研發出藥用的銀化合物，從而使銀成為常用的藥物。到20世紀早期，銀作為抗細菌物質的用途變得普遍起來。到1940年，市場上大約有48種不同的銀化合物用來治療各種已知的傳染病。它們有口服、注射和局部形式。但是，這些藥用銀制劑、尤其是某些蛋白質結合類型的銀化合物以及不適當制備和不穩定的組合物導致稱為銀質沉著病的皮膚褪色。
新的身體化學知識導致膠體消毒劑和藥物的大量應用，并導致對銀膠體的能力和可能性進行持續研究。然而，銀的“新發現”的優良抗感染劑的名譽只存在了很短的時間。
20世紀30年代期間，合成制備的藥物開始出現，并獲得利潤，加上制備簡單，這種新的治療來源成為市場上的強大力量。人們對新“特效藥”很興奮，并且那時未出現致病生物的抗抗生素株系。銀很快讓位于抗生素。
一些銀制劑在主流藥物中的用途保存下來。它們中包括在新生嬰兒的眼睛中使用稀釋的硝酸銀來防止感染，以及在燒傷病房中使用銀基藥膏“Silvadine”來消除感染。其它未失寵的用途如下●使用銀質水純化濾器和片劑來防止藻類和細菌生長。
●使用用銀離子或銅離子浸滲水的電離單元來消毒蓄水，沒有氯氣的刺激效果。
●在宇宙飛船上用銀來消毒循環水。
●瑞士人在家里和辦公室里使用銀質濾器。
●自治區使用銀來處理污水。
●銀是抵抗空氣傳播的毒素以及其它工業毒物的常用試劑。
但是大部分時候，由于藥物抗生素的發現，銀作為抗微生物試劑的興趣幾乎下降至消失的程度。
作為Margraf博士著名的工作結果，銀作為抗生素治療的佐劑再次出現，Margraf博士發現，使用5％的硝酸銀稀釋溶液殺死侵入的燒傷細菌并允許傷口愈合。更重要地，沒有抗性菌株出現。在20世紀60年代，Moyer廣泛地使用硝酸銀來治療燒傷患者。然而，硝酸銀還很不理想。最終，由于許多并發癥例如Ag+與體液中的Cl-、HCO3-以及蛋白質陰離子的中和作用(因此降低其殺微生物活性)以及產生容貌異常，即由于銀鹽在皮膚中沉淀致使藍灰著色而導致的銀質沉著病，其未被認為是理想的抗微生物劑。
研發出目前在70％的燒傷中心中使用的磺胺嘧啶銀(Silvadene，Marion Laboratories)。哥倫比亞大學的Charles Fox博士發現，磺胺嘧啶也已經成功用于治療霍亂、瘧疾和梅毒。它也能阻止造成感冒瘡、帶狀皰疹以及更嚴重疾病的皰疹病毒。
由于研究表明的膠體銀在抵抗微生物中的優良表現，其吸引了全世界一流科學家和醫學研究者的注意。它的益處激起了新的興趣，目前50名杰出醫生正在研究膠體銀在人類健康中的功效以及應用。
根據專家結論，當直接暴露于膠體銀時，尚沒有檢測到微生物能夠存活6分鐘以上。
Science Digest將膠體銀引證為“......現代藥物的奇跡”，并進一步陳述為“抗生素殺死6種不同的致病微生物，但銀殺死大約650種。不能產生抗性菌株。而且，銀幾乎無毒性。作為抗微生物試劑使用，膠體銀不會像抗生素一樣創造超級菌。”giant Searle Pharmaceuticals)(現在的Monsanto)的創始人Alfred Searle說道“向人類受試者應用膠體銀已經在大量病例中進行，得到令人驚訝的成功結果。對于體內施用，它具有快速致死病原體但對宿主無毒性的優點。它非常穩定。”更多的信息表明，膠體銀不與其它藥療法或局部治療產生有害的相互作用。在用膠體銀進行實驗室檢測時，細菌、病毒和真菌生物體在接觸數分鐘之內被殺死。1988年11月1日，健康科學中心(Centre For The Health Science)UCLA醫學院(UCLA School of Medicine)Department of Obstetrics and Genecology的M.D.Larry C.Ford報導“我用標準的殺菌劑抗微生物測試檢測了它們(銀溶液)。對于釀膿鏈球菌(streptococcus pyogenes)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus Aureus)、淋病奈瑟氏球菌(Neisseria Gonorrhea)、陰道加德納氏菌(Gardnerella Vaginalis)、傷寒沙門氏菌(Salmonella Typhi)和其它腸道病原體，銀溶液抗菌濃度為每毫升105個生物，并且對白假絲酵母(Candida Albicans)、Candida Globata和糠秕馬拉色菌(M.Furfur)是殺真菌的”。
由于許多生物演化出抵抗現代抗生素的菌株，所以Rober Becker博士的發現尤其重要。錫拉丘茲大學(Syracuse University)的Becker說道“我們檢測的所有微生物都對用電產生的銀離子敏感，包括一些抵抗所有已知抗生素的微生物。任何情況下，銀治療都不會有不希望的副作用。”由于膠體銀不像抗生素僅對細菌特異，它失活厭氧細菌、病毒、酵母和真菌必需的某些酶從而破壞這些酶，所以膠體銀的潛力非常顯著。由于銀攻擊細菌的食物來源而非直接攻擊它們，所以進一步表明這些細菌不能像對抗生素一樣發展出對銀的抗性。
然而，現在已經認識到，硝酸銀和磺胺嘧啶銀都損害成纖維細胞和上皮細胞增殖，最終阻止愈合過程。發現更好的含銀藥物的嘗試僅取得了有限的成功。在過去幾年中，出現了一些有趣的報道，其中描述了在燒傷治療應用銀涂布的薄膜。這些薄膜用蒸汽沉積技術制備，從而具有大約300nm的厚度。在一項這些研究中，據稱薄膜包含化學封端的納米結晶銀，一般粒徑為大約50nm。此類薄膜遞送持續劑量的高濃度(5000-10000mg/l)銀，這具有細胞毒性效應。當病人用局部含銀制劑進行治療時，會通過燒傷傷口發生銀離子的顯著吸收。當使用膏基包含高達3000μg Ag+/gm的銀制劑時，肝中估計的銀濃度為14mg/gm。Hidalgo等人研究了硝酸銀對人類皮膚成纖維細胞的效應，并發現低濃度(8.2μM/l)的銀離子顯示出抑制效應。
因此，存在對作為有效的抗微生物劑使用但不具有任何細胞毒性效應并且不需要加入任何生物不相容物質的含銀制劑的需求。
發明簡述本發明的目的是提供包含生物學穩定化的銀納米顆粒的抗微生物制劑，其中所述銀納米顆粒通過“綠色”生物路線穩定，其在載體中具有1-100nm的平均大小和1-6ppm的濃度。
本發明的另一目的是提供包含生物學穩定化的銀納米顆粒的抗微生物制劑，其中所述銀納米顆粒(a)在非常低的有效濃度(由于它們非常大的表面積)呈現抗微生物活性，并且(b)在這些濃度下無細胞毒性。
發明詳述根據本發明提供了抗微生物制劑，其包含(1)1-100nm大小范圍的生物學穩定化的銀納米顆粒；和(2)載體，其中所述生物學穩定化的銀納米顆粒的濃度范圍為1-6ppm。
一般而言，銀納米顆粒用浸軟的植物組織細胞的水溶液進行生物學穩定。
根據本發明的一個實施方案，水溶液用去離子水中進行高達10倍的稀釋。
一般而言，植物組織是選自一組植物組織的至少一種組織，所述一組植物組織包括下面植物的葉、根、莖、花和果實苜蓿(Alfa alfa)、阿拉伯金合歡(Acacia arabica)、芫荽(Coriandrum sativum)、East IndianRosebay(Ervatamia coronaria)、黃細心(Boerhavia diffusa)、具芒小檗(Berberris aristata)、金盞花(Calendula officinalis)、歐芹(Petroselinumsativum)、土牛膝(Achyranthes aspera)、耳葉番瀉(Cassia auriculata)、熏衣草、紅果欖仁樹(Terminalia belerica)、茴香(Fenniculum vulgare)、問荊(Equisetum arvense)、復盆子(Rubus idaeus)、翠葉蘆薈(Aloebarbadensis)、白毛茛(Hydrastis canadensis)、大蒜(Allium sativum)、紫松果菊屬(Echinacea spp.)、小米草(Euphrasis offcinalis)、木桔(Aeglemarmelos)、土木香(Trachyspermum ammi)、德國甘菊(Matricariachamomilla)、丁香(Syzygium aromaticum)、姜(Zingiber officinale)、圣羅勒(Ocimum sanctum)、印度鐵莧(Acalypha indica)、曼陀羅(Daturainnoxia)、薄荷(Mentha spp.)、萎葉(Piper betle，linn)、金盞花(Calendulaofficinalis LINN)、Chick weed(Trichobasis lychnidearum)、黃瓜(cucumissativus，Linn)、Acasia arabica、油橄欖(Olea europea L.)、野雛菊(Wilddaisy)、枯茗種子(Cuminum cyminum)、咖喱葉(Murraya koengi)、蒔蘿(Anethum graveolens)、磨盤草(Abutilon indicum)、楝樹(Azadirachtaindica)、Madhua(Madhuca indica)、羅望子(Tamarinus indicus)、姜黃(Curcuma longa)、催眠睡茄(Withania sommnifera)、棗(Zizyphus jujuba)、西葫蘆(Pumpkin)(Cucurbita pepo，Cucurbita maxima)、美洲椴(TiliaAmericana)、菖蒲(Acorus calamus)、莧(Amaranthus spinosa)、山生阿尼菊(Arnica Montana)、美洲接骨木(Sambucus Canadensis)、藥水蘇(Stachysofficinalis)、黑莓(Black berry)(Eugenia jambolana)、金盞花(Calendulaofficinalis LINN)、黃春菊(Matricaria chamomilla)、石松((Lycopodiumselago或clavatum)、蒲公英(Taraxacum officinalem)、Echinicea(Echinaceaangusifolia)、桉樹(Eucalyptus globules)、白毛茛(Hydrastis Canadensis)、Fig wort、聚合草(Symphytum officinale)、連香報春花(Primula veris(L))、歐洲變豆菜(Sanicula europaea)、歐洲馬鞭草(Verbena offcinalis)、Horseweed、石蓮花(Sempervivum tectorum，Linn)、美洲落葉松(Larix laricina)、療肺草(Pulmonaria angustifolia)、洋蔥(Alium cepa)、番木瓜(Caricapapaya)、桃樹(Prunus persica、三色堇(Viola tricolor(LINN)、珠光香青(Anaphalis margaritacea)。
載體是乳膏、凝膠劑、軟膏劑、液體、混懸劑、氣溶膠噴霧劑、紗布、纖維填料、膜、薄膜、帶子、硬膏。
根據本發明的另一方面，提供了制備根據前述權利要求中任意一項的抗微生物制劑的方法，其包括步驟(1)用常規方法制備選自乳膏、凝膠劑、軟膏劑、液體、混懸劑、氣溶膠噴霧劑、紗布、纖維填料、膜、薄膜、帶子、硬膏、結塊的載體，(2)制備1到100nm大小范圍的生物學穩定化的銀納米顆粒的水性分散液；(3)在所述載體中混合所述水性分散液的分配量，從而形成其中銀納米顆粒的濃度范圍介于1到6ppm之間的均勻基質。
生物學穩定銀納米顆粒的水性分散液通過下列步驟制備(a)在具有低于3微西門子電導率的水中溶解銀鹽，從而獲得其中銀離子濃度在20,000到50,000ppm范圍的溶液，(b)制備生物組織提取物新鮮過濾的水溶液；(c)用去離子水以1∶5到1∶50的比率稀釋所述水溶液，從而形成具有+0.2至+0.2伏特之間的斷路電位和5.5到7.5之間的pH以及至少7,500ppm的總的有機碳含量的溶液；(d)在20-30攝氏度之間的溫度、持續攪拌下維持所述水溶液；(e)在持續攪拌下，在所述水提取溶液中接種微量的銀鹽溶液，從而使反應混合物中金屬離子的終濃度在50到300ppm的范圍內；(f)在充分照明的條件下繼續攪拌30分鐘至3小時，從而獲得銀納米顆粒的膠體懸浮液；(g)通過已知方法例如離心從膠體懸浮液中分離納米顆粒。
制備生物學穩定化的銀納米顆粒的過程可以如下例證使用帶有預濾器、碳濾器和反滲透膜的Labconco，USA專業水處理系統采集水。經安裝在儀器上的聯機數字計測得所述水具有2.7微西門子的電導率。
將50枝整朵朱槿(Hibiscus rosasinensis Linn)(48.37gm濕重)用150ml去離子水在攪拌器(500rpm)中軟化10分鐘以獲得均質粘性懸浮液。使該粘性懸浮液通過Whatman No1濾紙在真空下過濾以獲得澄清的165ml粘性溶液。從中取10ml等分試樣用水稀釋至100ml。
取7ml等分試樣在電化學分析儀(CH Instruments 600B，USA)上使用三電極系統在25℃檢測斷路電位。Ag/AgCl(aq)用作參考電極，玻態碳用作工作電極(直徑3mm)，Pt金屬絲(長4cm)用作對電極。測出值為+0.15伏特。同樣的，使用數字pH計(control Dynamics，印度)檢測自由流動溶液的pH為5.6。
使用Beckman TOC分析儀測量總的有機碳的濃度為22180ppm。
使用Borohydride還原法合成銀納米顆粒，方法如Jin.R、Cao.Y.W.、Kelly k.l.、Schatz G.C.、Zheng J.G.和Chad A.Mirkin(2001)Photoinducedconversion of silver nanospheres to nanoprisms.Science294；1901-1903所述。簡言之，10ml花的水性提取液與100μl硝酸銀母液(100mM)反應，繼之加入100μl的硼氫化鈉(500mM)使形成膠態懸浮液。
使用Diode Array分光光度計(Ocean Optics，USA)在200-800nm掃描膠態懸浮液樣品。在410nm的峰被檢出。該峰是銀納米顆粒的特征性等離子體振子峰(附1)，通常具有5-120nm的平均直徑。
使用透射電鏡(TEM)在200kV用裝備有場發射槍，即CM200 FEG的Philips電子顯微鏡檢查另一份膠態懸浮液。吸取2μl的膠體溶液至碳包被的銅網制備TEM標本并獲得圖像。在圖像中所見平均大小為10-20nm(附2)。
使用帶有E掃描頭的Nanonics MultiView 1000 AFM(NanonicsImaging Ltd.，Jerusalem，以色列)對樣品進行原子力顯微鏡掃描。用具有20nm半徑和80kHz共振頻率的探針以非接觸模式掃描樣品。使用QUARTZ軟件，版本1.00(Cavendish Instruments Ltd.，UK)對AFM圖像進行捕獲、加工和分析。將5μl樣品置于1cm2載玻片(厚度0.5mm)上并在成像前層流干燥。觀察50-100nm直徑和125nm高的均勻顆粒，樣品的一部分的三維AFM視圖如在附3a所示，圖3b是二維視圖，顯示通常顆粒的大小分析。
抗微生物活性評估為了評估，如下制備制劑液體懸浮物在單獨的容器中用去離子水稀釋如上制備的銀納米顆粒，其中生物學穩定化的銀納米顆粒的濃度測定為在1.56-6ppm的范圍。
膏基軟膏劑用氧化鋅(25gm)和甘油(25gm)混合液態石蠟(400ml)，獲得均勻混合物。在設置為100℃的水浴中加熱蠟(50gm)、特種蠟(50gm)和硬脂酸(11gm)，形成均勻的液體混合物。將液態石蠟混合物緩慢地倒入石蠟混合物中，并劇烈攪拌，以便獲得均勻物質。緩慢地將生物學穩定化的銀納米顆粒(5mg)引入該物質并不斷攪拌，獲得包含均勻銀納米顆粒的軟膏。
紗布條將如上制備的生物學穩定化的銀納米顆粒懸浮物或軟膏劑浸滲在消毒的紗布條中。
生物學穩定化的銀納米顆粒的抗微生物潛力在下列方法和檢測的基礎上進行評估。
微生物。在研究中用到下列細菌菌株大腸桿菌ATCC117(Esherichiacoli ATCC 117)、銅綠假單胞桿菌ATCC 9027(Pseudomonas aeruginosaATCC 9027)、奧博尼沙門氏菌(Salmonella abony)NCTC 6017、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 23564(Salmonella typhimurium ATCC 23564)、產氣克雷伯氏菌ATCC 1950(Klebsiella aerogenes ATCC 1950)、普通變形菌NCBI4157(Proteus vulgaris NCBI 4157)、金黃色葡萄球菌ATCC 6538P(Staphylococcus aureus ATCC 6538P)、枯草芽孢桿菌ATCC 6633(Bacillussubtilis ATCC 6633)和白色念珠菌(Candida albicans)[酵母]。
敏感性檢測。根據National Committee for Clinical LaboratoryStandards，NCCLS的推薦，在含有200μl MH培養液的96孔微量滴定板上進行生物學穩定化的銀納米顆粒對上述菌株的最低抑制濃度(theminimum inhibitory concentration，MIC)實驗。孔中銀的濃度在1.56-25μg/ml的范圍。用鹽水稀釋對數生長期細胞懸浮液，并將其接種至孔中，使接種物的終濃度為1×105CFU/ml。在37℃溫育微量滴定板，并在24小時后通過肉眼對其生長/無生長打分。銀抑制生長的最低濃度記錄為最低抑制濃度(MIC)。從顯示無可見生長的孔中取培養基點接種于MH瓊脂平板上，并將平板溫育24小時，從而測定殺菌的最低銀濃度(MBC)。
結果如附圖
的圖4[表1]所示。結果顯示，革蘭氏陽性細菌和革蘭氏陰性細菌的MIC值介于1.56-3.12ppm生物學穩定化的銀納米顆粒的范圍，而MBC值介于6.25-12.5ppm生物學穩定化的銀納米顆粒的范圍。酵母的MIC值為12.5ppm，而MBC為50，這表明所選濃度對酵母沒有顯著作用。
中和劑對生物學穩定化的銀納米顆粒的影響。在存在血清白蛋白、氯化鈉和巰基乙醇酸鈉時在MHB中測定生物學穩定化的銀納米顆粒活性的中和作用。為了這個目的，按照Furr等人(1994)的建議在一組MHB中加入三種不同濃度的血清白蛋白(2％、5％、10％)和0.85％氯化鈉，而在另一組中加入0.1％、0.5％和1％的巰基乙醇酸鈉。如上所述測定MIC。
發現存在上述中和劑時MIC值保持不變。
時間-殺滅動力學。在加入適量生物學穩定化的銀納米顆粒(對應不同培養物MBC的濃度下)的2ml MH培養液中接種細菌培養物(最終的細胞密度為1×105CFU/ml)。在暴露于生物學穩定化的銀納米顆粒后的特定時間間隔(大約0、30、60、90和120分鐘)取出0.1ml樣品，連續稀釋，并接種于MH瓊脂平板上。將平板置37℃溫育24小時后測定總的活菌數目(thetotal viable count，TVC)。所有實驗一式四份地進行。通過CFU/ml的log10對時間繪圖構建殺滅曲線。這些殺滅曲線如附圖的圖5所示。
對于所有檢測的細菌培養物，在2小時短暫的暴露時間內總存活細胞數減少了90％。數據表明，生物學穩定化的銀納米顆粒有效地抑制革蘭氏陰性細菌和革蘭氏陽性細菌，包括銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)的多藥物抗性菌株。
生物學穩定化的銀納米顆粒的后效應。使用分光光度法研究生物學穩定化的銀納米顆粒的后效應。簡而言之，將所有細菌菌株(105CFU/ml)在37℃暴露于4×MBC的生物學穩定化的銀納米顆粒1小時。未暴露于生物學穩定化的銀納米顆粒的培養物在實驗中作為對照。將懸浮物在3000×g離心10分鐘，并用生理鹽水洗滌沉淀物數次以除去痕量的銀納米顆粒。在時間0(Ninic)和除去生物學穩定化的銀納米顆粒后(Nnanaosilver)后進行菌落計數。然后在MHB中懸浮培養物沉淀，并通過660nm下O.D測量定期監視培養物的生長。所有培養物于37℃攪拌下進行溫育，并在每小時之后測量O.D。生物學穩定化的銀納米顆粒的后效應計算為暴露和未暴露于生物學穩定化的銀納米顆粒的測試培養物的CFU達到一個對數刻度增加所需的時間的差異。
計算生物學穩定化的銀納米顆粒的后效應一旦測定了Ninic和Nnanaosilver，并且對照和通過分光光度法監視暴露的培養物的生長，那么進行下列步驟(i)在半對數紙上繪制對照和暴露后培養物的分光光度生長曲線，其y軸代表光密度(O.D)，而x軸代表時間，通常第一個有意義的O.D讀數可以在對照培養物起始時間(tinic＝0)后4或5小時處獲得。(ii)從分光光度的生長曲線測定世代時間(lg)。(iii)計算殺菌效應(r)r＝Ninic/Nnanosilver(iv)對照培養物和暴露后培養物的分光光度生長曲線時間分離(tsep)的圖解測定。(v)根據下列公式計算生物學穩定化的銀納米顆粒的后效應生物學穩定化的銀納米顆粒后效應＝tsep-texpo-tglogr/log2其中tsep為對照培養物和暴露后培養物分光光度生長曲線的分離時間；texpo為等效于1小時持續時間的暴露時間，trecrt為經處理的培養物的生活力計數(Nanti)匹配最初計數(Ninic)所需的理論時間，r為殺菌效應，而tg為世代時間。附圖的圖6a和6b分別顯示生物學穩定化的銀納米顆粒對革蘭氏陰性細菌培養物和酵母的后效應。如生長曲線中的停滯期所示，發現生物學穩定化的銀納米顆粒的后效應為6-8小時。
藥物與生物學穩定化的銀納米顆粒的相互作用。使用二維棋盤大量稀釋技術來表征生物學穩定化的銀納米顆粒與藥物(即慶大霉素、青霉素、頭孢噻肟、Ceptazidime、卡那霉素、萬古霉素)之間的相互作用。對上述銅綠假單胞桿菌MDR菌株進行6次實驗。相似于進行易感性測試的接種物制備接種物。每種含生物學穩定化的銀納米顆粒的藥物用連續兩倍稀釋法稀釋，濃度為MIC的1/4以下至MIC的四倍以上。將與生物學穩定化的銀納米顆粒組合的藥物抑制測試生物可見生長的最高稀釋濃度認為是部分抑制濃度(the fractional inhibitory concentration，FIC)。用部分抑制濃度(FIC)指數(FICI)來定義兩種藥物間的相互作用。FICI為每種藥物FIC的總和。FIC如下計算組合進行檢測的藥物的MIC/單獨進行檢測的藥物的MIC。如果FICI為0.5，那么相互作用定義為協同的，如果FICI＞0.5至1.0，那么為加性的，如果FICI＞1.0至2.0，那么為中性的，如果FICI＞2.0，那么為拮抗性的。
這項工作過程期間獲得的平均FICI值表明，生物學穩定化的銀納米顆粒的作用與頭孢噻肟和頭孢菌素是協同性的，而與ceptazidime部分協同，與慶大霉素、青霉素和氨芐青霉素為中性的。然而，與卡那霉素和萬古霉素組合時可見到拮抗效應。
生物學穩定化的銀納米顆粒在紗布條上的抗微生物活性。紗布條(2cm×2cm)進行高壓滅菌，并用100μl生物學穩定化的銀納米顆粒懸浮液或通過涂敷包含生物學穩定化的銀納米顆粒的軟膏劑(對各自培養物都含有4×MIC濃度的生物學穩定化的銀納米顆粒)將其潤濕，然后接種105個細胞。同時用生理鹽水處理作為對照。紗布條置于無菌培養皿中，并將其保持在37℃潮濕的培養箱中。在0時并且以4小時的間隔檢查培養物的生活力，持續24小時。為此，取出一塊紗布條，放置在10ml鹽水中，渦旋，并對懸浮液進行連續稀釋，最后接種在營養瓊脂平板上。37℃溫育24小時后測定TVC。對處理和對照紗布條在每個反應時間進行6次平行實驗。
對所有6次平行實驗計算從每種類型的紗布條回收的生物的log10對數值(當檢測到零個菌落時，假定為一個菌落)。結果如附圖的圖7A、7B和7C中相對于反應時間的平均Log值。
所得結果顯示，測試生物的數量下降＞97％所需要的時間為8小時。
體外細胞毒性測試。人白血病細胞系K562、肝細胞癌細胞系HEPG2和小鼠成纖維細胞L929在補加了10％胎牛血清和1％抗生素-抗真菌的商品化制劑的Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM，Sigma，美國)中進行常規培養。培養物維持在37℃、5％的CO2氣氛中。
用XTT測定試劑盒(Roche Molecular Biochemicals，德國)檢驗四種制劑即用甘油(EC-Gly)穩定的電化學合成的銀納米顆粒、用聚乙烯吡咯烷酮(EC-PVP)穩定的電化學合成的銀納米顆粒、生物學穩定化的銀納米顆粒(Chem-Bio)和硝酸銀(AgNO3)對以上3種細胞系的細胞增殖和生活力的比較效應。簡而言之，在含有DMEM的微量滴定板(96孔)中接種，最初的細胞密度為每毫升1×105個細胞。讓細胞在37℃、5％CO2中繁殖24小時。溫育之后，小心移出上清液培養基，并加入添加了1.5-15μg/ml納米銀的DMEM。平板進一步在37℃、5％的CO2氣氛中溫育48小時。溫育后，向每孔中加入50μl XTT試劑，平板在37℃、5％的CO2氣氛中溫育4小時。用ELISA讀出器(μQuant，Biotech Instruments)在450nm定量由于形成甲 而產生的顏色。在690nm掃描平板，以便提供對細胞吸光度的校正。XTT測定法用不含銀納米顆粒的適當對照進行6次重復。
所得結果如附圖的圖8、9和10中的表所示。
可以清楚地看到，生物學穩定化的銀納米顆粒在1-6ppm濃度下對所有三種細胞系都沒有毒性。也可以看到，化學穩定的銀納米顆粒和硝酸銀甚至在3.12ppm的濃度時也是高度細胞毒性的。
因此，在根據本發明所做的實驗中，發現生物學穩定化的銀納米顆粒在1-6ppm的濃度范圍內具有廣譜的抗微生物效應。而且，在這個濃度范圍內，生物學穩定化的銀納米顆粒不顯示出體外細胞毒性。
本文所述生物學穩定化的銀納米顆粒可以作為多種醫療裝置的涂布材料用于燒傷治療，其中所述醫學裝置為例如導管、心臟瓣膜、生物活性眼鏡涂布的縫線(bioactive glasses coated sutures)和矯形裝置。其非醫學應用為應用于水和空氣凈化系統中。
根據本發明的生物學穩定化的銀納米顆粒可以用作多種細菌感染的殺菌劑和抗生素。
因此，用生物學穩定化的銀納米顆粒制備的制劑可以用于治療炭疽、腳癬、癤、念珠菌性腹膜炎(Candida)、腦脊髓膜炎、結腸炎、膀胱炎、皮炎、白喉、雙球菌(diplococcus)、大腸桿菌(E.Coli)、淋病、膿皰病、感染、肺炎球菌(Pneumococci)、癬、帶狀皰疹、葡萄球菌(Staphylococci)、結核病、疣、百日咳。
生物學穩定化的銀納米顆粒可以制成懸浮液/溶液，其中溶劑可以是能夠應用于無菌制劑的純化水、注射用水，和任何其它的非水共溶劑，例如聚乙二醇、醇、惰性液化氣和鹵碳相關化合物等等。
其它賦形劑可以包括表面活性劑、懸浮劑和粘性修飾劑、蠟、纖維素聚合物、聚羧乙烯以及任選防腐劑、緩沖劑、滲透調節劑或張力(tonicifying)調節劑、烴和低沸點溶劑。
制劑中的賦形劑可以包括聚山梨酯、聚羧乙烯、羥丙基甲基纖維素、petrolactum base、蠟、氯化鈉、甘露醇、檸檬酸、磷酸、乙酸、苯甲醇、丁化羥基甲苯(butyratehydroxytoluene)(BHT)、丁基化羥基苯甲醚(butyrated hydroxyanisone)(BHA)、二元醇，例如甘油、聚乙二醇、丙二醇、山梨醇，惰性氣體，例如氮、氫和其它氣體，烴可以是乙醇、丁醇等、碳氟化合物。
制劑可以包含滴眼劑、滴耳劑、滴鼻劑、溶液劑、軟膏劑、乳膏劑、洗劑和其它燒傷或感染的敷料制劑。
那些在感染區域進行外部應用的制劑也可以包含其它協同活性成分，例如rubifacients，其可以至少是一種選自薄荷醇、水楊酸甲酯、亞麻子油、辣椒堿的物質。
這個含有低沸點溶劑或壓縮的液化氣或烴或任意兩種的組合的溶液可以使用適當的機器置于增壓系統中，其中所述藥物噴射進入感染的區域進行即時作用。
軟膏劑可以通過使用含所述活性賦形劑的生物學穩定化的銀納米顆粒的溶液/懸浮液制備，并且可以帶有上述共溶劑。按照制劑的需要，使用適當濃度的粘度修飾劑，以便獲得預期的粘度。
外用制劑也可以通過使用不合防腐劑的天然成分制備。制劑中細小的顆粒提供了更好的生物利用率和吸收率。
權利要求
1.無細胞毒性的抗微生物制劑，其包含a)1到100nm大小范圍的生物學穩定化的銀納米顆粒；和b)載體，其中所述生物學穩定化的銀納米顆粒的濃度為1到6ppm。
2.如權利要求1所述的抗微生物制劑，其中所述銀納米顆粒用浸軟的植物組織細胞的水溶液生物學穩定化。
3.如權利要求2所述的抗微生物制劑，其中所述水溶液用去離子水稀釋十倍。
4.如權利要求2所述的抗微生物制劑，其中所述植物組織是選自一組植物組織的至少一種組織，所述一組植物組織包括下面植物的葉、根、莖、花和果實苜蓿(Alfa alfa)、阿拉伯金合歡(Acacia arabica)、芫荽(Coriandrum sativum)、East Indian Rosebay(Ervatamia coronaria)、黃細心(Boerhavia diffusa)、具芒小檗(Berberris aristata)、金盞花(Calendulaofficinalis)、歐芹(Petroselinum sativum)、土牛膝(Achyranthes aspera)、耳葉番瀉(Cassia auriculata)、熏衣草、紅果欖仁樹(Terminalia belerica)、茴香(Fenniculum vulgare)、問荊(Equisetum arvense)、復盆子(Rubusidaeus)、翠葉蘆薈(Aloe barbadensis)、白毛茛(Hydrastis canadensis)、大蒜(Allium sativum)、紫松果菊屬(Echinacea spp.)、小米草(Euphrasisofficinalis)、木桔(Aegle marmelos)、土木香(Trachyspermum ammi)、德國甘菊(Matricaria chamomilla)、丁香(Syzygium aromaticum)、姜(Zingiberofficinale)、圣羅勒(Ocimum sanctum)、印度鐵莧(Acalypha indica)、曼陀羅(Datura innoxia)、薄荷(Mentha spp.)、萎葉(Piper betle，linn)、金盞花(Calendula officinalis LINN)、Chick weed(Trichobasis lychnidearum)、黃瓜(cucumis sativus，Linn)、Acasia arabica、油橄欖(Olea europea L.)、野雛菊(Wild daisy)、枯茗種子(Cuminum cyminum)、咖喱葉(Murrayakoengi)、蒔蘿(Anethum graveolens)、磨盤草(Abutilon indicum)、楝樹(Azadirachta indica)、Madhua(Madhuca indica)、羅望子(Tamarinusindicus)、姜黃(Curcuma longa)、催眠睡茄(Withania sommnifera)、棗(Zizyphus jujuba)、西葫蘆(Pumpkin)(Cucurbita pepo，Cucurbita maxima)、美洲椴(Tilia Americana)、菖蒲(Acorus calamus)、莧(Amaranthusspinosa)、山生阿尼菊(Arnica Montana)、美洲接骨木(SambucusCanadensis)、藥水蘇(stachys officinalis)、黑莓(Black berry)(Eugeniajambolana)、金盞花(Calendula officinalis LINN)、黃春菊(Matricariachamomilla)、石松((Lycopodium selago或clavatum)、蒲公英(Taraxacumofficinalem)、Echinicea(Echinacea angusifolia)、桉樹(Eucalyptusglobules)、白毛茛(Hydrastis Canadensis)、Fig wort、聚合草(Symphytumofficinale)、連香報春花(Primula veris(L))、歐洲變豆菜(Sanicula europaea)、歐洲馬鞭草(Verbena officinalis)、Horse weed、石蓮花(Sempervivumtectorum，Linn)、美洲落葉松(Larix laricina)、療肺草(Pulmonariaangustifolia)、洋蔥(Alium cepa)、番木瓜(Carica papaya)、桃樹(Prunuspersica、三色堇(Viola tricolor(LINN)、珠光香青(Anaphalis margaritacea)。
5.如權利要求1或2所述的抗微生物制劑，其中所述載體為乳膏、凝膠劑、軟膏劑、液體、混懸劑、氣溶膠噴霧劑、紗布、纖維填料、膜、薄膜、帶子、硬膏。
6.根據前面權利要求任意一項所述的抗微生物制劑的制備方法，其包括下列步驟a)以常規方式制備選自包括乳膏、凝膠劑、軟膏劑、液體、混懸劑、氣溶膠噴霧劑、紗布、纖維填料、膜、薄膜、帶子、硬膏、結塊的載體，b)制備1到100nm大小范圍的生物學穩定化的銀納米顆粒的水性分散液；c)在所述載體中混合所述水性分散液的分配量，從而形成其中生物學穩定化的銀納米顆粒的濃度范圍介于1到6ppm之間的均勻基質。
7.如權利要求6所述的抗微生物制劑的制備方法，其中所述生物學穩定化的銀納米顆粒的水性分散液通過如下步驟制備(a)在具有低于3微西門子電導率的水中溶解銀鹽，從而獲得其中銀離子濃度在20,000到50,000ppm范圍的溶液，(b)制備生物組織提取物的新鮮過濾的水溶液；(c)用去離子水以1∶5到1∶50的比率稀釋所述水溶液，從而形成具有+0.2至+0.2伏特之間的斷路電位和5.5到7.5之間的pH以及至少7,500ppm的總的有機碳含量的溶液；(d)在20到30攝氏度之間的溫度、持續攪拌下維持所述水溶液；(e)在持續攪拌下，在所述水提取溶液中接種微量的銀鹽溶液，從而使反應混合物中金屬離子的終濃度在50到300ppm的范圍內；(f)在充分照明的條件下繼續攪拌30分鐘至3小時，從而獲得銀納米顆粒的膠體懸浮液；(g)通過已知方法例如離心從膠體懸浮液中分離納米顆粒。
全文摘要
本發明公開了含有通過“綠色”生物學途徑穩定化的生物學穩定化的銀納米顆粒的抗微生物制劑，載體中銀納米顆粒的平均直徑為1－100nm，濃度為1到6ppm。
文檔編號A61K36/00GK1953664SQ200580015104
公開日2007年4月25日 申請日期2005年5月12日 優先權日2004年5月12日
發明者基肖爾·馬杜卡爾·帕克尼卡爾 申請人:基肖爾·馬杜卡爾·帕克尼卡爾