用于治療高血糖癥和相關病癥的人類g蛋白偶合受體及其調節物的制作方法

專利名稱：用于治療高血糖癥和相關病癥的人類g蛋白偶合受體及其調節物的制作方法
技術領域：
本發明涉及鑒別一種或一種以上候選化合物是否為G蛋白偶合受體(GPCR)的調節物或血糖濃度調節物的方法。在某些實施例中，GPCR為人類GPCR。本發明也涉及使用GPCR的調節物的方法。優選調節物為激動劑。本發明的激動劑適用作降低血糖濃度、預防或治療某些代謝病癥(例如胰島素抗性、葡萄糖耐受性異常和糖尿病)以及預防或治療血糖濃度升高并發癥(例如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓和周邊血管疾病)的治療劑。
背景技術：
以下討論旨在幫助理解本發明，但并不打算使本發明不承認先前技術。
A.高血糖癥血糖濃度一般維持在狹窄范圍內。血糖濃度升高通常導致胰島素釋放增加，其接著作用于目標細胞以增加葡萄糖攝取。血糖穩定狀態的失調可導致血糖濃度持續升高或高血糖癥。一些患有高血糖癥的個體可繼續發展成2型糖尿病。使組織慢性暴露于高血糖癥可導致各種并發癥，包括神經病、視網膜病和腎病的微血管問題以及中風、冠心病和周邊血管疾病的微血管并發癥。高血糖癥是需要更好管理選項的正在增長中的主要醫學問題[Nesto，Reviews in Cardiovascular Medicine(2003)4S11-S18；其揭示內容以全文引用的方式并入本文中]。
B.G蛋白偶合受體雖然人類中存在許多受體類別，但是迄今為止最充足且最具治療相關性的受體類別是由G蛋白偶合受體(GPCR)類別表示。估計在人類基因組內存在約30,000-40,000種基因，且估計其中大約2％編碼GPCR。
GPCR表示醫藥產品發展的重要領域已由100種已知GPCR中的大約20種發展出所有處方藥品中的大約60％。例如，1999年，在前100種商標處方藥物中，下列藥物與GPCR相互作用(與藥物相關的主要治療疾病和/或病癥表示在括號中)Claritin(過敏)Prozac(抑郁癥)Vasotec(高血壓)Paxil(抑郁癥)Zoloft(抑郁癥)Zyprexa(精神病)Cozaar(高血壓)Imitrex(偏頭痛)Zantac(逆流病)Propulsid(逆流病)Risperdal(精神分裂癥)Serevent(哮喘)Pepcid(逆流病)Gaster(潰瘍)Atrovent(支氣管痙攣)Effexor(抑郁癥)Depakote(癲癇)Cardura(前列腺肥大癥)Allegra(過敏)Lupron(前列腺癌)Zoladex(前列腺癌)Diprivan(麻木)BuSpar(焦慮)Ventolin(支氣管痙攣)Hytrin(高血壓)Wellbutrin(抑郁癥)Zyrtec(鼻炎)Plavix(MI/中風)Toprol-XL(高血壓)Tenormin(絞痛)Xalatan(青光眼)Singulair(哮喘)Diovan(高血壓)Harnal(前列腺增生)(Med Ad News 1999 Data)。
GPCR共有共同的結構基元，其具有7個含有22至24個疏水性氨基酸的序列，其形成7個α螺旋，所述螺旋各自跨膜(各跨越由數字鑒別，意即跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)。所述跨膜螺旋是通過細胞膜外部或“胞外”側的跨膜-2與跨膜-3之間、跨膜-4與跨膜-5之間和跨膜-6與跨膜-7之間(其分別被稱為“胞外”區1、2和3(EC-1、EC-2和EC-3))的氨基酸鏈接合。所述跨膜螺旋也是通過細胞膜內部或“胞內”側的跨膜-1與跨膜-2之間、跨膜-3與跨膜-4之間和跨膜-5與跨膜-6之間(其分別被稱為“胞內”區1、2和3(IC-1、IC-2和IC-3))的氨基酸鏈接合。受體的“羧基”(“C”)末端位于細胞內的胞內空隙中，且受體的“氨基”(“N”)末端位于細胞外的胞外空隙中。
當配體結合受體(通常被稱為“激活”受體)時，受體的構形通常存在改變，其有助于胞內區與胞內“G蛋白”之間的偶合。已報導GPCR關于G蛋白是“混雜的”，意即GPCR可與一種以上的G蛋白相互作用。參見Kenakin，T.，43 Life Sciences 1095(1988)。雖然存在其它G蛋白，但是當前已鑒別Gq、Gs、Gi、Gz和Go為G蛋白。經配體激活的GPCR與G蛋白的偶合會引發信號級聯過程(稱為“信號轉導”)。在正常條件下，信號轉導最終導致細胞激活或細胞抑制。雖然不希望受理論限制，但是相信IC-3環以及受體的羧基末端與G蛋白相互作用。
另外存在似乎將數種GPCR類別與磷脂酶C路徑偶合的混雜G蛋白(諸如Gα15或Gα16)[Offermanns & Simon，J Biol Chem(1995)27015175-80]，或經設計為將多種不同GPCR偶合至相同路徑(例如磷脂酶C)的嵌合G蛋白[Milligan & Rees，Trends inPharmaceutical Sciences(1999)20118-24]。
在生理條件下，GPCR以下列兩種不同構形之間的平衡存在于細胞膜中“惰性”態和“活性”態。惰性態的受體不能連接至胞內信號轉導路徑以引發信號轉導，從而引起生物學應答。受體構形改變成活性態將允許連接至轉導路徑(經由G蛋白)且產生生物學應答。
受體可在活性態下由配體或諸如藥物的化合物達成穩定。最近的發現(包括(但不獨有性限于)對受體氨基酸序列的修飾)提供除配體或藥物之外的方式以促進并穩定活性態構形的受體。所述方式通過刺激結合至受體的配體的效應而有效穩定活性態受體。由所述配體獨立性方式進行的穩定化作用被稱為“組成性受體激活”。
RUP43RUP43(其中應了解內源RUP43可為GPR131，例如GenBank入藏登記號NM_170699)近來已報導為充當膽汁酸的受體[2004年1月7日作為EP1378749出版的歐洲專利申請案第02717114.9號；以及Kawamata等人，J Biol Chem(2003)2789435-9440；其揭示內容各自以全文引用的方式并入本文中]。白血球中的RUP43表達據報導對單核細胞具有特異性，且作用于單核細胞RUP43的膽汁酸據報導會抑制腫瘤壞死因子α(TNFα)的表達。在EP1378749中揭示的化合物可用于本發明方法中。

發明內容
申請者出乎意料地發現，RUP43的激動劑會增加脂肪細胞和骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取。申請者揭示RUP43的激動劑對于降低哺乳動物中的血糖濃度具有出乎意料的效用。申請者進一步揭示對RUP43具有激動劑活性的新穎化合物及其用途。
第一方面，本發明提供鑒別一種或一種以上作為RUP43 GPCR調節物的候選化合物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述受體偶合至G蛋白；所述方法包含以下步驟(a)使候選化合物與受體接觸；以及(b)測定受體功能性是否受到調節；其中受體功能性的變化指示候選化合物為RUP43 GPCR的調節物。
在某些實施例中，GPR131氨基酸序列選自由下列序列組成的群組(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO2的氨基酸2-330；(c)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；(d)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(e)SEQ ID NO6的氨基酸序列；(f)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO7和SEQ ID NO8對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(h)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(i)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；以及(j)由在嚴格條件下與SEQ ID NO1的互補體雜交的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。
在某些實施例中，所述RUP43 GPCR為重組RUP43 GPCR。在某些實施例中，所述接觸包含與表達GPCR的宿主細胞接觸或與所述宿主細胞的細胞膜接觸，其中所述宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含編碼受體的多核苷酸。
在一些實施例中，所述接觸在已知GPCR配體存在下進行。在一些實施例中，所述接觸在已知GPCR調節物存在下進行。在一些實施例中，所述接觸在已知GPCR激動劑存在下進行。在一些實施例中，所述GPCR的已知激動劑為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述GPCR的已知激動劑為化合物1。在一些實施例中，所述GPCR的已知激動劑為化合物2。在一些實施例中，所述GPCR的已知激動劑為化合物3。在一些實施例中，所述已知激動劑關于所述測定應以約EC50至約EC75存在。
本發明也涉及鑒別一種或一種以上作為哺乳動物中血糖濃度調節物的候選化合物的方法，所述方法包含以下步驟使候選化合物與包含GPR131氨基酸序列的GPCR接觸，其中所述受體偶合至G蛋白；以及測定受體功能性是否受到調節；
其中受體功能性的變化指示候選化合物為哺乳動物中血糖濃度的調節物。
在某些實施例中，GPR131氨基酸序列選自由下列序列組成的群組(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO2的氨基酸2-330；(c)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；(d)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(e)SEQ ID NO6的氨基酸序列；(f)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO7和SEQ ID NO8對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(h)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(i)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；以及(j)由在嚴格條件下與SEQ ID NO1的互補體雜交的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。
在某些實施例中，受體功能性的增加指示候選化合物為降低哺乳動物中血糖濃度的化合物。
在某些實施例中，所述GPCR為重組GPCR。在某些實施例中，所述接觸包含與表達GPCR的宿主細胞接觸或與所述宿主細胞的細胞膜接觸，其中所述宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含編碼受體的多核苷酸。
在一些實施例中，所述接觸在已知GPCR配體存在下進行。在一些實施例中，所述接觸在已知GPCR調節物存在下進行。在一些實施例中，所述接觸在已知GPCR激動劑存在下進行。在一些實施例中，所述GPCR的已知激動劑為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述GPCR的已知激動劑為化合物1。在一些實施例中，所述GPCR的已知激動劑為化合物2。在一些實施例中，所述GPCR的已知激動劑為化合物3。在一些實施例中，所述已知激動劑關于所述測定應以約EC50至約EC75存在。
在某些實施例中，所述一種或一種以上候選化合物并非抗體或其抗原結合衍生物。
在某些實施例中，所述一種或一種以上候選化合物并非肽。
在某些實施例中，所述一種或一種以上候選化合物并非膽汁酸。
在一些實施例中，GPR131氨基酸序列為SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一些實施例中，GPR131氨基酸序列為SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體。在一些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體為所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物。在一些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體為所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的非內源組成性激活突變體。在某些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體為所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的生物活性片段。在某些實施例中，SEQ ID NO2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的所述生物活性片段為SEQ ID NO2或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的氨基酸序列，其缺失N末端甲硫氨酸。在某些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的一致性。在一些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的一致性。
在某些實施例中，所述包含GPR131氨基酸序列的RUP43 GPCR為進一步包含一種或一種以上抗原決定基標簽的融合蛋白。在一些實施例中，所述包含一種或一種以上抗原決定基標簽的融合蛋白為SEQ ID NO6的氨基酸序列。
在某些實施例中，所述G蛋白導致胞內cAMP水平的增加。在一些優選實施例中，所述G蛋白為Gs。
在某些實施例中，所述G蛋白對百日咳毒素敏感。在某些實施例中，所述G蛋白為Gi或Go。在某些實施例中，所述G蛋白為Gi。在某些實施例中，所述G蛋白為Go。
在某些實施例中，所述G蛋白為Gα15或Gα16。在某些實施例中，所述G蛋白為Gα15。在某些實施例中，所述G蛋白為Gα16。
在某些實施例中，所述G蛋白為Gq。
在某些實施例中，所述方法進一步包含將由候選化合物引起的受體調節與通過使受體與已知受體調節物接觸所引起的第二受體調節相比較的步驟。在某些實施例中，所述已知調節物為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為化合物1、化合物2或化合物3。在某些實施例中，所述激動劑為化合物1。在某些實施例中，所述激動劑為化合物2。在某些實施例中，所述激動劑為化合物3。
在一些優選實施例中，所述測定或所述比較是通過測量結合至包含所述GPCR的膜的GTPγS來進行。在某些實施例中，所述GTPγS經[35S]標記。
在某些實施例中，所述測定或所述比較是通過測量第二信使含量來進行，所述第二信使選自由環狀AMP(cAMP)、環狀GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰甘油(DAG)、MAP激酶活性和Ca2+組成的群組。在某些優選實施例中，所述第二信使為cAMP。在某些優選實施例中，cAMP水平增加。在某些實施例中，所述cAMP測量是使用全細胞腺苷酰基環化酶檢定來進行。在某些實施例中，所述cAMP測量是由包含所述GPCR的膜進行。在某些實施例中，所述第二信使為MAP激酶活性。在某些實施例中，MAP激酶活性水平增加。
在一些優選實施例中，所述測定或所述比較是通過CRE報導子檢定來進行。在某些實施例中，所述報導子為熒光素酶。在一些實施例中，所述報導子為β-半乳糖苷酶。
在某些實施例中，所述測定或所述比較是通過測量胞內IP3來進行。
在某些實施例中，所述測定或所述比較是通過測量胞內Ca2+來進行。
在某些實施例中，所述測定或所述比較是通過測量獲自哺乳動物的脂肪細胞的葡萄糖攝取來進行。
在某些實施例中，所述測定或所述比較是通過測量獲自哺乳動物的骨骼肌細胞的葡萄糖攝取來進行。
在某些優選實施例中，所述測定或所述比較是通過使用黑素細胞檢定來進行。
第二方面，本發明提供式(II)的化合物 或其醫藥學上可接受的鹽，
其中R1為H或C1-6烷基；R2為2-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-吲唑-3-基；或R1和R2連同其所鍵結的氮形成3，4-二氫-2H-喹啉-1-基；且R10和R11各自獨立地為H或鹵素。
第三方面，本發明提供根據第一方面的方法鑒別的GPCR調節物。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物并非膽汁酸。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。
本發明也提供可根據第一方面的方法鑒別的GPCR調節物。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。
在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些實施例中，所述調節物為激動劑。在某些實施例中，所述調節物為部分激動劑。在某些實施例中，所述調節物為反向激動劑。在某些實施例中，所述調節物為拮抗劑。
在某些實施例中，所述調節物優選為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在一些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1(“Cmpd#1，見表1)、化合物2(“Cmpd#2，見表1)或化合物3(“Cmpd#3，見表1)。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在一些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在一些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
第四方面，本發明提供一種制備醫藥組合物或生理學上可接受的組合物的方法，其包含混合載劑和RUP43 GPCR調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，調節物為部分激動劑。在某些實施例中，調節物為反向激動劑。在某些實施例中，調節物為拮抗劑。在某些實施例中，調節物優選為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
本發明也提供一種制備醫藥組合物或生理學上可接受的組合物的方法，其包含鑒別RUP43 GPCR調節物，其中所述受體包含GPR131氨基酸序列；以及接著混合載劑和調節物，其中所述調節物可通過根據第一方面的方法的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物是根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物優選為激動劑。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，調節物為部分激動劑。在某些實施例中，調節物為反向激動劑。在某些實施例中，調節物為拮抗劑。在某些實施例中，調節物優選為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述組合物為醫藥組合物。在某些實施例中，所述組合物為生理學上可接受的組合物。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在一些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在一些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在一些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
第五方面，本發明提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使受體與受體調節物接觸的步驟。在某些實施例中，調節物可通過根據第一方面的方法的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物是根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，調節物為部分激動劑。在某些實施例中，調節物為反向激動劑。在某些實施例中，調節物為拮抗劑。在某些實施例中，調節物優選為激動劑。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為增加獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
本發明也提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使受體與受體調節物接觸的步驟，其中所述調節物可通過第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物是根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，調節物為部分激動劑。在某些實施例中，調節物為反向激動劑。在某些實施例中，調節物為拮抗劑。在某些實施例中，調節物優選為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在一些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在一些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在一些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述接觸包含將調節物投用給包含受體的膜。
在某些實施例中，所述接觸包含將調節物投用給包含受體的細胞。
在某些實施例中，所述接觸包含將調節物投用給包含受體的組織。
在某些實施例中，所述接觸包含將調節物投用給包含受體的個體。在某些實施例中，所述將調節物投用給包含受體的個體的用藥是口服。在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第六方面，本發明提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于在需要所述調節的個體中降低血糖濃度，所述方法包含使所述受體與治療有效量的受體調節物接觸。在某些實施例中，調節物為激動劑。
本發明也提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于在需要所述調節的個體中預防或治療代謝病癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的受體調節物接觸。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于在需要所述調節的個體中預防或治療血糖濃度升高的并發癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的受體調節物接觸。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high blood pressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，調節物可通過根據第一方面的方法的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物是根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在某些實施例中，所述接觸包含將所述調節物口服投用給所述個體。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第七方面，本發明提供一種降低需要降低血糖濃度的個體血糖濃度的方法，其包含使治療有效量的RUP43 GPCR調節物與所述受體接觸，所述GPCR包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。
本發明另外提供一種降低哺乳動物中血糖濃度的方法，其包含向需要所述降低的哺乳動物提供或投用RUP43 GPCR調節物，所述GPCR包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，RUP43 GPCR的激動劑為GPR131 GPCR的激動劑，其中應了解GPR131 GPCR為內源RUP43 GPCR。
本發明也提供一種預防或治療需要預防或治療代謝病癥的個體的代謝病癥的方法，其包含使治療有效量的RUP43 GPCR調節物與所述受體接觸，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
本發明另外提供一種預防或治療代謝病癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物投用RUP43 GPCR調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，RUP43 GPCR的激動劑為GPR131 GPCR的激動劑，其中應了解GPR131 GPCR為內源RUP43 GPCR。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種預防或治療需要預防或治療血糖濃度升高的并發癥的個體血糖濃度升高的并發癥的方法，其包含使治療有效量的RUP43 GPCR調節物與所述受體接觸，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
本發明另外提供一種預防或治療血糖濃度升高的并發癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用RUP43 GPCR調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，RUP43 GPCR的激動劑為GPR131 GPCR的激動劑，其中應了解GPR131 GPCR為內源RUP43 GPCR。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，調節物可通過根據第一方面的方法的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物是根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在某些實施例中，所述接觸包含將所述調節物口服投用給所述個體。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第八方面，本發明提供包含RUP43 GPCR調節物、基本上由所述調節物組成或由所述調節物組成的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。
在某些實施例中，調節物可通過根據第一方面的方法的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物是根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述組合物為醫藥組合物。在某些實施例中，所述醫藥組合物包含RUP43 GPCR的調節物。在某些實施例中，所述醫藥組合物基本上由RUP43 GPCR的調節物組成。在某些實施例中，所述醫藥組合物由RUP43 GPCR的調節物組成。
在某些實施例中，所述組合物為生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，生理學上可接受的組合物包含RUP43 GPCR的調節物。在某些實施例中，生理學上可接受的組合物基本上由RUP43 GPCR的調節物組成。在某些實施例中，生理學上可接受的組合物由RUP43 GPCR的調節物組成。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
第九方面，本發明提供一種降低血糖濃度的方法，其包含向需要所述降低的個體提供或投用所述第八方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。
本發明也提供一種預防或治療代謝病癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的個體提供或投用所述第八方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；
(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種預防或治療血糖濃度升高的并發癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的個體提供或投用所述第八方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high b1oodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，所述調節物為激動劑。
在某些實施例中，將治療有效量的所述醫藥組合物或生理學上可接受的組合物提供或投用給所述個體。
在某些實施例中，所述醫藥組合物或生理學上可接受的組合物的所述提供或投用是口服。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第十方面，本發明提供用于通過療法來治療人體或動物體的方法中的RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。
在某些實施例中，調節物可通過根據第一方面的方法的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物是根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自人類或動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自人類或動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在某些實施例中，所述動物為哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠或非人類靈長類動物。人類或動物中更優選為人類。
第十一方面，本發明提供用于通過療法來降低人體或動物體中血糖濃度的方法中的RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。
本發明也提供用于通過療法來預防或治療人體或動物體中代謝病癥的方法中的RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；
(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供用于通過療法來預防或治療人體或動物體中血糖濃度升高并發癥的方法中的RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，調節物可通過根據第一方面的方法的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物是根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自人類或動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自人類或動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在某些實施例中，所述動物為哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠或非人類靈長類動物。人類或動物中更優選為人類。
第十二方面，本發明提供一種使用RUP43 GPCR的調節物來制備用于降低血糖濃度的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，RUP43 GPCR的激動劑為GPR131 GPCR的激動劑，其中應了解GPR131 GPCR為內源RUP43 GPCR。
本發明也提供一種使用RUP43 GPCR的調節物來制備用于預防或治療代謝病癥的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，RUP43 GPCR的激動劑為GPR131 GPCR的激動劑，其中應了解GPR131 GPCR為內源RUP43 GPCR。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種使用RUP43 GPCR的調節物來制備用于預防或治療血糖濃度升高并發癥的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，RUP43 GPCR的激動劑為GPR131 GPCR的激動劑，其中應了解GPR131 GPCR為內源RUP43 GPCR。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，調節物可通過根據第一方面的方法的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物是根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。在某些實施例中，所述激動劑為根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
第十三方面，本發明提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于在需要所述調節的個體中降低血糖濃度，所述方法包含使所述受體與治療有效量的受體調節物接觸。在某些實施例中，所述方法包含首先執行根據第一方面的方法以由此鑒別調節物。在某些實施例中，調節物為激動劑。
本發明也提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于在需要所述調節的個體中預防或治療代謝病癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的受體調節物接觸。在某些實施例中，所述方法包含首先執行根據第一方面的方法以由此鑒別調節物。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于在需要所述調節的個體中預防或治療血糖濃度升高的并發癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的受體調節物接觸。在某些實施例中，所述方法包含首先執行根據第一方面的方法以由此鑒別調節物。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；
(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，所述調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物是根據第三方面。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在某些實施例中，所述接觸包含將所述調節物口服投用給所述個體。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第十四方面，本發明提供一種降低需要降低血糖的個體的血糖的方法，其包含使治療有效量的RUP43 GPCR調節物與所述受體接觸，所述GPCR包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述方法包含首先執行根據第一方面的方法以由此鑒別調節物。在某些實施例中，調節物為激動劑。
本發明也提供一種預防或治療需要預防或治療代謝病癥的個體的代謝病癥的方法，其包含使治療有效量的RUP43 GPCR調節物與所述受體接觸，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述方法包含首先執行根據第一方面的方法以由此鑒別調節物。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種預防或治療需要預防或治療血糖濃度升高的并發癥的個體血糖濃度升高的并發癥的方法，其包含使治療有效量的RUP43 GPCR調節物與所述受體接觸，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述方法包含首先執行根據第一方面的方法以由此鑒別調節物。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，所述調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物是根據第三方面。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在某些實施例中，所述接觸包含將所述調節物口服投用給所述個體。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第十五方面，本發明提供包含RUP43 GPCR調節物、基本上由所述調節物組成或由所述調節物組成的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述調節物可通過執行根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，所述調節物是通過執行根據第一方面的方法來鑒別。
在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，所述調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物是根據第三方面。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。
在某些實施例中，所述組合物為醫藥組合物。在某些實施例中，所述醫藥組合物包含RUP43 GPCR的調節物。在某些實施例中，所述醫藥組合物基本上由RUP43 GPCR的調節物組成。在某些實施例中，所述醫藥組合物由RUP43 GPCR的調節物組成。
在某些實施例中，所述組合物為生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，生理學上可接受的組合物包含RUP43 GPCR的調節物。在某些實施例中，生理學上可接受的組合物基本上由RUP43 GPCR的調節物組成。在某些實施例中，生理學上可接受的組合物由RUP43 GPCR的調節物組成。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
第十六方面，本發明提供一種降低血糖濃度的方法，其包含向需要所述降低的個體提供或投用所述第十五方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。
本發明也提供一種預防或治療代謝病癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的個體提供或投用所述第十五方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種預防或治療血糖濃度升高的并發癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的個體提供或投用所述第十五方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；
(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，所述調節物為激動劑。
在某些實施例中，將治療有效量的所述醫藥組合物或生理學上可接受的組合物提供或投用給所述個體。
在某些實施例中，所述醫藥組合物或生理學上可接受的組合物的所述提供或投用是口服。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第十七方面，本發明提供用于通過療法來治療人體或動物體的方法中的RUP43GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述調節物可通過執行根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，所述調節物是通過執行根據第一方面的方法來鑒別。
在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，所述調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物是根據第三方面。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在一些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在一些實施例中，所述調節物為化合物1。在一些實施例中，所述調節物為化合物2。在一些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在某些實施例中，所述動物為哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠或非人類靈長類動物。人類或動物中更優選為人類。
第十八方面，本發明提供用于通過療法來降低人體或動物體中血糖濃度的方法中的RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述調節物可通過執行根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，所述調節物是通過執行根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物為激動劑。
本發明也提供用于通過療法來預防或治療人體或動物體中代謝病癥的方法中的RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述調節物可通過執行根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，所述調節物是通過執行根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供用于通過療法來預防或治療人體或動物體中血糖濃度升高的并發癥的方法中的RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述調節物可通過執行根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，所述調節物是通過執行根據第一方面的方法來鑒別。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；
(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，所述調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物是根據第三方面。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在某些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在某些實施例中，所述調節物為化合物1。在某些實施例中，所述調節物為化合物2。在某些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
在某些實施例中，所述動物為哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠或非人類靈長類動物。人類或動物中更優選為人類。
第十九方面，本發明提供一種使用RUP43 GPCR的調節物來制備用于降低血糖濃度的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述方法包含首先執行根據第一方面的方法以由此鑒別調節物。在某些實施例中，調節物為激動劑。
本發明也提供一種使用RUP43 GPCR的調節物來制備用于預防或治療代謝病癥的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述方法包含執行根據第一方面的方法以由此鑒別調節物。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組
(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種使用RUP43 GPCR的調節物來制備用于預防或治療血糖濃度升高并發癥的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列。在某些實施例中，所述方法包含執行根據第一方面的方法以由此鑒別調節物。在某些實施例中，調節物為激動劑。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，調節物并非抗體或其抗原結合衍生物。在某些實施例中，所述調節物并非肽。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，調節物為刺激獲自哺乳動物的骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的化合物。在某些實施例中，所述調節物是根據第三方面。在某些實施例中，所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。在某些優選實施例中，所述調節物為激動劑。
在某些實施例中，所述調節物對GPCR具有選擇性。
在某些實施例中，所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。在某些實施例中，所述調節物為化合物1。在某些實施例中，所述調節物為化合物2。在某些實施例中，所述調節物為化合物3。
在某些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。
在一些實施例中，所述調節物為EC50小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。在某些實施例中，所述EC50是使用選自由下列檢定組成的群組的檢定來確定使用經轉染的HEK293細胞執行的全細胞cAMP檢定，所述細胞表達具有SEQ IDNO2或6的氨基酸序列的重組RUP43 GPCR多肽；和使用經轉染的黑素細胞執行的黑素細胞檢定，所述黑素細胞表達具有SEQ ID NO2或6的氨基酸序列的重組RUP43GPCR多肽。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、小于1μM、小于100nM或小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于10μM、在所述檢定中小于9μM、在所述檢定中小于8μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于7μM、在所述檢定中小于6μM、在所述檢定中小于5μM、在所述檢定中小于4μM、在所述檢定中小于3μM、在所述檢定中小于2μM、在所述檢定中小于1μM、在所述檢定中小于900nM、在所述檢定中小于800nM、在所述檢定中小于700nM、在所述檢定中小于600nM、在所述檢定中小于500nM、在所述檢定中小于400nM、在所述檢定中小于300nM、在所述檢定中小于200nM、在所述檢定中小于100nM、在所述檢定中小于90nM、在所述檢定中小于80nM、在所述檢定中小于70nM、在所述檢定中小于60nM、在所述檢定中小于50nM、在所述檢定中小于40nM、在所述檢定中小于30nM、在所述檢定中小于20nM或在所述檢定中小于10nM的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至10μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至1μM的范圍的值的激動劑。在一些實施例中，所述調節物為EC50在所述檢定中小于選自10nM至100nM的范圍的值的激動劑。
第二十方面，本發明提供一種制備醫藥組合物或生理學上可接受的組合物的方法，其包含混合根據第二方面的化合物和載劑。
在某些實施例中，所述組合物為醫藥組合物。在某些實施例中，所述組合物為生理學上可接受的組合物。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
第二十一方面，本發明提供包含根據第二方面的化合物、基本上由所述化合物組成或由所述化合物組成的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。
在某些實施例中，所述組合物為醫藥組合物。在某些實施例中，所述醫藥組合物包含根據第二方面的化合物。在某些實施例中，所述醫藥組合物基本上由根據第二方面的化合物組成。在某些實施例中，所述醫藥組合物由根據第二方面的化合物組成。
在某些實施例中，所述組合物為生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，生理學上可接受的組合物包含根據第二方面的化合物。在某些實施例中，生理學上可接受的組合物基本上由根據第二方面的化合物組成。在某些實施例中，生理學上可接受的組合物由根據第二方面的化合物組成。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
第二十二方面，本發明提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于降低需要所述調節的個體中的血糖含量，所述方法包含使所述受體與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸，或與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第二十三方面，本發明提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于預防或治療需要所述調節的個體中的代謝病癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸，或與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于預防或治療需要所述調節的個體中的血糖濃度升高并發癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸，或與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第二十四方面，本發明提供一種用RUP43 GPCR降低需要降低血糖濃度的個體血糖濃度的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受體與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸，或與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第二十五方面，本發明提供一種用RUP43 GPCR預防或治療需要降低代謝病癥的個體的代謝病癥的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受體與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸，或與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組
(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種用RUP43 GPCR預防或治療需要預防或治療血糖濃度升高并發癥的個體的血糖濃度升高并發癥的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受體與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸，或與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二方面的化合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第二十六方面，本發明提供一種降低血糖濃度的方法，其包含向需要所述降低的個體提供或投用根據第二方面的化合物或治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，所述提供或投用化合物是提供或投用根據第二方面的化合物。在某些實施例中，所述提供或投用醫藥組合物或生理學上可接受的組合物是提供或投用根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第二十七方面，本發明提供一種治療代謝病癥的方法，其包含向需要所述治療或預防的個體提供或投用根據第二方面的化合物或治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，所述提供或投用化合物是提供或投用根據第二方面的化合物。在某些實施例中，所述提供或投用醫藥組合物或生理學上可接受的組合物是提供或投用根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種治療血糖濃度升高的并發癥的方法，其包含向需要所述治療或預防的個體提供或投用根據第二方面的化合物或治療有效量的根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，所述提供或投用化合物是提供或投用根據第二方面的化合物。在某些實施例中，所述提供或投用醫藥組合物或生理學上可接受的組合物是提供或投用根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。在某些實施例中，所述哺乳動物為小鼠、大鼠、非人類靈長類動物或人類。最優選為人類。
第二十八方面，本發明提供用于通過療法來治療人體或動物體的方法中的根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述動物為哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠或非人類靈長類動物。人類或動物中更優選為人類。
第二十九方面，本發明提供用于通過療法來降低人體或動物體中血糖濃度的方法中的根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述動物為哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠或非人類靈長類動物。人類或動物中更優選為人類。
第三十方面，本發明提供用于通過療法來預防或治療人體或動物體中的代謝病癥的方法中的根據第二方面的化合物。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供用于通過療法來預防或治療人體或動物體中的血糖濃度升高并發癥的方法中的根據第二方面的化合物。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；
(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
在某些實施例中，所述動物為哺乳動物。在某些實施例中，所述哺乳動物為馬、牛、綿羊、豬、貓、狗、兔、小鼠、大鼠或非人類靈長類動物。人類或動物中更優選為人類。
第三十一方面，本發明提供一種使用根據第二方面的化合物來制備用于降低血糖濃度的藥物的方法。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
第三十二方面，本發明提供一種使用根據第二方面的化合物來制備用于預防或治療代謝病癥的藥物的方法。在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；
(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
本發明也提供一種使用根據第二方面的化合物來制備用于預防或治療血糖濃度升高并發癥的藥物的方法。在某些實施例中，所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
第三十三方面，本發明提供一種調節RUP43 GPCR的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受體與根據第二方面的化合物接觸或與根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與根據第二方面的化合物接觸。在某些實施例中，所述接觸是與根據第二十一方面的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物接觸。
在某些實施例中，所述化合物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少1％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。在一些實施例中，所述口服生物可用性相對于腹膜內用藥為至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％或至少45％。
在某些實施例中，所述口服生物可用化合物進一步能夠穿過血腦障壁。
第三十四方面，本發明提供一種鑒別一種或一種以上作為結合至RUP43 GPCR的化合物的候選化合物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步驟(a)在候選化合物存在或不存在下，使受體與經可檢測標記的已知GPCR配體接觸；和(b)測定所述經標記配體的結合是否在候選化合物存在下受到抑制；其中所述抑制指示候選化合物為結合至RUP43 GPCR的化合物。
在某些實施例中，GPR131氨基酸序列選自由下列序列組成的群組(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO2的氨基酸2-330；(c)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；(d)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(e)SEQ ID NO6的氨基酸序列；(f)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO7和SEQ ID NO8對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(h)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(i)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；以及(j)由在嚴格條件下與SEQ ID NO1的互補體雜交的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。
在某些實施例中，所述RUP43 GPCR為重組RUP43 GPCR。在某些實施例中，所述接觸包含與表達GPCR的宿主細胞接觸或與所述宿主細胞的細胞膜接觸。在某些實施例中，所述表達GPCR的宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含編碼受體的多核苷酸。
在一些實施例中，GPR131氨基酸序列為SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一些實施例中，GPR131氨基酸序列為SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體。在一些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體為所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物。在一些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體為所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的非內源組成性激活突變體。在某些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體為所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的生物活性片段。在某些實施例中，SEQ ID NO2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的所述生物活性片段為SEQ ID NO2或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的氨基酸序列，其缺失N末端甲硫氨酸。在某些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的一致性。在一些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的一致性。
在某些實施例中，所述膜制備是通過用Brinkman PolytronTM均質化細胞來進行。在某些實施例中，所述膜制備是通過用所述polytron各自進行3次持續時間為10-20sec的均質化來進行。
在某些實施例中，所述候選化合物并非抗體或其衍生物。
在某些實施例中，所述候選化合物并非肽。
在某些實施例中，所述已知配體為根據第二方面的化合物。
在某些實施例中，所述已知配體為根據第三方面的調節物。
在某些實施例中，所述已知配體為化合物1、化合物2或化合物3。在某些實施例中，所述已知配體為化合物1。在某些實施例中，所述已知配體為化合物2。在某些實施例中，所述已知配體為化合物3。
在某些實施例中，所述已知配體為GPCR的特異性抗體，或所述抗體的抗原結合衍生物。
在某些實施例中，所述標記選自由下列各物組成的群組(a)放射性同位素；(b)酶；和(c)熒光團。
在某些實施例中，所述標記為放射性同位素。在某些實施例中，所述標記選自由下列各物組成的群組3H、14C、35S和125I。
化合物1、化合物2或化合物3可使用所屬領域中已知的下文所述技術經放射性標記。在某些實施例中，化合物1、化合物2或化合物3是經3H或14C放射性標記。
在其它實施例中，所述方法進一步包含以下步驟將候選化合物抑制經標記的第一已知配體的結合的水平與已知結合至GPCR的第二配體抑制所述經標記的第一已知配體的結合的第二水平相比較。
第三十五方面，本發明提供一種檢測結合至RUP43 GPCR的配體的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步驟在允許所述受體與測試配體之間的相互作用的條件下，使所述測試配體與表達所述受體的宿主細胞或所述宿主細胞的細胞膜接觸；和檢測結合至所述受體的配體。
在某些實施例中，GPR131氨基酸序列選自由下列序列組成的群組(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO2的氨基酸2-330；(c)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；
(d)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(e)SEQ ID NO6的氨基酸序列；(f)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO7和SEQ ID NO8對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(h)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(i)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；以及(j)由在嚴格條件下與SEQ ID NO1的互補體雜交的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。
在一些實施例中，GPR131氨基酸序列為SEQ ID NO2的氨基酸序列。在一些實施例中，GPR131氨基酸序列為SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體。在一些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體為所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物。在一些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體為所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的非內源組成性激活突變體。在某些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體為所述氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的生物活性片段。在某些實施例中，SEQ ID NO2的氨基酸序列或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的所述生物活性片段為SEQ ID NO2或所述氨基酸序列的等位基因變異體或哺乳動物直向同源物的氨基酸序列，其缺失N末端甲硫氨酸。在某些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的一致性。在一些實施例中，所述SEQ ID NO2的氨基酸序列的變異體與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％的一致性。
在某些實施例中，所述RUP43 GPCR為重組RUP43 GPCR。在某些實施例中，所述接觸包含與表達GPCR的宿主細胞接觸或與所述宿主細胞的細胞膜接觸。在某些實施例中，所述表達GPCR的宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含編碼受體的多核苷酸。
在某些實施例中，所述測試配體并非抗體或其抗原結合衍生物。
在某些實施例中，所述測試配體并非肽。
在某些實施例中，所述膜制備是通過用Brinkman PolytronTM均質化細胞來進行。在某些實施例中，所述膜制備是通過用所述polytron各自進行3次持續時間為10-20sec的均質化來進行。
在某些實施例中，所述測試配體經標記。在某些實施例中，所述標記為放射性同位素。在某些實施例中，所述標記選自由下列各物組成的群組3H、14C、35S和125I。
申請者保留將任一或多種候選化合物排除在任何本發明實施例之外的權利。申請者也保留將任一或多種調節物排除在任何本發明實施例之外的權利。申請者另外保留將任何多核苷酸或多肽排除在任何本發明實施例之外的權利。申請者另外保留將任何代謝病癥或任何血糖濃度升高并發癥排除在外的權利。另外，明確涵蓋本發明的代謝病癥可個別地或以任何組合包括于實施例中。另外，明確涵蓋本發明的血糖濃度升高并發癥可個別地或以任何組合包括于實施例中。
在本申請案通篇中，引用各種公開案、專利和已公開專利申請案。在本申請案中所引用的這些公開案、專利和已公開專利申請案的揭示內容以全文引用的方式并入所述揭示內容中。公開案、專利或已公開專利申請案的申請者在本文中的引用并不是所述公開案、專利或已公開專利申請案的申請者對先前技術的承認。
在熟練技術工人權限內對所揭示的發明進行的修改和擴展涵蓋于上文揭示內容和下述權利要求書中。


圖1以實例說明而非限制，圖1描述候選化合物初次篩檢作為與RUP43無關的內源組成性活性Gs偶合GPCR的Gsα融合蛋白構筑體的“目標受體”的結果。孔A2提供“化合物A”的結果。孔G9提供“化合物B”的結果。(參見實例7。)圖2由脂肪細胞和骨骼肌細胞表達RUP43的RT-PCR分析。人類和小鼠脂肪細胞表達RUP43。人類和小鼠骨骼肌細胞表達RUP43。(參見實例11。)圖3內源RUP43偶合至Gs。(參見實例14。)
圖4鑒別作為RUP43激動劑的化合物1。(參見實例15。)圖5鑒別作為RUP43激動劑的化合物2。(參見實例16。)圖6化合物2刺激小鼠3T3L1脂肪細胞中的葡萄糖攝取。(參見實例18。)圖7化合物2增強小鼠3T3L1脂肪細胞中的胰島素刺激的葡萄糖攝取。(參見實例19。)圖8化合物2刺激原代人類脂肪細胞中的葡萄糖攝取。(參見實例20。)圖9化合物2刺激大鼠L6成肌細胞中的葡萄糖攝取。(參見實例21。)圖10化合物2增強大鼠L6成肌細胞中的胰島素刺激的葡萄糖攝取。(參見實例22。)圖11化合物2刺激原代人類骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取。(參見實例23。)具體實施方式
定義已關于受體發展的科學文獻采用多種術語來指明對受體具有各種作用的配體。簡明起見且為一致，在本專利文獻中將全篇使用下列定義。為達到使這些定義與這些術語的其它定義相沖突的程度，下列定義應控制為激動劑應表示在與受體結合時將激活胞內應答的物質(例如配體、候選化合物)。在一些實施例中，激動劑是在與受體結合時將激活胞內應答(例如，為增強結合至膜的GTPγS，或為升高胞內cAMP水平)的那些先前未知的物質。在一些實施例中，激動劑是在與受體結合時將刺激獲自哺乳動物的脂肪細胞或骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的那些先前未知的物質。
本文所用的氨基酸縮寫列于表A中表A


拮抗劑應表示在與激動劑相同的位點競爭性結合至受體，但不會激活胞內應答且由此可抑制由激動劑引發的胞內應答的物質(例如配體、候選化合物)。拮抗劑在無激動劑存在下不會減少基線胞內應答。在一些實施例中，拮抗劑是在與受體結合時將與激動劑競爭抑制細胞應答的那些先前未知的物質，例如，其中細胞應答為GTPγS結合至膜或胞內cAMP水平升高。
本文中抗體旨在涵蓋單克隆抗體和多克隆抗體。抗體進一步旨在涵蓋IgG、IgA、IgD、IgE和IgM。抗體包括全抗體，包括單鏈全抗體；及其抗原結合片段，包括Fab、Fab′、F(ab)2和F(ab′)2。抗體可來自任何動物來源。抗體優選為人類、鼠科動物、兔、山羊、豚鼠、倉鼠、駱駝、驢、綿羊、馬或雞。抗體優選具有離解常數或Kd值小于5×10-6M、10-6M、5×10-7M、10-7M、5×10-8M、10-8M、5×10-9M、10-9M、5×10-10M、10-10M、5×10-11M、10-11M、5×10-12M、10-12M、5×10-13M、10-13M、5×10-14M、10-14M、5×10-15M和10-15M的結合親和力。本發明抗體可以所屬領域中已知的任何合適方法來制備。抗體衍生物旨在涵蓋(但不限于)抗原結合片段。
GPCR多肽或氨基酸序列的生物學活性片段應表示多肽或氨基酸序列的具有天然產生GPCR的結構和生化功能的片段。在某些實施例中，生物學活性片段偶合至G蛋白。在某些實施例中，生物學活性片段結合至內源配體。
候選化合物應表示經受篩檢技術的分子(例如但不限于化合物)。
化學基團術語“C1-6烷基”表示含有所示碳數目的直鏈或支鏈碳基團，例如，在一些實施例中，烷基為“C1-4烷基”且所述基團含有1-4個碳，而在其它實施例中，烷基為“C2-6烷基”且所述基團含有2-6個碳。在一些實施例中烷基含有1-3個碳，在一些實施例中含有1-2個碳，且在一些實施例中含有1個碳。烷基的實例包括(但不限于)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、異戊基、仲戊基、新戊基、己基、異己基、仲己基、新己基等等。
術語“鹵素”或“鹵基”表示氟、氯、溴或碘基團。
密碼子應表示三個核苷酸(或核苷酸的等效物)的群組，所述核苷酸通常包含偶合至磷酸基的核苷[腺苷(A)、鳥苷(G)、胞苷(C)、尿苷(U)和胸苷(T)]且在翻譯時編碼氨基酸。
組合物表示包含至少一種組份的物質。“醫藥組合物”是組合物的實例。
化合物功效應表示化合物抑制或刺激受體功能性的能力的測量；意即，激活/抑制信號轉導路徑的能力，與受體結合親和力形成對比。檢測化合物功效的例示性方式揭示于本專利文獻的實例部分中。
包含、基本上由...組成和由...組成在本文中根據其標準含義來定義。陳述于M.P.E.P.中的所定義含義控制所屬領域中的所定義含義，且陳述于監督聯邦巡回法院判例法(controlling Federal Circuit case law)中的所定義含義控制陳述于M.P.E.P.中的含義。
組成性活性受體應表示以除經由使受體結合至其配體或其化學等效物之外的方式穩定在活性態的受體。組成性活性受體可為內源或非內源組成性活性受體。
組成性激活受體應表示已修飾為具有組成性活性的內源受體。
組成性受體激活應表示在無受體結合至其配體或其化學等效物的情況下受體的激活。
接觸(CONTACT或CONTACTING)應表示在體外系統或體內系統中使至少兩個部分集合在一起。
降低(DECREASE)用于表示可測量的量的減少且在使用時與術語“減少”(“reduce”、“diminish”、“lower”和“lessen”)具有相同含義。
血糖濃度升高應表示哺乳動物中的禁食血糖濃度高于哺乳動物的正常禁食血糖濃度。以實例說明，正常人類禁食血糖濃度低于100mg/dl。如本文所用，人類血糖濃度升高是禁食血糖濃度為100mg/dl或更高。以實例說明而非限制，血糖濃度升高涵蓋高血糖癥。
內源應表示哺乳動物天然產生的物質。關于(例如但不限于)術語“受體”的內源應表示其是由哺乳動物(例如但不限于人類)天然產生。內源應理解為涵蓋基因的等位基因變異體以及如此編碼的等位基因多肽變異體。如本文所用，“內源GPCR”和“原生GPCR”可互換使用。相反，本文中的術語非內源應表示并非由哺乳動物(例如但不限于人類)天然產生。例如(但非限制)，內源形式不具有組成性活性但在受操縱時變得具有組成性活性的受體在本文中最好稱作“非內源組成性激活受體”。
表達載體在本文中是定義為在用于所述表達載體的適當宿主細胞重組體中經克隆DNA的轉錄和經轉錄mRNA的翻譯所需的DNA序列。經適當構建的表達載體應含有用于在宿主細胞中自主復制的復制起點、可選擇標記物、有限數目的適用限制酶位點、高拷貝數的可能性和活性啟動子。所述待轉錄的經克隆DNA可操作性地連接至所述表達載體內的組成性或條件性活性啟動子。以實例說明而非限制，pCMV為表達載體。
在本文所揭示的發明內容中，G蛋白偶合受體融合蛋白和GPCR融合蛋白各表示包含融合至至少一個G蛋白、最優選為所述G蛋白的α亞單元(其為結合GTP的亞單元)的內源組成性活性GPCR或非內源組成性激活GPCR的非內源蛋白，所述G蛋白優選為與天然偶合內源GPCR的G蛋白相同的類型。例如(而非限制)，在內源狀態中，如果G蛋白“Gsα”是偶合GPCR的主要G蛋白，則基于特異GPCR的GPCR融合蛋白將為包含融合至Gsα的GPCR的非內源蛋白；在一些情況下，如下文所述，非主要G蛋白可融合至GPCR。G蛋白可直接融合至組成性活性GPCR的C末端，或者在兩者之間可存在間隔物。
宿主細胞應表示能夠使載體并入其中的細胞。在某些實施例中，載體為表達載體。例示性宿主細胞包括(但不限于)293、293T、CHO、MCB3901和COS-7細胞以及黑素細胞。
如本文所用，需要預防或治療是指由護理者(例如，在人類狀況下為醫師、護士、從業護士等；在動物(包括非人類哺乳動物)狀況下為獸醫)所作的個體或動物需要治療或將受益于治療的判斷。此判斷是基于各種因素而作出，所述因素是在護理者的專業知識范圍內，但包括個體或動物由于本發明化合物可治療的病癥而生病或將生病的知識。
如本文所用，個體是指包括哺乳動物的任何動物，優選為小鼠、大鼠、其它嚙齒動物、兔、狗、貓、豬、牛、綿羊、馬或靈長類動物，且最優選為人類。
與術語“應答”相關的抑制(INHIBIT或INHIBITING)應表示相對于無化合物存在的情況，在所述化合物存在下應答得以降低或預防。
如本文所用，葡萄糖耐受性異常(IGT)旨在說明與胰島素抗性相關的病癥，其為frank、2型糖尿病和正常葡萄糖耐受性(NGT)之間的中間病癥。在診斷IGT的程序中，通過對飯后2小時血糖水平進行評估，確定病人的飯后葡萄糖應答異常。在此測試中，將所測量的量的葡萄糖投用給患者，并以固定時間間隔測量血糖水平，所述時間間隔通常在前兩個小時中為每隔半小時且在其后為每隔1小時。在“正常”或非IGT個體中，葡萄糖水平在前兩個小時中升至低于140mg/dl的水平且接著快速下降。在IGT個體中，血糖水平較高且以較緩慢速率直降。
如本文所用，胰島素抗性旨在涵蓋由多種方法中的任一方法對胰島素抗性作出的常規診斷，所述方法包括(但不限于)靜脈內葡萄糖耐受性測試或禁食胰島素水平測量。應了解，在禁食胰島素水平高度與胰島素抗性程度之間存在良好關系。因此，可將禁食胰島素水平升高用作胰島素抗性的代用標記物，以達成鑒別正常葡萄糖耐受性(NGT)個體具有胰島素抗性的目的。胰島素抗性的診斷也可使用正常血糖鉗葡萄糖測試來進行。
反向激動劑應表示結合至內源形式或組成性激活形式的受體以減少在無激動劑的情況下所觀察到的受體的基線胞內應答的物質(例如配體、候選化合物)。
經分離應表示自物質的初始環境(如果其天然存在，則為其天然環境)中將其移除。例如，存在于活體動物中的天然存在多核苷酸或多肽并未經分離，但自天然系統中的一些或所有共存物質中分離的相同多核苷酸或DNA或多肽卻經分離。所述多核苷酸可為載體的部分，和/或所述多核苷酸或多肽可為組合物的部分，且仍經分離，因為所述載體或組合物并非天然環境的部分。
配體應表示特異性結合至GPCR的分子。例如配體可為多肽、脂質、小分子、抗體。內源配體是作為原生GPCR的內源天然配體的配體。配體可為GPCR“拮抗劑”、“激動劑”、“部分激動劑”或“反向激動劑”等等。
如本文所用，術語調節或修飾表示指特定活性、功能或分子的量、性質或效應的增加或減少。以實例說明而非限制，G蛋白偶合受體的激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑為受體的調節物。
部分激動劑應表示在結合至受體時將激活胞內應答至低于完全激動劑的程度的物質(例如配體、候選化合物)。
醫藥組合物應表示包含至少一種活性成份的組合物，從而所述組合物可用于研究哺乳動物(例如但不限于人類)中的指定有效結果。所屬領域的技術人員應了解并認識到適用于確定活性成份是否具有所要有效結果(基于技術人員的需要)的技術。
多核苷酸應表示單鏈或雙螺旋形式的具有一個以上核苷酸的RNA、DNA或RNA/DNA雜合序列。本發明的多核苷酸可以任何已知方法(包括合成、重組、離體產生方法或其組合)以及使用所屬領域中已知的任何純化方法制備。
多肽是指與聚合物長度無關的氨基酸聚合物。因此，肽、寡肽和蛋白包括于多肽的定義內。此術語也并未規定或排除多肽的表達后修飾。舉例而言，包括糖基、乙酰基、磷酸基、脂質基團等等的共價連接的多肽明顯由術語多肽所涵蓋。
本文中使用引物來表示與目標核苷酸序列互補且用于與目標核苷酸序列雜交的特異性寡核苷酸序列。引物充當由DNA聚合酶、RNA聚合酶或逆轉錄酶所催化的核苷酸聚合作用的引發點。
本文中使用經純化來描述已自其它化合物分離的本發明多核苷酸或多肽載體，所述其它化合物包括(但不陷于)其它核酸、碳水化合物、脂質和蛋白(例如用于合成多核苷酸的酶)。在某些實施例中，當至少約50％、至少約60％、至少約75％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或至少約99.5％的樣品含有單一多核苷酸序列時，多核苷酸是實質上純的。在一些實施例中，實質上純的多核苷酸一般包含約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約99.5％重量/重量的多核苷酸樣品。
類似地，本文中使用術語經純化來描述已自其它化合物分離的本發明多肽，所述其它化合物包括(但不限于)核酸、脂質、碳水化合物及其它蛋白。在某些實施例中，當至少約50％、至少約60％、至少約75％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或至少約99.5％的樣品的多肽分子具有單一氨基酸序列時，多肽是實質上純的。在一些實施例中，實質上純的多肽一般包含約50％、約60％、約70％、約80％、約90％、約95％、約96％、約97％、約98％、約99％或約99.5％重量/重量的蛋白樣品。
類似地，本文中使用術語經純化來描述本發明的調節物。在某些實施例中，實質上純的調節物一般包含至少約70％、至少約80％、至少約90％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％、至少約99％或至少約99.5％重量/重量的所述調節物的制劑。在某些實施例中，調節物具有“至少”為90％與100％之間的任何數目(達到千分之一位置)的純度(例如，至少99.995％純)。
此外，如本文所用，術語經純化并不需要絕對純度；相反，其旨在表示相對定義。
受體功能性應指受體在細胞中接收刺激且緩和效應的正常運作，其包括(但不限于)調節基因轉錄、調節離子的流入或流出、實現催化反應和/或經由G蛋白調節活性。
第二信使應表示由于受體激活作用而產生的胞內應答。例如，第二信使可包括三磷酸肌醇(IP3)、二酰甘油(DAG)、環狀AMP(cAMP)、環狀GMP(cGMP)、MAP激酶活性和Ca2+。可測量第二信使應答以用于確定受體激活。此外，可測量第二信使應答以用于鑒別(例如)作為反向激動劑、部分激動劑、激動劑和拮抗劑的候選化合物。
信號噪聲比(SIGNAL TO NOISE RATIO)應表示應答激活、放大或刺激作用而產生的信號，其中應答非激活、非擴大或非刺激作用的信號在背景噪聲或基線水平以上。
間隔物應表示位于基因(例如所關注的GPCR)的最后密碼子或最后氨基酸之后，但在所關注G蛋白的起始密碼子或起始區之前的經翻譯氨基酸數目，其中經翻譯數目的氨基酸與所關注G蛋白的起始區置于同框內。經翻譯氨基酸的數目可為1、2、3、4等，且多達12個。
與術語“應答”相關的刺激(STIMULATE或STIMULATING)應表示相對于無化合物存在的情況，在所述化合物存在下應答得以增加。
受檢者應表示靈長類動物，包括(但不限于)人類和狒狒；以及寵物動物，例如狗和貓；實驗室動物，例如大鼠和小鼠；以及家畜，例如馬、綿羊和牛。
如本文所用，治療有效量是指在組織、系統、動物、個體或人類中引發研究人員、獸醫、醫生或其它醫師所尋求的生物或醫學應答的活性化合物或醫藥劑的量，所述生物或醫學應答包括下列應答中的一或多種(1)預防疾病，例如在易患疾病、病狀或病癥但未經歷或顯示所述疾病的病理學或癥狀學的個體中預防所述疾病、病狀或病癥；(2)抑制疾病，例如在經歷或顯示疾病、病狀或病癥的病理學或癥狀學的個體中抑制所述疾病、病狀或病癥(意即遏制病理學和/或癥狀學的進一步發展)；和(3)改善疾病，例如在經歷或顯示疾病、病狀或病癥的病理學或癥狀學的個體中改善所述疾病、病狀或病癥(意即逆轉病理學和/或癥狀學)。
如本文所用，術語變異體是與參考多核苷酸或多肽各自不同但保留基本特性的多核苷酸或多肽。多核苷酸的典型變異體與另一參考多核苷酸在核苷酸序列中有所不同。變異體核苷酸序列的變化可能改變或可能不改變由參考多核苷酸編碼的多肽的氨基酸序列。多肽的典型變異體與另一參考多肽在氨基酸序列中有所不同。變異體與參考多肽可因一個或一個以上取代、添加、缺失的任何組合而在氨基酸序列中有所不同。多核苷酸或多肽的變異體可為天然產生的變異體，例如等位基因變異體，或者其可為并非已知為天然產生的變異體。多核苷酸和多肽的非天然產生變異體可通過突變誘發技術或通過直接合成來制得。
引言出于呈現效率而闡述下列章節的順序且并不打算或不應解釋為對下列揭示內容或權利要求書構成限制。
B.受體表達1.所關注GPCR多肽本發明的RUP43 GPCR包含GPR131氨基酸序列。如本文所用，“GPR131氨基酸序列”旨在涵蓋SEQ ID NO2的內源人類GPR131氨基酸序列以及與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％一致性的變異體氨基酸序列。換言之，包含SEQ ID NO2的氨基酸序列變異體的GPCR可用于本發明方法中。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的等位基因變異體。在某些實施例中，SEQ ID NO2的氨基酸序列的等位基因變異體是由可通過使用特異性引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4對人類DNA樣品執行聚合酶鏈式反應(PCR)而獲得的內源GPR131核苷酸序列編碼。在一些實施例中，SEQ ID NO2的氨基酸序列的等位基因變異體是由可通過使用包含SEQ ID NO3的特異性引物和包含SEQ ID NO4的特異性引物對人類DNA樣品執行聚合酶鏈式反應(PCR)而獲得的內源GPR131核苷酸序列編碼。在某些實施例中，人類DNA樣品為人類基因組DNA。在某些實施例中，所述過程為PT-PCR(逆轉錄-聚合酶鏈式反應)。RT-PCR技術為熟練技術人員所熟知。在某些實施例中，人類cDNA樣品為人類單核細胞或巨嗜細胞cDNA。在某些實施例中，人類cDNA樣品為人類脂肪細胞cDNA。在某些實施例中，人類cDNA樣品為人類骨骼肌細胞cDNA。在某些實施例中，提供人類DNA樣品。在某些實施例中，人類DNA樣品獲自商業來源。在某些實施例中，可用于本發明方法中的變異體氨基酸序列為SEQ ID NO2的氨基酸序列的哺乳動物直向同源物。以實例說明而非限制，構想兔(例如GenBank入藏登記號BAC55237)、牛(例如GenBank入藏登記號NP_778219)、小鼠(例如GenBank入藏登記號NP_778150)和大鼠(例如GenBank入藏登記號NP_808797)的GPR131氨基酸序列在“GPR131氨基酸序列”的范圍內。應了解，如本文所用的“GPR131 GPCR”為內源RUP43GPCR；以實例說明而非限制，內源人類RUP43 GPCR是GenBank入藏登記號NM_170699的人類GPR131(具有與SEQ ID NO2一致的氨基酸序列)及其等位基因，內源兔RUP43 GPCR是GenBank入藏登記號BAC55237的兔GPR131及其等位基因，內源牛RUP43 GPCR是GenBank入藏登記號NP_778219的牛GPR131及其等位基因，內源小鼠RUP43 GPCR是GenBank入藏登記號NP_778150的小鼠GPR131及其等位基因，且內源大鼠RUP43 GPCR是GenBank入藏登記號NP_808797的大鼠GPR131及其等位基因。
在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的非內源組成性激活突變體、SEQ ID NO2的等位基因或SEQ ID NO2的哺乳動物直向同源物。如所屬領域中已知，組成性激活GPCR可使用各種方法來制備(例如參見1998年10月22日作為WO 98/46995公開的PCT申請案第PCT/US98/07496號，和美國專利第6,555,339號；其揭示內容各以全文引用的方式并入本文中)。SEQ ID NO2的氨基酸序列、SEQ ID NO2的等位基因、SEQ ID NO2的哺乳動物直向同源物、內源GPR131的非內源組成性激活突變體或與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％一致性的氨基酸序列的生物活性片段可用于本發明中。以實例說明而非限制，構想缺失N末端甲硫氨酸或N末端信號肽以提供可用于本發明方法的生物活性片段。以實例進一步說明而非限制，可用于本發明方法中的RUP43 GPCR可包含SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基。
在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約75％、至少約80％、至少約85％、至少約90％、至少約91％、至少約92％、至少約93％、至少約94％、至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約95％、至少約96％、至少約97％、至少約98％或至少約99％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約75％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約80％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ IDNO2的氨基酸序列具有至少約85％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約90％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約91％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約92％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約93％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約94％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約95％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約96％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約97％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約98％一致性的氨基酸序列。在某些實施例中，可用于本發明方法中的GPCR可包含與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少約99％一致性的氨基酸序列。與SEQ IDNO2的氨基酸序列具有至少(例如)95％“一致性”的氨基酸序列表示所述氨基酸序列與SEQ ID NO2的氨基酸序列一致，但其可包括每100個SEQ ID NO2的氨基酸序列的氨基酸中多達5個氨基酸改變。因此，為獲得與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有至少95％一致性的氨基酸序列，與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，序列中多達5％(100個中的5個)的氨基酸殘基可經插入、缺失或經另一氨基酸取代。這些改變可發生在氨基或羧基末端或所述末端位置之間的任何地方，其個別地散布在序列中的殘基中或散布在序列內的一個或一個以上鄰近基團中。
在一些實施例中，可用于本發明方法中的GPR131氨基酸序列是由在嚴格條件下與具有SEQ ID NO1中所述序列的過濾結合DNA雜交的多核苷酸序列的互補序列編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。以實例說明而非限制，可用于本發明方法中的GPR131氨基酸序列是由在嚴格條件下雜交至與SEQ ID NO1的互補體雜交的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。雜交技術為熟練技術人員所熟知。優選的嚴格雜交條件包括在42℃下在包含下列組份的溶液中培育過夜50％甲酰胺、5×SSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(pH 7.6)、5×鄧氏溶液(Denhardt’s solution)、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml變性剪切鮭魚精DNA；隨后在約65℃下在0.1×SSC中洗滌過濾器。
a.序列一致性用于確定查詢序列(例如SEQ ID NO2的氨基酸序列)與待詢問序列之間的最優選總體匹配的優選方法(也稱作總體序列比對)可基于Brutlag等人[Comp App Biosci(1990)6237-245，其揭示內容以全文引用的方式并入本文中]的算法使用FASTDB計算機程序來確定。在序列比對中，查詢序列與詢問序列都為氨基酸序列。所述總體序列比對的結果為一致性百分比。FASTDB氨基酸比對中所用的優選參數為矩陣＝PAM 0，k元組＝2，錯配罰分＝1，接合罰分＝20，隨機組＝25，長度＝0，截斷計分＝1，窗口大小＝序列長度，間隙罰分＝5，間隙大小罰分＝0.05，窗口大小＝247或詢問氨基酸序列的長度，無論哪個都可更小。
如果詢問序列因N或C末端缺失而非因內部缺失而比查詢序列更短，則一致性百分比結果必須手動校正，因為FASTDB程序在計算總體一致性百分比時并不說明詢問序列的N和C末端截斷。關于在N和C末端截斷的詢問序列，相對于查詢序列，通過計算作為詢問序列的N和C末端、不與對應詢問序列殘基匹配/比對的查詢序列的殘基數目，將一致性百分比校正為查詢序列的總堿基數百分比。由FASTDB序列比對的結果來確定殘基是否匹配/比對。接著，自通過使用指定參數的上述FASTDB程序計算的一致性百分比減去此百分數以得到最終一致性百分比計分。此最終一致性百分比計分是用于達成本發明目的。僅詢問序列的N和C末端的不與查詢序列匹配/比對的殘基被認為用于達成手動調節一致性百分比計分的目的。即，僅詢問序列的最遠N和C末端殘基之外的查詢氨基酸殘基。
舉例而言，將90個氨基酸殘基的詢問序列與100個殘基的查詢序列相比對以確定一致性百分比。在詢問序列的N末端發生缺失，且因此FASTDB比對并不與N末端的第一殘基匹配/比對。10個未配對殘基表示10％的序列(N和C末端不匹配的殘基數目/查詢序列中的殘基總數)，因此自通過FASTDB程序所計算的一致性百分比計分減去10％。如果剩余90個殘基完全匹配，則最終一致性百分比為90％。
在另一實例中，將90個殘基的詢問序列與100個殘基的查詢序列相比較。這次缺失為內部缺失，因此在詢問序列的N或C末端不存在不與查詢序列匹配/比對的殘基。在所述狀況下，由FASTDB計算的一致性百分比并不是手動校正。再一次，僅手動校正目標序列的N和C末端外部不與查詢序列匹配/比對的殘基位置(如FASTDB比對中所顯示)。為達成本發明目的，并不進行任何其它校正。
b.融合蛋白在某些實施例中，所關注多肽為融合蛋白，且(例如)可含有親和標簽域或報導子域。合適親和標簽包括可與另一部分(通常為另一多肽，最通常為抗體)特異性結合的任何氨基酸序列。如所屬領域中已知，合適親和標簽包括抗原決定基標簽，例如V5標簽、FLAG標簽、HA標簽(來自血球凝集素流行性感冒病毒)、myc標簽等等。合適親和標簽也包括已知結合底物的區域(例如所屬領域中已知的HIS、GST和MBP標簽)，以及可獲得特異性結合配對物(例如抗體，尤其為單克隆抗體)的來自其它蛋白的區域。合適親和標簽也包括可使用合適的結合配對物(諸如IgG Fc受體)特異性結合且檢測的任何蛋白-蛋白相互作用域，諸如IgG Fc區。明確涵蓋所述融合蛋白可含有N末端甲硫氨酸殘基缺失或經替代氨基酸取代的與GPCR同框融合的異源N末端域(例如抗原決定基標簽)。
合適報導子域包括可報導多肽存在的任何區域。雖然認為使用(例如)特異性結合至標簽的經標記抗體，可將親和標簽用于報導多肽存在，但更通常使用發光報導子域。合適發光報導子域包括熒光素酶(例如來自螢火蟲、Vargula、珊瑚蟲(Renilla reniformis)或Renilla muelleri)或其發光變異體。其它合適報導子域包括熒光蛋白(例如來自水母、珊瑚蟲及其它腔腸動物，例如來自水母(Aequoria)、海腎(Renilla)、Ptilosarcus、Stylatula屬的腔腸動物)或其發光變異體。這些報導蛋白的發光變異體在所屬領域中為人所熟知，且與原生報導蛋白相比其可更明亮、更黯淡或具有不同的激發和/或發射光譜。舉例而言，可改變一些變異體使得其不再呈現綠色且可呈現藍色、青色、黃色、增強的黃紅色(各自稱為BFP、CFP、YFP、eYFP和RFP)或具有所屬領域中已知的其它發射光譜。其它合適報導子域包括可經由生化或顏色變化來報導多肽存在的區域，諸如β-半乳糖苷酶、β-葡糖苷酸酶、氯霉素乙酰轉移酶和經分泌胚胎堿性磷酸酶。
所屬領域中同樣已知，親和標簽或報導子域可存在于所關注多肽中的任何位置。然而，在大多數實施例中，其存在于所關注多肽的C或N末端。
2.編碼所關注GPCR多肽的核酸因為操縱核酸的遺傳密碼和重組技術是已知的且所關注GPCR多肽的氨基酸序列如上所述，所以編碼所關注GPCR多肽的核酸的設計和產生為熟練技術人員所熟知。在某些實施例中，使用標準重組DNA技術(Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons，1995；Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold Spring Harbor，N.Y.)方法。舉例而言，可使用無需在本文中描述的各種重組方法中的任一種或其組合自GPCR編碼序列文庫分離GPCR編碼序列。也可使用標準重組DNA技術進行編碼蛋白的核酸序列中核苷酸的隨后取代、缺失和/或添加。
舉例而言，可使用定點突變誘發和亞克隆以在編碼所關注多肽的多核苷酸中引入/缺失/取代核酸殘基。在其它實施例中，可使用PCR。編碼所關注多肽的核酸也可通過化學合成而完全自寡核苷酸制得(例如Cello等人，Science(2002)2971016-8)。
在一些實施例中，編碼所關注多肽的核酸的密碼子經優化以在特定物種(尤其為哺乳動物，例如小鼠、大鼠、倉鼠、非人類靈長類動物或人類物種)的細胞中表達。在一些實施例中，編碼所關注多肽的核酸的密碼子經優化以在特定物種、尤其為兩棲動物物種的細胞中表達。
a.載體本發明進一步提供包含本發明核酸的載體(也稱作“構筑體”)。在許多本發明實施例中，本發明核酸序列將在所述序列已可操作性連接至表達控制序列(例如包括啟動子)之后在宿主中表達。本發明核酸通常也置于可在宿主細胞中復制為游離基因或宿主染色體DNA的整體部分的表達載體中。表達載體通常含有選擇標記(例如四環素或新霉素)以允許檢測經所要DNA序列轉染的那些細胞(例如參見美國專利第4,704,362號，其以引用的方式并入本文中)。包括單和雙表現序列盒載體的載體為所屬領域中所熟知(Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons，1995；Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，(1989)Cold SpringHarbor，N.Y.)。合適載體包括病毒載體、質粒、粘質粒、人工染色體(人類人工染色體、細菌人工染色體、酵母人工染色體等)、微小染色體等等。可使用逆轉錄酶病毒、腺病毒和腺相關病毒載體。
多種表達載體可用于所屬領域中以在細胞中產生所關注多肽。一種合適載體為pCMV，其用于某些實施例中。在國際承認用于專利程序的微生物保存布達佩斯條約(Budapest Treaty for the International Recognition of the Deposit of Microorganisms forthe Purpose of Patent Procedure)的規定下，此載體于1998年10月13日保存于美國菌種保藏中心(ATCC)(1080l University Blvd.，Manassas，VA 20110-2209 USA)。由ATCC測試DNA且確定其具有存活力。ATCC將以下保存號指派給pCMVATCC#203351。
本發明核酸通常包含編碼本發明所關注多肽的單一開放閱讀框，然而，在某些實施例中，因為表達所關注多肽的宿主細胞可為真核生物細胞(例如哺乳動物細胞，諸如人類細胞)，所以開放閱讀框可由內含子中斷。本發明核酸一般為轉錄單元的部分，所述轉錄單元除本發明核酸之外也可含有可指導RNA穩定性、翻譯效率等的3′和5′未翻譯區(UTR)。本發明核酸也可為表達序列盒的部分，所述表達序列盒除本發明核酸之外也含有指導所關注多肽的轉錄和表現的啟動子以及轉錄終止子。
真核生物啟動子可為在真核生物宿主細胞中具有功能性的任何啟動子，其包括病毒啟動子和來源于真核生物基因的啟動子。例示性真核生物啟動子包括(但不限于)以下啟動子小鼠金屬硫蛋白I基因序列的啟動子(Hamer等人，J.Mol.Appl.Gen.1273-288，1982)、皰疹病毒的TK啟動子(McKnight，Cell 31355-365，1982)、SV40早期啟動子(Benoist等人，Nature(London)290304-310，1981)、酵母gall基因序列啟動子(Johnston等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)796971-6975，1982；Silver等人，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)815951-59SS，1984)、CMV啟動子、EF-1啟動子、蛻皮激素應答性啟動子、四環素應答性啟動子等等。病毒啟動子尤其受到關注，因為其通常為尤其強的啟動子。在某些實施例中，使用作為目標病原體的啟動子的啟動子。選擇用于本發明的啟動子，使得其在引入其中的細胞類型(和/或動物)中具功能性。在某些實施例中，啟動子為CMV啟動子。
在某些實施例中，本發明載體也可用于表達可選擇標記。合適載體和可選擇標記為所屬領域中所熟知且討論于Ausubel等人，Short Protocols in Molecular Biology，第3版，Wiley & Sons，1995和Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，(2001)Cold Spring Harbor，N.Y.中。各種不同基因已用作可選擇標記，且主要為方便起見，選擇在本發明載體中用作可選擇標記的特定基因。已知可選擇標記基因包括胸苷激酶基因、二氫葉酸還原酶基因、黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖基轉移酶基因、CAD、腺苷脫氨酶基因、天冬酰胺酸合成酶基因、抗生素抗性基因(例如tetr、ampr、Cmr或cat、kanr或neor(氨基糖苷磷酸轉移酶基因))、潮霉素B磷酸轉移酶基因等等。
如上所述，所關注多肽可為含有親和域和/或報導子域的融合蛋白。例如，在GPCR的C或N末端制得報導子或標簽與GPCR的融合體的方法完全在所屬領域的技術人員的能力范圍內(例如McLean等人，Mol.Pharma.Mol Pharmacol.1999 561182-91；Ramsay等人，Br.J.Pharmacology，2001，315-323)且不再進一步描述。明確涵蓋所述融合蛋白可含有N末端甲硫氨酸殘基缺失或經替代氨基酸取代的與GPCR同框融合的異源N末端域(例如抗原決定基標簽)。應了解所關注多肽首先可由原生多肽制得且接著可操作性連接至如上所述的合適報導子/標簽。
本發明核酸也可含有限制位點、多克隆位點、引物結合位點、可連接末端、重組位點等，通常以便幫助構建編碼所關注多肽的核酸。
b.宿主細胞本發明進一步提供包含載體的宿主細胞，所述載體包含本發明核酸。合適宿主細胞包括原核生物細胞(例如細菌細胞(例如大腸桿菌))以及真核生物細胞(例如動物細胞(例如昆蟲、哺乳動物、魚類、兩棲動物、鳥類或爬行動物細胞)、植物細胞(例如玉米或芥菜屬(Arabidopsis)細胞)或真菌細胞(例如釀酒酵母(S.cerevisiae)細胞))。在某些實施例中，適于表達編碼所關注多肽的核酸的任何細胞都可用作宿主細胞。通常使用動物宿主細胞株，其實例如下猴腎細胞(COS細胞)、由SV40轉化的猴腎CVI細胞(COS-7，ATCC CRL 1651)、人類胚胎腎細胞(HEK-293[“293”]，Graham等人，J.Gen Virol.3659(1977))、HEK-293T[“293T”]細胞、幼倉鼠腎細胞(BHK，ATCC CCL 10)、中華倉鼠卵巢細胞(CHO，Urlaub和Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)774216，(1980))、敘利亞黃金倉鼠細胞(Syrian golden hamster cells)MCB3901(ATCC CRL-9595)、小鼠史拖利細胞(mouse sertoli cell)(TM4，Mather，Biol.Reprod.23243-251(1980))、猴腎細胞(CVI ATCC CCL 70)、非洲綠猴腎細胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人類宮頸癌細胞(HELA，ATCC CCL 2)、犬腎細胞(MDCK，ATCC CCL 34)、水牛鼠肝臟細胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)、人類肺細胞(W138，ATCC CCL 75)、人類肝臟細胞(hepG2，HB 8065)、小鼠乳房腫瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)、TRI細胞(Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci 38344-68(1982))、NIH/3T3細胞(ATCC CRL-1658)和小鼠L細胞(ATCC CCL-1)。在某些實施例中，使用黑素細胞。黑素細胞為在低等脊椎動物中所發現的皮膚細胞。將遵循根據美國專利第5,462,856號和美國專利第6,051,386號的揭示內容的相關物質和方法。這些專利揭示內容以全文引用的方式并入本文中。額外細胞株將對一般技術人員變得顯而易見，且多種細胞株可獲自美國菌種保藏中心(10801University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209)。
C.篩檢候選化合物1.通用GPCR篩檢檢定技術當G蛋白受體變得具有活性時，其結合至G蛋白(例如Gq、Gs、Gi、Gz、Go)且刺激GTP與G蛋白的結合。G蛋白接著充當GTP酶且將GTP緩慢水解為GDP，由此受體在正常條件下變得失活。然而，激活受體繼續將GDP交換為GTP。GTP的不可水解類似物[35S]GTPγS可用于監測表達激活受體的膜的增強結合。據報導[35S]GTPγS可用于監測在配體不存在和存在下偶合至膜的G蛋白。在所屬領域所熟知且可使用的其它實例中，此監測的一實例是由Traynor和Nahorski在1995年報導。此檢定系統的優選用途是用于初始篩檢候選化合物，因為無論與受體的胞內域相互作用的特定G蛋白如何，所述系統通常都適用于所有G蛋白偶合受體。
2.特異性GPCR篩檢檢定技術在使用“通用”G蛋白偶合受體檢定(意即選擇作為激動劑或反向激動劑的化合物的檢定)鑒別候選化合物之后，在一些實施例中進一步篩檢以確定化合物已在受體位點相互作用是優選的。舉例而言，由“通用”檢定所鑒別的化合物可能不結合至受體，但可能代之以僅僅“解開”來自胞內域的G蛋白。
Gs、Gz和GiGs刺激酶腺苷酰基環化酶。另一方面，Gi(和Gz與Go)抑制腺苷酰基環化酶。腺苷酰基環化酶催化ATP轉化為cAMP，因此偶合Gs蛋白的激活GPCR與cAMP的胞內含量增加相關。另一方面，偶合Gi(或Gz、Go)蛋白的激活GPCR與cAMP的胞內含量降低相關。通常參見“Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission，”第8章，FromNeuron To Brain(第3版)Nichols，J.G.等人編，Sinauer Associates，Inc.(1992)。因此，檢測cAMP的檢定可用于確定候選化合物是否為(例如)受體的反向激動劑(意即所述化合物將降低cAMP含量)。可使用測量cAMP的所屬領域中已知的各種方法；在一些實施例中，優選方法依賴于抗cAMP抗體在基于ELISA的格式中的使用。可使用的另一類型檢定為全細胞第二信使報導子系統檢定。基因上的啟動子驅動特定基因所編碼的蛋白的表達。環狀AMP通過促進cAMP-應答性DNA結合蛋白或轉錄因子(CREB)的結合來驅動基因表達，所述結合蛋白或轉錄因子接著在特異性位點結合至被稱為cAMP應答元件的啟動子且驅動基因表達。可構建報導子系統，其在報導基因(例如β-半乳糖苷酶或熒光素酶)之前具有含有多個cAMP應答元件的啟動子。因此，經激活的連接Gs的受體會引起cAMP積聚，其接著激活基因和報導蛋白的表達。接著，可使用標準生化檢定(Chen等人，1995)來檢測諸如β-半乳糖苷酶或熒光素酶的報導蛋白。
Go和GqGq和Go與酶磷脂酶C的激活作用相關，磷脂酶C接著水解磷脂PIP2，從而釋放兩種胞內信使二酰甘油(DAG)和1，4，5-三磷酸肌醇(IP3)。增加的IP3積聚與Gq和Go相關受體的激活作用相關。通常參見“Indirect Mechanisms of Synaptic Transmission，”第8章，From Neuron To Brain(第3版)Nichols，J.G.等人編，Sinauer Associates，Inc.(1992)。檢測IP3積聚的檢定可用于確定候選化合物是否為(例如)Gq或Go相關受體的反向激動劑(意即所述化合物將降低IP3含量)。也可使用AP1報導子檢定來檢測Gq相關受體，在所述檢定中Gq依賴性磷脂酶C引起含AP1元件的基因的激活，因此經激活Gq相關受體將證明所述基因的表達增加，由此其反向激動劑將證明所述表達降低，且激動劑將證明所述表達增加。可使用用于所述檢測的市售檢定。
3.GPCR融合蛋白內源組成性活性GPCR或非內源組成性激活GPCR用于篩檢直接鑒別反向激動劑或激動劑的候選化合物的用途提供引人注意的篩檢挑戰，因為根據定義，受體甚至在沒有與其結合的內源配體存在下也具有活性。因此，為(例如)區分候選化合物存在下的非內源受體與無所述化合物存在下的非內源受體(所述區分的目的是允許了解所述化合物是否可為反向激動劑或激動劑或對所述受體不具有效應)，在一些實施例中優選使用可增強所述區分的方法。在一些實施例中，優選方法為使用GPCR融合蛋白。
通常，在使用上述檢定技術(以及為熟練技術人員已知的其它技術)確定非內源GPCR經組成性激活之后，可能確定與內源GPCR偶合的主要G蛋白。G蛋白與GPCR的偶合提供可評估的信號轉導路徑。在一些實施例中，優選使用哺乳動物表達系統進行篩檢，因為預期所述系統中具有內源G蛋白。因此，根據定義，在所述系統中非內源組成性激活GPCR將持續信號轉導。在一些實施例中，此信號優選為增強的，使得在(例如)受體的反向激動劑存在下，更可能能夠在受體與反向激動劑接觸時更易于區分受體，尤其是在篩檢情況下。
GPCR融合蛋白旨在增強與非內源GPCR偶合的G蛋白的功效。對于篩檢內源組成性活性GPCR或非內源組成性激活GPCR而言，GPCR融合蛋白是優選的，因為所述方法增加在所述篩檢技術中產生的信號。這在促進顯著“信號噪聲”比方面是重要的；所述顯著比率對于篩檢如本文所揭示的候選化合物而言是優選的。
適用于表達GPCR融合蛋白的構筑體的構建在一般技術人員的能力范圍內。市售表達載體和系統提供可符合研究人員特定需要的多種方法。所述GPCR融合蛋白構筑體的構建中的重要標準包括(但不限于)GPCR序列與G蛋白序列同框(優選為內源GPCR的序列在G蛋白序列上游)以及GPCR的“終止”密碼子缺失或經替代以致使得在表達GPCR之后也可表達G蛋白。GPCR可直接連接至G蛋白，或者在兩者之間可存在間隔殘基(優選不超過約12個，雖然此數目可易于由一般技術人員確認)。基于便利性，優選使用間隔物。在一些實施例中，偶合至非內源GPCR的G蛋白優選在產生GPCR融合蛋白構筑體之前已經鑒別。因為僅很少G蛋白已被鑒別，所以包含G蛋白序列的構筑體(意即通用G蛋白構筑體，參見以下實例5(a))優選可用于在其中插入內源GPCR序列；此在大規模篩檢具有不同序列的各種不同內源GPCR的情況下提供更高效率。
如上所述，預期偶合至Gi、Gz和Go的激活GPCR將抑制cAMP形成，使得基于這些類型GPCR的檢定具有挑戰性[意即cAMP信號在激活之后減少，因此使得(例如)激動劑(其將進一步減少此信號)的直接鑒別具有挑戰性]。如本文中所揭示，已確定對于這些類型的受體而言，可能產生不基于GPCR的內源G蛋白的GPCR融合蛋白，其目的為創立可行的基于環化酶的檢定。因此，舉例而言，偶合內源Gi的受體可融合至Gs蛋白，所述融合構筑體在表達之后可“驅動”或“驅使”內源GPCR與(例如)Gs而非“天然”Gi蛋白偶合，使得可確立基于環化酶的檢定。因此，對于偶合Gi、Gz和Go的受體而言，在一些實施例中當使用GPCR融合蛋白且檢定是基于腺苷酰基環化酶活性的檢測時，以Gs(或刺激酶腺苷酰基環化酶形成的等效G蛋白)創建融合構筑體是優選的。
表B

使用與Gs、Gi、Gz或Go蛋白融合的Gq蛋白的G蛋白融合構筑體具有相等效率。在一些實施例中，可以Gq蛋白獲得優選融合構筑體，其中G蛋白α亞單元(“Gαq”)的最先六(6)個氨基酸缺失且Gαq的C末端的最后五(5)個氨基酸由所關注G蛋白的Gα的對應氨基酸替代。舉例而言，融合構筑體可具有與Gi蛋白融合的Gq(6個氨基酸缺失)，從而導致“Gq/Gi融合構筑體”。所述融合構筑體將驅使偶合內源Gi的受體偶合至其非內源G蛋白Gq，使得可測量第二信使(例如三磷酸肌醇或二酰甘油)而非cAMP產生。
以偶合信號增強子Gs的GPCR共轉染偶合目標Gi的GPCR(基于cAMP的檢定)已知偶合Gi的受體抑制腺苷酰基環化酶，且因此降低cAMP產生水平，其可使得cAMP含量的評定具有挑戰性。在某些實施例中，測量指示在激活時主要偶合Gi的受體的激活作用的cAMP的產生降低的有效技術可通過以Gi連接GPCR共轉染信號強化子(例如在激活時主要偶合Gs的非內源組成性激活受體(例如TSHR-A623I；參見上文))來實現。顯而易見，可基于cAMP產生的增加來確定偶合Gs的受體的激活作用。偶合Gi的受體的激活作用引起cAMP產生的降低。因此，共轉染方法旨在有利地利用這些“相對”影響。舉例而言，單獨用表達載體共轉染非內源組成性激活的偶合Gs的受體(“信號增強子”)可提供基線cAMP信號(意即雖然偶合Gi的受體將降低cAMP含量，但是此“降低”是相對于由組成性激活的偶合Gs的信號增強子所創建的cAMP含量的實質增加)。通過接著用“目標受體”共轉染信號增強子，偶合Gi的目標受體的反向激動劑將增加所測量的cAMP信號，而偶合Gi的目標受體的激動劑將降低此信號。
使用此方法直接鑒別的候選化合物應獨立評定以確保其不靶向信號增強受體(此可在篩檢共轉染受體之前或之后進行)。
D.醫學化學候選化合物可測試所屬領域中已知的任何分子調節(增加或降低)本發明GPCR的活性的能力。為鑒別調節活性的化合物，候選化合物可直接提供給表達受體的細胞。
本發明的此實施例非常適于篩檢調節(例如抑制、拮抗或促效)受體的量或活性的分子的化學文庫。化學文庫可為肽文庫、肽模擬劑文庫、化學合成文庫、重組文庫(例如噬菌體展示文庫)和基于體外翻譯的文庫、其它非肽合成性有機文庫等。本發明的此實施例也非常適于篩檢包含生物物質(包括(但不限于)血漿和組織提取物)的內源候選化合物和篩檢已知具有生物活性的內源化合物的文庫。
在一些實施例中，候選化合物的直接鑒別是結合經由組合化學技術產生的化合物來進行，從而隨機制備數千種化合物以用于所述分析。候選化合物可為化學文庫的成員。此可包含任何合適數目的個體成員，例如幾十至幾百至幾千至幾百萬種合適化合物，例如肽、類肽及其它寡聚化合物(環狀或線性)以及基于模板的較小分子，例如苯并二氮呯、乙內酰脲、聯芳基、碳環和多環化合物(例如萘、吩噻嗪、吖啶、類固醇等)、碳水化合物和氨基酸衍生物、二氫吡啶、二苯甲基和雜環(例如三嗪、吲哚、噻唑烷等)。所述數目和所列化合物類型為例示性而非限制性的。優選化學文庫包含低分子量化合物和潛在治療劑。
例示性化學文庫可自若干來源(ArQule、Tripos/PanLabs、ChemDesign、Pharmacopoeia)購得。在一些情況下，使用組合策略產生這些化學文庫，所述組合策略編碼各文庫成員對成員化合物所連接的底物的一致性，因此允許直接和立即鑒別作為有效調節物的分子。因此，在許多組合方法中，化合物平板上的位置說明所述化合物的組成。在一實例中，單一平板位置也可具有1-20種可通過投用給含有所關注相互作用的孔來篩檢的化學制劑。因此，如果檢測調節作用，則可檢定越來越小的相互作用對的集合的調節活性。可以所述方法篩檢許多候選分子。
適于使用的許多多樣性文庫在所屬領域中為已知的且可用于提供根據本發明待測試的化合物。或者，可使用標準方法來構建文庫。此外，也可使用更一般的結構受限的有機多樣性(例如非肽)文庫。以實例說明，可使用苯并二氮呯文庫(例如參見Bunin等人，1994，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 914708-4712)。
在本發明的另一實施例中，可使用組合化學來鑒別本發明GPCR的調節物。組合化學能夠產生含有幾十萬種化合物的文庫，其中許多文庫可在結構上類似。雖然高產量篩檢程序能夠篩檢這些巨大文庫對已知目標的親和力，但是已開發出達成具有較小規模但提供最大化學多樣性的文庫的新穎方法。(例如參見Matter，1997，Journal of MedicinalChemistry 401219-1229)。
一種組合化學方法(親和力指紋法)先前已用于測試小分子離散文庫對界定蛋白組的結合親和力。通過篩檢所獲得的指紋可用于預測個別文庫成員對所關注的其它蛋白或受體(在本發明中為本發明的受體)的親和力。將指紋與獲自己知與所關注蛋白反應的其它化合物的指紋相比較以預測文庫化合物是否可類似地反應。舉例而言，并非測試大文庫中的每個配體與復合物或蛋白組份的相互作用，而是測試與已知具有所述活性的其它化合物具有類似指紋的那些配體。(例如參見Kauvar等人，1995，Chemistry and Biology2107-118；Kauvar，1995，Affinity fingerprinting，Pharmaceutical ManufacturingInternational.825-28；以及Kauvar，Toxic-Chemical Detection by Pattern Recognition inNew Frontiers in Agrochemical Immunoassay，D.Kurtz.、L.Stanker和J.H.Skerritt編輯，1995，AOACWashington，D.C.，305-312)。
經鑒別為調節物的候選化合物所述篩檢的結果通常為具有獨特核心結構的化合物；其后，這些化合物可經受優選核心結構周圍的額外化學修飾以進一步增強其醫學特性。所述技術為所屬領域的技術人員已知且不在本專利文獻中詳細說明。
在某些實施例中，所述經鑒別調節物具有生物可用性。已開發一般技術人員可使用的多種計算方法以預測藥物的口服生物可用性[Ooms等人，Biochim Biophys Acta(2002)1587118-25；Clark & Grootenhuis，Curr OpinDrug Discov Devel(2002)5382-90；Cheng等人，J Comput Chem(2002)23172-83；Norinder & Haeberlein，Adv Drug Deliv Rev(2002)54291-313；Matter等人，Comb Chem High Throughput Screen(2001)4453-75；Podlogar &Muegge，Curr Top Med Chem(2001)1257-75，其揭示內容各自以全文引用的方式并入本文中]。此外，許多群組已成功使用正電子放射斷層攝影法(PET)來獲得口服藥物的哺乳動物體(包括非人類靈長類動物和人體)中藥物分布的直接測量(包括口服生物可用性的評定)[Noda等人，J Nucl Med(2003)44105-8；Gulyas等人，Eur J Nucl Med MolImaging(2002)291031-8；Kanerva等人，Psychopharmacology(1999)14576-81，其揭示內容各自以全文引用的方式并入本文中]。另見下文，包括實例25。
在某些實施例中，所述生物可用性經鑒別調節物進一步能夠穿過血腦障壁。已開發一般技術人員可使用的多種計算方法以預測血腦障壁的滲透[Ooms等人，BiochimBiophys Acta(2002)1587118-25；Clark & Grootenhuis，Curr OpinDrug Discov Devel(2002)5382-90；Cheng等人，J Comput Chem(2002)23172-83；Norinder & Haeberlein，Adv DrugDeliv Rev(2002)54291-313；Matter等人，Comb Chem High Throughput Screen(2001)4453-75；Podlogar & Muegge，Curr Top Med Chem(2001)1257-75，其揭示內容各自以全文引用的方式并入本文中]。已開發多種體外方法以預測藥物的血腦障壁滲透性[Lohmann等人，J Drug Target(2002)10263-76；Hansen等人，J Pharm Biomed Anal(2002)27945-58；Otis等人，J Pharmocol Toxicol Methods(2001)4571-7；Dehouck等人，JNeurochem(1990)541798-801，其揭示內容各自以全文引用的方式并入本文中]。此外，已開發多種策略以增強穿過血腦障壁的藥物傳遞[Scherrmann，Vascul Pharmacol(2002)38349-54；Pardridge，Arch Neurol(2002)5935-40；Pardridge，Neuron(2002)36555-8，其揭示內容各自以全文引用的方式并入本文中]。最終，許多群組已成功使用正電子放射斷層攝影法(PET)來獲得哺乳動物體內(包括非人類靈長類動物和人體)藥物分布的直接測量(包括大腦內)[Noda等人，J Nucl Med(2003)44105-8；Gulyas等人，Eur J NuclMed Mol Imaging(2002)291031-8；Kanerva等人，Psychopharmacology(1999)14576-81，其揭示內容各自以全文引用的方式并入本文中]。另見下文，包括實例26。
E.本發明化合物本發明的一方面涉及式(II)的化合物 或其醫藥學上可接受的鹽，其中R1為H或C1-6烷基；R2為2-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-吲唑-3-基；或R1和R2連同其所鍵結的氮形成3，4-二氫-2H-喹啉-1-基；且R10和R11各自獨立地為H或鹵素。
F.用于制備本發明化合物的合成方法本發明化合物的制備一一般合成方法本發明的新穎化合物可易于根據各種合成方法來制備，所述方法都為所屬領域的技術人員所熟悉。用于制備本發明化合物的某些方法包括(但不限于)下文流程1-3中所述的那些方法。
如流程1所示，可制備新穎2-哌啶-4-基-噻唑的中間物(AD)。在氮處受合適保護基(意即PG)保護的硫代酰胺(AA)通過與在羧酸處受到保護的3-鹵基-2-氧代-丙酸(AB)發生類Hantzsch反應而得以環化，從而生成經二保護的2-哌啶-4-基-噻唑(AC)。兩個保護基通常不同。例如，適用于環化作用的溶劑包括醇類(例如甲醇、乙醇和丙醇)、低碳鹵代烴(例如二氯甲烷、二氯乙烷和氯仿)、DMF等等。環化作用的反應溫度可在約室溫至約所用溶劑的沸點的范圍內；所述溫度范圍通常為約50℃至約90℃。
適用于硫代酰胺(AA)的保護基包括氨基甲酸叔丁酯(BOC)、氨基甲酸苯甲酯(Cbz)、氨基甲酸對甲氧基苯甲酯(Moz)等等。可使用各種方法來保護硫代酰胺(AA)的氮。例如，可在約0℃至約50℃的溫度下在合適溶劑(THF、CH3CN、DMF、EtOH、MeOH、H2O或其混合物)中使用各種試劑(例如(BOC)2O)由合適的堿(例如NaOH、KOH或Me4OH)引入氨基甲酸叔丁酯基團。
適用于3-鹵基-2-氧代-丙酸(AB)的保護基包括烷基酯(例如甲基、乙基、丙基和叔丁基)、經取代的甲基酯(例如甲氧基甲基、甲氧乙氧基甲基和苯甲氧基甲基)、視情況經取代的苯甲基酯(例如苯甲基、4-甲氧基苯甲基和2，6-二甲氧基苯甲基)等等。一種特別適用的經保護3-鹵基-2-氧代-丙酸(AB)為3-溴-2-氧代-丙酸乙酯，其通常也稱作溴丙酮酸乙酯。
適用于各種合成轉化的其它代表性保護基揭示于Greene和Wuts的ProtectiveGroups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，1999中，其揭示內容以全文引用的方式并入本文中。
為簡便起見，選擇2-哌啶-4-基-噻唑(AC)中的兩個保護基，使得一個保護基實質上可在并未實質上影響另一保護基的情況下移除。這種類型的策略被稱作正交保護。一個實例包括用BOC基團保護氮且將羧酸保護為甲酯或乙酯。在此實例中，可在并未實質上影響酯基的情況下在酸性條件下移除BOC基團。或者，由于BOC基團在堿性條件下并未實質上水解，所以可在并未實質上影響BOC基團的情況下移除酯。所屬領域中已知多種正交保護流程且其可用于本文中。
隨后，如流程1所示，在實質上保持羧酸保護的情況下移除(意即去保護)2-哌啶-4-基-噻唑(AC)的氮保護基以生成常見中間物(AD)。在由BOC基團保護氮的情況下，可在酸存在下且視情況在合適溶劑存在下達成有效裂解。合適的酸包括HCl(水溶液或無水)、HBr(水溶液或無水)、H2SO4、三氟乙酸、對甲苯磺酸等等。在存在溶劑時，合適的溶劑包括酯溶劑(例如乙酸乙酯)、烷基醇(例如甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇和正丁醇)、醚性溶劑(例如四氫呋喃和二噁烷)等等或混合物。可視情況加入凈化劑以捕獲所釋放的陽離子。合適的凈化劑包括苯硫酚、苯甲醚、苯硫基甲烷、甲苯硫酚、甲酚、甲硫醚等等。用于2-哌啶-4-基-噻唑(AC)中的氮的去保護的反應溫度范圍可在約-20℃至約所用溶劑的沸點的范圍內；通常所述溫度范圍為約-10℃至約50℃。
流程1
如流程2方法A所說明，無論是否存在堿，在脫水縮合劑和惰性溶劑存在下使中間物(AD)與羧酸偶合以提供酰胺(AE)。合適的脫水縮合劑包括二環己基碳二亞胺(DCC)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)、溴-三吡咯烷-磷六氟磷酸鹽(PyBroP)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)、1-環己基-3-甲基聚苯乙烯-碳二亞胺等等。合適的堿包括叔胺(例如N，N-二異丙基-乙胺、N-甲基嗎啉和三乙胺)。合適的惰性溶劑包括低碳鹵代烴溶劑(優選為二氯甲烷、二氯乙烷和氯仿)、醚性溶劑(例如四氫呋喃和二噁烷)、腈溶劑(例如乙腈)、酰胺溶劑(例如N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基乙酰胺)或其混合物。視情況，其它試劑可用于偶合反應中且所述試劑包括1-羥基苯并三唑(HOBT)、HOBT-6-氨甲酰基甲基聚苯乙烯、1-羥基-7-氮雜苯并三唑(HOAT)等等。合適的反應溫度在約-25℃至約60℃的范圍內，且在約0℃至約35℃的范圍內。
流程2 或者，如流程2方法B所示，可在堿和惰性溶劑存在下使用酰基鹵由中間物(AD)通過酰胺化反應來獲得酰胺(AE)。合適的酰基鹵包括酰基氯或酰基溴。合適的堿包括堿金屬碳酸鹽(例如碳酸鈉和碳酸鉀)、堿金屬碳酸氫鹽(例如碳酸氫鈉和碳酸氫鉀)、堿金屬氫氧化物(例如氫氧化鈉和氫氧化鉀)、叔胺(例如N，N-二異丙基乙胺、三乙胺和N-甲基嗎啉)和芳族胺(例如吡啶、咪唑和聚-(4-乙烯基吡啶))。合適的惰性溶劑包括低碳鹵代烴溶劑(例如二氯甲烷、二氯乙烷和氯仿)、醚性溶劑(例如四氫呋喃和二噁烷)、酰胺溶劑(例如N，N-二甲基甲酰胺和N，N-二甲基乙酰胺)和芳族溶劑(例如甲苯、苯和吡啶)。合適的反應溫度在約-25℃至約55℃、優選為約-5℃至約40℃的范圍內。
如流程3所示，移除酰胺(AE)中的受保護酸基以生成相應羧酸。適用于羧酸去保護的方法為所屬領域的一般技術人員所知。例如，烷基酯(例如甲基、乙基和正丙基)可在堿存在下在合適溶劑中經由水解而轉化為羧酸。合適的堿包括堿金屬碳酸鹽(例如碳酸鈉和碳酸鉀)、堿金屬碳酸氫鹽(例如碳酸氫鈉和碳酸氫鉀)和堿金屬氫氧化物(例如氫氧化鋰、氫氧化鈉和氫氧化鉀)。適用于去保護的溶劑包括烷基醇類(例如甲醇、乙醇、異丙醇、正丙醇和正丁醇)、醚性溶劑(例如四氫呋喃和二噁烷)等等或其混合物，優選在H2O存在下進行水解。用于酰胺(AE)中的酸基去保護的反應溫度可在約室溫至約所用溶劑的沸點的范圍內；所述溫度范圍通常為約50℃至約90℃。酯以及其它額外的合適保護基的其它去保護方法描述于Greene和Wuts，Protective Groups inOrganic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，1999，上文中。分別使羧酸(AF)與甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-吲唑-3-基)-胺或1，2，3，4-四氫-喹啉偶合以生成式(AG)和(AH)的化合物。通常，無論堿是否存在，可在脫水縮合劑和惰性溶劑存在下進行偶合，或者可在堿和惰性溶劑存在下使用由羧酸(AF)產生的酰基鹵通過酰胺化反應進行偶合，各方法都如上文流程2所述。
流程3

本發明的-些實施例包括如下文所示表1中說明的化合物。
表1

G.醫藥組合物本發明提供通過向需要治療(或預防)的個體投用治療有效量的本發明調節物來進行所述治療(和預防)的方法[另外，例如參見在2002年8月29日作為WO 02/066505公開的PCT申請案第PCT/IB02/01461號，其揭示內容各以全文引用的方式并入本文中]。在優選方面，調節物為激動劑。在優選方面，調節物實質上經純化。所述個體優選為動物，其包括(但不限于)例如牛、豬、馬、雞、非人類靈長類動物、貓、狗、兔、大鼠、小鼠等的動物，且優選為哺乳動物，且最優選為人類。
可使用所屬領域中熟知的技術將本發明調節物單獨或在其與合適載劑或賦形劑混合的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物中投用給非人類動物[參見下文實例]和/或人類。所屬領域的技術人員可獲得合適的醫藥學上可接受的載劑，例如參見Remington’sPharmaceutical Sciences，第16版，1980，Mack Publishing Co.(Oslo等人編)。
接著以治療有效劑量提供醫藥組合物或生理學上可接受的組合物。治療有效劑量是指如以實例說明所確定且不受本文所述方法限制，足以導致病癥的癥狀或生理學狀態得到預防或改善的調節物的量，其中病癥的癥狀或生理學狀態的預防或改善包括(但不限于)降低血糖濃度、預防或治療特定代謝病癥(例如胰島素抗性、葡萄糖耐受性異常和糖尿病)以及預防或治療血糖濃度升高并發癥(例如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓和周邊血管疾病)。
顯然認為本發明調節物可單獨提供或與其它醫藥學或生理學上可接受的化合物組合提供。目前，所屬領域中熟知用于治療本發明病癥的其它化合物，其中本發明病癥的治療包括(但不限于)降低血糖濃度、預防或治療特定代謝病癥(例如胰島素抗性、葡萄糖耐受性異常和糖尿病)以及預防或治療血糖濃度升高并發癥(例如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓和周邊血管疾病)。本發明的一方面涵蓋根據本文所揭示實施例的用途，所述實施例進一步包含一種或一種以上選自由下列各物組成的群組的藥劑磺酰脲(例如格列本脲(glibenclamide)、格列甲嗪(glipizide)、格列齊特(gliclazide)、谷胱甘肽(glimepiride))、美格替耐(meglitinide)(例如瑞格列奈(repaglinide)、那格列奈(nateglinide))、雙胍(例如二甲雙胍(metformin))、α-葡糖苷酶抑制劑(例如阿卡波糖(acarbose)、依帕司他(epalrestat)、米格列醇(miglitol)、伏格列波糖(voglibose))、噻唑烷二酮(例如羅格列酮(rosiglitazone)、吡格列酮(pioglitazone))、胰島素類似物(例如賴脯胰島素(insulin lispro)、門冬胰島素(insulin aspart)、甘精胰島素(insulinglargine))、吡啶甲酸鉻(chromium picolinatefoiotin)和生物藥劑(例如脂聯素(adiponectin)或其包含C末端球狀域的片段，或其脂聯素或所述片段的多聚物；或脂聯素受體AdipoRl或AdipoR2的激動劑，優選其中所述激動劑具有口服生物可用性)。此外，明確涵蓋本發明調節物(例如本發明的激動劑和部分激動劑)可單獨提供或與磷酸二酯酶(PDE)抑制劑(包括4型cAMP特異性PDE(PDE4)的選擇性抑制劑，例如羅氟司特；PDE4B的選擇性抑制劑；和PDE4B2的選擇性抑制劑)組合提供。
在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組葡萄糖耐受性異常、胰島素抗性、高胰島素血癥和糖尿病。在一些實施例中，糖尿病為l型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為l型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
在某些實施例中，血糖濃度升高并發癥選自由下列病癥組成的群組綜合癥X、動脈粥樣硬化、動脈粥樣化疾病、心臟病、高血壓、中風、神經病、視網膜病、腎病和周邊血管疾病。心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
投藥途徑合適投藥途徑包括使用所屬領域中已知的方法經口、經鼻、經直腸、經粘膜、經皮或經腸投藥、非經腸傳遞(包括肌肉內、皮下、髓內注射以及鞘內、直接心室內、靜脈內、腹膜內、鼻內、肺內(吸入)或眼內注射)。其它尤其優選的投藥途徑為氣霧劑和儲槽調配物。明確涵蓋所發明藥物的持續釋放調配物(尤其為儲槽)。在某些實施例中，投藥途徑為口服。
組合物/調配物可使用一種或一種以上生理學上可接受的載劑(包含賦形劑和助劑)，以常規方式調配根據本發明使用的醫藥或生理學上可接受的組合物和藥物。合適調配視所選投藥途徑而定。
某些本文所述的藥物將包括醫藥學或生理學上可接受的載劑和至少一種本發明調節物。為進行注射，可在水溶液中、優選在生理學上可相容的緩沖液(諸如漢克氏溶液(Hanks’s solution)、林格氏溶液(Ringer’s solution)或生理鹽水緩沖液(諸如磷酸鹽或碳酸氫鹽緩沖液))中調配本發明藥劑。為經粘膜投藥，在調配物中使用適于待滲透障壁的滲透劑。所述滲透劑通常為所屬領域中已知的。
可口服的醫藥制劑或生理學上可接受的制劑包括由明膠制得的配合插入膠囊，以及由明膠和增塑劑(諸如甘油或山梨醇)制得的軟質密封膠囊。配合插入膠囊可含有與填充劑(諸如乳糖)、粘合劑(諸如淀粉)和/或潤滑劑(諸如滑石或硬脂酸鎂)以及視情況與穩定劑混合的活性成份。在軟質膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮于合適液體(諸如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇)中。此外，可加入穩定劑。用于口服的所有調配物都應呈適于所述投藥的劑量形式。
為經口腔投藥，組合物可采用以常規方式調配的片劑或錠劑形式。
為通過吸入投藥，根據本發明使用的化合物便于以氣霧劑噴霧呈現形式自霧化器的加壓包傳遞，其中使用合適的氣態推進劑(例如二氧化碳)。在加壓氣霧劑的情況下，可通過提供閥門以傳遞定量來確定劑量單位。用于吸入器或吹入器中的(例如)明膠膠囊和藥筒可調配成含有所述化合物與合適的粉末基劑(諸如乳糖或淀粉)的粉末混合物。
所述化合物可調配成通過注射(例如通過快速注射或連續輸注)來非經腸投藥。用于注射的調配物可以單位劑量呈現以用于(例如)具有附加防腐劑的安瓿或多劑量容器中。組合物可采用諸如在水性媒劑中的懸浮液、溶液或乳液的形式，且可含有諸如懸浮劑、穩定劑和/或分散劑的調配劑。
用于非經腸投藥的醫藥調配物或生理學上可接受的調配物包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。水性懸浮液可含有增加懸浮液粘度的物質，諸如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。懸浮液也可視情況含有增加化合物溶解性以允許制備高濃度溶液的合適穩定劑或藥劑。
或者，活性成份可呈現為在使用前以合適媒劑(例如無菌無熱原質水)復水的粉末或凍干形式。
除先前所述的調配物外，化合物也可調配成儲槽制劑。可通過植入(例如皮下或肌肉內)或通過靜脈內注射來投用所述長效調配物。因此，舉例而言，可用合適的聚合或疏水物質(例如調配為可接受的油中的乳液)或離子交換樹脂調配化合物或將其調配為微溶性衍生物(例如微溶性鹽)。
在特定實施例中，可經由控制釋放系統傳遞化合物。在一實施例中，可使用泵(Langer，上文；Sefton，1987，CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.1420l-240；Buchwald等人，1980，Surgery 88507-516；Saudek等人，1989，N.Engl.J.Med.321574-579)。在另一實施例中，可使用聚合物質(Medical Applications of Controlled Release，Langer和Wise編，CRC Press，Boca Raton，Florida，1974；Controlled Drug Bioavailability，Drug Product Design andPerformance，Smolen和Ball編，Wiley，New York，1984；Ranger和Peppas，1983，Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.236l；Levy等人，1985，Science 228190-192；During等人，1989，Ann.Neurol.2535l-356；Howard等人，1989，J.Neurosurg.7l858-863)。其它控制釋放系統由Langer(1990，Science 2491527-1533)在綜述中討論。
此外，也可使用持續釋放系統(諸如含有治療劑的固體疏水性聚合物的半透性基質)傳遞化合物。已確定各種持續釋放物質且其為所屬領域的技術人員所熟知。視化學性質而定，持續釋放膠囊可釋放化合物歷時數周至長達100天以上。
視治療試劑的化學性質和生物穩定性而定，可使用調節物穩定化作用的額外策略。
醫藥組合物或生理學上可接受的組合物也可包含合適的固相或凝膠相載劑或賦形劑。所述載劑或賦形劑的實例包括(但不限于)碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠和聚合物(諸如聚乙二醇)。
有效劑量適用于本發明的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物包括其中含有有效量的活性成份以達成其預定目的的組合物。更特定言之，治療有效量表示可有效預防所治療受檢者的現有癥狀發展或緩解所述癥狀的量。對有效量的判定在所屬領域的技術人員的能力范圍內，尤其是根據本文所提供的詳細揭示內容。
對于本發明方法中所用的任何化合物而言，治療有效劑量起初可根據細胞培養檢定進行評估。舉例而言，可在動物模型中調配劑量以達成包括或涵蓋顯示為刺激細胞中的葡萄糖攝取、預防或治療特定代謝病癥或預防或治療血糖濃度升高并發癥的濃度點或范圍的循環濃度范圍。[見下文關于體外檢定和體內動物模型的實例]。所述信息可用于更準確地判定人類的適用劑量。
治療有效劑量是指導致患者癥狀改善的化合物的量。可在細胞培養物或實驗動物中以標準醫藥程序來確定所述化合物的毒性和治療功效，例如用于確定LD50(致死50％測試群體的劑量)和ED50(在50％測試群體中治療有效的劑量)。毒性效應與治療效應的劑量比為治療指數且其可表示為LD50與ED50的比率。優選為呈現高治療指數的化合物。
自所述細胞培養檢定和動物研究獲得的資料可用于調配用于人類的多種劑量。所述化合物的劑量優選處于包括ED50的循環濃度范圍內，其具有很少毒性或無毒性。視所用劑型和所用投藥途徑而定，劑量可在此范圍內變化。精確配方、投藥途徑和劑量可由主治醫師根據患者情況來選擇。(例如參見Fingl等人，1975，“The Pharmacological Basisof Therapeutics”，第1章)。
視特定情形而定，可個別調節劑量和間隔以提供足以預防或治療本發明病癥的活性化合物的血漿含量。達成這些效應所需的劑量將視個體特征和投藥途徑而定。
也可使用最低有效濃度的值來確定劑量間隔。應使用當時維持血漿含量高于最低有效濃度達10-90％、優選介于30與99％之間且最優選介于50與90％之間的方案來投用化合物。在局部投藥或選擇性攝取的狀況下，藥物的有效局部濃度可能與血漿濃度無關。
所投用組合物的量當然將視所治療的受檢者、受檢者體重、病患嚴重性、投藥方式和主治醫師的判斷而定。
本發明調節物的量的優選劑量范圍為0.1-100mg/kg身體質量，所述劑量范圍可基于每日或常規基礎來投用以達成所要結果。另一優選劑量范圍為0.1-30mg/kg身體質量。另一優選劑量范圍為0.1-10mg/kg身體質量。另一優選劑量范圍為0.1-3.0mg/kg身體質量。當然，這些每日劑量可在一天之中以少量周期性傳遞或投用。應注意這些劑量范圍僅為優選范圍且并不表示對本發明構成限制。所述所要結果包括(但不限于)降低血糖濃度；預防或治療某些代謝病癥，例如胰島素抗性、葡萄糖耐受性異常和糖尿病；以及預防或治療血糖濃度升高并發癥，例如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓和周邊血液疾病。
H.治療方法本發明尤其涉及下列方法，其包括(但不限于)降低血糖濃度的方法、預防或治療某些代謝病癥(例如胰島素抗性和糖尿病)的方法和預防或治療血糖濃度升高并發癥(例如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓和周邊血管疾病)的方法，其包含將本發明調節物提供給需要所述治療的個體。在某些實施例中，調節物為激動劑。在一些實施例中，所述調節物具有口服生物可用性。在一些實施例中，所述口服生物可用調節物進一步能夠穿過血腦障壁。在某些實施例中，將調節物以醫藥組合物或生理學上可接受的組合物形式提供給個體。在某些實施例中，將調節物以醫藥組合物形式提供給個體。在某些實施例中，將調節物以生理學上可接受的組合物形式提供給個體。在某些實施例中，將調節物以口服的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物形式提供給個體。在某些實施例中，所述個體為非人類哺乳動物。在某些實施例中，所述個體為哺乳動物。在某些實施例中，所述個體或哺乳動物為人類。
在某些實施例中，代謝病癥選自由下列病癥組成的群組葡萄糖耐受性異常、胰島素抗性、高胰島素血癥和糖尿病。在一些實施例中，糖尿病為1型糖尿病。在某些優選實施例中，糖尿病為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為1型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為2型糖尿病。在某些實施例中，代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。在某些實施例中，代謝病癥為胰島素抗性。在某些實施例中，代謝病癥為高胰島素血癥。在某些實施例中，代謝病癥與個體中血糖濃度升高有關。
在某些實施例中，血糖濃度升高并發癥選自由下列病癥組成的群組綜合癥X、動脈粥樣硬化、動脈粥樣化疾病、心臟病、高血壓、中風、神經病、視網膜病、腎病和周邊血管疾病。心臟病包括(但不限于)心功能不全、冠狀動脈功能不全、冠狀動脈疾病和高血壓。在某些實施例中，并發癥為綜合癥X。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣硬化。在某些實施例中，并發癥為動脈粥樣化疾病。在某些實施例中，并發癥為心臟病。在某些實施例中，并發癥為心功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈功能不全。在某些實施例中，并發癥為冠狀動脈疾病。在某些實施例中，并發癥為高血壓(high bloodpressure)。在某些實施例中，并發癥為高血壓(hypertension)。在某些實施例中，并發癥為中風。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為視網膜病。在某些實施例中，并發癥為神經病。在某些實施例中，并發癥為周邊血管疾病。在某些實施例中，并發癥為多囊卵巢綜合癥。在某些實施例中，并發癥為高脂質血癥。
I.其它效用可通過使候選化合物與RUP43受體接觸且確定候選化合物對RUP43受體功能性的影響來鑒別調節(意即增加、降低或阻斷)RUP43受體功能性的藥劑。可通過將調節RUP43受體功能性的化合物對RUP43受體的影響與所述化合物對其它G蛋白偶合受體的影響相比較來評估所述化合物的選擇性。以實例說明而非限制，內源RUP43受體的調節物與一種或一種以上來自相同物種的其它內源G蛋白偶合受體相比較顯示出具有選擇性。以實例說明而非限制，如果內源RUP43受體的激動劑關于內源RUP43受體的EC50比所述激動劑關于來自相同物種的一種或一種以上其它內源G蛋白偶合受體的EC50低至少100倍，則所述激動劑可顯示為選擇性RUP43激動劑。在鑒別調節RUP43受體功能性的化合物之后，可在其它檢定(包括(但不限于)體內模型)中進一步測試所述候選化合物以便確認或量化其活性。RUP43受體功能性的調節物在治療上適用于治療其中涉及正常或異常RUP43受體功能性的疾病和生理病狀。
通過使候選化合物與RUP43受體接觸且確定所述候選化合物是否結合至RUP43受體可鑒別作為RUP43受體的配體的藥劑。結合RUP43受體的化合物的選擇性可通過將其對RUP43受體的結合與其對其它受體的結合相比較來進行評估。以實例說明而非限制，內源RUP43受體的配體與一種或一種以上來自相同物種的其它內源G蛋白偶合受體相比較可顯示出具有選擇性。作為RUP43受體功能性的調節物的配體在治療上適用于治療其中涉及正常或異常RUP43受體功能性的疾病和生理病狀。
本發明也涉及鑒別為RUP43受體的調節物或配體的本發明化合物的經放射性同位素標記的型式，其不僅適用于放射成像，而且適用于定位且量化組織樣品(包括人類)中的RUP43受體以及通過抑制經放射性同位素標記的化合物的結合來鑒別RUP43受體配體的體外和體內檢定中。本發明的另一目的是開發包含所述經放射性同位素標記的化合物的新穎RUP43受體檢定。
本發明涵蓋經鑒別為RUP43受體的調節物或配體的本發明化合物的經放射性同位素標記的型式。
本發明也涉及適用于檢測結合至RUP43受體的配體的測試配體的經放射性同位素標記的型式。在一些實施例中，本發明明確涵蓋適用于檢測結合至RUP43受體的配體的所述經放射性同位素標記的測試配體的文庫。在某些實施例中，所述文庫包含至少約10、至少約102、至少約103、至少約105或至少約106種所述經放射性同位素標記的測試化合物。本發明的另一目的是開發包含所述經放射性同位素標記的測試配體的新穎RUP43受體檢定。
在一些實施例中，化合物的經放射性同位素標記的型式與所述化合物相同，但實際上一個或一個以上原子由具有與自然界中一般所發現(意即天然產生)的原子質量或質量數不同的原子質量或質量數的原子置換或取代。可并入本發明化合物中的合適放射性核素包括(但不限于)2H(氘)、3H(氚)、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和131I。并入本發明經放射性標記化合物中的放射性核素將視所述經放射性標記化合物的特定應用而定。舉例而言，對于體外RUP40受體標記和競爭檢定而言，并入3H、14C、82Br、125I、131I、35S的化合物通常將最為適用。對于放射成像應用而言，11C、18F、125I、123I、124I、131I、75Br、76Br或77Br通常將最為適用。在一些實施例中，放射性核素選自由3H、11C、18F、14C、125I、124I、131I、35S和82Br組成的群組。
將放射性同位素并入有機化合物中的合成方法適用于本發明化合物且在所屬領域中為人所熟知。例如，將放射性水平的氚并入目標分子中的這些合成方法如下所示A.用氚氣催化還原-此程序通常得到高比放射性產物且需要鹵化或不飽和前驅物。
B.用硼氫[3H]化鈉還原-此程序非常廉價且需要含有可還原官能基(諸如醛、酮、內酯、酯等等)的前驅物。
C.用氫化鋁鋰[3H]還原-此程序提供幾乎具有理論比放射性的產物。其也需要含有可還原官能基(諸如醛、酮、內酯、酯等等)的前驅物。
D.氚氣曝露標記-此程序包括在合適催化劑存在下將含有可交換質子的前驅物曝露于氚氣下。
E.使用甲基碘[3H]進行N-甲基化-此程序通常通過以高比放射性甲基碘(3H)處理適當前驅物而用于制備O-甲基或N-甲基(3H)產物。此方法大體而言允許較高比放射性，例如約70-90 Ci/mmol。
將放射性水平的125I并入目標分子中的合成方法包括A.Sandmeyer和類似反應-此程序將芳基胺或雜芳基胺轉化為重氮鹽(諸如四氟硼酸鹽)且隨后使用Na125I將其轉化為經125I標記的化合物。代表程序由Zhu，D.-G.及其合作者在J.Org.Chem.2002，67，943-948中報導。
B.苯酚的鄰位125碘化-此程序允許在苯酚鄰位上并入125I，如Collier，T.L.及其合作者在J.Labeled Compd Radiopharm.1999，42，S264-S266中所報導。
C.用125I交換芳基溴和雜芳基溴-此方法通常為兩步方法。第一步是在三烷基鹵化錫或六烷基二錫[例如(CH3)3SnSn(CH3)3]存在下，使用(例如)Pd催化反應[意即Pd(Ph3P)4]或通過芳基鋰或雜芳基鋰，將芳基溴或雜芳基溴轉化為對應的三烷基錫中間物。代表程序由Bas，M.-D.及其合作者在J.Labeled Compd Radiopharm.2001，44，S280-S282中報導。
在一些實施例中，化合物的經放射性同位素標記的型式與所述化合物相同，但添加有一個或一個以上包含放射性核素的取代基。在一些其它實施例中，化合物為多肽。在一些其它實施例中，化合物為抗體或其抗原結合片段。在一些其它實施例中，所述抗體為單克隆抗體。合適的所述放射性核素包括(但不限于)2H(氘)、3H(氚)、11C、13C、14C、13N、15N、15O、17O、18O、18F、35S、36Cl、82Br、75Br、76Br、77Br、123I、124I、125I和131I。并入本發明經放射性標記化合物中的放射性核素將視所述經放射性標記化合物的特定應用而定。舉例而言，對于體外RUP43受體標記和競爭檢定而言，并入3H、14C、82Br、125I、131I、35S的化合物通常將最為適用。對于放射成像應用而言，11C、18F、125I、123I、124I、131I、75Br、76Br或77Br通常將最為適用。在一些實施例中，放射性核素是選自由3H、11C、18F、14C、125I、124I、131I、35S和82Br組成的群組。
添加一個或一個以上包含放射性核素的取代基的方法在熟練技術人員的能力范圍內且包括(但不限于)以酶促方法[Marchalonic JJ，Biochemical Journal(1969)113299-305；Thorell JI和Johansson BG，Biochimica et Biophysica Acta(1969)251363-9；其各自揭示內容以全文引用的方式并入本文中]和/或以氯胺-T/Iodogen/Iodobead方法[Hunter WM和Greenwood FC，Nature(1962)194495-6；Greenwood FC等人，Biochemical Journal(1963)89114-23；其各自揭示內容以全文引用的方式并入本文中]添加放射性同位素碘。
尤其基于本專利文獻的綜述，所揭示受體和方法的其它用途將對所屬領域的技術人員變得顯而易見。
實例呈現以下實例以用于闡述而非限制本發明。雖然本文揭示特定核酸和氨基酸序列，但相信所屬領域的一般技術人員具有對這些序列進行微小修飾同時達成下文所報導的相同或實質上類似的結果的能力。所述經修改方法被視為在本揭示案的范圍內。
提供以下實例以達成說明目的而非一種限制手段。所屬領域的一般技術人員將能夠基于本文的揭示內容來設計等效檢定和方法，其共同形成本發明的部分。
例如，與本發明主旨相關且為所屬領域的一般技術人員所熟知的重組DNA技術可見于Maniatis T等人，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)Cold Spring HarborLaboratory；美國專利第6,399,373號；和在2002年8月29日作為WO 02/066505公開的PCT申請案第PCT/IB02/01461號中，其各自揭示內容以全文引用的方式并入本文中。
實例1人類GPCR的全長克隆內源人類RUP43(SEQ ID NO1和2)如本文所述，可克隆編碼全長內源人類RUP43(GPR131，例如GenBank入藏登記號NM_170699)的多核苷酸序列。SEQ ID NO1是可如本文所述進行克隆的內源人類RUP43(GPR131)多核苷酸編碼序列。SEQ ID NO2是對應的經編碼的內源人類RUP43(GPR131)多肽。
使用Platinum PCR SuperMix(Invitrogen目錄號11306-016)和特異性引物5′-GACAAGCATGACGCCCAACAGCACTGGCGAG-3′(5′-引物；SEQ ID NO3)與5′-CTTGAATTAGTTCAAGTCCAGGTCGACACTGC-3′(3′-引物；SEQ ID NO4)以及作為模板的人類DNA，通過PCR來克隆全長內源人類RUP43。人類DNA可為基因組DNA或cDNA。所用的循環條件為以下過程的25個循環95℃，40秒；60℃，50秒；和72℃，1分鐘。將1.0 kb PCR產物克隆到pCRII-TOPOTM載體(Invitrogen)中。
經HA/V5His雙標記的內源人類RUP43(SEQ ID NO5和6)如本文所述，克隆編碼全長內源人類RUP43(GPR131)多肽(缺乏N末端甲硫氨酸)的多核苷酸，其具有N末端HA抗原決定基標簽和安置于C末端的V5His抗原決定基標簽。“HA”抗原決定基標簽包含氨基酸序列MYPYDVPDYA。“V5”包含氨基酸序列GKPIPNPLLGLDST；“His”包含氨基酸序列HHHHHH。SEQ ID NO5是具有5′-末端HA抗原決定基標簽和3′-末端V5His抗原決定基標簽的內源人類RUP43(GPR131)多核苷酸編碼序列(缺乏編碼N末端甲硫氨酸的密碼子)。SEQ ID NO6是對應的經編碼的經HA/V5His雙標記的RUP43多肽。
使用EST克隆(MAGE#5221127，GenBank入藏登記號BC033625)作為模板且使用pfu聚合酶(Stratagene)來執行PCR，其中由制造商提供補充有10％DMSO、0.25μM各引物和0.5mM各4種核苷酸的緩沖液系統。循環條件為以下過程的25個循環95℃，40秒；60℃，50秒；和72℃，1分鐘40秒。5′PCR引物并入HindIII位點且具有下列序列5′-GACAAGCTTGACGCCCAACAGCACTGGCGAG-3′(SEQ ID NO7)。
3′PCR引物并入EcoRI位點且具有下列序列5′-CTTGAATTCGTTCAAGTCCAGGTCGACACTGC-3′(SEQ ID NO8)。
用HindIII和EcoRI消化1.0kb PCR產物且將其克隆到經5′HA/3′V5His雙標記的pCMV表達載體中。
實例2非內源組成性激活人類RUP43的制備相信所屬領域的技術人員具有選擇核酸序列突變技術的能力。下文呈現可用于產生人類GPCR的非內源型式的方法。本文所揭示的關于內源人類RUP43(GPR131)的突變是基于算法逼近，由此在保守脯氨酸(或其內源保守取代)殘基(位于GPCR的TM6區，接近TM6/IC3界面)的N末端的第16個氨基酸(位于GPCR的IC3區中)優選突變為組氨酸、精氨酸或賴氨酸氨基酸殘基，最佳突變為賴氨酸氨基酸殘基。
以實例說明而非限制，可通過在SEQ ID NO2的氨基酸位置223使丙氨酸優選突變為賴氨酸而制備內源人類RUP43(GPR131)的非內源組成性激活型式。
1.Transformer Site-DirectedTMMutagenesis根據制造商說明書尤其使用Transformer Site-DirectedTMMutagenesis試劑盒(Clontech)，可在人類GPCR上完成非內源人類GPCR的制備。使用兩種突變誘發引物，最佳為產生賴氨酸突變的賴氨酸突變誘發寡核苷酸和選擇標記物寡核苷酸。為簡便起見，也應注意將要并入人類GPCR中的標準形式的密碼子突變。
2.QuikChangeTMSite-DirectedTMMutagenesis也可使用QuikChangeTMSite-DirectedTMMutagenesis試劑盒(Stratagene，根據制造商說明書)來完成非內源人類GPCR的制備。優選使用內源GPCR作為模板，并使用兩種突變誘發引物，且所述引物最佳為賴氨酸突變誘發寡核苷酸和選擇標記物寡核苷酸(包括于試劑盒中)。為簡便起見，應注意標準形式的并入新穎人類GPCR中的密碼子突變和個別寡核苷酸。
實例3受體表達雖然多種細胞可用于表達蛋白的技術，但最佳為使用哺乳動物細胞或黑素細胞。如果有可能，將(例如)酵母細胞用于表達GPCR會在實驗方案中引入非哺乳動物細胞，其可能不包括(在酵母狀況下的確不包括)哺乳動物系統所涉及的受體偶合、遺傳機制和分泌路徑，因此在非哺乳動物細胞中獲得結果，如果具有潛在用途，則并不如自哺乳動物細胞或黑素細胞所獲得的結果一樣優選，此情況的主要原因應根據實踐來預測。雖然可基于技術人員的特定需要來預測所用的特定哺乳動物細胞，但在哺乳動物細胞中CHO、COS-7、MCB3901、293和293T細胞是尤其優選的。在一些實施例中，可使用獲自哺乳動物的脂肪細胞或骨骼肌細胞。參見與黑素細胞相關的下文，包括實例10。
a.短暫轉染第1天，在每個10cm培養皿上涂板6×106個293細胞。第2天，制備兩個反應管(各管所遵循的比例是對于每個培養盤而言)通過在0.5ml無血清DMEM(Gibco BRL)中混合4μgDNA(例如pCMV載體；具有受體cDNA等的pCMV載體)來制備管A；通過在0.5ml無血清DMEM中混合24μl脂質轉染劑(lipofectamine)(Gibco BRL)來制備管B。通過倒轉(數次)，隨后在室溫下培育30-45min來混合管A和B。所述混合物被稱為“轉染混合物”。用1×PBS洗滌經涂板293細胞，隨后加入5ml無血清DMEM。將1ml轉染混合物加入細胞中，隨后在37℃/5％CO2下培育4小時。通過抽吸移除轉染混合物，隨后加入10ml DMEM/10％胎牛血清。在37℃/5％CO2下培育細胞。培育48小時后，采集細胞且用于分析。
b.穩定細胞株將大約12×106個293細胞涂板于15cm組織培養盤上。使其在含有10％胎牛血清和1％丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺以及抗生素的DME高葡萄糖培養基中生長。在涂板293細胞后24小時(或達到約80％長滿)，使用12μgDNA(例如具有受體cDNA的pCMV載體)轉染細胞。將12μgDNA與60μl脂質轉染劑和2ml無血清DME高葡萄糖培養基組合。自培養盤抽吸培養基且用無血清培養基將細胞洗滌一次。將DNA、脂質轉染劑和培養基混合物連同10ml無血清培養基加入培養盤中。在37℃下培育4至5小時后，抽吸培養基且加入25ml含血清培養基。在轉染后24小時，再次抽吸培養基，且加入新鮮的含血清培養基。在轉染后48小時，抽吸培養基且加入含有最終濃度遺傳霉素(G418藥物)的含血清培養基。將大約12×106個293細胞涂于15cm組織培養盤上。使其在含有10％胎牛血清和1％丙酮酸鈉、L-谷氨酰胺以及抗生素的DME高葡萄糖培養基中生長。在涂板293細胞后24小時(或達到約80％長滿)，使用12μgDNA(例如具有受體cDNA的pCMV載體)轉染細胞。將12μgDNA與60μl脂質轉染劑和2ml無血清DME高葡萄糖培養基組合。自培養盤抽吸培養基且用無血清培養基將細胞洗滌一次。將DNA、脂質轉染劑和培養基混合物連同10mL無血清培養基加入培養盤中。在37℃下培育4至5小時后，抽吸培養基且加入25ml含血清培養基。在轉染后24小時，再次抽吸培養基，且加入新鮮的含血清培養基。在轉染后48小時，抽吸培養基且加入含有最終濃度為500μg/ml的遺傳霉素(G418藥物)的含血清培養基。經轉染細胞現經歷對含有G418抗性基因的陽性轉染細胞的選擇。在進行選擇時每4至5天替換培養基。在選擇期間，使細胞生長以產生穩定池，或使細胞分裂以進行穩定克隆選擇。
實例4用于確定GPCR激活作用的檢定多種方法可用于評定人類GPCR的激活作用。下文具有說明性；相信所屬領域的技術人員具有判定優選有益于技術人員需要的那些技術的能力。
1.膜結合檢定[35S]GTPγS檢定當G蛋白偶合受體由于配體結合或組成性激活而呈其活性態時，受體偶合至G蛋白且刺激GDP釋放且隨后刺激GTP與G蛋白的結合。G蛋白-受體復合物的α亞單元充當GTP酶且將GTP緩慢水解成GDP，此時受體通常失活。激活受體繼續將GDP交換為GTP。不可水解的GTP類似物[35S]GTPγS可用于證明[35S]GTPγS與表達激活受體的膜的增強結合。使用[35S]GTPγS結合來測量激活作用的優勢在于(a)其通常適用于所有G蛋白偶合受體；(b)其鄰接于膜表面，使得采集影響胞內級聯的分子的可能性較低。
所述檢定使用G蛋白偶合受體刺激[35S]GTPγS結合至表達相關受體的膜的能力。因此，所述檢定可用于直接鑒別方法中，從而將候選化合物篩檢為內源GPCR和非內源組成性激活GPCR。所述檢定為通用檢定且適用于關于所有G蛋白偶合受體的藥物發現。
GTPγS檢定是在20mM HEPES和介于1與約20mM之間的MgCl2(此量可經調節以優化結果，雖然20mM為優選的)pH 7.4、含有介于約0.3與約1.2nM之間的[35S]GTPγS(此量可經調節以優化結果，雖然1.2為優選的)以及12.5至75μg膜蛋白(例如表達Gs融合蛋白的293細胞，此量可經調節以優化)的結合緩沖液和10μM GDP(此量可經改變以優化)中培育1小時。接著加入麥芽凝集素珠粒(25μl；Amersham)且將混合物在室溫下培育另外30分鐘。接著將管在室溫下以1500×g離心5分鐘且接著在閃爍計數器中計數。
2.腺苷酰基環化酶針對基于細胞的檢定所設計的Flash PlateTM腺苷酰基環化酶試劑盒(New EnglandNuclear，目錄號SMP004A)可經修飾以用于粗質膜。Flash Plate孔可含有閃爍涂層，所述閃爍涂層也含有識別cAMP的特異性抗體。孔中所產生的cAMP可通過對放射性cAMP示蹤劑與cAMP抗體的結合進行直接競爭來量化。下文充當用于測量表達受體的全細胞中cAMP水平變化的簡要實驗方案。
在短暫轉染后大約24小時采集經轉染細胞。小心吸出培養基且丟棄。將10ml PBS緩慢加入各細胞培養皿中，隨后小心抽吸。將1ml Sigma細胞解離緩沖液和3ml PBS加入各培養盤中。自培養盤中吸出細胞且將細胞懸浮液收集到50ml錐形離心管中。接著，在室溫下將細胞以1,100rpm離心5分鐘。將細胞小球小心地再懸浮于適當體積的PBS(約3ml/培養盤)中。接著，使用血球計數器對細胞計數且加入額外PBS以得到適當數目的細胞(最終體積為約50μl/孔)。
制備cAMP標準物和檢測緩沖液(包含1μCi示蹤劑[125I]cAMP(50μl)至11ml檢測緩沖液)且根據制造商說明書維持。新鮮制備檢定緩沖液以用于篩檢且其含有50μl刺激緩沖液、3μl測試化合物(12μM最終檢定濃度)和50μl細胞。將檢定緩沖液儲存于冰上直至使用。通過加入50μl cAMP標準物至適當孔中，隨后加入50μl PBSA至孔H-11和H12中來起始檢定，其優選(例如)在96孔培養盤中進行。將50μl刺激緩沖液加入所有孔中。使用能夠分配3μl化合物溶液的針頭組將DMSO(或所選候選化合物)加入適當孔中，最終檢定濃度為12μM測試化合物和100μl總檢定體積。接著將細胞加入孔中且在室溫下培育60分鐘。接著將100μl含有示蹤劑cAMP的檢測混合物加入孔中。接著將培養盤培育額外2小時，隨后在Wallac MicroBeta閃爍計數器中計數。接著，由內含于各檢定盤中的標準cAMP曲線外推cAMP/孔的值。
3.用于Gi偶合目標GPCR的基于細胞的cAMPTSHR是使得cAMP在激活后積聚的Gs偶合GPCR。TSHR將通過突變氨基酸殘基623(意即將丙氨酸殘基改變為異白氨酸殘基)而得以組成性激活。預期Gi偶合受體會抑制腺苷酰基環化酶，且因此降低cAMP產生水平，其可使得cAMP水平的評定具有挑戰性。測量指示Gi偶合受體的激活作用的cAMP產生的降低的有效技術可通過最佳以連接Gi的目標GPCR將非內源組成性激活TSHR(TSHR-A623I)(或內源組成性活性Gs偶合受體)共轉染為“信號強化子”以創建cAMP的基線含量來實現。在產生Gi偶合受體的非內源型式后，接著以信號強化子共轉染目標GPCR的所述非內源型式，且正是所述物質可用于篩檢。所述方法可用于當使用cAMP檢定時有效產生信號。在一些實施例中，此方法優選用于直接鑒別抗Gi偶合受體的候選化合物。應注意當使用此方法時，對于Gi偶合GPCR而言，目標GPCR的反向激動劑將增加cAMP信號且激動劑將降低cAMP信號。
第1天，每個孔中將涂板2×104個293細胞。第2天，制備兩個反應管(各管所遵循的比例是對于每個培養盤而言)通過在1.2ml無血清DMEM(Irvine Scientific，Irvine，CA)中混合轉染至哺乳動物細胞中的各受體的2μgDNA(總共為4μgDNA(例如pCMV載體；具有突變THSR(TSHR-A623I)、TSHR-A623I和GPCR等的pCMV載體))來制備管A；通過在1.2ml無血清DMEM中混合120μl脂質轉染劑(Gibco BRL)來制備管B。接著通過倒轉(數次)混合管A和B，隨后在室溫下培育30-45分鐘。所述混合物被稱為“轉染混合物”。用1×PBS洗滌經涂板293細胞，隨后加入10ml無血清DMEM。接著，將2.4ml轉染混合物加入細胞中，隨后在37℃/5％CO2下培育4小時。接著，通過抽吸來移除轉染混合物，隨后加入25ml DMEM/10％胎牛血清。接著，在37℃/5％CO2下培育細胞。在培育24小時后，接著采集細胞且用于分析。
針對基于細胞的檢定設計Flash PlateTM腺苷酰基環化酶試劑盒(New EnglandNuclear，目錄號SMP004A)，但可視熟練技術人員需要對其進行修飾以用于粗質膜。FlashPlate孔將含有閃爍涂層，所述閃爍涂層也含有識別cAMP的特異性抗體。孔中所產生的cAMP可通過對放射性cAMP示蹤劑與cAMP抗體的結合進行直接競爭來量化。下文充當用于測量表達受體的全細胞中cAMP水平變化的簡要實驗方案。
在短暫轉染后大約24小時采集經轉染細胞。小心吸出培養基且丟棄。將10ml PBS緩慢加入各細胞培養皿中，隨后小心抽吸。將1ml Sigma細胞解離緩沖液和3ml PBS加入各培養盤中。自培養盤中吸出細胞且將細胞懸浮液收集到50ml錐形離心管中。接著，在室溫下將細胞以1,100rpm離心5分鐘。將細胞小球小心地再懸浮于適當體積的PBS(約3ml/培養盤)中。接著使用血球計數器對細胞計數且加入額外PBS以得到適當數目的細胞(最終體積為約50μl/孔)。
制備cAMP標準物和檢測緩沖液(包含1μCi示蹤劑[125I]cAMP(50μl)至11ml檢測緩沖液)且根據制造商說明書維持。應新鮮制備檢定緩沖液以用于篩檢且其含有50μl刺激緩沖液、3μl測試化合物(12μM最終檢定濃度)和50μl細胞。檢定緩沖液可儲存于冰上直至使用。可通過加入50μl cAMP標準物至適當孔中，隨后加入50μl PBSA至孔H1和H12中來起始檢定。加入50μl刺激緩沖液至所有孔中。使用能夠分配3μl化合物溶液的針頭組將所選化合物(例如TSH)加入適當孔中，最終檢定濃度為12μM測試化合物和100μl總檢定體積。接著將細胞加入孔中且在室溫下培育60分鐘。接著將100μl含有示蹤劑cAMP的檢測混合物加入孔中。接著將培養盤培育額外2小時，隨后在Wallac MicroBeta閃爍計數器中計數。接著由內含于各檢定盤中的標準cAMP曲線外推cAMP/孔的值。
4.基于報導子的檢定CRE-LUC報導子檢定(Gs相關受體)將293和293T細胞以每孔2×104個細胞的密度涂板于96孔培養盤上且在后一天根據制造商說明書使用脂質轉染試劑(BRL)進行轉染。如下制備用于各6孔轉染的DNA/脂質混合物將100μlDMEM中的260ng質粒DNA與100μl DMEM中的2μl脂質緩慢混合(260ng質粒DNA是由200ng 8×CRE-LUC報導子質粒、50ng包含內源受體或非內源受體的pCMV或單獨pCMV和10ng GPRS表達質粒(pcDNA3(Invitrogen)中的GPRS)組成)。如下制備8×CRE-Luc報導子質粒通過在pβgal-Basic載體(Clontech)中的BglV-HindIII位點處克隆大鼠生長激素抑制素啟動子(-71/+51)來獲得載體SRIF-β-gal。通過PCR自腺病毒模板AdpCF126CCRE8獲得八個(8)cAMP應答元件的拷貝(參見Suzuki等人，Hum Gene Ther(1996)71883-1893，其揭示內容以全文引用的方式并入本文中)且將其在Kpn-BglV位點處克隆于SRIF-β-gal載體中，從而得到8×CRE-β-gal報導子載體。通過用獲自pGL3-basic載體(Promega)的熒光素酶基因在HindIII-BamHI位點處替代8×CRE-β-gal報導子載體中的β-半乳糖苷酶基因來產生8×CRE-Luc報導子質粒。在室溫下培育30分鐘后，用400μl DMEM稀釋DNA/脂質混合物且將100μl經稀釋混合物加入各孔中。在細胞培養物培育箱中培育4小時后，將含有10％FCS的100μl DMEM加入各孔中。后一天，用含有10％FCS的200μl/孔DMEM交換經轉染細胞。八(8)小時后，用PBS洗滌一次，隨后將孔換成100μl/孔無酚紅的DMEM。第2天使用LucLiteTM報導子基因檢定試劑盒(Packard)，根據制造商說明書來測量熒光素酶活性且在1450 MicroBetaTM閃爍和發光計數器(Wallac)上讀取。
b.AP1報導子檢定(Gq相關受體)檢測Gq刺激的方法視Gq依賴性磷脂酶C引起在啟動子內含有AP1元件的基因的激活作用的已知特性而定。可根據上文關于CREB報導子檢定所述的實驗方案使用PathdetectTMAP-1順式報導系統(Stratagene，目錄號219073)，其例外為磷酸鈣沉淀物的組份為410ng pAP1-Luc、80ng pCMV-受體表達質粒和20ng CMV-SEAP。
c.SRF-LUC報導子檢定(Gq相關受體)一種檢測Gq刺激的方法視Gq依賴性磷脂酶C引起在啟動子內含有血清應答因子的基因的激活作用的已知特性而定。PathdetectTMSRF-Luc-報導系統(Stratagene)可用于檢定(例如)COS7細胞中的Gq偶合活性。根據制造商說明書使用MammalianTransfectionTM試劑盒(Stratagene，目錄號#200285)，以系統的質粒組份和編碼內源或非內源GPCR的指定表達質粒轉染細胞。簡言之，根據制造商說明書在磷酸鈣沉淀物中組合410ng SRF-Luc、80ng pCMV-受體表達質粒和20ng CMV-SEAP(經分泌的堿性磷酸酶表達質粒；在經轉染細胞的培養基中測量堿性磷酸酶活性以控制樣品之間的轉染效率變化)。將一半沉淀物均等地分布于96孔培養盤中的3個孔上，在無血清培養基中的細胞上維持24小時。在最后5小時將細胞與(例如)1μM測試化合物一起培育。接著溶解細胞且根據制造商說明書使用LucliteTM試劑盒(Packard，目錄號6016911)和“Trilux1450 Microbeta”液體閃爍和發光計數器(Wallac)檢定熒光素酶活性。可使用GraphPadPrismTM2.0a(GraphPad Software Inc.)分析資料。
胞內IP3積聚檢定(Gq相關受體)第1天，可將包含受體(內源或非內源)的細胞涂板于24孔培養盤上，通常為1×105個細胞/孔(但此數目可經優化)。第2天，可通過首先在50μl無血清DMEM/孔中混合0.25μgDNA且在50μl無血清DMEM/孔中混合2μl脂質轉染劑來轉染細胞。緩慢混合溶液且在室溫下培育15-30分鐘。用0.5ml PBS洗滌細胞且將400μl無血清培養基與轉染培養基混合并加入細胞中。接著將細胞在37℃/5％CO2下培育3-4小時，且接著移除轉染培養基并用1ml/孔的常規生長培養基替換。第3天，用3H-肌醇標記細胞。簡言之，移除培養基且用0.5ml PBS洗滌細胞。接著，向0.5ml無肌醇/無血清培養基(GIBCOBRL)/孔中加入0.25μCi3H-肌醇/孔且將細胞在37℃/5％CO2下培育16-18小時。第4天，用0.5ml PBS洗滌細胞且加入0.45ml檢定培養基(其含有無肌醇/無血清培養基、10μM帕吉林(pargyline)、10mM氯化鋰)或0.4ml檢定培養基以及50μl 10×酮色林(ketanserin，ket)直至最終濃度為10μM。接著將細胞在37℃下培育30分鐘。接著用0.5ml PBS洗滌細胞且每孔加入200μl新鮮/冰冷終止溶液(1 M KOH；18mM硼酸鈉；3.8mM EDTA)。將溶液在冰上維持5-10分鐘或直至細胞溶解，且接著用200μl新鮮/冰冷中和溶液(7.5％HCl)中和。接著將溶胞物轉移至1.5ml eppendorf管中且每管加入1ml氯仿/甲醇(1∶2)。將溶液渦旋15秒且將上層相施加于Biorad AG1-X8TM陰離子交換樹脂(100-200目)。首先，用水以1∶1.25W/V洗滌樹脂且將0.9ml上層相裝載至管柱上。用10ml 5mM肌醇和10ml 5mM硼酸鈉/60mM甲酸鈉洗滌管柱。將三磷酸肌醇洗提到含有10ml閃爍混合液的閃爍瓶中，所述閃爍混合液含有2ml 0.1M甲酸/1M甲酸銨。通過用10ml 0.1M甲酸/3M甲酸銨洗滌來再生管柱且用雙蒸水沖洗兩次，并在4℃下儲存于水中。
實例5融合蛋白制備a.GPCRGs融合構筑體可如下實現GPCR-G蛋白融合構筑體的設計對大鼠G蛋白Gsα(長形式；Itoh，H.等人，83 PNAS 3776(1986))的5’和3’端進行基因工程設計以在其上包括HindIII(5’-AAGCTT-3’)序列。在確認正確序列(包括側接HindIII序列)之后，通過使用所述載體的HindIII限制位點進行亞克隆而使完整序列穿梭于pcDNA3.1(-)(Invitrogen，目錄號V795-20)中。在亞克隆到pcDNA3.1(-)中之后確定Gsα序列的正確定位。接著校驗在HindIII序列處含有大鼠Gsα基因的經修飾pcDNA3.1(-)，此載體現可用作“通用”Gsα蛋白載體。pcDNA3.1(-)載體在HindIII位點上游含有多種熟知限制位點，因此有益地提供在Gs蛋白上游插入內源組成性活性GPCR的編碼序列的能力。此相同方法可用于產生其它“通用”G蛋白載體，且當然可使用技術人員已知的其它市售或專利載體-重要標準為GPCR的序列在上游且與G蛋白的序列同框。
Gq(6個氨基酸缺失)/Gi融合構筑體可如下實現Gq(del)/Gi融合構筑體的設計Gαq亞單元的N末端六個(6)氨基酸(氨基酸2-7，具有TLESIM的序列)將缺失且具有序列EYNLV的C末端五個(5)氨基酸將由Gαi蛋白的具有序列DCGLF的相應氨基酸替代。使用以下引物和作為模板的質粒63313，通過PCR獲得此融合構筑體5′-gatcAAGCTTCCATGGCGTGCTGCCTGAGCGAGGAG-3′(SEQ ID NO9)和5′-gatcGGATCCTTAGAACAGGCCGCAGTCCTTCAGGTTCAGCTGCAGGATGGTG-3′(SEQ ID NO10)，所述質粒63313含有具有血球凝集素標簽的小鼠Gαq野生型型式。包括小寫形式的核苷酸，其為間隔物。
使用TaqPlus Precision DNA聚合酶(Stratagene)，通過以下循環進行擴增，其中步驟2至4重復35次95℃，2分鐘；95℃，20秒；56℃，20秒；72℃，2分鐘；和72℃，7分鐘。將PCR產物克隆到pCRII-TOPO載體(Invitrogen)中且使用ABI Big DyeTerminator試劑盒(P.E.Biosystems)測序。通過兩步克隆方法使含有融合構筑體序列的來自TOPO克隆的插入物穿梭于HindIII/BamHI位點處的表達載體pcDNA3.1(+)中。另外參見2002年9月6日作為WO02068600出版的PCT申請案第PCT/US02/05625號，其揭示內容以全文引用的方式并入本文中。
實例6 GTPγS檢定A.膜制備在一些實施例中，包含所關注的目標GPCR且用于鑒別作為(例如)反向激動劑、激動劑或拮抗劑的候選化合物的膜優選如下進行制備a.物質“膜刮擦緩沖液”包含20mM HEPES和10mM EDTA(pH 7.4)；“膜洗滌緩沖液”包含20mM HEPES和0.1mM EDTA(pH 7.4)；“結合緩沖液”包含20mM HEPES、100mMNaCl和10mM MgCl2(pH 7.4)。
b.程序在整個程序中，所有物質都保持在冰上。首先，自長滿單層細胞抽吸培養基，隨后用10ml冷PBS沖洗，隨后抽吸。其后，將5ml膜刮擦緩沖液加入刮擦細胞中；此后將細胞提取物轉移到50ml離心管中(在4℃下以20,000rpm離心17分鐘)。其后，抽吸上清液且將離心塊再懸浮于30ml膜洗滌緩沖液中，隨后在4℃下以20,000rpm離心17分鐘。接著抽吸上清液且將離心塊再懸浮于結合緩沖液中。接著，使用BrinkmanPolytronTM均化器(15-20秒沖撞，直至所有物質都呈懸浮液形式)將其均質化。其在本文中被稱作“膜蛋白”。
Bradford蛋白檢定在均質化之后，使用Bradford蛋白檢定來測定膜的蛋白濃度(蛋白可稀釋至約1.5mg/ml，等分且冷凍(-80℃)以供隨后使用；當冷凍時，所用實驗方案如下在檢定當天，在室溫下將冷凍膜蛋白解凍，隨后渦旋且接著用Polytron以約12×1,000rpm均質化約5-10秒；應注意對于多個制劑而言，均化器應在不同制劑的均質化之間徹底清潔)。
a.物質根據制造商說明書(Biorad，目錄號500-0006)使用結合緩沖液(根據上文)、Bradford染料試劑、Bradford蛋白標準物。
b.程序制備雙重復管，一只管包括膜且另一只作為對照“空白”。各自含有800μl結合緩沖液。其后，將10μl Bradford蛋白標準物(1mg/ml)加入各管中，且接著將10μl膜蛋白加入剛才那只管(非空白)中。其后，將200μl Bradford染料試劑加入各管中，隨后各自渦旋。五(5)分鐘后，將管再渦旋且將其中的物質轉移至比色皿中。接著使用CECIL3041分光光度計在波長595下讀取比色皿。
鑒別檢定
a.物質GDP緩沖液是由37.5ml結合緩沖液和2mg GDP(Sigma，目錄號G-7127)組成，隨后在結合緩沖液中連續稀釋以獲得0.2μM GDP(各孔中的GDP最終濃度為0.1μMGDP)；包含候選化合物的各孔具有200μl最終體積，其由100μl GDP緩沖液(最終濃度0.1μM GDP)、50μl結合緩沖液中的膜蛋白和50μl結合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6nM)(每10ml結合緩沖液2.5μl[35S]GTPγS)組成。
b.程序優選使用96孔培養盤格式篩檢候選化合物(其可在-80℃下冷凍)。短暫均質化膜蛋白(或具有排除目標GPCR的表達載體的膜，其作為對照物)，直至呈懸浮液形式。接著使用上文所述的Bradford蛋白檢定來測定蛋白濃度。接著，將膜蛋白(和對照物)在結合緩沖液(最終檢定濃度，12.5μg/孔)中稀釋至0.25mg/ml。其后，將100μl GDP緩沖液加入Wallac ScintistripTM(Wallac)的各孔中。接著，使用5μl針頭組將5μl候選化合物轉移至所述孔中(意即200μl總檢定體積中的5μl為1∶40比率，使得候選化合物的最終篩檢濃度為10μM)。為避免污染，在各轉移步驟之后，針頭組應在包含水(1×)、乙醇(1×)和水(2×)的三個儲槽中再次清洗-在各清洗之后應自針頭組振蕩出過量液體且以紙和kimwipe干燥。其后，將50μl膜蛋白加入各孔(也使用包含不含目標GPCR的膜的對照孔)中，且在室溫下預培育5-10分鐘。其后，將50μl結合緩沖液中的[35S]GTPγS(0.6nM)加入各孔中，隨后在振蕩器上在室溫下培育60分鐘(在此實例中，再次用箔片覆蓋培養盤)。接著，通過在22℃下以4000RPM旋轉培養盤15分鐘來終止檢定。接著以8通道歧管抽吸所述培養盤且用培養盤覆蓋物密封。接著使用設定“Prot.#37”(根據制造商說明書)在Wallac 1450上讀取培養盤。
實例7環狀AMP檢定通過使用基于環化酶的檢定來實現鑒別(例如)作為反向激動劑、激動劑或拮抗劑的候選化合物的另一檢定方法。除直接鑒別外，此檢定方法也可用作獨立方法以提供對來自上文實例6中所述的[35S]GTPγS方法的結果的確認。
根據以下實驗方案，經修飾Flash PlateTM腺苷酰基環化酶試劑盒(New EnglandNuclear，目錄號SMP004A)優選用于直接鑒別作為內源或非內源組成性激活GPCR的反向激動劑和激動劑的候選化合物。
在轉染后大約3天，采集經轉染細胞。通過在含有20mM HEPES(pH 7.4)和10mMMgCl2的緩沖液中均質化懸浮細胞來制備膜。使用Brinkman PolytronTM在冰上進行大約10秒均質化。將所得勻漿在4℃下以49,000×g離心15分鐘。接著將所得離心塊再懸浮于含有20mM HEPES(pH 7.4)和0.1mM EDTA的緩沖液中，均質化10秒，隨后在4℃下以49,000×g離心15分鐘。接著將所得離心塊儲存于-80℃下直至使用。在直接鑒別篩檢當天，將膜離心塊在室溫下緩慢解凍，再懸浮于含有20mM HEPES(pH 7.4)和10mMMgCl2的緩沖液中以得到0.60mg/ml的最終蛋白濃度(將再懸浮膜置于冰上直至使用)。
制備cAMP標準物和檢測緩沖液(包含2μCi示蹤劑[125I]cAMP(100μl)至11ml檢測緩沖液)且根據制造商說明書維持。新鮮制備檢定緩沖液以用于篩檢且其含有20mM HEPES(pH 7.4)、10mM MgCl2、20mM磷酸肌酸(Sigma)、0.1單位/毫升肌酸磷酸激酶(Sigma)、50μM GTP(Sigma)和0.2mM ATP(Sigma)；接著將檢定緩沖液儲存于冰上直至使用。
優選將候選化合物連同40μl膜蛋白(30μg/孔)和50μl檢定緩沖液加入(例如)96孔培養盤的孔中(3μl/孔；12μM最終檢定濃度)。接著，在緩慢振蕩下在室溫下培育此混合物30分鐘。
在培育后，向各孔中加入100μl檢測緩沖液，隨后培育2-24小時。接著，使用“Prot.#31”(根據制造商說明書)在Wallac MicroBetaTM培養盤讀取器上對培養盤計數。
以實例說明而非限制，在圖1中呈現所獲得的說明性篩檢檢定盤(96孔格式)結果。各條形表示在各孔中不同的化合物的結果，“目標GPCR”為與GPR131無關的內源組成性活性Gs偶合GPCR的Gsα融合蛋白構筑體。圖1中所呈現的結果也提供基于各培養盤的平均結果(“m”)的標準偏差，且平均值加兩個自初步篩檢選擇作為“主導物”的反向激動劑的任意優選項包括通過平均培養盤應答減去兩個標準偏差而選擇減少應答百分比的候選化合物。相反地，自初步篩檢選擇作為“主導物”的激動劑的任意優選項包括通過至少平均培養盤應答加上兩個標準偏差而選擇增加應答百分比的候選化合物。基于這些選擇方法，將下列孔中的候選化合物分別直接鑒別為孔A2和G9中的所述內源GPCR的假定反向激動劑(化合物A)和激動劑(化合物B)。參見圖1。出于清晰性應注意已在無任何關于此GPCR的內源配體的知識的情況下直接鑒別這些化合物。通過致力于基于受體功能而非化合物結合親和力的檢定技術，可能確定能夠降低此受體的功能活性(化合物A)以及增加受體的功能活性(化合物B)的化合物。
實例8測量胞內鈣濃度的熒光成像板讀取器(FLIPR)檢定將來自各別克隆株的經目標受體(實驗性)和pCMV(陰性對照)穩定轉染的細胞以5.5×104個細胞/孔接種至具有完全培養基(含有10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸鈉的DMEM)的經聚-D-賴氨酸預處理的96孔培養盤(Becton-Dickinson，#356640)中以用于在第2天檢定。為制備Fluo4-AM(Molecular Probe，#F14202)培育緩沖液儲液，將1mg Fluo4-AM溶解于467μl DMSO和467μl泊洛尼克酸(Pluronic acid)(Molecular Probe，#P3000)中以得到1mM儲備溶液，其可在-20℃下儲存1個月。Fluo4-AM為熒光鈣指示染料。
在洗滌緩沖液(1×HBSS/2.5mM丙磺舒(Probenicid)/20mM HEPES(pH 7.4))中制備候選化合物。
在檢定時，自孔中移除培養基且以100μl的4μM Fluo4-AM/2.5mM丙磺舒(Sigma，#P8761)/20mM HEPES/完全培養基(pH 7.4)裝載細胞。在37℃/5％CO2下使培育進行60分鐘。
培育1小時后，移除Fluo4-AM培育緩沖液且用100μl洗滌緩沖液將細胞洗滌兩次。在各孔中留下100μl洗滌緩沖液。將培養盤送回到培育箱中，在37℃/5％CO2下歷時60分鐘。
對FLIPR(熒光成像板讀取器；Molecular Device)設定程式以在第30秒加入50μl候選化合物且記錄由候選化合物引起的胞內鈣濃度([Ca2+])短暫變化，歷時另外150秒。使用FLIPR軟件，使用總熒光變化計數來確定激動劑活性。儀器軟件標準化熒光讀數以得到零點的等效起始讀數。
在一些實施例中，包含目標受體的細胞進一步包含Gα15、Gα16或嵌合Gq/Giα亞單元。
雖然上文提供使用穩定轉染細胞進行的用于激動劑活性的FLIPR檢定，但一般技術人員應能夠易于修改所述檢定以便表征拮抗劑活性。所述一般技術人員也應易于了解可替代性地使用經短暫轉染的細胞。
實例9MAP激酶檢定可監測MAP激酶(由促細胞分裂劑激活的激酶)以評估受體激活作用。可以數種方法檢測MAP激酶。一種方法是基于對未經磷酸化(無活性)或經磷酸化(活性)的磷酸化狀態的評估。經磷酸化蛋白在SDS-PAGE中具有較低移動力且因此可使用Western印跡法與未經刺激的蛋白相比較。或者，可使用經磷酸化蛋白的特異性抗體(NewEngland Biolabs)，其可用于檢測經磷酸化激酶的增加。在任一方法中，以測試化合物刺激細胞且接著用Laemmli緩沖液提取。將可溶性部分施加于SDS-PAGE凝膠且以電泳法將蛋白轉移至硝酸纖維素或Immobilin中。以標準Western印跡技術檢測免疫反應帶。在薄膜上記錄可見或化學發光信號且可通過密度測定法量化。
另一方法是基于經由磷酸化檢定對MAP激酶活性的評估。以測試化合物刺激細胞且制備可溶性提取物。在30℃下將提取物與γ-32p-ATP、ATP再生系統和MAP激酶的特異性底物(諸如由胰島素調節的磷酸化熱穩定和酸穩定蛋白或PHAS-I)一起培育10分鐘。通過加入H3PO4來終止反應且將樣品轉移至冰上。將等分試樣點漬于Whatman P81色譜紙上，其保留磷酸化蛋白。洗滌色譜紙且在液體閃爍計數器中計數32P。或者，將細胞提取物與γ-32p-ATP、ATP再生系統和由抗生蛋白鏈菌素結合至過濾器支撐物的生物素基化髓磷脂堿性蛋白一起培育。髓磷脂堿性蛋白為激活MAP激酶的底物。使磷酸化反應在30℃下進行10分鐘。接著，可經由過濾器抽吸提取物，所述過濾器保留磷酸化髓磷脂堿性蛋白。洗滌過濾器且通過液體閃爍計數法計數32p。
實例10黑素細胞技術黑素細胞為在低等脊椎動物中所發現的皮膚細胞。其含有被稱為黑素體的著色細胞器。黑素細胞能夠在G蛋白偶合受體(GPCR)激活后沿微管網絡再分布這些黑素體。此色素移動的結果為細胞明顯變亮或變暗。在黑素細胞中，由Gi偶合受體的激活作用引起的胞內cAMP水平降低會引起黑素體向細胞中心遷移，從而導致顏色顯著變亮。如果在Gs偶合受體激活之后接著升高cAMP水平，則黑素體再分散且細胞再次變暗。由Gq偶合受體的激活作用引起的二酰甘油含量的增加也可誘發此再分散作用。此外，所述技術也適于研究某些受體酪氨酸激酶。黑素細胞的應答在受體激活的數分鐘內發生且在樣品中導致強烈顏色變化。使用常規吸光度微板讀取器或合適影像成像系統可易于檢測應答。不同于其它皮膚細胞，黑素細胞來源于神經脊且似乎表達信號轉導蛋白的完全互補體。詳言之，所述細胞表達各種G蛋白且因此能夠功能性地表達幾乎所有GPCR。
黑素細胞可用于鑒別抗GPCR的化合物，包括天然配體。此方法也可通過引入應答特定刺激而能夠分散或聚集色素的色素細胞株的測試細胞且表達編碼GPCR的外源克隆來進行。刺激劑(例如褪黑激素)設定色素沉積的初始狀態，其中如果GPCR的激活作用誘發色素分散，則色素在測試細胞內聚集。然而，用刺激劑刺激細胞以設定色素沉積的初始狀態，其中如果GPCR的激活誘發色素積聚，則色素得以分散。接著以化合物接觸測試細胞，且確定細胞中的色素沉積是否自色素沉積的初始狀態變化而來。由候選化合物(包括(但不限于)配體)與GPCR的偶合引起的色素細胞沉積將在培養皿上變暗，同時色素細胞積聚將變亮。
遵循根據美國專利第5,462,856號和美國專利第6,051,386號的揭示內容的物質和方法。這些專利揭示內容以全文引用的方式并入本文中。
例如，將細胞涂板于96孔培養盤中(每個培養盤一種受體)。轉染后48小時，用10nM褪黑激素處理各培養盤上的一半細胞。褪黑激素激活黑素細胞中的內源Gi偶合受體且引起黑素細胞積聚其色素。將剩余一半細胞轉移至無血清培養基0.7XL-15(Gibco)中。1小時后，無血清培養基中的細胞仍保持色素分散狀態，而經褪黑激素處理的細胞則呈色素積聚狀態。此時，用劑量回應的測試/候選化合物處理細胞。如果經涂板GPCR結合至測試/候選化合物，則預期黑素細胞將應答所述化合物而經歷顏色變化。如果受體為Gs或Gq偶合受體，則褪黑激素積聚的黑素細胞將經歷色素分散。相反，如果受體為Gi偶合受體，則預期色素分散的細胞將經歷劑量依賴性色素積聚。
實例11人類和小鼠RUP43的組織分布通過RT-PCR來詢問人類和小鼠脂肪細胞和骨骼肌細胞的RUP43表達。人類白血球子集的RUP43表達是通過TaqMan RT-PCR來詢問。
a.
人類前成脂肪細胞購自Biowhirtaker且允許保持不分化或經歷分化。人類分化脂肪細胞購自Zen Bio。由所述未分化或分化人類脂肪細胞制備RNA且將其轉化為cDNA。接著執行RT-PCR以使用以下特異性引物來詢問RUP43的表達5′-CTACCTGTACCTCGAAGTCTA-3′(正義引物；SEQ ID NO11)和5′-AGTGGCGGGCGCTGCTCAT-3′(反義引物；SEQ ID NO12)。
所用循環條件為94℃，2分鐘；94℃，15秒；55℃，30秒；和72℃，1分鐘，最后3個步驟歷經35個循環。發現RUP43由分化人類脂肪細胞內源性表達且在較少程度上由人類前成脂肪細胞表達(圖2A)。
b.
如上文[a]所述，通過RT-PCR來詢問人類皮下(“Sub Q”)和內臟脂肪的RUP43表達。皮下脂肪樣品獲自BMI在19至35的范圍內的10個個體。內臟脂肪樣品獲自BMI在19至45的范圍內的8個個體。使用甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶(GAPDH)的RT-PCR來顯示樣品的相當負載。發現人類RUP43在皮下和內臟脂肪中內源性表達(圖2B)。
c.
使小鼠3T3L1細胞保持未分化或經歷分化。由未分化3T3L1細胞、分化3T3L1細胞或小鼠骨骼肌細胞制備RNA。在逆轉錄酶存在(“+”)或不存在(“-”)下，執行將RNA轉化為cDNA。接著使用以下特異性引物執行RT-PCR以詢問RUP43的表達
5′-TGAGCTGTCGGCCATTCCCAT-3′(正義引物；SEQ ID NO13)和5′-GATTGTCCCTCTTGGCTCTTC-3′(反義引物；SEQ ID NO14)。
所用循環條件為94℃，2分鐘；94℃，15秒；55℃，30秒；和72℃，1分鐘，最后3個步驟歷經35個循環。發現RUP43由分化小鼠3T3L1脂肪細胞表達且在較少程度上由未分化3T3L1脂肪細胞表達。也發現RUP43由小鼠骨骼肌細胞內源性表達(圖2C)。
d.
人類骨骼肌細胞獲自Cambrex。由骨骼肌細胞制備RNA且將其轉化為cDNA。作為陽性對照，使用如[a]所述由獲自Biowhittaker的人類脂肪細胞制備的cDNA。如[a]中所述執行RT-PCR。發現RUP43由骨骼肌細胞內源性表達，且如先前在[a]中所示由脂肪細胞表達(圖2D)。
實例12脂肪細胞分化小鼠3T3L1細胞的分化3T3L1生長培養基 1000mlDMEM 1000ml10％BCS 100mlL-谷氨酰胺，200mM10mlP/S 10ml3T3L1常規培養基 1000mlDMEM 1000ml10％FBS 100mlL-谷氨酰胺，200mM10mlP/S 10ml3T3L1誘導培養基 1000mlDMEM 1000ml10％FBS 100mlL-谷氨酰胺，200mM10mlP/S 10ml胰島素(10mg/ml) 1mlIBMax(10mg/ml) 11.1ml地塞米松(10mg/ml)328μl3T3L1胰島素唯一培養基1000mlDMEM 1000ml10％FBS 100mlL-谷氨酰胺，200mM10ml
P/S 10ml胰島素(10mg/ml) 1mlDMEMHYQ DEM/高葡萄糖，SH30081.01，500ml。SH30081.02，1000ml。
BCS小牛血清，Hyclone SH 30073.03FBS胎牛血清，Hyclone SH 30071.03L-谷氨酰胺，200mm，100×。Hyclone SH40003-11。
青霉素-鏈霉素，100ml Hyclone SV30010胰蛋白酶，HYQ，0.05％1×，SH30236.01 100ml。
HYQ DPBS/經修飾的1×SH30028.0，50ml。
以50％長滿接種3T3L1細胞，使得培養物第二天完全長滿。在細胞已達到100％長滿后2天，加入誘導培養基。2-5天后，將細胞轉換為胰島素唯一培養基。誘導后2-5天，將細胞返回至常規培養基中歷時2天，完成3T3L1細胞分化為脂肪細胞的過程。
b.人類前成脂肪細胞的分化以1×106個細胞/培養盤在24孔培養盤中接種購自Cambrex的人類前成脂肪細胞。2天后，當細胞達到100％長滿時，加入購自Cambrex的誘導培養基。將細胞在誘導培養基中培養10天，由此完成初代人類前成脂肪細胞分化為脂肪細胞的過程。
實例13人類骨骼肌細胞的分化在購自Cambrex的SKGM-2培養基中培養人類初代未分化骨骼肌細胞。當成骨骼肌細胞培養物達到50-70％長滿時，移除SKGM-2培養基，且加入融合培養基(補充有2％馬血清的DMEM-F12)。
使細胞在融合培養基中的培養繼續4-7天(每隔1天替換融合培養基)或直至在整個培養物中觀察到肌管。
觀察到所得分化培養物含有多核(3個以上核)肌管。
如果將肌管用于需要延長培養期的檢定中，則移除融合培養基且用SKGM-2培養基替換。為達到最佳性能，每隔1天替換SKGM-2培養基以將培養物維持2-3周。最佳使用肌管培養物至分化后2周。
實例14內源RUP43偶合至Gs通過比較經內源人類、小鼠或大鼠RUP43轉染的HEK293細胞與經模擬轉染的HEK293細胞(“pCMV”)中的胞內cAMP水平來詢問RUP43的Gs偶合。基本上根據制造商說明書使用具有125I作為示蹤劑(NEX130)的Perkin Elmer Flashplate試劑盒(SMP004B)，通過環化酶檢定來執行胞內cAMP水平的確定。
以1.2×107的密度涂板HEK 293細胞且使其粘附過夜。接著使用脂質轉染劑(每15cm培養皿120μg)，僅以pCMV轉染HEK293細胞，或以含有編碼內源人類、小鼠或大鼠RUP43的pCMV轉染細胞。使經轉染細胞恢復過夜。為進行檢定，采集經轉染細胞且將其以1×106個細胞的最終細胞計數加入flashplate孔中。使其粘附，接著使其經受示蹤劑歷時2小時。接著，抽吸所有孔且使用微板讀取器(Wallac 1450 microbeta計數器)對培養盤讀數。發現經RUP43轉染的HEK293細胞的胞內水平顯著高于經模擬轉染的細胞的胞內水平，說明RUP43證明組成性Gs偶合的可檢測水平(圖3)。
實例15鑒別作為RUP43激動劑的化合物1物質在所有檢定中使用獲自ATCC的HEK 293細胞。培養基由90ml補充有10％胎牛血清的DMEM(Gibco，BRL)組成。使用具有直接cAMP[125I]檢測系統的腺苷酰基環化酶激活(Adenylyl Cyclase Activation)Flashplate檢定，確定環狀AMP測量。
短暫轉染和全細胞環化酶Flashplate檢定將HEK 293細胞(5×105個細胞/ml)涂板于15cm培養皿中。第2天，如制造商所建議使用FuGENE 6試劑(Roche Applied Science)來轉染細胞。簡言之，將由OptiMEM(Gibco，BRL)和FuGENE 6試劑組成的轉染混合物混合在一起且使其在室溫下培育5分鐘。將轉染試劑逐滴加入含有2μg內源人類RUP43受體質粒(經轉染)或2μg空pCMV載體(模擬)的獨立管中，且使其在室溫下培育15分鐘。將DNA/轉染混合物逐滴加入各透視板且在保持37℃、95/5％O2/CO2的潮濕培育箱中培育過夜。第2天，用正常生長培養基替換所述培養基且將細胞培育過夜。
第3天，用PBS將細胞沖洗一次，且使用非酶促細胞解離緩沖液(Gibco，BRL)使其脫離培養盤，并使其以2×106個細胞/ml的密度再懸浮于檢定刺激緩沖液(PerkitiElmer)中以測量cAMP。相繼將化合物1或媒劑以2×所要最終濃度稀釋于刺激緩沖液中。將化合物1和媒劑(50μl/孔)加入96孔Flashplate(Perkin Elmer)的透視孔中。將經轉染或模擬細胞等分到各孔(50μl/孔)中且使其在室溫下在平板形式振蕩器上培育1小時。將檢測緩沖液(Perkin Elmer，100μL)加入各孔中且在室溫下培育2小時并同時攪拌。在2小時培育結束時，抽吸培養盤且使用Wallac 1450 microbeta計數器來確定cAMP水平。
發現化合物1以劑量依賴方式導致經內源人類RUP43轉染的HEK293細胞中胞內cAMP尤其增加，而經模擬轉染細胞中的胞內cAMP并未增加，由此鑒別化合物1為RUP43的激動劑(圖4)。
實例16鑒別作為RUP43激動劑的化合物2使用黑素細胞技術(上文實例10)，發現化合物2為內源人類RUP43的激動劑(圖5)。簡言之，使用胰蛋白酶(0.7×)自長滿燒瓶(T-185cm2燒瓶)采集黑素細胞且通過電穿孔將其轉染。將編碼內源人類RUP43的多核苷酸(30μg)用于轉染黑素細胞。電穿孔后，將細胞預涂于燒瓶中歷時大約3-4小時以去除不可活細胞和碎片。一旦完成，隨后使燒瓶胰蛋白酶化且一式三樣將其涂板于384孔經聚-D-賴氨酸涂覆的培養盤上以用于檢定。轉染后48小時，以分光光度計對檢定盤讀數(吸光度T0)。接著，以相繼稀釋的化合物#2(100μM-51.2pM，5倍稀釋，最終為0.5％DMSO)將細胞培育1小時且再次讀數(吸光度T60)。分析三重測定吸光度資料且將其描述為與陽性對照孔(200)和陰性對照孔(100)相比的對照應答百分比。曲線高度約為對照物的92％，EC50＝0.212μM。
實例17體外葡萄糖攝取檢定如本文所述來進行體外葡萄糖攝取檢定。
緩沖液和試劑饑餓培養基DMEM/具有0.5％BSA的高葡萄糖。
KRPH緩沖液5mM NaHPO4，pH7.4(每次使KRPH緩沖液新鮮)20mM Hepes.pH 7.41mM MgSO41mM CaCl2136mM NaCl4.7mM KCl1％BSA2-脫氧葡萄糖(DOG)儲液100mM16.4mg/ml在水中(在4℃下儲存1-2周)。
向各孔中加入1μl含1μCi[3H]-2-DOG和1μl冷儲液2-DOG以及2ml KRPH。
細胞松弛素B(CytoB)儲液(10mM在95％乙醇中)在-20℃下保存。
使用最終為10μM的CytoB來阻斷經載劑介導的攝取。最終也使用此濃度來終止反應。終止緩沖液為PBS加10μM CytoB(“PBS”)。
1％Triton-X此為溶解緩沖液。
將細胞涂板于24孔培養盤上。
程序1.使細胞饑餓至少2小時。
2.用KRPH緩沖液洗滌細胞2次且將2ml KRPH加入孔中。
3.用胰島素和/或測試化合物或媒劑(對照物)處理細胞20min。
4.20min后，自孔中抽吸緩沖液且立即加入1ml KRPH緩沖液加2-DOG。在攝取檢定前5min，向經CytoB處理的細胞中加入CytoB。
5.4min后，自孔中抽吸緩沖液且加入3ml冷PBS。在完成檢定后，在各孔中用冷PBS洗滌細胞2次。完全抽吸終止PBS，且接著加入700μl的1％Triton X。將其置于37℃培育箱中歷時30min。
6.對總溶胞物中的CPM計數。計算CPM/孔。
自關于經胰島素和/或測試化合物處理的各細胞和經媒劑(對照物)處理的各細胞所獲得的值減去CytoB值。
實例18化合物2刺激小鼠3T3L1脂肪細胞中的葡萄糖攝取用50μM化合物2處理分化的小鼠3T3L1脂肪細胞不同時間，其后根據實例17來測定葡萄糖攝取。根據圖6，顯然化合物2刺激3T3L1脂肪細胞中的葡萄糖攝取。結果表明RUP43激動劑是用于調節胰島素無法控制的高血糖癥中的葡萄糖水平的有吸引力的候選物。經刺激葡萄糖攝取的快速時程表明，RUP43激動劑可比當前可用于降低血糖濃度的藥物提供更快速的治療效果。
實例19化合物2增強小鼠3T3L1脂肪細胞中的經胰島素刺激的葡萄糖攝取在無血清培養基中，用(“化合物2”)或不用(“對照物”)化合物2處理分化的小鼠3T3L1脂肪細胞，歷時3小時。接著，用新鮮KRPH緩沖液洗滌3T3L1細胞兩次且用各種濃度的胰島素處理20min。用胰島素處理后，根據實例17來測定葡萄糖攝取。根據圖7，顯然化合物2增強3T3L1脂肪細胞中的經胰島素刺激的葡萄糖攝取。結果表明RUP43激動劑可增加胰島素功效，由此降低達成最大葡萄糖攝取所需的胰島素濃度。
實例20
化合物2刺激人類初代人類脂肪細胞中的葡萄糖攝取人類前成脂肪細胞(Cambrex)分化成脂肪細胞。在無血清培養基中，用或不用50μM化合物2處理分化的初代人類脂肪細胞，歷時3小時。接著，用新鮮KRPH緩沖液洗滌人類脂肪細胞兩次且用或不用100nM胰島素處理20min。用或不用胰島素處理后，根據實例17來測定葡萄糖攝取。根據圖8，顯然化合物2刺激初代人類脂肪細胞中的葡萄糖攝取。根據圖8，顯然化合物2也增強初代人類脂肪細胞中的經胰島素刺激的葡萄糖攝取。值得注意的是，如對小鼠3T3L1細胞所觀察，RUP43激動劑可在無胰島素存在的情況下刺激初代人類脂肪細胞中的葡萄糖攝取，且經RUP43刺激的葡萄糖攝取水平可與經胰島素刺激的葡萄糖攝取水平相當。
實例21化合物2刺激大鼠L6成肌細胞中的葡萄糖攝取自ATCC獲得大鼠骨骼肌L6成肌細胞且使其在24孔培養盤中生長至長滿。
a.
在無血清培養基中，用或不用各種濃度的化合物2處理長滿L6細胞歷時3小時。接著，用KRPH緩沖液洗滌L6細胞兩次。用KRPH緩沖液培育已經化合物2處理的L6細胞，歷時20分鐘；用10nM或100nM胰島素處理未經化合物2處理的L6細胞，歷時20分鐘。用或不用胰島素處理后，根據實例17來測定葡萄糖攝取。根據圖9A，顯然化合物2刺激大鼠L6成肌細胞中的葡萄糖攝取。RUP43激動劑可比胰島素刺激大鼠L6成肌細胞中的更多葡萄糖攝取。由于骨骼肌細胞對體內的80％葡萄糖處理負責，所以所獲得的結果表明RUP43激動劑是比胰島素提供更好體內葡萄糖處理的有吸引力的候選物。
b.
用50μM化合物2處理長滿L6成肌細胞不同時間。在各處理期結束時，根據實例17測定葡萄糖攝取。結果表明RUP43激動劑可在20分鐘內刺激骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取，此時限類似于胰島素的時限(圖9B)。結果表明RUP43激動劑是用于在可與胰島素時限相當的短期內調節體內葡萄糖水平的有吸引力的候選物。
實例22化合物2增強大鼠L6成肌細胞中的經胰島素刺激的葡萄糖攝取在無血清培養基中，用或不用50μM化合物2處理長滿大鼠L6成肌細胞，歷時3小時。接著，用新鮮KRPH緩沖液洗滌L6細胞兩次。接著，用或不用100nM胰島素處理L6細胞，歷時20分鐘。用或不用胰島素處理后，根據實例17來測定葡萄糖攝取。根據圖10，顯然類似于關于脂肪細胞的觀察，化合物2增強大鼠L6成肌細胞中的經胰島素刺激的葡萄糖攝取。結果進一步表明RUP43激動劑可增加胰島素功效，由此降低達成最大葡萄糖攝取所需的胰島素濃度。因此，RUP43代表患有高胰島素血癥引起的胰島素抗性相關問題的個體的有吸引力的治療選項。
實例23化合物2刺激初代人類骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取使獲自Cambrex的初代人類骨骼肌細胞生長至50％長滿且接著用誘導培養基使其在培養物中分化5至7天。接著，將分化的初代人類骨骼肌細胞轉移到生長培養基中，歷時7至10天。
a.
在無血清培養基中，用或不用各種濃度的化合物2處理分化的人類骨骼肌細胞，歷時3小時。在用或不用化合物2處理后，用新鮮KRPH緩沖液洗滌細胞兩次。接著，用KRPH緩沖液培育已經化合物2處理的細胞，歷時20分鐘；用10nM或100nM胰島素培育未經化合物2處理的細胞，歷時20分鐘。用或不用胰島素處理后，根據實例17來測定葡萄糖攝取。根據圖11A，顯然RUP43激動劑在無胰島素存在的情況下可刺激人類骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取且比胰島素更有效。所獲得的結果表明RUP43激動劑在刺激人類骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取時有效，其中發生80％的葡萄糖處理。所獲得的結果表明RUP43激動劑是用于控制胰島素作用難以治愈的高血糖癥中的葡萄糖水平的有吸引力的候選物。
b.
用50μM化合物2處理分化的人類骨骼肌細胞，歷時不同時期。在各處理期結束時，根據實例17來測定葡萄糖攝取。所獲得的結果呈現于圖11B中。關于RUP43激動劑所觀察到的人類骨骼肌細胞中的葡萄糖攝取的快速刺激作用表明，RUP43激動劑是直接且在短期內調節體內葡萄糖水平的有吸引力的候選物。
實例24口服生物可用性用于直接評估口服生物可用性的物理化學分析方法為所屬領域的技術人員所熟知，且可加以使用[例如(但不限于)參見Wong PC等人，Cardiovasc Drug Rev(2002)20137-52；和Buchan P等人，Headache(2002)Suppl 2S54-62；其揭示內容各自以全文引用的方式并入本文中]。以實例說明而非限制，所述替代分析方法可包含液相色譜-串連質譜[Chavez-Eng CM等人，J ChromatogrB Analyt Technol Biomed Life Sci(2002)767117-29；Jetter A等人，Clin Pharmacol Ther(2002)7121-9；Zimmerman JJ等人，J ClinPharmacol(1999)391155-61；和Barrish A等人，Rapid Commun Mass Spectrom(1996)101033-7；其揭示內容各自以全文引用的方式并入本文中]。近來，正電子發射斷層攝影法(PET)已成功用于在口服藥物之后獲得哺乳動物體內藥物分布(包括口服生物可用性)的直接測量[Gulyas等人，Eur J Nucl Med Mol Imaging(2002)291031-8；其揭示內容以全文引用的方式并入本文中]。
或者，基于所發展的體內資料，以實例26的小鼠模型作為實例來說明而非限制。通過口服管飼來投用劑量在0.1mg kg-1至100mg kg-1的范圍內的調節物。調節物的效果顯示為劑量依賴性且可與腹膜內投藥后的效果相當，其中所述效果為血糖濃度減少(實例26)。將通過口服達成有益效果的50％最大減少所需的調節物劑量與通過腹膜內投藥達成有益效果的50％最大減少所需的調節物劑量相比較。以實例說明，如果所述口服劑量為所述腹膜內劑量的兩倍，則調節物的口服生物可用性取為50％。更一般而言，如果所述口服劑量為θmg kg-1且所述腹膜內劑量為ρmg kg-1，則調節物的口服生物可用性百分比取為[(ρ/θ)×100]。
實例25血腦障壁模型使用獲自腦部的細胞可測定本發明化合物通過血腦障壁的能力。以實例說明而非限制，所構想的一種方法是使用Dehouck等人[J Neurochem(1990)541798-801；以全文引用的方式并入本文中]的血腦障壁模型，所述模型使用腦部毛細管內皮細胞和星形細胞的共培養物。
如Meresse等人所述[J Neurochem(1989)531363-1371；以全文引用的方式并入本文中]，分離并表征牛毛細管內皮(BBCE)細胞。簡言之，在通過機械均質化作用自牛腦部的一個半球分離之后，將微脈管接種到經牛角膜內皮細胞所分泌的胞外基質涂覆的培養皿上。在接種后5天，內皮細胞首先遷移出毛細管且開始形成微菌落。當菌落足夠大時，在補充有15％小牛血清(Seromed)、3mM谷氨酰胺、50μg/ml慶大霉素、2.5μg/ml兩性霉素B(Fungizone)和牛纖維母細胞生長因子(每隔1天加入1ng/ml)的杜氏培養基(Dulbecco′s modified Eagle′s medium，DMEM)存在下使5個最大小島胰蛋白酶化且將其接種到35mm直徑的涂覆有明膠的培養皿(每個培養皿1個克隆)上。在長滿時，自一個35mm直徑培養皿采集內皮細胞且將其接種到60mm直徑的涂覆有明膠的培養皿上。6-8天后，以1∶20的分裂比率傳代培養長滿細胞。將第3代繼代移種的細胞(約100個培養皿)儲存在液氮中。
由新生大鼠大腦皮層制得星形細胞的初代培養物。在已清除腦脊膜后，如Booher和Sensenbrenner[Neurobiology(1972)297-105；以全文引用的方式并入本文中]所述輕輕壓迫腦組織使其通過尼龍篩。將補充有10％胎牛血清(Seromed)、2mM谷氨酰胺和50μg/ml慶大霉素的DMEM用于解離腦組織且發育星形細胞。
將培養盤插入物(Millicell-CM；孔徑，0.4μM；直徑，30mm；Millipore)涂覆于通過修飾Bornstein方法[Lab Invest(1958)7134-139；以全文引用的方式并入本文中]所制備的大鼠尾部膠原蛋白的兩側。
使用倒置過濾器，以2.5×105個細胞/ml的濃度將星形細胞涂于底部。8天后，將過濾器正置，且每周替換兩次培養基。接種后3周，星形細胞的培養物變得穩定。接著，在60mm直徑的涂覆有明膠的培養皿上再培養冷凍的第3代BBCE細胞。使長滿細胞胰蛋白酶化且以4×105個細胞的濃度將其涂于過濾器的上部。用于共培養的培養基是補充有15％小牛血清、2mM谷氨酰胺、50μg/ml慶大霉素和每隔1天加入的1ng/ml牛纖維母細胞生長因子的DMEM。在這些條件下，BBCE細胞在8天內形成長滿單層。
將培養盤設定為6孔培養盤，其中將2ml緩沖液加入上部腔室且將2ml加入含有插入物的培養盤上。將6孔培養盤置于37℃的振蕩水浴中。將本發明化合物加入上部腔室，且在各時間點自下部腔室移除100μl。在某些實施例中，測試化合物經放射性標記。在某些實施例中，放射性標記為3H或14C。在一些實施例中，最終時間點為約20min、約30min、約40min、約50min、約60min、約70min、約80min或約90min。測定在各時間點存在于下部腔室中的總測試化合物的百分比。將白氨酸用作滲透性陽性對照。將菊糖用作滲透性陰性對照。
在某些實施例中，在最終時間點測定至少約10％、至少約20％、至少約30％、至少約40％、至少約50％、至少約60％、至少約70％、至少約80％或至少約90％的本發明化合物存在于下部腔室中，表明本發明化合物能夠通過血腦障壁。
實例26RUP43激動劑對大鼠中的葡萄糖穩定狀態的體內影響A.大鼠中的口服葡萄糖耐受性測試(oGTT)。
使10周齡的雄性Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠(Charles River)禁食18小時且將其隨機分組(n＝11)以接收各種劑量的RUP43激動劑，或接收已知增加胰島素敏感性的對照物羅格列酮(rosiglitazone)(RSG，10mg/kg)。經腹膜內傳遞RUP43激動劑。經腹膜內傳遞RSG。RUP43激動劑的優選劑量為0.1-100mg/kg。其它優選劑量選自由下列各量組成的群組0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg。使安慰劑組服用媒劑。
在投用測試化合物和對照物RSG后30分鐘，使大鼠口服2g/kg劑量的右旋糖。使用Glucometer Elite XL(Bayer)，在各時間點測定血糖水平。將右旋糖投用時間取為“0min”，例示性時間點為-30min、0min、30min、60min、90min和120min。對各治療組中的11只動物的平均葡萄糖濃度取平均值。這些結果可證明RUP43激動劑在用葡萄糖免疫激發之后會以劑量依賴方式降低大鼠血糖。
或者，在7次每日注射RUP43激動劑、RSG或媒劑之后立即在大鼠中進行如本文所述的口服葡萄糖耐受性測試。
明確涵蓋本文所述的口服葡萄糖耐受性測試也可在不同動物(例如小鼠或兔)中進行。
B.ZDF大鼠對RUP43激動劑的急劇應答。
將10周齡的雄性Zucker糖尿病肥胖(ZDF)大鼠(Charles River)隨機分組(n＝6)以接收媒劑(經腹膜內)、RUP43激動劑(經腹膜內)或羅格列酮(RSG，10mg/kg，經腹膜內)。RUP43激動劑的優選劑量為0.1-100mg/kg。其它優選劑量選自由下列各量組成的群組0.1mg/kg、0.3mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg、10mg/kg、30mg/kg和100mg/kg。在投用化合物后，移除食物且在各時間點測定血糖水平。葡萄糖水平測定的例示性時間為0hr、1hr、2hr、3hr和4hr，且接著為1天至長達1周。將各時間點的血糖減少表示為由各組的6只動物平均的初始葡萄糖水平的百分比。這些動物具有300-400mg/dl的血糖水平(喂養狀態)，顯著高于非糖尿病野生型動物。用RUP43激動劑或RSG進行的治療可顯示為與媒劑對照物相比顯著減少葡萄糖水平。這些資料可證明RUP43激動劑在改善糖尿病動物的葡萄糖穩定狀態時具有功效。
或者，在每天測定血糖水平(歷時7天)之前，每天即刻向大鼠注射RUP43激動劑、RSG或媒劑(歷時7天)。
明確涵蓋本文所述的急劇應答測試也可在不同動物(例如小鼠或兔)中進行。
實例27合成本發明化合物實例27A2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-吲唑-3-基)-酰胺2-哌啶-4-基-噻唑-4-羧酸乙酯二氫溴酸鹽將4-(氨基碳硫基)四氫吡啶-1(2H)-羧酸叔丁酯(2.0g，8.2mmol)和溴丙酮酸乙酯(1.6g，8.2mmol)溶于30mL EtOH中的溶液在80℃下攪拌4h。其后，將所述混合物冷卻到室溫且接著饋入48％HBr(1.0mL，14mmol)。將反應混合物攪拌另外1h，且接著將其濃縮為油性固體。用乙醚濕磨會提供3.0g(91％)棕黃色固體1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ9.02(br s，1H)，8.77(br s，1H)，8.46(s，1H)，7.01(br s，1H)，4.29(q，J＝7.1 Hz，2H)，3.44-3.33(m，3H)，3.02(q，J＝11.7Hz，2H)，2.19(d，J＝13.2Hz，2H)，1.97-1.88(m，2H)，1.29(t，J＝7.0Hz，3H)。關于C11H16N2O2S+H的MS計算值241，觀測值241。
2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸乙酯將2-哌啶-4-基-噻唑-4-羧酸乙酯二氫溴酸鹽(1.0g，3.2mmol)、2-氯苯基乙酸(0.55g，3.2mmol)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(1.4g，3.5mmol)和二異丙基乙胺(3.0mL，17mmol)溶于30mL CH2Cl2中的溶液在40℃下攪拌8h。其后，用30mL CH2Cl2稀釋粗混合物且用1M檸檬酸(3×50mL)、飽和NaHCO3水溶液(1×30mL)和飽和NaCl水溶液(1×30mL)洗滌。將所得有機層以MgSO4干燥、過濾且濃縮為褐色油狀物。以EtOAc∶己烷(3∶1)進行硅膠純化會提供0.94g(75％)淺褐色油狀物1H NMR(400MHz，CDCl3)δ8.08(s，1H)，7.39(dd，J＝7.6，1.6Hz，1H)，7.32(dd，J＝7.2，2.0Hz，1H)，7.25-7.19(m，2H)，4.76(表觀d，1H)，4.42(q，J＝7.2Hz，2H)，3.99-3.95(m，1H)，3.88(d，AB型式，JAB＝16.0Hz，1H)，3.83(d，AB型式，JAB＝16.0Hz，1H)，3.34(tt，J＝11.7，3.7Hz，1H)，3.21-3.14(m，1H)，2.83-2.76(m，1H)，2.20-2.16(m，2H)，1.74(qd，J＝12.3，4.1Hz，1H)，1.63(qd，J＝12.3，4.0Hz，1H)，1.40(t，J＝7.2Hz，3H)。關于C19H21ClN2O3S+H的MS計算值393，觀測值393。
2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸用1M NaOH(20mL，20mmol)稀釋2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸乙酯(0.94g，2.4mmol)溶于20mL MeOH中的溶液且將其在60℃下攪拌4h。其后，濃縮粗混合物以移除MeOH溶劑。接著，用CH2Cl2(2×25mL)洗滌堿性水溶液且用5 M HCl將其酸化至pH＝1。用CH2Cl2(3×25mL)萃取所得酸性水溶液。將有機層組合、以MgSO4干燥、過濾且濃縮以提供0.51g(58％)白色泡沫狀固體1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ12.96(br s，1H)，8.36(s，1H)，7.45-7.40(m，1H)，7.33-7.25(m，3H)，4.43(d，J＝13.2 Hz，1H)，4.06(d，J＝13.6 Hz，1H)，3.87(d，AB型式，JAB＝16.0 Hz，1H)，3.82(d，AB型式，JAB＝16.0 Hz，1H)，3.38-3.31(m，1H)，3.25(表觀t，J＝11.8 Hz，1H)，2.79(表觀t，J＝11.6 Hz，1H)，2.08(t，J＝10.6 Hz，2H)，1.67(qd，J＝12.1，3.7 Hz，1H)，1.53(qd，J＝12.2，4.0 Hz，1H)。關于C17H17ClN2O3S+H的MS計算值365，觀測值365。
2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-吲唑-3-基)-酰胺二鹽酸鹽將N，1-二甲基-4，5，6，7-四氫-1H-吲唑-3-胺(23mg，0.14mmol)、O-(7-氮雜苯并三唑-1-基)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(75mg，0.20mmol)和2-{1-[2-(2-氯-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸(50mg，0.14mmol)溶于1OmL CH2Cl2中的溶液在40℃下攪拌8h。其后，用20mL CH2Cl2稀釋粗混合物且用1M檸檬酸(3×30mL)、飽和NaHCO3水溶液(1×30mL)和飽和NaCl水溶液(1×30mL)洗滌。將所得有機層以MgSO4干燥、過濾且濃縮為黃色油狀物。以梯度HPLC(乙腈-水，具有O.1％TFA)進行純化且將其轉化為二鹽酸鹽會提供56mg(70％)白色固體1H NMR(400MHz，CD3OD)δ8.28(d，J＝8.8 Hz，1H)，7.43-7.41(m，1H)，7.30-7.26(m，3H)，4.50(t，J＝11.8 Hz，1H)，4.09-4.03(m，1H)，3.98-3.91(m，2H)，3.83(d，J＝12.8 Hz，3H)，3.37(s，3H)，3.24-3.20(m，1H)，2.89-2.82(m，1H)，2.83-2.66(m，2H)，2.47-2.41(m，1H)，2.03-1.88(m，4H)，1.72-1.60(m，3H)，1.46-1.26(m，3H)。關于C26H30ClN5O2S+H的MS計算值512，觀測值512。
實例27B2-(2-氯-苯基)-1-{4-[4-(3，4-二氫-2H-喹啉-1-羰基)-噻唑-2-基]-哌啶-1-基}-乙酮以與實例29A相同的通用程序，由黃色固體狀的1，2，3，4-四氫喹啉獲得2-(2-氯-苯基)-1-{4-[4-(3，4-二氫-2H-喹啉-1-羰基)-噻唑-2-基]-哌啶-1-基}-乙酮。1H NMR(400MHz，CD3OD)δ7.78(s，1H)，7.42-7.40(m，1H)，7.30-7.24(m，3H)，7.18(d，J＝7.6 Hz，1H)，7.03(t，J＝7.4 Hz，1H)，6.91(t，J＝7.6 Hz，1H)，6.72(br s，1H)，4.28(d，J＝12.8 Hz，1H)，3.94-3.81(m，5H)，3.30-3.20(m，2H)，2.98-2.91(m，1H)，2.83(t，J＝6.4 Hz，2H)，2.04(五重峰，J＝6.6 Hz，2H)，1.99-1.93(br m，2H)，1.60-1.51(m，2H)。關于C26H26C1N3O2S+H的MS計算值480，觀測值480。
實例27C2-{1-[2-(2-氟-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-吲唑-3-基)-酰胺以與實例29A相同的通用程序，由白色固體狀的2-{1-[2-(2-氟-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸獲得2-{1-[2-(2-氟-苯基)-乙酰基]-哌啶-4-基}-噻唑-4-羧酸甲基-(2-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-吲唑-3-基)-酰胺。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ7.71(d，J＝10.4 Hz，1H)，7.30(t，J＝7.6 Hz，1H)，7.26-7.22(m，1H)，7.11(t，J＝7.4 Hz，1H)，7.05(t，J＝9.0 Hz，1H)，4.47(表觀t，J＝1 3.6 Hz，1H)，3.90-3.79(m，1H)，3.74(s，2H)，3.63(d，J＝4.4 Hz，3H)，3.32(s，3H)，3.17-3.11(m，1H)，3.04-2.95(m，1H)，2.91-2.79(m，1H)，2.61-2.43(m，2H)，2.27(dt，J＝15.3，5.7 Hz，1H)，1.99-1.88(m，3H)，1.79-1.72(m，1H)，1.64-1.38(m，5H)。關于C26H30FN5O2S+H的MS計算值496，觀測值496。
序列表<110>艾尼納制藥公司<120>用于治療高血糖癥和相關病癥的人類G蛋白偶合受體及其調節物<130>86.WO1<150>60/561，954<151>2004-04-13<160>14<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>993<212>DNA<213>智人<400>1atgacgccca acagcactgg cgaggtgccc agccccattc ccaagggggc tttggggctc60tccctggccc tggcaagcct catcatcacc gcgaacctgc tcctagccct gggcatcgcc120tgggaccgcc gcctgcgcag cccacctgct ggctgcttct tcctgagcct actgctggct180gggctgctca cgggtctggc attgcccaca ttgccagggc tgtggaacca gagtcgccgg240ggttactggt cctgcctcct cgtctacttg gctcccaact tctccttcct ctccctgctt300gccaacctct tgctggtgca cggggagcgc tacatggcag tcctgaggcc actccagccc360cctgggagca ttcggctggc cctgctcctc acctgggctg gtcccctgct ctttgccagt420ctgcccgctc tggggtggaa ccactggacc cctggtgcca actgcagctc ccaggctatc480ttcccagccc cctacctgta cctcgaagtc tatgggctcc tgctgcccgc cgtgggtgct540gctgccttcc tctctgtccg cgtgctggcc actgcccacc gccagctgca ggacatctgc600cggctggagc gggcagtgtg ccgcgatgag ccctccgccc tggcccgggc ccttacctgg660aggcaggcaa gggcacaggc tggagccatg ctgctcttcg ggctgtgctg ggggccctac720gtggccacac tgctcctctc agtcctggcc tatgagcagc gcccgccact ggggcctggg780acactgttgt ccctcctctc cctaggaagt gccagtgcag cggcagtgcc cgtagccatg840gggctgggcg atcagcgcta cacagccccc tggagggcag ccgcccaaag gtgcctgcag900gggctgtggg gaagagcctc ccgggacagt cccggcccca gcattgccta ccacccaagc960agccaaagca gtgtcgacct ggacttgaac taa 993<210>2
<211>330<212>PRT<213>智人<400>2Met Thr Pro Asn Ser Thr Gly Glu Val Pro Ser Pro Ile Pro Lys Gly1 5 10 15Ala Leu Gly Leu Ser Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ile Ile Thr Ala Asn20 25 30Leu Leu Leu Ala Leu Gly Ile Ala Trp Asp Arg Arg Leu Arg Ser Pro35 40 45Pro Ala Gly Cys Phe Phe Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Thr50 55 60Gly Leu Ala Leu Pro Thr Leu Pro Gly Leu Trp Asn Gln Ser Arg Arg65 70 75 80Gly Tyr Trp Ser Cys Leu Leu Val Tyr Leu Ala Pro Asn Phe Ser Phe85 90 95Leu Ser Leu Leu Ala Asn Leu Leu Leu Val His Gly Glu Arg Tyr Met100 105 110Ala Val Leu Arg Pro Leu Gln Pro Pro Gly Ser Ile Arg Leu Ala Leu115 120 125Leu Leu Thr Trp Ala Gly Pro Leu Leu Phe Ala Ser Leu Pro Ala Leu130 135 140Gly Trp Asn His Trp Thr Pro Gly Ala Asn Cys Ser Ser Gln Ala Ile145 150 155 160Phe Pro Ala Pro Tyr Leu Tyr Leu Glu Val Tyr Gly Leu Leu Leu Pro165 170 175Ala Val Gly Ala Ala Ala Phe Leu Ser Val Arg Val Leu Ala Thr Ala180 185 190His Arg Gln Leu Gln Asp Ile Cys Arg Leu Glu Arg Ala Val Cys Arg195 200 205Asp Glu Pro Ser Ala Leu Ala Arg Ala Leu Thr Trp Arg Gln Ala Arg210 215 220Ala Gln Ala Gly Ala Met Leu Leu Phe Gly Leu Cys Trp Gly Pro Tyr
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atcaccgcga acctgctcct agccctgggc atcgcctggg accgccgcct gcgcagccca180cctgctggct gcttcttcct gagcctactg ctggctgggc tgctcacggg tctggcattg240cccacattgc cagggctgtg gaaccagagt cgccggggtt actggtcctg cctcctcgtc300tacttggctc ccaacttctc cttcctctcc ctgcttgcca acctcttgct ggtgcacggg360gagcgctaca tggcagtcct gaggccactc cagccccctg ggagcattcg gctggccctg420ctcctcacct gggctggtcc cctgctcttt gccagtctgc ccgctctggg gtggaaccac480tggacccctg gtgccaactg cagctcccag gctatcttcc cagcccccta cctgtacctc540gaagtctatg ggctcctgct gcccgccgtg ggtgctgctg ccttcctctc tgtccgcgtg600ctggccactg cccaccgcca gctgcaggac atctgccggc tggagcgggc agtgtgccgc660gatgagccct ccgccctggc ccgggccctt acctggaggc aggcaagggc acaggctgga720gccatgctgc tcttcgggct gtgctggggg ccctacgtgg ccacactgct cctctcagtc780ctggcctatg agcagcgccc gccactgggg cctgggacac tgttgtccct cctctcccta840ggaagtgcca gtgcagcggc agtgcccgta gccatggggc tgggcgatca gcgctacaca900gccccctgga gggcagccgc ccaaaggtgc ctgcaggggc tgtggggaag agcctcccgg960gacagtcccg gccccagcat tgcctaccac ccaagcagcc aaagcagtgt cgacctggac1020ttgaacgaat tcggatccaa gggcaattct gcagatatcc agcacagtgg cggccgctcg1080agtctagagg gcccgcggtt cgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat1140tctacgcgta ccggtcatca tcaccatcac cattga 1176<210>6<211>391<212>PRT<213>人工<220>
<223>新穎序列<400>6Met Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Gly Ser Leu Thr Pro Ash1 5 10 15Ser Thr Gly Glu Val Pro Ser Pro Ile Pro Lys Gly Ala Leu Gly Leu20 25 30Ser Leu Ala Leu Ala Ser Leu Ile Ile Thr Ala Asn Leu Leu Leu Ala35 40 45Leu Gly Ile Ala Trp Asp Arg Arg Leu Arg Ser Pro Pro Ala Gly Cys50 55 60
Phe Phe Leu Ser Leu Leu Leu Ala Gly Leu Leu Thr Gly Leu Ala Leu65 70 75 80Pro Thr Leu Pro Gly Leu Trp Asn Gln Ser Arg Arg Gly Tyr Trp Ser85 90 95Cys Leu Leu Val Tyr Leu Ala Pro Asn Phe Ser Phe Leu Ser Leu Leu100 105 110Ala Asn Leu Leu Leu Val His Gly Glu Arg Tyr Met Ala Val Leu Arg115 120 125Pro Leu Gln Pro Pro Gly Ser Ile Arg Leu Ala Leu Leu Leu Thr Trp130 135 140Ala Gly Pro Leu Leu Phe Ala Ser Leu Pro Ala Leu Gly Trp Asn His145 150 155 160Trp Thr Pro Gly Ala Asn Cys Ser Ser Gln Ala Ile Phe Pro Ala Pro165 170 175Tyr Leu Tyr Leu Glu Val Tyr Gly Leu Leu Leu Pro Ala Val Gly Ala180 185 190Ala Ala Phe Leu Ser Val Arg Val Leu Ala Thr Ala His Arg Gln Leu195 200 205Gln Asp Ile Cys Arg Leu Glu Arg Ala Val Cys Arg Asp Glu Pro Ser210 215 220Ala Leu Ala Arg Ala Leu Thr Trp Arg Gln Ala Arg Ala Gln Ala Gly225 230 235 240Ala Met Leu Leu Phe Gly Leu Cys Trp Gly Pro Tyr Val Ala Thr Leu245 250 255Leu Leu Ser Val Leu Ala Tyr Glu Gln Arg Pro Pro Leu Gly Pro Gly260 265 270Thr Leu Leu Ser Leu Leu Ser Leu Gly Ser Ala Ser Ala Ala Ala Val275 280 285Pro Val Ala Met Gly Leu Gly Asp Gln Arg Tyr Thr Ala Pro Trp Arg290 295 300Ala Ala Ala Gln Arg Cys Leu Gln Gly Leu Trp Gly Arg Ala Ser Arg305 310 315 320
Asp Ser Pro Gly Pro Ser Ile Ala Tyr His Pro Ser Ser Gln Ser Ser325 330 335Val Asp Leu Asp Leu Asn Glu Phe Gly Ser Lys Gly Asn Ser Ala Asp340 345 350Ile Gln His Ser Gly Gly Arg Ser Ser Leu Glu Gly Pro Arg Phe Glu355 360 365Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu Asp Ser Thr Arg Thr370 375 380Gly His His His His His His385 390<210>7<211>31<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物序列<400>7gacaagcttg acgcccaaca gcactggcga g 31<210>8<211>32<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物序列<400>8cttgaattcg ttcaagtcca ggtcgacact gc32<210>9<211>36<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物序列<400>9gatcaagctt ccatggcgtg ctgcctgagc gaggag36<210>10<211>53<212>DNA<213>人工
<220>
<223>引物序列<400>10gatcggatcc ttagaacagg ccgcagtcct tcaggttcag ctgcaggatg gtg53<210>11<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物序列<400>11ctacctgtac ctcgaagtct a 21<210>12<211>19<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物序列<400>12agtggcgggc gctgctcat 19<210>13<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>小鼠引物序列<400>13tgagctgtcg gccattccca t 21<210>14<211>21<212>DNA<213>人工<220>
<223>小鼠引物序列<400>14gattgtccct cttggctctt c 2權利要求
1.一種鑒別一種或一種以上作為RUP43 GPCR調節物的候選化合物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述受體偶合至G蛋白；所述方法包含以下步驟(a)使候選化合物與所述受體接觸；以及(b)測定受體功能性是否受到調節；其中受體功能性的變化表示所述候選化合物為RUP43 GPCR的調節物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述GPR131氨基酸序列選自由下列序列組成的群組(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO2的氨基酸2-330；(c)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其附帶條件為所述RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；(d)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(e)SEQ ID NO6的氨基酸序列；(f)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO7和SEQ ID NO8對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(h)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(i)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代，其附帶條件為所述RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ IDNO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；以及(j)由在嚴格條件下與SEQ ID NO1的互補體雜交的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。
3.根據權利要求1或權利要求2所述的方法，其中所述RUP43 GPCR是重組RUP43GPCR。
4.根據權利要求1至3中任一權利要求所述的方法，其中所述接觸包含與表達所述RUP43 GPCR的宿主細胞接觸或與所述宿主細胞的細胞膜接觸，其中所述宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含編碼所述RUP43 GPCR的多核苷酸。
5.根據權利要求1至4中任一權利要求所述的方法，其中所述接觸在所述RUP43GPCR的已知激動劑存在下進行。
6.根據權利要求5所述的方法，其中所述接觸在化合物1、化合物2或化合物3存在下進行。
7.一種鑒別一種或一種以上作為哺乳動物中血糖濃度的調節物的候選化合物的方法，所述方法包含以下步驟(a)使候選化合物與包含GPR131氨基酸序列的GPCR接觸，其中所述受體偶合至G蛋白；以及(b)測定受體功能性是否受到調節；其中受體功能性的變化表示所述候選化合物為哺乳動物中血糖濃度的調節物。
8.根據權利要求7所述的方法，其中所述GPR131氨基酸序列選自由下列序列組成的群組(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO2的氨基酸2-330；(c)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其附帶條件為所述RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；(d)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(e)SEQ ID NO6的氨基酸序列；(f)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO7和SEQ ID NO8對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(h)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(i)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代，其附帶條件為所述RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ IDNO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；以及(j)由在嚴格條件下與SEQ ID NO1的互補體雜交的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。
9.根據權利要求7或權利要求8所述的方法，其中所述RUP43 GPCR是重組RUP43GPCR。
10.根據權利要求7至9中任一權利要求所述的方法，其中所述接觸包含與表達所述RUP43 GPCR的宿主細胞接觸或與所述宿主細胞的細胞膜接觸，其中所述宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含編碼所述RUP43 GPCR的多核苷酸。
11.根據權利要求7至10中任一權利要求所述的方法，其中所述接觸在所述RUP43GPCR的已知激動劑存在下進行。
12.根據權利要求11所述的方法，其中所述接觸在化合物1、化合物2和化合物3存在下進行。
13.根據權利要求1至12中任一權利要求所述的方法，其中受體功能性的增加表示所述候選化合物為降低哺乳動物中血糖濃度的化合物。
14.根據權利要求1至13中任一權利要求所述的方法，其中所述測定是通過測量第二信使的水平來進行，所述第二信使選自由環狀AMP(cAMP)、環狀GMP(cGMP)、三磷酸肌醇(IP3)、二酰甘油(DAG)和Ca2+組成的群組。
15.根據權利要求14所述的方法，其中所述cAMP的胞內水平增加。
16.根據權利要求1至13中任一權利要求所述的方法，其中所述測定是通過使用黑素細胞檢定來進行，或通過測量結合至包含所述RUP43 GPCR的膜的GTPγS來進行。
17.一種制備RUP43 GPCR的調節物的方法，其包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別所述調節物；以及(b)合成(a)中所鑒別的所述調節物。
18.一種根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別的調節物。
19.根據權利要求18所述的調節物或根據權利要求17所述的方法，其中所述調節物選自由激動劑、部分激動劑、反向激動劑和拮抗劑組成的群組。
20.根據權利要求18所述的調節物或根據權利要求17所述的方法，其中所述調節物為激動劑。
21.根據權利要求20所述的激動劑，其中所述激動劑為部分激動劑。
22.根據權利要求18所述的調節物或根據權利要求17所述的方法，其中所述調節物增加所述RUP43 GPCR的功能性。
23.根據權利要求18所述的調節物或根據權利要求17所述的方法，其中所述調節物增加所述cAMP的胞內水平。
24.一種式(II)的化合物 或其醫藥學上可接受的鹽，其中R1為H或C1-6烷基；R2為2-甲基-4，5，6，7-四氫-2H-吲唑-3-基；或R1和R2連同其所鍵結的氮形成3，4-二氫-2H-喹啉-1-基；且R10和R11各自獨立地為H或鹵素。
25.一種制備醫藥組合物或生理學上可接受的組合物的方法，其包含混合載劑和RUP43GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。
26.一種調節RUP43 GPCR的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受體與所述受體的調節物接觸。
27.一種調節RUP43 GPCR的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于降低需要降低血糖濃度的哺乳動物的血糖濃度，所述方法包含使所述受體與治療有效量的所述受體的調節物接觸。
28.一種調節RUP43 GPCR的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于預防或治療需要預防或治療代謝病癥的哺乳動物的代謝病癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的所述受體的調節物接觸，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
29.一種調節RUP43 GPCR的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于預防或治療需要預防或治療血糖濃度升高并發癥的哺乳動物的血糖濃度升高并發癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的所述受體的調節物接觸，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
30.一種降低需要降低血糖濃度的哺乳動物的血糖濃度的方法，其包含使治療有效量的RUP43 GPCR的調節物與所述受體接觸，所述受體包含GPR131氨基酸序列。
31.一利預防或治療需要預防或治療代謝病癥的哺乳動物的代謝病癥的方法，其包含使治療有效量的RUP43 GPCR調節物與所述受體接觸，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
32.一種預防或治療需要預防或治療血糖濃度升高并發癥的哺乳動物的血糖濃度升高并發癥的方法，其包含使治療有效量的RUP43 GPCR調節物與所述受體接觸，所受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
33.一種降低哺乳動物中血糖濃度的方法，其包含向需要所述降低的哺乳動物提供或投用RUP43 GPCR調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。
34.一種預防或治療代謝病癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用RUP43 GPCR調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
35.一種預防或治療血糖濃度升高并發癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用RUP43 GPCR調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
36.根據權利要求27至35中任一權利要求所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。
37.根據權利要求27至36中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物是根據權利要求18至23中任一權利要求所述。
38.根據權利要求27至36中任一權利要求所述的方法，其中所述RUP43 GPCR的調節物為所述RUP43 GPCR的激動劑。
39.根據權利要求27至36中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為根據權利要求24所述的化合物。
40.根據權利要求27至36中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。
41.根據權利要求27至40中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的脂肪細胞的葡萄糖攝取的化合物。
42.根據權利要求27至40中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的骨骼肌細胞的葡萄糖攝取的化合物。
43.一種降低哺乳動物中的血糖的方法，其包含向需要所述降低的哺乳動物提供或投用GPR131 GPCR的激動劑。
44.一種預防或治療代謝病癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用GPR131 GPCR的激動劑，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
45.根據權利要求34所述的方法，其中所述代謝病癥為糖尿病。
46.根據權利要求34所述的方法，其中所述代謝病癥為葡萄糖耐受性異常。
47.根據權利要求34所述的方法，其中所述代謝病癥為胰島素抗性。
48.根據權利要求34所述的方法，其中所述代謝病癥為高胰島素血癥。
49.一種預防或治療血糖濃度升高并發癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用GPR131 GPCR的激動劑，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
50.根據權利要求27至35中任一權利要求所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。
51.一種包含、基本上由或由RUP43 GPCR的調節物組成的醫藥組合物或生理學上可接受的組合物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。
52.一種包含RUP43 GPCR調節物和醫藥學上可接受的載劑的醫藥組合物，所述受體包含GPR131氨基酸序列。
53.根據權利要求52所述的醫藥組合物，其中所述調節物是根據權利要求18至23中任一權利要求所述。
54.根據權利要求52所述的醫藥組合物，其中所述RUP43 GPCR的調節物為所述RUP43 GPCR的激動劑。
55.根據權利要求52所述的醫藥組合物，其中所述調節物為根據權利要求24所述的化合物。
56.根據權利要求52所述的醫藥組合物，其中所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。
57.根據權利要求52至56中任一權利要求所述的醫藥組合物，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的脂肪細胞的葡萄糖攝取的化合物。
58.根據權利要求52至56中任一權利要求所述的醫藥組合物，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的骨骼肌細胞的葡萄糖攝取的化合物。
59.一種降低哺乳動物中的血糖的方法，其包含向需要所述降低的哺乳動物提供或投用根據權利要求52至58中任一權利要求所述的醫藥組合物。
60.一種預防或治療代謝病癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用根據權利要求52至58中任一權利要求所述的醫藥組合物，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
61.一種預防或治療血糖濃度升高并發癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用根據權利要求52至58中任一權利要求所述的醫藥組合物，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
62.根據權利要求59至61中任一權利要求所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。
63.一種RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述調節物用于通過療法來治療人體或動物體的方法中。
64.一種RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述調節物用于通過療法來降低人體或動物體中的血糖濃度的方法中。
65.一種RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述調節物用于通過療法來預防或治療人體或動物體中的代謝病癥的方法中，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
66.一種RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述調節物用于通過療法來預防或治療人體或動物體中的血糖濃度升高并發癥的方法中，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
67.根據權利要求63至66中任一權利要求所述的方法，其中所述動物為哺乳動物。
68.根據權利要求63至67中任一權利要求所述的調節物，其中所述調節物是根據權利要求18至23中任一權利要求所述。
69.根據權利要求63至67中任一權利要求所述的方法，其中所述RUP43 GPCR的調節物為所述RUP43 GPCR的激動劑。
70.根據權利要求63至67中任一權利要求所述的調節物，其中所述調節物為根據權利要求24所述的化合物。
71.根據權利要求63至67中任一權利要求所述的調節物，其中所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。
72.根據權利要求63至71中任一權利要求所述的調節物，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的脂肪細胞的葡萄糖攝取的化合物。
73.根據權利要求63至71中任一權利要求所述的調節物，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的骨骼肌細胞的葡萄糖攝取的化合物。
74.一種使用RUP43 GPCR調節物制備用于降低血糖濃度的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列。
75.一種使用RUP43 GPCR調節物制備用于預防或治療代謝病癥的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
76.一種使用RUP43 GPCR調節物制備用于預防或治療血糖濃度升高并發癥的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
77.根據權利要求74至76中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物是根據權利要求18至23中任一權利要求所述。
78.根據權利要求74至76中任一權利要求所述的方法，其中所述RUP43 GPCR的調節物為所述RUP43 GPCR的激動劑。
79.根據權利要求74至76中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為根據權利要求24所述的化合物。
80.根據權利要求74至76中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。
81.根據權利要求74至80中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的脂肪細胞的葡萄糖攝取的化合物。
82.根據權利要求74至80中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的骨骼肌細胞的葡萄糖攝取的化合物。
83.一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別所述受體的調節物；以及(b)使所述受體與(a)中所鑒別的所述調節物接觸。
84.一種制備醫藥組合物或生理學上可接受的組合物的方法，其包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列；以及(b)混合載劑和(a)中所鑒別的所述調節物。
85.一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于降低需要降低血糖濃度的哺乳動物的血糖濃度，所述方法包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別所述受體的調節物；以及(b)使所述受體與治療有效量的(a)中所鑒別的所述調節物接觸。
86.一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于預防或治療需要預防或治療代謝病癥的哺乳動物的代謝病癥，所述方法包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別所述受體的調節物；以及(b)使所述受體與治療有效量的(a)中所鑒別的所述調節物接觸；其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(i)糖尿病；(ii)葡萄糖耐受性異常；(iii)胰島素抗性；和(iv)高胰島素血癥。
87.一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于預防或治療需要預防或治療血糖濃度升高并發癥的哺乳動物的血糖濃度升高并發癥，所述方法包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別所述受體的調節物；以及(b)使所述受體與治療有效量的(a)中所鑒別的所述調節物接觸；其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(i)綜合癥X；(ii)動脈粥樣硬化；(iii)動脈粥樣化疾病；(iv)心臟病；(v)高血壓；(vi)中風；(vii)神經病；(viii)視網膜病；(ix)腎病；和(x)周邊血管疾病。
88.一種降低需要降低血糖濃度的哺乳動物的血糖濃度的方法，其包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列；以及(b)使治療有效量的(a)中所鑒別的所述調節物與所述受體接觸。
89.一種預防或治療需要預防或治療代謝病癥的哺乳動物的代謝病癥的方法，其包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列；以及(b)使治療有效量的(a)中所鑒別的所述調節物與所述受體接觸；其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(i)糖尿病；(ii)葡萄糖耐受性異常；(iii)胰島素抗性；和(iv)高胰島素血癥。
90.一種預防或治療需要預防或治療血糖濃度升高并發癥的哺乳動物的血糖濃度升高并發癥的方法，其包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列；以及(b)使治療有效量的(a)中所鑒別的所述調節物與所述受體接觸；其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(i)綜合癥X；(ii)動脈粥樣硬化；(iii)動脈粥樣化疾病；(iv)心臟病；(v)高血壓；(vi)中風；(vii)神經病；(viii)視網膜病；(ix)腎病；和(x)周邊血管疾病。
91.一種降低哺乳動物中的血糖的方法，其包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列；以及(b)向需要所述降低的哺乳動物提供或投用(a)中所鑒別的所述調節物。
92.一種預防或治療代謝病癥的方法，其包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列；以及(b)向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用(a)中所鑒別的所述調節物；其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(i)糖尿病；(ii)葡萄糖耐受性異常；(iii)胰島素抗性；和(iv)高胰島素血癥。
93.一種預防或治療血糖濃度升高并發癥的方法，其包含以下步驟(a)根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法鑒別RUP43 GPCR的調節物，所述受體包含GPR131氨基酸序列；以及(b)向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用(a)中所鑒別的所述調節物；其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(i)綜合癥X；(ii)動脈粥樣硬化；(iii)動脈粥樣化疾病；(iv)心臟病；(v)高血壓；(vi)中風；(vii)神經病；(viii)視網膜病；(ix)腎病；和(x)周邊血管疾病。
94.根據權利要求85至93中任一權利要求所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。
95.一種使用RUP43 GPCR調節物制備用于降低血糖濃度的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含執行根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法以由此鑒別所述調節物的步驟。
96.一種使用RUP43 GPCR調節物制備用于預防或治療代謝病癥的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含執行根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法以由此鑒別所述調節物的步驟；其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
97.一種使用RUP43 GPCR調節物制備用于預防或治療血糖濃度升高并發癥的藥物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含執行根據權利要求1至16中任一權利要求所述的方法以由此鑒別所述調節物的步驟；其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
98.根據權利要求85至97中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物是根據權利要求18至23中任一權利要求所述。
99.根據權利要求85至97中任一權利要求所述的方法，其中所述RUP43 GPCR的調節物為所述RUP43 GPCR的激動劑。
100.根據權利要求85至97中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為根據權利要求24所述的化合物。
101.根據權利要求85至97中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為化合物1、化合物2或化合物3。
102.根據權利要求85至101中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的脂肪細胞的葡萄糖攝取的化合物。
103.根據權利要求85至101中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的骨骼肌細胞的葡萄糖攝取的化合物。
104.一種制備醫藥組合物的方法，其包含混合根據權利要求24所述的化合物和醫藥學上可接受的載劑。
105.根據權利要求104所述的方法，其中所述化合物為化合物1、化合物2或化合物3。
106.一種醫藥組合物，其包含根據權利要求24所述的化合物和醫藥學上可接受的載劑。
107.根據權利要求106所述的醫藥組合物，其中所述化合物為化合物1、化合物2或化合物3。
108.一種調節RUP43 GPCR的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含使所述受體與根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物接觸。
109.一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于降低需要降低血糖濃度的哺乳動物的血糖濃度，所述方法包含使所述受體與治療有效量的根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物接觸。
110.一種調節RUP43 GPCR活性的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于預防或治療需要預防或治療代謝病癥的哺乳動物的代謝病癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物接觸，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
111.一種調節RUP43 GPCR的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述調節是用于預防或治療需要預防或治療血糖濃度升高并發癥的哺乳動物的血糖濃度升高并發癥，所述方法包含使所述受體與治療有效量的根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物接觸，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
112.一種降低需要降低血糖濃度的哺乳動物的血糖濃度的方法，其包含使治療有效量的根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物與RUP43 GPCR接觸，所述受體包含GPR131氨基酸序列。
113.一種預防或治療需要預防或治療代謝病癥的哺乳動物的代謝病癥的方法，其包含使治療有效量的根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物與RUP43 GPCR接觸，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
114.一種預防或治療需要預防或治療血糖濃度升高并發癥的哺乳動物的血糖濃度升高并發癥的方法，其包含使治療有效量的根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物與RUP43 GPCR接觸，所述受體包含GPR131氨基酸序列，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
115.一種降低血糖濃度的方法，其包含向需要所述降低的哺乳動物提供或投用治療有效量的根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物。
116.一種預防或治療代謝病癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用治療有效量的根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
117.一種預防或治療血糖濃度升高并發癥的方法，其包含向需要所述預防或治療的哺乳動物提供或投用治療有效量的根據權利要求24所述的化合物或根據權利要求106或權利要求107所述的醫藥組合物，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
118.根據權利要求109至117中任一權利要求所述的方法，其中所述哺乳動物為人類。
119.根據權利要求108至118中任一權利要求所述的方法，其中所述化合物為化合物1、化合物2或化合物3。
120.根據權利要求108至119中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的脂肪細胞的葡萄糖攝取的化合物。
121.根據權利要求108至119中任一權利要求所述的方法，其中所述調節物為增加自哺乳動物獲得的骨骼肌細胞的葡萄糖攝取的化合物。
122.根據權利要求24所述的化合物，其用于通過療法來治療人體或動物體的方法中。
123.根據權利要求24所述的化合物，其用于通過療法來降低人體或動物體中的血糖濃度的方法中。
124.根據權利要求24所述的化合物，其用于通過療法來預防或治療人體或動物體中的代謝病癥的方法中，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
125.根據權利要求24所述的化合物，其用于通過療法來預防或治療人體或動物體中的血糖濃度升高并發癥的方法中，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
126.根據權利要求122至125中任一權利要求所述的化合物，其中所述化合物為化合物1、化合物2或化合物3。
127.根據權利要求122至126中任一權利要求所述的化合物，其中所述動物為哺乳動物。
128.一種使用根據權利要求24所述的化合物制備用于降低血糖濃度的藥物的方法。
129.一種使用根據權利要求24所述的化合物制備用于預防或治療代謝病癥的藥物的方法，其中所述代謝病癥選自由下列病癥組成的群組(a)糖尿病；(b)葡萄糖耐受性異常；(c)胰島素抗性；和(d)高胰島素血癥。
130.一種使用根據權利要求24所述的化合物制備用于預防或治療血糖濃度升高并發癥的藥物的方法，其中所述并發癥選自由下列病癥組成的群組(a)綜合癥X；(b)動脈粥樣硬化；(c)動脈粥樣化疾病；(d)心臟病；(e)高血壓；(f)中風；(g)神經病；(h)視網膜病；(i)腎病；和(j)周邊血管疾病。
131.根據權利要求128至130中任一權利要求所述的方法，其中所述化合物為化合物1、化合物2或化合物3。
132.一種鑒別一種或一種以上作為結合至RUP43 GPCR的化合物的候選化合物的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步驟(a)在所述候選化合物存在或不存在下，使所述受體與所述受體的可檢測標記的已知配體接觸；和(b)測定所述經標記的已知配體與所述受體的結合是否在所述候選化合物存在下受到抑制；其中所述抑制作用指示所述候選化合物為結合至所述RUP43 GPCR的化合物。
133.根據權利要求1所述的方法，其中所述GPR131氨基酸序列選自由下列序列組成的群組(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO2的氨基酸2-330；(c)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其附帶條件為所述RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；(d)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(e)SEQ ID NO6的氨基酸序列；(f)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO7和SEQ ID NO8對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(h)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(i)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代，其附帶條件為所述RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ IDNO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；以及(j)由在嚴格條件下與SEQ ID NO1的互補體雜交的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。
134.根據權利要求132或權利要求133所述的方法，其中所述接觸包含與表達所述GPCR的宿主細胞接觸或與所述宿主細胞的細胞膜接觸。
135.根據權利要求134所述的方法，其中所述宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含編碼所述受體的多核苷酸。
136.根據權利要求132至135中任一權利要求所述的方法，其中所述已知配體為化合物1、化合物2或化合物3。
137.一種檢測結合至RUP43 GPCR的配體的方法，所述受體包含GPR131氨基酸序列，所述方法包含以下步驟(a)在允許所述受體與測試配體之間相互作用的條件下，使所述測試配體與表達所述受體的宿主細胞接觸或與所述宿主細胞的細胞膜接觸；和(b)檢測結合至所述受體的配體。
138.根據權利要求137所述的方法，其中所述GPR131氨基酸序列選自由下列序列組成的群組(a)SEQ ID NO2的氨基酸序列；(b)SEQ ID NO2的氨基酸2-330；(c)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其附帶條件為所述RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；(d)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(e)SEQ ID NO6的氨基酸序列；(f)由包含核酸序列的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列，所述核酸序列可通過包含使用引物SEQ ID NO7和SEQ ID NO8對人類DNA樣品執行PCR的方法而獲得；(g)SEQ ID NO2的氨基酸序列，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(h)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代；(i)SEQ ID NO2的氨基酸2-330，其中在SEQ ID NO2的氨基酸位置223的丙氨酸由賴氨酸取代，其附帶條件為RUP43 G蛋白偶合受體不包含在SEQ ID NO2的氨基酸位置1的甲硫氨酸殘基；以及(j)由在嚴格條件下與SEQ ID NO1的互補體雜交的多核苷酸編碼的G蛋白偶合受體的氨基酸序列。
139.根據權利要求137或權利要求138所述的方法，其中所述接觸包含與表達所述GPCR的宿主細胞接觸或與所述宿主細胞的細胞膜接觸。
140.根據權利要求139所述的方法，其中所述宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含編碼所述受體的多核苷酸，其中所述宿主細胞包含表達載體，所述表達載體包含編碼所述受體的多核苷酸。
全文摘要
本發明涉及鑒別一種或一種以上候選化合物是否為G蛋白偶合受體(GPCR)的調節物或血糖濃度調節物的方法。在某些實施例中，GPCR為人類GPCR。本發明也涉及使用GPCR的調節物的方法。一優選調節物為激動劑。本發明的激動劑用作降低血糖濃度、預防或治療某些代謝病癥(例如胰島素抗性、葡萄糖耐受性異常和糖尿病)以及預防或治療血糖濃度升高并發癥(例如動脈粥樣硬化、心臟病、中風、高血壓和周邊血管疾病)的治療劑。
文檔編號A61K45/06GK101027560SQ200580018730
公開日2007年8月29日 申請日期2005年4月12日 優先權日2004年4月13日
發明者邱俊, 羅伯特·R·韋布, 戴維·J·阿納特, 喬爾·E·加特林, 丹尼爾·T·康諾利 申請人:艾尼納制藥公司