疼痛的治療和預防中神經膠質細胞來源的bdnf的調節的制作方法

專利名稱：疼痛的治療和預防中神經膠質細胞來源的bdnf的調節的制作方法
技術領域：
本發明涉及神經膠質細胞來源的BDNF(腦衍生神經營養因子)的調節，尤其涉及神經膠質細胞來源的BDNF的調節，用以治療和預防受試者中的疼痛。本發明還涉及鑒定或者表征可以用于治療或預防疼痛的化合物的方法。
背景技術：
對疼痛治療和預防的新的和改進的方法和藥劑的需要在醫學受到大量關注。現在使用的治療法主要集中在治療疼痛的癥狀而不治療疼痛的實際原因。此外，這些治療法不一定是特異的并且可以引起許多不希望的副作用。
仍然需要更好地定義涉及痛覺的機理。仍然需要基于新發現的傷害感受機理，提供新的和特異性治療法，其可以通過在實際疼痛來源處的干預治療或者預防疼痛。
發明概述本發明涉及調節(例如，減少)神經膠質細胞來源的BDNF以治療或預防疼痛。本發明還涉及鑒定或表征能夠調節(例如，減少)神經膠質細胞來源的BDNF的化合物。
第一方面，本發明提供了治療或預防受試者中疼痛的方法，該方法包括減少受試者中神經膠質細胞來源的BDNF。
另一方面，本發明提供了減輕受試者中的傷害感受的方法，該方法包括減少受試者中神經膠質細胞來源的BDNF。
再一方面，本發明提供了用于治療或者預防受試者中疼痛的組合物，該組合物包含(a)能夠減少所述受試者中神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑；和(b)可藥用載體。
另一方面，本發明提供了包含本文描述的組合物以及關于其用于治療或預防疼痛的使用說明書的包裝。在再一方面，本發明提供了包含(a)能夠減少受試者中神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑；和(b)其用于治療或預防所述受試者中疼痛的使用說明書的包裝。
在再一方面，本發明提供了本文描述的組合物用于治療或預防受試者中疼痛和/或制備用于治療或預防疼痛的藥物的用途。在再一方面，本發明提供了能夠減少受試者中神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑用于治療或預防所述受試者中疼痛的用途和/或能夠減少神經膠質細胞來源的BDNF用于制備治療或預防受試者中疼痛的藥物的用途。
在再一個實施方案中，本發明提供了鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，該方法包括(a)將受試化合物與表達BDNF或者具有BDNF活性的神經膠質細胞接觸，和(b)確定在受試化合物存在下BDNF表達或者活性是否降低；其中降低表明該受試化合物可以用于治療或預防疼痛。
在再一個實施方案中，本發明提供了鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，該方法包括(a)將受試化合物與神經膠質細胞接觸，所述神經膠質細胞包含第一種核酸，該核酸包含與BDNF基因正常結合的可轉錄調節的元件，該第一種核酸有效連接包含能夠編碼報道蛋白的報道基因的第二種核酸，和(b)確定在受試化合物存在下報道基因表達或者報道蛋白活性是否降低；其中報道基因表達或者報道蛋白活性降低表明該受試化合物可以用于治療或預防疼痛。
在另一實施方案中，本發明提供了鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，該方法包括(a)將受試化合物與能夠分泌BDNF多肽的神經膠質細胞接觸，和(b)確定在受試化合物存在下所述BDNF多肽的分泌是否降低；其中BDNF多肽的分泌降低表明該受試化合物可以用于治療和預防疼痛。
在另一實施方案中，本發明提供了鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，該方法包括(a)將受試化合物與神經膠質細胞接觸；和(b)確定在受試化合物存在下所述神經膠質細胞的刺激是否降低；其中所述神經膠質細胞的刺激降低表明該受試化合物可以用于治療和預防疼痛。
在一個實施方案中，本發明提供了能夠減小選自(a)神經膠質細胞中的BDNF表達，(b)BDNF從神經膠質細胞的釋放或分泌，(c)神經膠質細胞的刺激，(d)神經膠質細胞來源的BDNF活性，和(e)(a)到(d)的任一組合的參數的方法或活性劑。
在另一實施方案中，神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞，在另一實施方案中，神經膠質細胞位于所述受試者的中樞神經系統中。在另一實施方案中，神經膠質細胞是受刺激的神經膠質細胞，在另一實施方案中，受刺激的神經膠質細胞已經與ATP接觸和/或受刺激的神經膠質細胞對于外周神經或者神經束損傷是突觸后的。
在再一個實施方案中，BDNF包含與選自SEQ ID NO2、4、6和其片段的序列實質同一的氨基酸序列。
在再一個實施方案中，所述疼痛的信號在外周神經系統(PNS)細胞或者中樞神經系統(CNS)細胞中發生。在實施方案中，疼痛是神經性疼痛，在另一實施方案中，神經性疼痛與神經或者神經束損傷有關和/或選自軀體或內臟疼痛。在再一個實施方案中，神經性疼痛與化學損傷有關。在再一個實施方案中，疼痛選自慢性痛、慢性炎性痛、與關節炎相關的疼痛、纖維肌痛(fibromyalgia)、背痛、癌癥相關的疼痛、消化性疾病相關的疼痛、克隆病相關的疼痛、自身免疫病相關的疼痛、內分泌疾病相關的疼痛、糖尿病性神經病相關的疼痛、幻肢痛、自發性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頜痛、灼痛、皰疹后神經痛、艾滋病相關的疼痛、I和II型復合性區域疼痛綜合征、三叉神經痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關的疼痛、與藥物攝入相關的疼痛和再發的急性痛。
在再一個實施方案中，方法包括對受試者施用能夠減少所述受試者中神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑。在另一實施方案中，用途、組合物和包裝包含此類活性劑。在一個實施方案中，該活性劑能夠減少或者抑制神經膠質細胞的刺激，在再一個實施方案中，活性劑是ATP受體的抑制劑，在再一個實施方案中，ATP受體是P2X受體，在再一個實施方案中，該活性劑是TNP-ATP。在另一實施方案中，活性劑能夠抑制BDNF表達，在再一個實施方案中，活性劑選自反義分子、核酶、siRNA和siRNA樣分子。在再一個實施方案中，活性劑是反義分子，在再一個實施方案中，反義分子與編碼BDNF的mRNA的部分實質互補，在再一個實施方案中，反義分子互補于與選自SEQ ID NO1、3和5的序列實質同一的核酸序列的部分。在再一個實施方案中，活性劑是siRNA，在再一個實施方案中，siRNA的序列與選自SEQ ID NO7、8、9、10和其片段的序列實質同一。在再一個實施方案中，活性劑向鞘內施用或者適于鞘內施用。
在一個實施方案中，受試者是哺乳動物，在另一實施方案中，哺乳動物是人。
附圖簡述

圖1.ATP刺激的小膠質細胞通過鞘內導管向大鼠的脊柱遞送引起異常性疼痛和脊髓I板層神經元的跨膜陰離子梯度的去極化偏移。在幼稚大鼠中，ATP刺激的小膠質細胞(皮質或者脊髓來源)但不是靜止小膠質細胞的局部脊髓遞送導致平均縮足閾值(WD50)的顯著降低。B，左，在來自靜息小膠質細胞和ATP刺激的小膠質細胞注射的大鼠的LI神經元中記錄的平均E陰離子的比較(注意到在細胞的靜息膜電位中沒有顯著改變)。右，GABA引起的平均峰電流，其是來自用A中ATP刺激的或者靜息小膠質細胞處理的大鼠的切片中不同Vm值下在LI神經元中測量的。水平標準誤差線代表神經元間差異。Inset-代表原始跡線。C，電流鉗記錄模式下的代表性跡線，表明在靜息膜電位下，在來自WD50＝3.4g的大鼠的LI神經元中對GABA的突觸后應答，相比，在來自WD50＝12.6g的大鼠的LI神經元中的應答，GABA被超極化。
圖2.在背角中BDNF的增強的濃度引起感受傷害超敏感性和脊髓I板層神經元的跨膜陰離子梯度的去極化偏移。A，重組人BDNF(20μg)向完整大鼠的腰部背角的鞘內遞送導致與鹽水對照相比在1小時內WD50的顯著和瞬時減少，鹽水對照不引起顯著減少。B，在用BDNF(50ng/ml；＞90分鐘)處理的切片對比對照ACSF中的切片(幼稚)中LI神經元中的平均E陰離子的顯著去極化。C，來自Fura-2-AM-裝載的LI神經元的鈣測量的代表性跡線表明在灌流(superfuse)BDNF的切片中快速應用GABA可以導致細胞內鈣的荷包牡丹堿敏感的增加([Ca2+]i)。通過KCl介導的應答證實不應答GABA的細胞的生活力。右下插圖，顯示[Ca2+]i的GABA介導的升高的LI神經元的比例不斷增加，在連續BDNF灌注的80-120分鐘之間達到31％(χ2校正的＝5.15)。相比，不存在BDNF時，在相似的時間期間內，僅2％的細胞應答[Ca2+]i的升高(C；χ2校正的＝6.74)。D，鞘內施用BDNF轉導腺病毒載體(adBDNF)11引發WD50的延遲和進行性減少，其持續到注射后4天。相比，施用不編碼BDNF的對照腺病毒(adGFP)不引起縮足閾值的減小。E，在來自D中adBDNF-vs.adGFP處理的大鼠的切片中LI神經元的平均E陰離子的顯著去極化。F，來自D中adBDNF或adGFP處理的大鼠的切片中在不同Vm值下在LI神經元中測量的GABA引起的平均峰電流。水平標準誤差線代表神經元間差異。G，電流鉗記錄方式的代表性跡線，其表明對來自adBDNF處理的大鼠的切片中LI神經元快速應用GABA可以引起動作電位。
圖3.具有外周神經損傷的大鼠中BDNF-TrkB信號傳遞逆轉的異常性疼痛的功能性抑制和脊髓I板層神經元中E陰離子的去極化偏移。A，對顯示出應答外周神經損傷(PNI)的強烈異常性疼痛的大鼠的腰部背角鞘內施用抗-TrkB或者TrkB-Fc導致WD50的顯著增加。B，電流鉗記錄模式下代表性跡線，表明對GABA的突觸后應答從來自PNI大鼠的LI神經元中靜息去極化，而這些電位從用抗TrkB灌注的切片中靜息去極化。C，電位鉗記錄方式下對來自PNI大鼠的切片中兩個LI神經元中快速局部GABA應用(10ms)應答的代表性電流電壓圖，所述神經元一個來自用對照ACSF灌注的切片(對照)，另一個來自抗-TrkB灌注2小時后的切片(1μg/ml)。插圖，合并的數據，表明來自已經接受PNI的大鼠的切片的抗TrkB灌注引起LI神經元中E陰離子的顯著超極化。
圖4.小膠質細胞來源的BDNF引起脊髓I板層神經元的跨膜陰離子梯度的異常性疼痛和去極化偏移。A，局部脊髓遞送用抗TrkB或者TrkB-Fc溫育的或者用BDNF干擾RNA(siRNA)脂轉染的ATP刺激的小膠質細胞都不導致縮足閾值的顯著改變(WD50)。然而，用干擾RNA的亂序形式(Scr.siRNA)脂轉染ATP刺激的小膠質細胞導致5小時后WD50顯著下降。B，電流鉗記錄模式下代表性跡線，表明對GABA的突觸后應答在來自用ATP刺激的小膠質細胞與抗-TrkB聯合處理，或者用BDNFsiRNA脂轉染的ATP刺激的小膠質細胞處理的大鼠的LI神經元中超極化。C，合并的數據，表明從來自已經接受局部脊髓遞送與抗TrkB混合的ATP刺激的小膠質細胞或者用BDNF siRNA脂轉染的ATP刺激的小膠質細胞的大鼠的LI神經元測量的平均E陰離子比從用ATP刺激的小膠質細胞注射的大鼠得到的LI神經元測量的更負。D，來自Fura-2-AM-裝載的小膠質細胞的鈣測量的代表性跡線，表明細胞對快速應用ATP的應答不受小膠質細胞暴露于抗TrkB或BDNF siRNA的影響。E，用磷酸緩沖鹽水載體(PBS)、ATP、ATP+TNP-ATP(10μM)或者用BDNF siRNA預處理后再用ATP處理后5小時，培養的小膠質細胞的上清液中BDNF蛋白質的基于ELISA的測量。F.圖解E陰離子和WD50之間關系的相關性圖。該圖中的數據包括在同一大鼠中記錄了WD50和E陰離子的那些數據。
圖5A.A，PNI后但不是假手術后，對成年大鼠的機械刺激的感受傷害縮足閾值(WD50)在2-3周中顯著下降。B和C，顯微照片，表明OX-42染色(指出活化的小膠質細胞)在PNI大鼠(右)的同側背角比假手術的大鼠(左)中更濃烈。C中的比例尺為0.2mm；SDH ipsi.＝與PNI同側的表面背角。D，合并的數據，表明對從已經接受PNI的大鼠得到的切片灌注TNP-ATP(1μM)引起LI神經元中E陰離子的顯著超極化。
圖6.人BDNF的編碼(SEQ ID NO1，檢索號M37762)和多肽(SEQ IDNO2，檢索號AAA51820)序列。
圖7.小鼠BDNF的編碼(SEQ ID NO3，檢索號BC034862)和多肽(SEQ ID NO4，檢索號AAH34862)序列。
圖8.大鼠BDNF的編碼(SEQ ID NO5，檢索號AY176065)和多肽(SEQ ID NO6，檢索號AAO17828)序列。
發明詳述在第一方面，本發明涉及基于神經膠質細胞來源的BDNF的調節(例如，減少)，治療和預防疼痛的方法和化合物。本文使用的“BDNF”或者“腦源性神經營養因子”在本文中可互換使用并且涉及參與多種神經元過程的神經營養因子，所述神經元過程為諸如神經發生、突觸發生、受損網絡的修復、發育神經元的存活和分化、腦14和脊髓15中成熟神經元、正常突觸(例如，抑制性和/或興奮性)的維持、樹突和軸突生長的調節和行為過程(例如，抗抑郁、情緒穩定、記憶)。BDNF多肽在中樞神經系統中是普遍存在的并且由多種細胞來源產生，所述細胞來源為諸如神經元(例如，初級感覺神經元和突觸后神經元)、神經膠質細胞(例如，小膠質細胞、星形膠質細胞或者少突膠質細胞)、非神經免疫細胞(例如，淋巴細胞(例如，T和B淋巴細胞)、白細胞、巨噬細胞和內皮細胞。在實施方案中，BDNF多肽由神經膠質細胞(例如，受刺激的神經膠質細胞)產生和分泌。在實施方案中，BDNF包含SEQ ID NO2(人BDNF；也見圖6)、4(小鼠BDNF，也見圖7)或6(大鼠BDNF，也見圖8)的多肽序列，其片段或者其實質上同一的序列。在其他實施方案中，BDNF由能夠編碼SEQ ID NO2、4或6的多肽的核酸序列或其片段或者其實質上同一或通過雜交標準(見下文)相關的序列編碼。在進一步的實施方案中，此類核酸序列可以包含SEQ ID NOs1(人BDNF DNA，也見圖6)、3(小鼠BDNF DNA，也見圖7)或5(大鼠BDNFDNA，也見圖8)的序列，其片段或者其實質上同一或通過雜交標準(見下文)相關的序列。
本發明還提供了通過減小(1)神經膠質細胞中的BDNF表達；(2)BDNF從神經膠質細胞的釋放或分泌；(3)神經膠質細胞的刺激和/或(4)神經膠質細胞來源的BDNF活性的方法。
因此，在一個實施方案中，本發明涉及通過減少神經膠質細胞來源的BDNF治療疼痛的方法。本文使用的“神經膠質細胞”定義為神經系統的非神經元細胞。在一個實施方案中，神經膠質細胞位于神經系統中，在進一步的實施方案中，位于中樞神經系統中(例如，脊髓中)。在一個實施方案中，神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。在一個實施方案中，神經膠質細胞是少突膠質細胞。少突膠質細胞通常形成白質的髓鞘形成和灰質中的周圍細胞體。它們很大，圍繞的神經元具有很少的分枝包裹。在另一實施方案中，神經膠質細胞是星形膠質細胞。星形膠質細胞通常在血管和神經元之間形成連接。它們比少突膠質細胞小并且具有廣泛的分枝。在另一實施方案中，神經膠質細胞是小膠質細胞。小膠質細胞在神經系統中起免疫功能。一旦被活化或刺激，小膠質細胞可以吞噬碎屑。它們是非常小的細胞但是一旦被活化或刺激就變大。在實施方案中，神經膠質細胞通常表達OX-42(CR3/CD11b)、神經膠質fribrillary酸性蛋白和/或RIP。本文使用的術語“神經膠質細胞來源的BDNF”定義為神經膠質細胞產生、釋放或者分泌的BDNF，在實施方案中，包括小膠質細胞、星形膠質細胞和/或少突膠質細胞產生或分泌的BDNF。
在另一實施方案中，BDNF活性或表達的調節劑(例如，抑制劑)可以用于治療或預防受試者中的疼痛或者減小傷害感受。在一個實施方案中，抑制劑(例如，活性劑或化合物)可以鞘內施用。在一個實施方案中，這些調節劑是能夠減小BDNF下游信號傳遞的活性劑，如BDNF受體的抑制劑(例如，TrkB或者p75NTR)，例如，K-252a或者抗-TrkB抗體；MAPK(ras促分裂原活化蛋白激酶)途徑的抑制劑；PI3K-Akt(磷脂酰肌醇-3激酶-Akt)途徑抑制劑；PLCγ(磷脂酶Cγ途徑)的抑制劑。在另一實施方案中，這些調節劑是能夠抑制神經膠質細胞的刺激(例如，ATP刺激)的化合物(如P2X(如P2X4和P2X7)受體的抑制劑，例如，TNP-ATP、米諾環素和丙戊茶堿(propentophylline))。在再一個實施方案中，這些調節劑是能夠減小BDNF表達的化合物或者活性劑(如dsRNA BDNF、siRNA分子、siRNA樣分子、反義寡核苷酸、核酶，等等)。在一個實施方案中，當活性劑或者化合物是反義寡核苷酸時，它與編碼BDNF的mRNA的部分實質互補，在另一實施方案中，它與核酸序列的部分互補，所述核酸序列與選自SEQID NO1、3和5的序列實質同一。在再一個實施方案中，當活性劑或者化合物是siRNA時，該siRNA的序列與選自SEQ ID NO7、8、9、10的序列和其片段實質同一。
在一個實施方案中，本發明還涉及急性或者慢性痛的治療，更具體地，涉及神經性疼痛的治療。本文使用的“神經性疼痛”指與中樞神經系統中神經損傷(化學損傷后、壓傷或者橫切后、神經壓迫后、疾病導致的神經退化后、化學損傷后)有關的慢性痛。在一個實施方案中，化學損傷可以來自化學治療。在一個實施方案中，神經性疼痛與神經或者神經束損傷有關。在進一步的實施方案中，神經性疼痛與內臟和/或軀體疼痛有關。在實施方案中，疼痛的信號可以來自外周神經系統細胞或者神經膠質細胞的跨突觸感覺纖維。在實施方案中，疼痛可以與許多狀況有關，如慢性炎性痛、與關節炎相關的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關的疼痛、消化性疾病相關的疼痛、克隆病相關的疼痛、自身免疫病相關的疼痛、內分泌疾病相關的疼痛、糖尿病性神經病相關的疼痛、幻肢痛、自發性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頜痛、灼痛、皰疹后神經痛、艾滋病相關的疼痛、I和II型復合性區域疼痛綜合征、三叉神經痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關的疼痛、與藥物攝入相關的疼痛和/或再發的急性痛。在一個實施方案中，與藥物攝入相關的疼痛是與化學療法治療有關的疼痛。
本文描述的方法還涉及降低神經膠質細胞來源的BDNF以減小傷害感受。本文使用的“傷害感受”指疼痛的感覺組分。疼痛可以是多種刺激的結果，包括但不限于壓力、損傷、熱刺激或者化學(例如，離子)刺激。
本文使用的“BDNF”指與BDNF有關的任何可檢測的表型。例如，可以通過測量TrkB酪氨酸磷酸化水平(例如，使用蛋白質印跡)、MAPK(ERK)途徑激活水平(例如，使用蛋白質印跡)、Akt磷酸化水平(例如，使用蛋白質印跡)、PLCγ途徑激活水平、神經遞質釋放報告水平、NMDA受體磷酸化水平、細胞存活、細胞分化和細胞死亡(例如，凋亡)來評估BDNF活性。可以使用許多凋亡測定法，如TUNEL染色、膜聯蛋白V染色、FACS分析、瓊脂糖電泳、蛋白質印跡、組織學、電子顯微術、胱天蛋白酶測定、ELISA、線粒體測定法(例如，細胞色素C釋放測定)、組織蛋白酶和鈣蛋白酶測定，等等。在實施方案中，BDNF活性也可以影響神經細胞(例如，LI神經元)的陰離子逆轉電位(E陰離子)。例如，通過使用短桿菌肽穿孔膜片鉗記錄(見下文實施例部分)可以測定陰離子逆轉電位。
“BDNF表達”涉及BDNF轉錄物的產生和/或BDNF多肽或者蛋白質的分泌。因此，在實施方案中，BDNF表達可以通過直接估計蛋白質水平(例如，通過免疫細胞化學、ELISA和/或蛋白質印跡分析)或者編碼BDNF的核酸的水平(例如，BDNF mRNA水平或者轉錄物)來確定。通過使用例如，諸如逆轉錄酶聚合酶鏈式反應[RT-PCR]方法、基于微陣列的方法或者通過RNA印跡分析測定這些水平。
能夠降低神經膠質細胞中BDNF活性或者表達的化合物可以例如，以使得它們接觸CNS組織或者CNS細胞的方式施用。可以使用的化合物包括，但不限于，直接或間接修飾蛋白質的活性的化合物和調節(例如，在轉錄、翻譯、成熟、翻譯后修飾、磷酸化、分泌和降解水平上)該蛋白質的產生和/或穩定性的那些化合物。
一類這些化合物是通過抑制神經膠質細胞的刺激起作用的化合物。實際上，應答神經膠質細胞的刺激(例如，ATP刺激)而分泌BDNF。本領域中已知許多化合物抑制神經膠質細胞的活化。通過抑制神經膠質細胞的活化，這些化合物抑制BDNF的分泌并因此可以用于預防或者治療疼痛。這些化合物包括，但不限于P2X受體(例如，P2X4和P2X7)抑制劑，如TNP-ATP。
可以用于抑制BDNF表達的另一類化合物是降低BDNF轉錄物水平的化合物。通過這樣做，這些化合物抑制可以產生的BDNF多肽的數目，并且因此可以用于治療或預防疼痛。這些化合物包括但不限于，dsRNA(例如，SEQ ID NO7、8、9或者10)、siRNA、siRNA樣分子、反義寡核苷酸或者核酶。
另一類可以用于治療或預防疼痛的化合物或者活性劑是能夠抑制BDNF信號的介導的化合物。這些化合物可以例如，作用于BDNF受體，如TrkB或者p75NTR。在一個實施方案中，BDNF受體是TrkB受體。可以抑制TrkB信號傳遞的化合物包括，但不限于，K-252a(可以從Calbiochem購買)或者針對TrkB的中和抗體(抗TrkB抗體[例如，IgG])(可以從BD Transduction Laboratories購買)。備選地，這些化合物可以作用于多種信號傳遞途徑，該途徑在BDNF與其受體連接時被激活。
此外，BDNF表達的調節還可以從調節BDNF表達的轉錄因子的調節(例如，通過磷酸化介導)產生。此類轉錄因子包括，但不限于NFκB和Brn-3c。
此外，BDNF活性的調節可以通過調節(例如，減少)BDNF從神經膠質細胞的分泌實現。
本文描述的方法還預期調節(例如增強)BDNF降解。此類增強的降解可以在產生BDNF的細胞(例如神經膠質細胞)中或者在含有BDNF受體的細胞中(例如，具有BDNF受體如TrkB或者p75NTR的神經元細胞)細胞內地產生。對于后一種情況，在它的降解之前，BDNF在接觸BDNF受體后已經被細胞內轉移。在另一實施方案中，一旦已經分泌BDNF，還可以在細胞外觀察到增強的降解速率。
在一個實施方案中，本文描述的方法和用途應用于脊椎動物受試者。在另一實施方案中，受試者是哺乳動物，在再一個實施方案中，是人。
如上面提到的，BDNF的保留活性的同源物、變體和/或片段也可以用所描述的方法抑制。同源物包括與BDNF的氨基酸序列實質上同一、與BDNF共有結構和功能同源性的蛋白質序列。變體包括但不限于，通過任一修飾、和/或氨基酸替代、缺失或添加而與BDNF不同的蛋白質或肽。修飾可以發生在任何地方，包括多肽主鏈(即，氨基酸序列)、氨基酸側鏈和氨基或羧基末端。此類替代、缺失或添加可以包括一個或多個氨基酸。片段包括BDNF的片段或者部分或者BDNF的同源物或變體的片段或部分。
“同源物”和“同源的”指兩個肽或者兩個核酸分子之間的序列相似性。可以通過比較比對的序列中每個位置確定同源性。核酸之間或者氨基酸序列之間同源性程度是序列共有的位置上相同或者匹配核苷酸或者氨基酸的數目的函數。如該術語在本文使用的，給定序列(核酸或者氨基酸)與另一序列是“同源的”，條件是這兩個序列實質同一并且保留該序列的功能活性(如本文使用的，術語“同源的”不推論出進化相關性)。兩個核酸序列或者兩個氨基酸序列被認為是“實質同一的”，條件是當最佳比對(允許缺口)時，它們具有至少約50％序列相似性或者同一性，或者這兩個序列共有確定的功能基序。在備選實施方案中，最佳比對的實質同一的序列的序列相似性可以為至少60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。如本文使用的，序列之間同源性的給定百分數表示最佳比對的序列中序列同一性程度。“不相關的”或者“非同源的”序列與SEQ ID NO1到10具有小于40％同一性，盡管優選小于約25％同一性。
實質互補的核酸是其中一種分子的“互補序列”與另一分子實質同一的核酸。
用于同一性比較的序列的最佳比對可以使用多種算法進行，如Smith和Waterman，1981，Adv.Appl.Math 2482的局部同源性算法，Needleman和Wunsch，1970，J.Mol.Biol.48443的同源性比對算法，Pearson和Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444的相似性搜索方法，和這些算法的計算機化實現(如Wisconsin Genetics SoftwarePackage，Genetics Computer Group，Madison，WI，U.S.A中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)。還可以使用Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215403-10(使用公開的默認設置)中描述的BLAST算法確定序列同一性。用于進行BLAST分析的軟件可以從National Center forBiotechnology Information(通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov/的因特網)得到。BLAST算法包括首先鑒定高得分序列對(HSP)，其通過鑒定查詢序列中長為W的短字來進行，所述短字當與數據庫序列中相同長度的字比度時匹配或者滿足某個正值閾值得分T。T稱作鄰近字得分閾值。最初的鄰近字命中作為起始搜索的種子以發現更長的HSP。字命中在兩個方向上沿著序列延伸，只要累積比對得分可以增加。當滿足下面的參數時停止每個方向的字命中延伸累積比對得分從其實現的最大得分下降量X；由于一個或多個負得分殘基比對的積累，累積得分達到0或者以下；或者達到了任一序列的末端。BLAST算法參數W、T和X確定比對的靈敏性和速度。BLAST算法可以以字長(W)11、BLOSUM62得分矩陣(Henikoff和Henikoff，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910915-10919)比對(B)50、期望值(E)10(或1或0.1或者0.01或者0.001或者0.0001)，M＝5，N＝4，和兩條鏈的比較作為默認值。使用BLAST算法對兩條序列之間統計學相似性的一種測量是最小總概率(P(N))，其提供了兩個核苷酸或者氨基酸序列之間的匹配將由于機會發生的概率的指示。在本發明的備選實施方案中，如果測試序列的比較中最小總概率小于約1，優選小于約0.1，更優選小于約0.01，最優選小于約0.001，那么認為核苷酸或氨基酸序列是實質同一的。
兩個核酸序列實質互補的備選表示是在中等嚴格，或者優選地嚴格條件下兩條序列相互雜交。在中等嚴格條件下與濾器結合的序列雜交可以例如，在0.5M NaHPO4，7％十二烷基硫酸鈉(SDS)，1mM EDTA 65℃下進行，并在0.2x SSC/0.1％SDS 42℃下洗滌(見Ausubel，等人(編著)，1989，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，Green PublishingAssociates，Inc.，和John Wiley & Sons，Inc.，New York，at p.2.10.3)。備選地，在嚴格條件下與濾器結合的序列雜交可以例如在0.5M NaHPO4，7％SDS，1mM EDTA中65℃下進行并在0.1x SSC/0.1％SDS中68℃下洗滌(見Ausubel，等人(編著)，1989，上文)。雜交條件可以根據已知的方法修改，取決于目的序列(見Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistryand Molecular Biology--Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter 2″Overview of principles of hybridization and the strategy ofnucleic acid probe assays″，Elsevier，New York)。通常，選擇嚴格條件比在確定的離子強度和pH下對特定序列的解鏈溫度低約5℃。
本發明還提供了用于預防和/或治療疼痛的組合物，其包含能夠降低神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑與可藥用載體的混合物。在實施方案中，該活性劑能夠減小(1)神經膠質細胞中的BDNF表達，(2)BDNF從神經膠質細胞的釋放或分泌，(3)神經膠質細胞的刺激，和/或(4)神經膠質細胞來源的BDNF活性。在一個實施方案中，這種組合物適于施用于CNS神經細胞或者組織，如脊髓組織或者細胞。在再一個實施方案中，這種組合物可以是BDNF表達或者活性的抑制劑。本文使用的“抑制劑”是直接或者間接下調或者減小BDNF基因的表達、BDNF mRNA或轉錄物的穩定性、BDNFmRNA或轉錄物的翻譯、BDNF多肽的成熟、轉運和/或BDNF多肽的分泌的化合物。在一個實施方案中，“抑制劑”還可以下調或者抑制BNDF激活劑(如增強BDNF基因表達的轉錄因子(如NFκB和Brn-3c))。在實施方案中，BDNF可以來自小膠質細胞、星形膠質細胞和/或少突膠質細胞。在再一個實施方案中，組合物可以適于鞘內施用。
本發明還提供了能夠減少神經膠質細胞來源的BDNF的上述組合物或者上述活性劑或者化合物用于治療或預防疼痛的用途。本發明還提供了能夠降低BDNF活性或者表達的上述組合物或者上述活性劑或者上述化合物用于制備治療或預防疼痛的藥物的用途。在另一實施方案中，可以配制活性劑用于施用于受試者的CNS組織，例如，CNS細胞。在再一個實施方案中，活性劑可以適于鞘內施用。在另一實施方案中，所述化合物可以例如是BDNF表達或者活性的抑制劑。
本發明還提供了包含上述組合物或者活性劑以及它們用于治療或預防疼痛的使用說明書的藥盒或包裝(例如，商業包裝)。
在多種實施方案中，能夠調節(例如減少)神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑可以治療性用于治療疼痛的制劑或者藥物中。本發明還提供了對應的醫學治療方法，其中將能夠調節(在一個實施方案中，減少)神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑的治療劑量以藥理學上可接受的制劑施用。因此，本發明提供了治療組合物，其包含能夠調節(在一個實施方案中，減小)BDNF活性或表達的化合物，和可藥用的賦形劑或者載體。治療組合物在生理上可接受的pH下可溶于水溶液中。
在一個實施方案中，可以施用本文描述的活性劑使得它與CNS組織或者CNS神經元接觸。本文使用的“中樞神經系統”或者CNS是神經系統的部分，包含腦和脊髓(例如，腰區中)。相比，“外周神經系統”或者PNS是神經系統的除了腦和脊髓之外的部分。在一個實施方案中，CNS組織是表面背角，在進一步的實施方案中，是I板層(lamina I)神經元。同樣，在一個實施方案中，可以施用本發明的活性劑以通過直接顱內或者鞘內注射或者注射到腦脊液施用以治療CNS細胞。備選地，可以以能夠穿過血腦屏障并進入CNS的形式全身(例如，靜脈內或者口服)施用活性劑。本文使用的“神經的”和“神經元的”可以互換使用并且都涉及神經元。“非神經元的”在本文中用于涉及不同于神經元的細胞，在神經系統的細胞的上下文中，涉及神經系統的不同于神經元(例如，神經膠質細胞)的細胞。
本發明還提供了藥物組合物(藥物)，其包含能夠調節，例如減少CNS細胞中的神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑。在一個實施方案中，此類組合物包括足以治療或減輕疼痛的治療或預防有效量的活性劑和可藥用載體。“治療有效量”指在必要的劑量和時間期限內，有效實現所希望的治療結果，如疼痛的減輕的量。能夠調節，在一個實施方案中減少神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑的治療有效量可以根據如下因素而變個體的疾病狀態、年齡、性別和體重，和化合物在個體中引起所希望的應答的能力。可以調節劑量方案以提供最佳治療應答。治療有效量還是治療有益效果超過化合物的毒性或者有害效果的量。“預防有效量”指在在必要的劑量和時間期限內，有效實現所希望的預防結果，如預防或抑制疼痛的發作或者增加疼痛的嚴重性的量。可以如上面對治療有效量描述的確定預防有效量。對于任何具體受試者，可以根據個體需要和施用或監督組合物施用的人的職業判斷隨時間調節特定劑量方案。
本文使用的“可藥用載體”或者“賦形劑”包括生理上相容的任何和所有溶劑、分散介質、包衣、抗細菌和抗真菌劑、等滲和吸收延遲劑，等等。在一個實施方案中，載體適于腸胃外施用。備選地，載體可以適于靜脈內、腹膜內、肌內、顱內、鞘內、舌下或者口服施用。可藥用載體包括無菌水溶液或者分散體和用于臨時制備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。此類介質和活性劑用于藥學活性物質的用途是本領域公知的。除了與活性化合物不相容的常規介質或者活性劑外，預期其用于本發明的藥物組合物。還可以將補充的活性化合物摻入組合物中。
治療組合物通常必須在生產和保存條件下是無菌和穩定的。可以將組合物配制為溶液、微乳劑、脂質體或者其他適于高藥物濃度的有序結構。載體可以是溶劑或者分散介質，其含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液態聚乙二醇，等等)，和其合適的混合物。例如，通過使用包衣，如卵磷脂，對于分散體的情況通過保持所需的顆粒大小和通過使用表面活性劑可以保持合適的流動性。在許多情況中，將優選在組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇，如甘露醇、山梨醇或者氯化鈉。通過在組合物中包括延遲吸收的物質，如單硬脂酸鹽和明膠可以引起可注射組合物的延長吸收。此外，能夠調節，(在一個實施方案中，減少或下調)神經膠質細胞來源的BDNF的化合物可以以定時釋放制劑，例如以包括緩釋聚合物的組合物施用。活性化合物可以用將保護該化合物免于快速釋放的載體配制，如控釋制劑，包括植入物和微囊化的遞送系統。可以使用生物可降解的生物相容的聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原、聚原酸酯、聚乳酸和聚乳酸聚乙醇酸共聚物(PLG)。許多用于制備此類制劑的方法已經申請專利并且是本領域技術人員公知的。
通過將活性化合物(例如，能夠減少神經膠質細胞來源的BDNF的化合物)與上述列舉的一種或幾種成分的組合(如果需要)一起以所需的量摻入合適的溶劑中，然后過濾除菌，可以制備無菌注射液。通常，將活性化合物摻入含有基本分散介質和來自上述的那些所需的其他成分的無菌載體中來制備分散體。對于用于制備無菌注射液的無菌粉劑，優選的制備方法是真空干燥和冷凍干燥，其產生活性成分加上來自其以前的無菌過濾的溶液的額外目的成分的粉末。根據本發明的備選方面，能夠調節，(在一個實施方案中，減少或下調)神經膠質細胞來源的BDNF的化合物可以用增強其溶解度的一種或多種額外化合物配制。
根據本發明的另一方面，包含能夠減少神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑的本發明的治療組合物可以在容器或者包裝(例如，商業包裝)中提供，該容器或者包裝還包含它們用于實現疼痛的治療或預防的使用說明書。
考慮到神經膠質細胞來源的BDNF的減少與如本文描述的痛覺的減輕相關，本發明的另一方面是通過對受試者施用編碼BDNF抑制劑的核酸分子，如dsRNA、siRNA、反義寡核苷酸或者核酶來治療疼痛。合適的施用方法包括基因治療方法(見下文)。
使用諸如DNA的直接注射、受體介導的DNA攝入、病毒介導的轉染或非病毒轉染和基于脂類的轉染，可以將本發明的核酸遞送到體內細胞，所有這些方法可以包括使用基因治療載體。直接注射已經用于向細胞體內導入裸DNA(見例如，Acsadi等人(1991)Nature 332815-818；Wolff等人(1990)Science 2471465-1468)。可以使用用于將DNA注射到體內細胞的遞送裝置(例如，“基因槍”)。此類裝置可以通過商業途徑獲得(例如，從BioRad)。還可以通過將DNA與陽離子如聚賴氨酸絡合(該陽離子偶聯到細胞表面受體的配體)向細胞導入裸DNA(見例如，Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.26314621；Wilson等人(1992)J.Biol.Chem.267963-967；和美國專利號5,166,320)。DNA配體絡合物與受體的結合可以促進通過受體介導的內吞對DNA的攝入。可以用連接到腺病毒殼體的DNA-配體復合體避免細胞內溶酶體對復合體的降解，所述腺病毒殼體破壞內體，從而向細胞質釋放物質(見例如Curiel等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888850；Cristiano等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA902122-2126)。
缺陷逆轉錄病毒被良好表征用作基因治療載體(綜述見Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。用于產生重組逆轉錄病毒和用這種病毒在體外或者體內感染細胞的方案可以見Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.M.等人(eds.)Greene Publishing Associates，(1989)，Sections9.10-9.14和其他標準實驗室手冊。合適的逆轉錄病毒的實例包括本領域技術人員公知的pLJ、pZIP、pWE和pEM。合適的包裝病毒株的實例包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am.。逆轉錄病毒已經用于向許多不同的細胞類型體外和/或體內導入多種基因，所述細胞類型包括上皮細胞、內皮細胞、淋巴細胞、成肌細胞、肝細胞、骨髓細胞(見例如，Eglitis，等人(1985)Science 2301395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA853014-3018；Armentano等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA876141-6145；Huber等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA838039-8043；Ferry等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA888377-8381；Chowdhury等人(1991)Science 2541802-1805；vanBeusechem等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897640-7644；Kay等人(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等人(1993)J.Immunol.1504104-4115；美國專利號4,868,116；美國專利號4,980,286；PCT申請WO 89/07136；PCT申請WO 89/02468；PCT申請WO 89/05345；和PCT申請WO 92/07573)。
對于用作基因治療載體，可以操作腺病毒的基因組使得它編碼和表達本發明的核酸，但是它在正常溶解病毒生命周期中復制的能力方面是失活的。見例如Berkner等人(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld等人(1991)Science 252431-434；和Rosenfeld等人(1992)Cell 68143-155。來自腺病毒株Ad型5dl324或者腺病毒的其他毒株(例如，Ad2、Ad3、Ad7等等)的合適的腺病毒載體是本領域技術人員公知的。重組腺病毒是有利的，因為它們不需要分裂細胞以成為有效的基因遞送載體并且可以用于感染多種細胞類型，包括氣管上皮(Rosenfeld等人(1992)上文引用)、內皮細胞(Lemarchand等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896482-6486)、肝細胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902812-2816)和肌細胞(Quantin等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892581-2584)。
腺伴隨病毒(AAV)可以用作基因治療載體以為了基因治療目的遞送DNA。AAV是天然發生的缺陷病毒，其需要另一種病毒，如腺病毒或者皰疹病毒作為輔助病毒以有效復制和產生生命周期(Muzyczka等人Curr.Topics in Micro，and Immunol.(1992)15897-129)。AAV可以用于將DNA整合到非分裂細胞(見例如，Flotte等人(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski等人(1989)J.Virol.633822-3828；和McLaughlin等人(1989)J.Virol.621963-1973)中。如在Tratschin等人(1985)Mol.Cell.Biol.53251-3260中描述的AAV載體可以用于向細胞引入DNA(見例如，Hermonat等人(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA816466-6470；Tratschin等人(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford等人(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin等人(1984)J.Virol.51611-619；和Flotte等人(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)。慢病毒基因治療載體也可以適用于本發明。
用于基因治療的一般是本領域已知的。見例如，Anderson等人的美國專利號5,399,346，Baetge等人的PCT公開WO 95/05452中描述了用于遞送遺傳物質的生物相容的膠囊，以前已經報導了基因向造血細胞轉移的方法(見Clapp，D.W.，等人，Blood 781132-1139(1991)；Anderson，Science 288627-9(2000)；和Cavazzana-Calvo等人，Science 288669-72(2000))。
考慮到神經膠質細胞來源的BDNF和疼痛的相關性，能夠減少如神經膠質細胞來源的BDNF的化合物可以用于預防和治療疼痛。因此，本發明涉及鑒定和表征能夠減少神經膠質細胞來源的BDNF的化合物的篩選方法。
因此，本發明還提供了確定候選或者受試化合物是否能夠減小神經膠質細胞來源的BDNF活性或表達并且又可用于預防和治療疼痛的方法。這種方法可以包括在候選化合物存在與不存在下測定合適的系統中BDNF活性和/或表達。在一個實施方案中，該方法包括將具有BDNF活性或者表達BDNF的神經膠質細胞與所述候選化合物接觸并測定在受試化合物存在下，BDNF活性或者表達是否降低。BDNF活性或者表達的降低表明受試化合物可以用于治療或預防疼痛。在一個實施方案中，神經膠質細胞是受刺激的神經膠質細胞(例如，ATP刺激的神經膠質細胞或者外周神經或者神經束損傷的突觸后的神經膠質細胞)。在另一實施方案中，神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。在再一個實施方案中，神經膠質細胞內源地表達BDNF。在另一實施方案中，上述神經膠質細胞已經基因工程化以表達BDNF基因。本文描述的方法可以用于篩選受試化合物，如dsRNA、siRNA分子、siRNA樣分子、核酶和/或反義寡核苷酸。
本發明還提供了鑒定或表征可以用于治療或預防疼痛的化合物的另一種篩選方法。在一個實施方案中，該方法包括將神經膠質細胞與候選化合物接觸并確定在受試化合物存在下，神經膠質細胞刺激是否降低。神經膠質細胞活化的降低表明該受試/候選化合物可以用于治療或預防疼痛。在一個實施方案中，神經膠質細胞是受刺激的神經膠質細胞(例如，ATP刺激的神經膠質細胞或者外周神經或者神經束損傷的突觸后的神經膠質細胞)。在另一實施方案中，神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
如上面提到的，本發明還涉及鑒定和表征能夠減少BDNF基因表達的化合物的方法。這種方法可以包括測定在受試化合物存在和不存在下BDNF基因的表達。通過檢測對應的RNA或者蛋白質，或者通過使用合適的報導構建體可以測量這種基因表達，所述構建體包含通常與有效連接報導基因的BDNF基因結合的轉錄調節元件。當第一種核酸序列與第二種核酸序列置于功能關系中時，第一種核酸序列可以“有效連接”第二種核酸序列。例如，如果啟動子影響編碼序列的轉錄或表達，那么啟動子有效連接編碼序列。通常，有效連接的DNA序列是連續的，并且必要時連接可讀框中的兩個蛋白質編碼區。然而，因為例如，增強子當與啟動子相隔幾千堿基時通常是有功能的，并且內含子序列可以是不同的長度，一些多核苷酸元件可以是有效連接的但不是連續的。“轉錄調節元件”是通用術語，其指DNA序列，如起始和結束信號、增強子和啟動子、剪接信號、多聚腺苷酸化信號，其誘導或者控制它們有效連接的蛋白質編碼序列的轉錄。可以在轉錄或者翻譯水平上，例如，通過產生的RNA或者蛋白質的量測量這種報導基因的表達。例如，通過RNA印跡分析或者通過逆轉錄酶聚合酶鏈式反應(RT-PCR)方法可以檢測RNA(見例如，Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(第二版)，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，USA)。可以使用親和試劑(例如，抗體或其片段[方法見例如，Harlow，E.和Lane，D(1988)AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY]；結合蛋白質的配體)或者通過其他性質(例如，對于綠色熒光蛋白，通過熒光)或者通過測量蛋白質的活性(其可以使得酶促活性產生可檢測的產物(例如，具有改變的分光性質)或者可檢測的表型(例如，細胞生長中的改變)來檢測。合適的報導基因包括但不限于氯霉素乙酰轉移酶、β-D半乳糖苷酶、螢光素酶，和/或綠色熒光蛋白。
在一個實施方案中，可以進一步分析候選化合物以測定它是否能夠調節BDNF介導的過程或者BDNF活性。
本發明還提供了化合物的另一篩選方法，所述化合物可以基于它們減小神經膠質細胞分泌BDNF的能力治療或預防疼痛。在一個實施方案中，該方法包括在能夠分泌BDNF的細胞(如神經膠質細胞)存在下接觸受試化合物并確定在受試化合物存在下，BDNF的分泌是否減少。BDNF從神經膠質細胞的分泌減少表明該受試化合物可以用于治療或預防疼痛。在一個實施方案中，神經膠質細胞是受刺激的神經膠質細胞(例如，ATP刺激的神經膠質細胞或者外周神經或者神經束損傷的突觸后的神經膠質細胞)。在一個實施方案中，神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
本文提到的篩選方法可以使用單種受試化合物或者多種受試化合物或者受試化合物文庫(例如，組合文庫)。對于后一種情況，還可以鑒定和表征通過化合物組合提供的協同作用。上面提到的化合物可以用于預防和/或治療疼痛，或者可以用作前導化合物用以開發和測試具有提高的特異性、功效和/或藥理學(例如，藥物代謝動力學)性質的額外化合物。在一個實施方案中，化合物可以是前體藥物，其在合適的作用部位，例如，在CNS組織(例如，脊髓中)改變成它的活性形式。在一些實施方案中，可以自動化本發明的篩選/測試方法的一個或多個步驟。
盡管本文公開了本發明的多種實施方案，但是可以根據本領域技術人員的一般常識在本發明范圍內進行許多改編和修改。此類修改包括本發明的任一方面的已知等同物的替代，以便以基本上相同的方式實現相同的結果。數字范圍包括定義該范圍的數字。在權利要求中，單詞“包含”用作開放式術語，基本上等同于短語“包括，但不限于”。下面的實施例闡明本發明的不同方面，并且不限定如權利要求書中公開的本發明的寬泛方面。
實施例實施例1-材料和方法外周神經損傷模型和行為研究通過在成年雄性Sprague-Dawley大鼠的坐骨神經周圍手術植入聚乙烯套囊(長2mm，內徑0.7mm)誘導外周神經損傷3，17。對于用作對照的假手術，動物將進行所有手術步驟，只是不植入套囊。評估對機械刺激的50％縮足閾值，或者50％縮足閾值3，18。神經手術后，僅機械閾值(14-17天內)逐漸下降到2g或者以下的動物用于進一步實驗。在用該模型誘導外周神經損傷的動物中，在神經套囊同側的脊髓中有小膠質細胞激活，如通過小膠質細胞活化標記OX-42的增加的標記所示(圖5B和5C)。
切片制備.如以前描述的從成年(＞50日齡)雄性大鼠制備脊髓的旁矢狀面切片(300-350μm)31。將切片用含有(mM)126NaCl、26NaHCO3、10葡萄糖、2.5KCl、2CaCl2、2MgCl2、1.25NaH2PO4的人工腦脊液(ACSF)(用95％O2/5％CO2冒泡，pH～7.4)連續灌流(2-3ml min-1)。
記錄.對于穿孔膜片鉗記錄，將吸管吸頭裝入含有(mM)130甲基硫酸鉀((KMeSO4)、5CsCl、2MgCl2、11BAPTA、1CaCl2、4ATP、0.4GTP、10HEPES(～pH 7.4)的溶液。將吸管回裝補充25μg ml-1短桿菌肽D(短桿菌肽貯存液為二甲亞砜(DMSO)中10mg ml-1)的該相同溶液。當接入電阻穩定在25-45MΩ時，選擇以該模式記錄。對于全細胞電位鉗記錄，將吸管裝入缺少短桿菌肽D的上述溶液。通過經由微量吸管通過壓力注射局部應用GABA10-50ms。如以前描述的進行PSC的數據獲取和分析19；如以前描述的校正膜電位測量20。輸入電阻和LI神經元的靜息膜電位都沒有受到用于該研究的任何藥物或者方案的顯著影響。除了指出時，所有測量都以平均值±SEM給出。對于平均值的比較，使用斯氏t檢驗測試統計學顯著性，卡方檢驗用于列聯表，方差的混合設計分析(因此Tukey′s HSD檢驗)用于重復測量。
小膠質細胞培養物.在如所述的標準條件下制備大鼠原代培養的小膠質細胞2，21。簡言之，從新生Wistar大鼠制備混合的神經膠質細胞培養物并在含有10％胎牛血清的DMEM培養基中保持10-16天。通過輕微搖動培養瓶將小膠質細胞與原代培養物分離并在塑料皿上再次平板接種。使用細胞刮棒從皿表面除去細胞并用100μl PBS收集；隨后，使用細胞計數器測量小膠質細胞的細胞密度并調節PBS的體積以得到1000個細胞/10μl的最終密度。該方法產生＞95％純度的小膠質細胞培養物。對于ATP刺激，將純化的小膠質細胞與ATP(50μM)溫育1小時。
鞘內注射和ELISA.在藥物施用前至少3天，將大鼠用戊巴比妥鈉(65mg kg-1)麻醉并將腰部脊椎導管(PE-10聚乙烯管)插入到鞘內空間22。在從手術回收時，通過鞘內利多卡因注射(2％，30μl)誘導下部身體麻醉以證實正確的導管定位。僅將顯示出對利多卡因的適當的暫時麻醉，以及缺少運動缺陷的動物用于行為測試。藥物/載體施用后，處死動物并解剖它們的脊柱以在視覺上證實導管的正確放置。藥物包括BDNF(10μg/天或者10μg/注射)和抗-TrkB抗體(12μg每2小時或者30μg/注射)、TrkB-Fc(5μg/注射)，它們都用鹽水+10％(v/v)DMSO制備。對于病毒介導的轉導，施用編碼BDNF和EGFP28的腺病毒載體一次(20μl；2.0×1010PFU/ml)。在使用的劑量下，沒有化合物產生運動障礙或者鎮靜，如通過抓握、翻正和放置反射和行為觀察評估23。對于其中用小干擾RNA(siRNA)脂轉染小膠質細胞的實驗，從Dharmacon Inc得到抗-BDNF和亂序siRNA。BDNF siRNA由四種合并的21-核苷酸雙鏈體組成。四種雙鏈體的序列如下61)TCGAAGAGCTGCTGGATGA(SEQ ID NO7)2)TATGTACACTGACCATTAA(SEQ ID NO8)3)GAGCGTGTGTGACAGTATT(SEQ ID NO9)4)GAACTACCCAATCGTATGT(SEQ ID NO10)按照生產商的使用說明，用BDNF或者亂序siRNA與Lipofectamine2000TM轉染小膠質細胞培養物。簡言之，將siRNA和lipofectamine用無血清的培養基稀釋，混合并加入到小膠質細胞培養物中。允許轉染進行5小時并如上所述收集小膠質細胞用于隨后的鞘內注射。在所有情況中，將30μl小膠質細胞+上清液鞘內注射到正常大鼠中。
免疫組織化學.在灌流的自由漂浮的切片上進行免疫組織化學。標記CD3/CD11b的OX-42(Cedarlane，1∶1000)用作小膠質細胞的特異標記物。在4℃與一級抗體過夜溫育后，沖洗切片并用生物素化的抗-小鼠IgG(1∶1000)在室溫下溫育1小時。然后將切片再次沖洗并浸入抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復合體(Vector Laboratories)1小時。最后，用含有0.003％過氧化氫的0.05％3，3’-二氨基聯苯胺(DAB)顯色陽性標記。
為了測量BDNF分泌，在如上述的多種實驗條件下制備小膠質細胞并在37℃溫育6小時以對上面的體內實驗建模。
鈣成像.制備脊髓切片用于鈣成像和如以前描述的測試對GABA的應答5。如上制備小膠質細胞的原代培養物，轉移到標準蓋玻片中并與HEPES緩沖鹽水(+0.01％DMSO)中的2.5μM Fura-2-AM溫育45分鐘。熒光團負荷后，使用從微量移液器快速(～5s)應用ATP(10μM)引起各小膠質細胞中[Ca2+]i的改變。使用在裝備表面熒光光學儀器的Zeiss Axioscope上的40倍水浸物鏡通過熒光分析測量[Ca2+]i。用連接CCD照像機的TILLPhotonics單色器獲得圖像，并在明顯不同的神經元細胞體上畫上目的區域(用于計算比例)。
實施例2結果為了研究小膠質細胞是否可以影響I板層(LI)神經元中的E陰離子，申請人通過鞘內導管對幼稚大鼠的腰部脊柱水平體內施用小膠質細胞，如以前描述2，隨后在從這些動物制備的急性脊髓切片中LI神經元在體外進行穿孔膜片鉗和全細胞記錄。在處死每只動物前，申請人測定感受傷害縮足閾值以證實存在或不存在響應該處理的觸覺異常性疼痛2，3。在申請人施用了用ATP(50μM)刺激的小膠質細胞的動物中，感受傷害縮足閾值不斷下降，約5小時后達到最小值(圖1A)。相比，在用對照——未受刺激的小膠質細胞處理的動物中，縮足閾值沒有改變(圖1A)。申請人發現皮質和脊柱來源的小膠質細胞導致縮足閾值的相當水平的降低。因為皮質的較大尺寸，它產生更多小膠質細胞并且因此用于隨后的研究中。
在鞘內小膠質細胞施用后5小時從切片進行電生理記錄。使用來自LI神經元的電位鉗記錄，申請人發現在來自用對照小膠質細胞注射的大鼠的脊髓切片中，E陰離子為-68.3±1.8mV(n＝6；圖1B)。另一方面，在來自施用ATP刺激的小膠質細胞后大鼠的LI神經元中，E陰離子為-61.6±1.1mV(n＝16，p＜0.0001)。使用電流鉗記錄，申請人發現GABA導致來自對照動物的LI神經元中的超極化(圖1C，上圖)，而在來自已經施用ATP刺激的小膠質細胞的大鼠的神經元中，GABA引起去極化(圖1C，下圖)。從而，鞘內施用ATP刺激的小膠質細胞導致LI神經元中E陰離子的去極化偏移并將GABA引起的應答從超極化轉變成去極化。這些抑制性應答的改變與ATP刺激的小膠質細胞產生的感受傷害縮足閾值的減小相吻合。
為了實現E陰離子的偏移，ATP刺激的小膠質細胞可以對LI背角神經元發信號。已知活化的小膠質細胞分泌多種生物學活性信號傳遞分子，其中之一是BDNF，其已經涉及致敏和炎癥后背角神經元的超敏25，26和海馬中陰離子梯度偏移27。申請人對幼稚大鼠鞘內施用BDNF并且發現它產生縮足閾值的減小，該減小與ATP刺激的小膠質細胞產生的縮足閾值的減小相當(圖2A)。
為了確定BDNF是否可以導致E陰離子的偏移，申請人將其bath-applied到得自幼稚大鼠的脊髓切片。申請人發現用BDNF處理(＞90分鐘)的切片中LI神經元(n＝9)中E陰離子比來自對照、未處理的切片的LI神經元的E陰離子顯著較不負(n＝9；p＜0.005；圖2B)。從而，在BDNF施用期間，對GABA的應答是刺激性的，而不是抑制性的。申請人利用鈣成像，通過在LI神經元(n＝96)中快速GABA應用后監視細胞內鈣([Ca2+]i)的水平研究了該問題。在用BDNF灌注期間，并且在谷氨酸受體阻斷劑存在下，隨著[Ca2+]i的升高，應答GABA的神經元的比例隨時間增加，在80到120分鐘之間記錄為達到31％的神經元(p＜0.05；圖2C)。通過bath applying GABAA受體阻斷劑荷包牡丹堿阻止了[Ca2+]i的升高(n＝18；p＜0.05)，證實該效應由GABAA受體介導。從而，申請人推斷在切片中急性施用BDNF導致E陰離子的去極化偏移，并且在約30％的細胞中導致GABA產生凈興奮。
為了確定在體內持續長期暴露于BDNF的效果，申請人通過鞘內導管施用BDNF轉導重組腺病毒(adBDNF)28(n＝16)。該adBDNF導致注射后測試的4天內縮足閾值的不斷減小。相比，注射不編碼BDNF的對照腺病毒在相同的時間內對縮足閾值沒有影響(n＝6；p＜0.005；圖2D)。因為adBDNF處理的長期效果，申請人能夠測試來自被處理的動物的切片中E陰離子的改變。申請人發現來自adBDNF注射的大鼠(n＝7)的LI神經元中E陰離子比來自用對照腺病毒處理的大鼠(n＝4；p＜0.01；圖2E，F)測量的E陰離子明顯較不負。此外，GABA應用導致來自adBDNF注射的大鼠的一些LI神經元引起動作電位(測試的7種細胞的兩種)，而這在對照條件下從沒有觀察到。從而，像急性施用BDNF一樣，持續局部釋放導致縮足閾值的減小、E陰離子的去極化偏移，并且可以將GABA的作用從抑制性轉向興奮性。
這些結果表明外源BDNF足夠導致觸覺異常性疼痛和E陰離子的偏移。為了研究BDNF是否可能是外周神經損傷后遺癥的內源介體，申請人使用針對TrkB受體的功能阻斷性抗體(抗-TrkB)以及BDNF螯合性融合蛋白(TrkB-Fc)，已經表明它們都阻斷BDNF的作用5，25，29。申請人通過鞘內導管對在外周神經損傷后兩周已經產生異常性疼痛的大鼠施用抗-TrkB或者TrkB-Fc。施用這些試劑之前和之后測量縮足閾值。申請人發現這些試劑的每一種都急性逆轉縮足閾值的減小(n分別＝7和4，p＜0.05；圖3A)。相比，對具有外周神經損傷的大鼠進行載體施用不產生縮足閾值的改變(圖3A)。為了確定BDNF-TrkB信號傳遞對于LI神經元中E陰離子的神經損傷誘導的偏移是否是必需的，申請人檢查了對從外周神經損傷后兩周具有異常性疼痛大鼠得到的脊髓切片急性應用抗-TrkB的效果。申請人發現用抗-TrkB處理的切片(n＝7)中LI神經元的E陰離子比載體處理的切片中E陰離子更負(n＝6；p＜0.05；圖3B，C)。總之，這些發現表明內源BDNF對于維持觸覺異常性疼痛和外周神經損傷導致的LI神經元中E陰離子的去極化偏移是必要的。
為了測試用BDNF-TrkB信號傳遞干擾是否將防止通過施用ATP刺激的小膠質細胞產生的異常性疼痛和LI神經元E陰離子的偏移，申請人施用ATP刺激的小膠質細胞以及抗-TrkB或者TrkB-Fc。施用ATP刺激的小膠質細胞以及這些阻斷劑的任一種在鞘內注射后5小時內不導致縮足閾值的改變(n分別＝8和7；圖4A)。相比，不用這些試劑，施用ATP刺激的小膠質細胞后進行性產生異常性疼痛(n＝8)。用ATP刺激的小膠質細胞可以引起從脊髓內的細胞釋放BDNF。阻斷劑可以干擾來自該來源而不是來自施用的小膠質細胞本身的BDNF的作用。為了區分這兩種可能性，申請人用針對BDNF的雙鏈RNA(BDNF siRNA6)預處理培養的小膠質細胞。該預處理后，將小膠質細胞用ATP刺激，然后當鞘內注射到幼稚大鼠時，不能導致縮足閾值的改變(n＝7；圖4A)。為了控制siRNA的可能的非特異作用，申請人在ATP刺激前用BDNF siRNA的亂序形式處理小膠質細胞；這些小膠質細胞引起強烈的異常性疼痛(n＝4；圖4A)。而且，用抗TrkB或用BDNF siRNA處理的小膠質細胞中ATP引起的鈣應答與載體處理的對照小膠質細胞沒有不同，表明抗TrkB或用BDNF siRNA處理不影響小膠質細胞對ATP的應答(圖4D)。然而，用BDNF-TrkB信號傳遞干擾阻止了小膠質細胞誘導的觸覺異常性疼痛。
ATP刺激的小膠質細胞產生的E陰離子中的去極化偏移可以通過用BDNF-TrkB信號傳遞干擾來阻止。申請人發現來自接受ATP刺激的小膠質細胞以及抗-TrkB或者BDNF siRNA預處理后動物的LI神經元中E陰離子與來自接受未受刺激的小膠質細胞的動物的LI神經元中的無顯著差異。然而，來自這些組大鼠的LI神經元中E陰離子與接受了ATP刺激的小膠質細胞與載體的動物的LI神經元中的相比明顯更負(圖4C)。從而，抗-TrkB和BDNF siRNA阻止了ATP刺激的小膠質細胞誘導的E陰離子中的偏移。
此外，ATP刺激(n＝3)但不是載體對照(n＝4)導致從培養的小膠質細胞釋放BDNF(p＜0.001；圖4E)。該ATP的作用通過用P2X受體阻斷劑TNP-ATP處理阻斷(n＝3；p＜0.05)。此外，用BDNF siRNA預處理小膠質細胞阻止通過ATP刺激導致的BDNF釋放(n＝3；p＜0.001)。將這些發現與上面的行為和電生理學結果一起考慮，申請人推斷ATP刺激的小膠質細胞引起的縮足閾值的減小和LI神經元中E陰離子的偏移需要BDNF-TrkB信號傳遞并且BDNF的來源是小膠質細胞它們自身。
為了測試抑制小膠質細胞ATP信號傳遞是否可以抑制外周神經損傷導致的E陰離子的偏移，申請人使用了TNP-ATP，已經表明它通過作用于小膠質細胞中P2X而逆轉神經損傷誘導的觸覺異常性疼痛2。申請人將TNP-ATP急性地bath-applied于來自外周神經損傷后2周從異常性疼痛大鼠得到的脊髓切片。在TNP-ATP存在下，LI神經元的E陰離子為-59.3±1.8mV(n＝6)，其與來自神經損傷的動物的未處理切片的LI神經元中的E陰離子(-49.3±4.5mV，n＝6，p＜0.05)相比明顯更負。從而，申請人斷定必需P2X受體激活來維持具有外周神經損傷的E陰離子動物中去極化偏移。此外，申請人發現所有實驗條件下縮足閾值和LI神經元中E陰離子之間的負相關(圖4F)，提示E陰離子作為小膠質細胞和異常性疼痛之間關鍵的機械聯系。
顯然在腦14和脊髓15中抑制性突觸的正常調諧需要神經元來源的BDNF；實際上，已知引發長期突觸后塑性的刺激模式已經被證明引起從表面背角中初級傳入釋放BDNF11。然而，似乎正常塑性僅僅必需TrkB受體的快速激活，因為已經記載BDNF螯合抗體的應用僅僅減弱長期塑性的誘導，對于維持沒有作用16。相比，抑制的病理生理阻遏可能需要重復活化TrkB受體在本文中表明，通過應用中和抗體(抗-TrkB)抑制TrkB快速減弱疼痛超敏反應，以及減小來自神經損傷的LI神經元陰離子梯度。從而，本文中描述的研究表明靶定小膠質細胞來源的BDNF對于神經性疼痛的治療干預而不是操作所有BDNF作用的益處，因為它代表消除催化該疾病的過程，而使對于正常神經元功能關鍵的過程(例如，BDNF的神經元庫)保持完整。因此，在一個實施方案中，本文描述的方法對正常神經元過程沒有影響或者基本沒有影響。
在本申請全文中，引用多種參考文獻來更完整地描述本發明所述領域狀態。將這些參考文獻的公開引入本公開作為參考。
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<220>
<221>CDS<222>(28)..(774)<400>3cctgagttcc accaggtgag aagagtg atg acc atc ctt ttc ctt act atg gtt 54Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val1 5att tca tac ttc ggt tgc atg aag gcg gcg ccc atg aaa gaa gta aac102Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met Lys Ala Ala Pro Met Lys Glu Val Asn10 15 20 25gtc cac gga caa ggc aac ttg gcc tac cca ggt gtg cgg acc cat ggg150Val His Gly Gln Gly Asn Leu Ala Tyr Pro Gly Val Arg Thr His Gly30 35 40act ctg gag agc gtg aat ggg ccc agg gca ggt tcg aga ggt ctg acg198Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly Pro Arg Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr45 50 55acg aca tca ctg gct gac act ttt gag cac gtc atc gaa gag ctg ctg246Thr Thr Ser Leu Ala Asp Thr Phe Glu His Val Ile Glu Glu Leu Leu60 65 70gat gag gac cag aag gtt cgg ccc aac gaa gaa aac cat aag gac gcg294Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg Pro Asn Glu Glu Asn His Lys Asp Ala75 80 85gac ttg tac act tcc cgg gtg atg ctc agc agt caa gtg cct ttg gag342Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val Met Leu Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu90 95 100 105cct cct cta ctc ttt ctg ctg gag gaa tac aaa aat tac ctg gat gcc390Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala110 115 120gca aac atg tct atg agg gtt cgg cgc cac tcc gac cct gcc cgc cgt438Ala Asn Met Ser Met Arg Val Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg125 130 135ggg gag ctg agc gtg tgt gac agt att agc gag tgg gtc aca gcg gca486Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala140 145 150
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<400>4Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met1 5 10 15Lys Ala Ala Pro Met Lys Glu Val Asn Val His Gly Gln Gly Asn Leu20 25 30Ala Tyr Pro Gly Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly35 40 45Pro Arg Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Thr Thr Ser Leu Ala Asp Thr50 55 60Phe Glu His Val Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg65 70 75 80Pro Asn Glu Glu Asn His Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val85 90 95Met Leu Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu100 105 110Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val115 120 125Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp130 135 140Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp145 150 155 160Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys
165 170 175Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly180 185 190Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser195 200 205Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser210 215 220Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val225 230 235 240Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg245<210>5<211>750<212>DNA<213>大鼠(Rattus norvegicus)<220>
<221>CDS<222>(1)..(747)<400>5atg acc atc ctt ttc ctt act atg gtt att tca tac ttc ggt tgc atg48Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met1 5 10 15aag gct gcg ccc atg aaa gaa gca aac gtc cac gga caa ggc aac ttg96Lys Ala Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Val His Gly Gln Gly Asn Leu20 25 30gcc tac cca gct gtg cgg acc cat ggg act ctg gag agc gtg aat ggg144Ala Tyr Pro Ala Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly
35 40 45ccc agg gca ggt tcg aga ggt ctg acg acg acg tcc ctg gct gac act192Pro Arg Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Thr Thr Ser Leu Ala Asp Thr50 55 60ttt gag cac gtg atc gaa gag ctg ctg gat gag gac cag aag gtt cgg240Phe Glu His Val Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg65 70 75 80ccc aac gaa gaa aac cat aag gac gcg gac ttg tac act tcc cgg gtg288Pro Asn Glu Glu Asn His Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val85 90 95atg ctc agc agt caa gtg cct ttg gag cct cct ctg ctc ttt ctg ctg336Met Leu Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu100 105 110gag gaa tac aaa aat tac ctg gat gcc gca aac atg tct atg agg gtt384Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val115 120 125cgg cgc cac tcc gac ccc gcc cgc cgt ggg gag ctg agc gtg tgt gac432Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp130 135 140agt att agt gag tgg gta acg gcg gca gac aaa aag act gca gtg gac480Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp145 150 155 160atg tcg ggc ggg acg gtc aca gtc ctt gaa aag gtc cct gta tca aaa528Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys165 170 175ggc caa ctg aag caa tac ttc tac gag acc aag tgc aat ccc atg ggt576Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly180 185 190tac aca aaa gaa ggc tgc agg ggc ata gac aaa agg cat tgg aac tcc624Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser195 200 205cag tgc cga act acc cag tcg tac gtg cgg gcc ctt acc atg gat agc672Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser
210 215 220aaa aag aga att ggc tgg cga ttc ata agg ata gac act tct tgt gta720Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val225 230 235 240tgt aca ttg acc att aaa agg gga aga tag750Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg245<210>6<211>249<212>PRT<213>大鼠<400>6Met Thr Ile Leu Phe Leu Thr Met Val Ile Ser Tyr Phe Gly Cys Met1 5 10 15Lys Ala Ala Pro Met Lys Glu Ala Asn Val His Gly Gln Gly Asn Leu20 25 30Ala Tyr Pro Ala Val Arg Thr His Gly Thr Leu Glu Ser Val Asn Gly35 40 45Pro Arg Ala Gly Ser Arg Gly Leu Thr Thr Thr Ser Leu Ala Asp Thr50 55 60Phe Glu His Val Ile Glu Glu Leu Leu Asp Glu Asp Gln Lys Val Arg65 70 75 80Pro Asn Glu Glu Asn His Lys Asp Ala Asp Leu Tyr Thr Ser Arg Val85 90 95Met Leu Ser Ser Gln Val Pro Leu Glu Pro Pro Leu Leu Phe Leu Leu100 105 110
Glu Glu Tyr Lys Asn Tyr Leu Asp Ala Ala Asn Met Ser Met Arg Val115 120 125Arg Arg His Ser Asp Pro Ala Arg Arg Gly Glu Leu Ser Val Cys Asp130 135 140Ser Ile Ser Glu Trp Val Thr Ala Ala Asp Lys Lys Thr Ala Val Asp145 150 155 160Met Ser Gly Gly Thr Val Thr Val Leu Glu Lys Val Pro Val Ser Lys165 170 175Gly Gln Leu Lys Gln Tyr Phe Tyr Glu Thr Lys Cys Asn Pro Met Gly180 185 190Tyr Thr Lys Glu Gly Cys Arg Gly Ile Asp Lys Arg His Trp Asn Ser195 200 205Gln Cys Arg Thr Thr Gln Ser Tyr Val Arg Ala Leu Thr Met Asp Ser210 215 220Lys Lys Arg Ile Gly Trp Arg Phe Ile Arg Ile Asp Thr Ser Cys Val225 230 235 240Cys Thr Leu Thr Ile Lys Arg Gly Arg245<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>7tcgaagagct gctggatga 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>8tatgtacact gaccattaa 19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>9gagcgtgtgt gacagtatt 19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的寡核苷酸<400>10gaactaccca atcgtatgt 19
權利要求
1.治療或預防受試者中疼痛的方法，所述方法包括減少所述受試者中神經膠質細胞來源的BDNF。
2.權利要求1的方法，所述方法包括減小選擇如下的一種參數(a)神經膠質細胞中的BDNF表達；(b)BDNF從神經膠質細胞的釋放或分泌；(c)神經膠質細胞的刺激；(d)神經膠質細胞來源的BDNF活性；和(e)(a)到(d)的任一組合。
3.權利要求1的方法，其中所述神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
4.權利要求1的方法，其中所述神經膠質細胞位于所述受試者的中樞神經系統中。
5.權利要求1的方法，其中所述BDNF包含與選自SEQ ID NO2、4、6和其片段的序列實質同一的氨基酸序列。
6.權利要求1的方法，其中所述疼痛的信號在外周神經系統(PNS)細胞或者中樞神經系統(CNS)細胞中產生。
7.權利要求1的方法，其中所述疼痛是神經性疼痛。
8.權利要求7的方法，其中所述神經性疼痛與神經或者神經束損傷有關。
9.權利要求7的方法，其中所述神經性疼痛選自軀體和內臟疼痛。
10.權利要求7的方法，其中所述神經性疼痛與化學損傷有關。
11.權利要求1的方法，其中所述疼痛選自慢性痛、慢性炎性痛、與關節炎相關的疼痛、纖維肌痛、背痛、癌癥相關的疼痛、消化性疾病相關的疼痛、克隆病相關的疼痛、自身免疫病相關的疼痛、內分泌疾病相關的疼痛、糖尿病性神經病相關的疼痛、幻肢痛、自發性疼痛、慢性術后疼痛、慢性顳下頜痛、灼痛、皰疹后神經痛、艾滋病相關的疼痛、I和II型復合性區域疼痛綜合征、三叉神經痛、慢性背痛、與脊髓損傷相關的疼痛、與藥物攝入相關的疼痛和再發的急性痛。
12.權利要求1的方法，其中所述方法包括對所述受試者施用能夠減少所述受試者中神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑。
13.權利要求12的方法，其中所述活性劑能夠減少或者抑制神經膠質細胞的刺激。
14.權利要求13的方法，其中所述活性劑是ATP受體的抑制劑。
15.權利要求14的方法，其中所述ATP受體是P2X受體。
16.權利要求15的方法，其中所述活性劑是TNP-ATP。
17.權利要求12的方法，其中所述活性劑能夠抑制BDNF表達。
18.權利要求17的方法，其中所述活性劑選自反義分子、核酶、siRNA和siRNA樣分子。
19.權利要求18的方法，其中所述活性劑是反義分子。
20.權利要求19的方法，其中所述反義分子與編碼BDNF的mRNA的部分實質互補。
21.權利要求19的方法，其中所述反義分子互補于與選自SEQ IDNO1、3和5的序列實質同一的核酸序列的部分。
22.權利要求21的方法，其中所述活性劑是siRNA。
23.權利要求22的方法，其中所述siRNA的序列與選自SEQ ID NO7、8、9、10和其片段的序列實質同一。
24.權利要求12的方法，其中所述活性劑鞘內施用。
25.權利要求1的方法，其中所述受試者是哺乳動物。
26.權利要求25的方法，其中所述哺乳動物是人。
27.減輕受試者中傷害感受的方法，所述方法包括減少所述受試者中神經膠質細胞來源的BDNF。
28.權利要求27的方法，所述方法包括減小選擇如下的一種參數(a)神經膠質細胞中的BDNF表達；(b)BDNF從神經膠質細胞的釋放或分泌；(c)神經膠質細胞的刺激；(d)神經膠質細胞來源的BDNF活性；和(e)(a)到(d)的任一組合。
29.權利要求27的方法，其中所述神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
30.權利要求27的方法，其中所述方法包括對所述受試者施用能夠減少神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑。
31.權利要求30的方法，其中所述活性劑能夠減少或者抑制神經膠質細胞的刺激。
32.權利要求31的方法，其中所述活性劑是ATP受體的抑制劑。
33.權利要求32的方法，其中所述ATP受體是P2X受體。
34.權利要求33的方法，其中所述活性劑是TNP-ATP。
35.權利要求30的方法，其中所述活性劑能夠抑制BDNF表達。
36.權利要求35的方法，其中所述活性劑選自反義分子、核酶、siRNA和siRNA樣分子。
37.權利要求36的方法，其中所述活性劑是反義分子。
38.權利要求37的方法，其中所述反義分子與編碼BDNF的mRNA的部分實質互補。
39.權利要求37的方法，其中所述反義分子互補于與選自SEQ IDNO1、3和5的序列實質同一的核酸序列的部分。
40.權利要求36的方法，其中所述活性劑是siRNA。
41.權利要求40的方法，其中所述siRNA的序列與選自SEQ ID NO7、8、9、10和其片段的序列實質同一。
42.權利要求30的方法，其中所述活性劑鞘內施用。
43.用于治療或預防受試者中疼痛的組合物，所述組合物包含(a)能夠減少所述受試者中神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑；和(b)可藥用載體。
44.權利要求43的組合物，其中所述活性劑能夠減小選擇如下的一種參數(a)神經膠質細胞中的BDNF表達；(b)BDNF從神經膠質細胞的釋放或分泌；(c)神經膠質細胞的刺激；(d)神經膠質細胞來源的BDNF活性；和(e)(a)到(d)的任一組合。
45.權利要求43的組合物，其中所述神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
46.權利要求43的組合物，所述組合物適于鞘內施用。
47.包裝，其包含權利要求43的組合物以及它用于治療或預防疼痛的使用說明書。
48.包裝，其包含(a)能夠減少受試者中神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑；和(b)它用于治療或預防所述受試者中疼痛的使用說明書。
49.權利要求48的包裝，其中所述活性劑能夠減小選擇如下的一種參數(a)神經膠質細胞中的BDNF表達；(b)BDNF從神經膠質細胞的釋放或分泌；(c)神經膠質細胞的刺激；(d)神經膠質細胞來源的BDNF活性；和(e)(a)到(d)的任一組合。
50.權利要求48的包裝，其中所述神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
51.權利要求43的組合物用于治療或預防受試者中疼痛的用途。
52.權利要求43的組合物用于制備治療或預防疼痛的藥物的用途。
53.能夠減少神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑用于治療或預防受試者中疼痛的用途。
54.能夠減少神經膠質細胞來源的BDNF的活性劑用于制備治療或預防受試者中疼痛的藥物的用途。
55.權利要求53的用途，其中所述活性劑能夠減小選擇如下的一種參數(a)神經膠質細胞中的BDNF表達；(b)BDNF從神經膠質細胞的釋放或分泌；(c)神經膠質細胞的刺激；(d)神經膠質細胞來源的BDNF活性；和(e)(a)到(d)的任一組合。
56.權利要求53的用途，其中所述神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
57.權利要求53的用途，其中所述活性劑能夠減少或者抑制神經膠質細胞的刺激。
58.權利要求57的用途，其中所述活性劑是ATP受體的抑制劑。
59.權利要求58的用途，其中所述ATP受體是P2X受體。
60.權利要求59的用途，其中所述活性劑是TNP-ATP。
61.權利要求53的用途，其中所述活性劑能夠抑制BDNF表達。
62.權利要求61的用途，其中所述活性劑選自反義分子、核酶、siRNA和siRNA樣分子。
63.權利要求62的用途，其中所述活性劑是反義分子。
64.權利要求63的用途，其中所述反義分子與編碼BDNF的mRNA的部分實質互補。
65.權利要求63的用途，其中所述反義分子互補于與選自SEQ IDNO1、3和5的序列實質同一的核酸序列的部分。
66.權利要求62的用途，其中所述活性劑是siRNA。
67.權利要求66的用途，其中所述siRNA的序列與選自SEQ ID NO7、8、9、10和其片段的序列實質同一。
68.權利要求53的用途，其中所述活性劑適于鞘內施用。
69.鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(a)將受試化合物與表達BDNF或者具有BDNF活性的神經膠質細胞接觸；和(b)確定在所述受試化合物存在下，所述BDNF表達或者活性是否降低；其中所述降低表明所述受試化合物可以用于治療或預防疼痛。
70.權利要求69的方法，其中所述神經膠質細胞是受刺激的神經膠質細胞。
71.權利要求70的方法，其中所述受刺激的神經膠質細胞在步驟(a)之前已經接觸ATP。
72.權利要求70的方法，其中所述受刺激的神經膠質細胞對于外周神經或者神經束損傷是突觸后的。
73.權利要求69的方法，其中所述神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
74.權利要求69的方法，其中所述受試化合物選自dsRNA、siRNA、siRNA樣分子、反義寡核苷酸和核酶。
75.鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(a)將受試化合物與神經膠質細胞接觸，所述神經膠質細胞包含第一種核酸，該核酸包含與BDNF基因正常結合的可轉錄調節的元件，該第一種核酸有效連接包含能夠編碼報道蛋白的報道基因的第二種核酸；和(b)確定在所述受試化合物存在下報道基因表達或者報道蛋白活性是否降低；其中所述報道基因表達或者報道蛋白活性降低表明所述受試化合物可以用于治療或預防疼痛。
76.權利要求75的方法，其中所述神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
77.鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，該方法包括(a)將受試化合物與能夠分泌BDNF多肽的神經膠質細胞接觸；和(b)確定在所述受試化合物存在下所述BDNF多肽的分泌是否降低；其中所述BDNF多肽的分泌降低表明所述受試化合物可以用于治療和預防疼痛。
78.權利要求77的方法，其中所述神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
79.鑒定或表征用于治療或預防疼痛的化合物的方法，所述方法包括(a)將受試化合物與神經膠質細胞接觸；和(b)確定在所述受試化合物存在下所述神經膠質細胞的刺激是否降低；其中所述神經膠質細胞的刺激降低表明所述受試化合物可以用于治療和預防疼痛。
80.權利要求79的方法，其中所述神經膠質細胞選自小膠質細胞、星形膠質細胞和少突膠質細胞。
全文摘要
描述了用于治療或預防疼痛和減輕傷害感受的方法和產品，包括通過施用活性劑如P2X受體抑制劑、TNP－ATP、BDNF反義分子或者BDNFsiRNA來調節哺乳動物宿主中神經膠質細胞來源的腦源性神經營養因子(BDNF)表達。還描述了用于鑒定或表征用于治療或預防疼痛和減輕傷害感受的化合物的相關方法。
文檔編號A61P29/02GK101060863SQ200580039712
公開日2007年10月24日 申請日期2005年9月30日 優先權日2004年10月22日
發明者J·A·M·庫爾, Y·德科寧克, M·薩爾特, S·貝吉斯 申請人:拉瓦勒大學, 兒童醫院