診斷和治療妊娠并發癥的方法

專利名稱：診斷和治療妊娠并發癥的方法
技術領域：
總體地說，本發明涉及患有妊娠相關的高血壓病癥的受試者的檢測和治療。
背景技術：
先兆子癇是高血壓、水腫和蛋白尿的綜合征，其影響5-10％的妊娠，并導致相當大的產婦和胎兒發病率及死亡率。先兆子癇造成全世界每年至少200,000名產婦死亡。先兆子癇的癥狀一般地在妊娠第20周后出現，且通常是通過常規測量婦女的血壓和尿而檢測出來的。然而，這些監控方法不能有效診斷早期綜合征，如果采取有效的治療，所述診斷就可減少對受試者或發育中胎兒的危險。
目前還沒有已知的先兆子癇療法。先兆子癇的嚴重程度可從輕度直至威脅生命。輕度形式的先兆子癇可通過臥床休息和經常監控來治療。對于中度至嚴重的病例，建議住院并接受血壓藥物治療或抗驚厥劑藥物治療，以防止癲癇發作。如果狀況威脅到母親或嬰兒的生命，則要終止妊娠并在預產期前分娩出嬰兒。
胎兒和胎盤的正確發育是由幾種生長因子或血管生成因子介導的。這些血管生成因子中的一種是內皮糖蛋白，其也稱作CD105。內皮糖蛋白是一種同源二聚體細胞膜糖蛋白，其主要在內皮細胞(如合胞體滋養層、人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和血管內皮細胞)上表達。內皮糖蛋白與β聚糖，一種轉化生長因子(TGF)-β受體III型共有序列同一性。已經表明，內皮糖蛋白是TGF-β受體復合物的調節組分，其調節血管生成、增殖、分化和細胞凋亡。內皮糖蛋白也結合TGF-β超家族的幾種其它成員，包括活化素-A、骨形態發生蛋白(BMP)-2和BMP-7。具體地，內皮糖蛋白以高親和力結合TGF-β1和TGF-β3，并與TGF-β信號傳導受體I和II型形成異源三聚體結合。內皮糖蛋白基因的編碼區的突變造成出血性毛細管擴張1型(HHT1)，后者是一種顯性遺傳的血管病癥，其特征在于多系統的血管發育異常和復發性出血。還已經鑒別出了可溶形式的內皮糖蛋白，并發現其以增高的水平存在于轉移性乳腺癌和結腸直腸癌患者中；但是，尚不清楚可溶內皮糖蛋白在癌癥的發病機理中的確切功能作用。尚未報道可溶內皮糖蛋白生成與先兆子癇或正常妊娠有關。
已經報道幾種因子與胎兒和胎盤發育有關，且更具體地與先兆子癇有關。它們包括血管內皮生長因子(VEGF)、可溶的Flt-1受體(sFlt-1)和胎盤生長因子(PlGF)。VEGF是內皮細胞-特異性的促分裂原、血管生成誘導物和血管通透性的介質。已經表明VEGF對于腎小球毛細血管修復是重要的。VEGF作為同源二聚體與兩種同源跨膜酪氨酸激酶受體(fms-樣酪氨酸激酶(Flt-1)和激酶結構域受體(KDR))之一結合，所述受體在從很多不同組織獲得的內皮細胞中差別表達。Flt-1(而不是KDR)由促成胎盤形成的滋養層細胞高度表達。PlGF是VEGF家族成員，其也參與胎盤發育。PlGF由細胞滋養層及合胞體滋養層表達，且能夠誘導內皮細胞的增殖、遷移及活化。PlGF作為同源二聚體與Flt-1受體結合，但不與KDR受體結合。PlGF和VEGF均可對促有絲分裂活性和血管生成作出貢獻，后者對于發育中的胎盤是至關重要的。
近來已經在人臍靜脈內皮細胞的培養基中鑒別了sFlt-1，其缺少受體的跨膜和胞質結構域，并隨后在胎盤組織中證實了體內表達。sFlt-1以高親和力與VEGF結合，但不會刺激內皮細胞的有絲分裂發生。
小心地調節血管生成和促有絲分裂信號傳導途徑對于由發育中的胎盤的滋養層細胞維持適宜的增殖、遷移和血管生成是至關重要的。
需要準確診斷有危險患有或患有先兆子癇或子癇的受試者的方法，特別是在發作最嚴重的癥狀之前。還需要進行治療。
發明概述我們已經發現了診斷和治療妊娠相關的高血壓病癥(包括先兆子癇和子癇)的方法。
利用基因表達分析，我們已經發現在來自患有與高血壓有關的妊娠并發癥(包括先兆子癇)的孕婦的胎盤組織樣品中，可溶內皮糖蛋白(sE)的水平顯著提高。內皮糖蛋白是TGF-β受體復合物的部分，后者起調節血管生成的作用。內皮糖蛋白可以以高親和力結合TGF-β家族成員，后者是TGF-β受體的配體。在受影響的個體中，過量的可溶內皮糖蛋白可以耗盡胎盤的必需量的必需血管生成和促有絲分裂因子。在本發明中，使用結合或中和可溶內皮糖蛋白的化合物來減少提高的水平的可溶內皮糖蛋白。另外，還提供了可溶內皮糖蛋白的抗體，以及用于降低生物學活性的可溶內皮糖蛋白的水平的RNA干擾和反義核堿基(nucleobase)寡聚體。最后，本發明提供了可溶內皮糖蛋白水平的測量，作為妊娠相關的高血壓病癥(包括先兆子癇子癇和子癇或其素因)的早期診斷和控制的檢測工具。
因此，在一個方面，本發明提供了通過給受試者施用能結合可溶內皮糖蛋白的化合物來治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的方法，其中施用的時間和量足以治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥的至少一種癥狀。妊娠相關的高血壓病癥的非限制性實例包括先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有小于胎齡兒嬰兒(SGA)的妊娠。在一個優選的實施方案中，化合物是特異性地結合可溶內皮糖蛋白的純化的可溶內皮糖蛋白抗體或其抗原結合片段。在另一個優選的實施方案中，化合物是能特異性地結合可溶內皮糖蛋白的生長因子，如TGF-β家族成員(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)或其片段。
在另一個優選的實施方案中，該方法也包括施用化合物，如純化的sFlt-1抗體，sFlt-1抗原結合片段，煙堿，茶堿，腺苷，硝苯地平，米諾地爾，硫酸鎂，血管內皮生長因子(VEGF)，包括所有同工型如VEGF189、VEGF121、VEGF165或其片段，或胎盤生長因子(PlGF)，包括所有同工型和其片段，其中施用的時間和量足以治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥。
在另一個方面，本發明涉及通過給受試者施用化合物(例如，化合物、多肽、肽、抗體或其片段)，所述化合物增加能結合可溶內皮糖蛋白的生長因子的水平，來治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的方法。施用化合物的時間和量足以治療或預防妊娠相關的高血壓病癥。在優選的實施方案中，化合物增加TGF-β家族成員(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)和其片段的水平。這樣的化合物的非限制性實例包括環孢菌素、α生育酚、美西麥角、溴隱亭和愛道美。
在另一個有關的方面，本發明涉及通過給受試者施用化合物(例如，化合物、多肽、肽、抗體或其片段)，所述化合物抑制生長因子結合可溶內皮糖蛋白多肽，來治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥的方法。施用化合物的時間和量足以治療或預防妊娠相關的高血壓病癥。在優選的實施方案中，化合物結合可溶內皮糖蛋白，并阻止生長因子結合。這樣的化合物的非限制性實例包括通過篩選得到的抗體和小分子化合物。
在另一個方面，本發明提供了通過給受試者施用能降低可溶內皮糖蛋白表達或生物學活性的化合物，來治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的方法，其中所述施用足以治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥。在優選的實施方案中，化合物是純化的抗體或其抗原結合片段或抑制選自下述的蛋白水解酶的酶活性的化合物基質金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶或彈性蛋白酶。MMP包括MMP 1-26中的任一種，優選MMP9或膜型MMP1。
合意地，通過它的抑制內皮糖蛋白的血管生成活性的能力，如通過血管生成測定所測得的，鑒別能抑制可溶內皮糖蛋白的生物學活性的化合物。在這樣的測定的一個實例中，在matrigel管形成測定中使用先兆子癇患者的血清來誘導抗血管生成狀態。然后加入化合物，且抗血管生成狀態減少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，指示著治療上有效的化合物。
能抑制可溶內皮糖蛋白的生物學活性的化合物，可以是反義核堿基寡聚體，其具有至少一條與可溶內皮糖蛋白的序列的至少一部分至少80％、優選地85％、90％、95％、99％或100％互補的鏈。在一個實施方案中，反義核堿基寡聚體與可溶內皮糖蛋白的至少8、10、優選地20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多個連續核苷酸互補，且可以減少或抑制可溶內皮糖蛋白的表達或生物學活性。合意地，反義核堿基寡聚體是8至30個核苷酸長。
能抑制可溶內皮糖蛋白的生物學活性的化合物，也可以是雙鏈RNA(dsRNA)分子，其具有至少一條與可溶內皮糖蛋白核酸分子的序列的至少一部分至少80％、優選地85％、90％、95％、99％或100％互補的鏈。在一個實施方案中，雙鏈RNA是小干擾RNA(siRNA)，它是19至25個核苷酸長，且可以減少或抑制可溶內皮糖蛋白的表達或生物學活性。在其它優選的實施方案中，dsRNA與可溶內皮糖蛋白分子的核酸序列的至少18、優選地19、20、21、22、23、24、25、35、45、50或更多個連續核苷酸具有100％核酸同一性。合意地，dsRNA是siRNA。
在任一個上述方面的各實施方案中，該方法還包含給受試者施用抗高血壓化合物(例如，腺苷、硝苯地平、米諾地爾和硫酸鎂)的步驟。在上述方面的其它實施方案中，所述受試者是妊娠的人、產后的人、非妊娠的人、或非人類(例如，牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓)。本發明的治療方法可以用于治療或預防妊娠相關的高血壓病癥，包括先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有SGA嬰兒的妊娠。優選的病癥是先兆子癇和子癇。在上述方面的各實施方案中，該方法可以與下述的本發明的診斷方法相結合，以監控治療中的受試者或確定有效治療劑量。
本發明的任一個治療方面也可以包括，施用一種或多種其它的化合物，如純化的sFlt-1抗體，sFlt-1抗原結合片段，煙堿，茶堿，腺苷，硝苯地平，米諾地爾，硫酸鎂，血管內皮生長因子(VEGF)，包括所有同工型如VEGF189、VEGF121或VEGF165或其片段；胎盤生長因子(PlGF)，包括所有同工型和其片段，其中施用的時間和量足以治療或預防受試者的先兆子癇或子癇。在美國專利申請公開號20040126828和20050025762和PCT公開號WO 2004/008946中，描述了這樣的化合物的優選實例。合意地，所述化合物是能結合sFlt-1或降低sFlt-1表達的化合物。
可以單獨地或與本發明的一種或多種其它方法組合地，使用本發明的任一個治療方面。在一個實例中，可以組合使用MMP抑制劑和抗體，以中和存在的可溶內皮糖蛋白，并通過膜結合形式的切割，阻斷可溶內皮糖蛋白的進一步生成。
在另一個方面，本發明涉及特異性地結合可溶內皮糖蛋白的純化的抗體或其抗原結合片段。在一個優選的實施方案中，抗體阻止生長因子(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)與可溶內皮糖蛋白的結合。在另一個實施方案中，抗體是單克隆抗體。在其它優選的實施方案中，抗體或其抗原結合片段是人或人源化抗體。在其它實施方案中，抗體缺少Fc部分。在其它實施方案中，抗體是F(ab′)2、Fab或Fv結構。在其它實施方案中，抗體或其抗原結合片段存在于藥學上可接受的載體中。
在另一個方面，本發明提供了診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的方法，其包含測量來自受試者的樣品中的可溶內皮糖蛋白多肽的水平。在優選的實施方案中，可溶內皮糖蛋白的水平是游離的、結合的或總的可溶內皮糖蛋白的水平。在有些實施方案中，可溶內皮糖蛋白的水平是降解或酶切割產生的可溶內皮糖蛋白多肽的水平。妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向的診斷，可以源自與正常參照樣品相比可溶內皮糖蛋白的相對水平的變化(例如，增加)，或源自超過正常參照值的可溶內皮糖蛋白的絕對水平的檢測。例如，通常，在非妊娠狀態期間，可溶內皮糖蛋白的循環血清或血漿濃度范圍是2-7ng/ml，而在正常妊娠期間，是10-20ng/ml。關于包含測量可溶內皮糖蛋白的絕對水平的實施方案，認為大于15ng/ml、20ng/ml或優選地大于25ng/ml的水平，是妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的診斷指標。在其它優選的實施方案中，該方法還包括，如美國專利申請公開號20040126828、20050025762和2005017044和PCT公開號WO2004/008946和WO 2005/077007所述，測量sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中的至少一種在來自受試者的樣品中的水平。該方法也可以包括，測量sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中的至少兩種在來自受試者的樣品中的水平，并使用度量(metric)計算sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之間的關系，其中受試者樣品相對于參照樣品的變化，可診斷妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向。在優選的實施方案中，該方法也包括確定體重指數(BMI)、胎兒的胎齡(GA)或二者，并在度量中包含BMI或GA或二者。在一個實施方案中，度量是先兆子癇抗血管生成指數(PAAI)[sFlt-1/VEGF+PlGF]，其中PAAI用作抗血管生成活性的指標。在一個實施方案中，大于10、更優選地大于20的PAAI，指示著先兆子癇或子癇。在另一實施方案中，度量是下面的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數(sFlt-1+0.25(可溶內皮糖蛋白多肽))/PlGF。可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數的值的增加，是妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的診斷指標。例如，在21-32周期間大于75的值或在＞32周后大于100的值，診斷妊娠相關的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。用于本發明的診斷方法中的另一種度量是(可溶內皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF。任一種方法也可以包括，確定體重指數(BMI)、胎兒的胎齡(GA)或二者，并在度量中包含BMI或GA或二者。
在上述方面的各實施方案中，樣品是體液，如尿、羊水、血液、血清、血漿和腦脊液。合意地，通過免疫學測定(如ELISA)，確定可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的水平。在另一個實例中，單獨地或與升高的sFlt-1和降低的游離PlGF或VEGF結合地，使用大于20、優選地大于25ng/ml的可溶內皮糖蛋白的水平，診斷妊娠相關的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。
在一個實施方案中，可溶內皮糖蛋白的水平的增加，是先兆子癇或子癇或發展先兆子癇或子癇的的傾向的指標。在上述方面的優選的實施方案中，測量的sFlt-1多肽的水平是游離的、結合的或總的sFlt-1多肽的水平。在其它實施方案中，sFlt-1多肽也可以包含sFlt-1片段、降解產物或酶切割產物。在上述方面的其它優選的實施方案中，VEGF或PlGF的水平是游離的VEGF或PlGF的水平。
在另一個方面，本發明提供了診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的方法，其包含測量來自受試者的樣品中的內皮糖蛋白核酸分子(例如，mRNA)、優選可溶內皮糖蛋白核酸的水平，并將其與參照樣品相對比，其中與參照樣品(例如，正常參照)相比水平的變化(例如，增加)，診斷受試者的妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)，或診斷發展妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的傾向。在其它實施方案中，該方法還可以包含，測量來自受試者的樣品中的sFlt-1、VEGF或PlGF核酸分子(例如，mRNA)的水平，并將其與參照樣品相對比，其中與正常參照樣品相比水平的變化(例如，VEGF或PlGF水平的降低或sFlt-1水平的增加)，診斷受試者的妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)，或診斷發展妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的傾向。
在上述診斷方面的優選的實施方案中，在兩個或更多個場合測量水平，且測量之間的水平的變化是妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的診斷指標。在一個優選的實施方案中，使用從第一次測量到下一次測量的可溶內皮糖蛋白的水平的增加(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)，診斷妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)。在上述診斷方面的另一個實施方案中，將可溶內皮糖蛋白的水平與正常參照樣品相對比，且與正常參照樣品相比可溶內皮糖蛋白的水平的增加(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更大)是先兆子癇或子癇的指示。
在另一個方面，本發明提供了診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的方法，其包括確定受試者的內皮糖蛋白基因的核酸序列，并將其與參照序列相對比，其中受試者核酸序列的改變受試者中基因產物的水平或生物學活性的變化，診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥，或有發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向。在一個實施方案中，變化是核酸序列的多態性。在另一個實施方案中，sFlt-1、VEGF或PlGF的核酸序列或其任意組合，也確定基因，并與參照序列相對比。這些序列中的任一個或多個改變受試者中基因產物的水平或生物學活性的變化，診斷患有妊娠相關的高血壓病癥的受試者。
在上述方面的各實施方案中，樣品是受試者的體液(例如，尿、羊水、血液、血清、血漿或腦脊液)，其中可溶內皮糖蛋白和sFlt-1、VEGF或PlGF通常是可檢測的。在其它實施方案中，樣品是組織或細胞(例如，胎盤組織或胎盤細胞、內皮細胞、白細胞和單核細胞)。在上述方面的其它實施方案中，受試者是非妊娠的人、妊娠的人或產后的人。在上述方面的其它實施方案中，受試者是非人類(例如，牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓)。在一個實施方案中，受試者是非妊娠的或妊娠的人，且該方法用于診斷發展先兆子癇或子癇的傾向。在其它實施方案中，也測量BMI或GA或二者。在上述方面的各實施方案中，可溶內皮糖蛋白的核酸或多肽的水平相對于參照的增加是先兆子癇或子癇的診斷指標。
在另一個方面，本發明提供了診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的方法，其包括測量可溶內皮糖蛋白配體(如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)在來自受試者的樣品中的水平。
在任一個上述診斷方面的各實施方案中，妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征或具有SGA嬰兒的妊娠。在任一個診斷方面，在兩個或更多個場合完成水平的測量，且測量之間的水平的增加是妊娠相關的高血壓病癥的診斷指標。該診斷方法可以合意地用于在發作癥狀之前(例如，至少4、5、6、7、8、9或10周前)，診斷妊娠相關的高血壓病癥。
在另一個方面，本發明提供了用于診斷受試者的妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的試劑盒，其包含用于檢測內皮糖蛋白核酸或其片段的核酸序列，或其互補序列。在一個優選的實施方案中，核酸序列與編碼可溶內皮糖蛋白的核酸或其片段雜交，優選地以高嚴格性。在一個優選的實施方案中，試劑盒還包含用于檢測sFlt-1、VEGF或PlGF的核酸序列。
在一個有關的方面，本發明提供了用于診斷受試者的妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的試劑盒，其包含可溶內皮糖蛋白結合分子(例如，特異性地結合可溶內皮糖蛋白的抗體或其抗原結合片段)。在一個實施方案中，組分是免疫學測定、酶促測定或比色測定。在上述方面的其它實施方案中，試劑盒診斷妊娠的或非妊娠的受試者發展先兆子癇或子癇的傾向。在上述方面的優選的實施方案中，試劑盒也包含用于檢測sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的組分。在其它優選的實施方案中，使用試劑盒來檢測可溶內皮糖蛋白，并進一步檢測VEGF、sFlt-1和PlGF，并確定樣品的診斷比率(例如，PAAI或可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數)。
在優選的實施方案中，診斷試劑盒包含關于試劑盒組分的預期用途的標簽或說明書。在一個實施方案中，診斷試劑盒貼有標簽，或包含關于用于診斷受試者的妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)、或發展妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的傾向的說明書。在一個優選的實施方案中，診斷試劑盒包含關于使用試劑盒來確定受試者樣品的可溶內皮糖蛋白水平、并將可溶內皮糖蛋白水平與參照值相對比的標簽或說明書。應當理解，參照值將取決于試劑盒的預期用途。例如，可以將樣品與正常可溶內皮糖蛋白參照值相對比，其中可溶內皮糖蛋白水平的增加是妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的指示。也可以將樣品與參照相對比，所述參照是來自已知患有先兆子癇的受試者的值或樣品，其中可溶內皮糖蛋白水平的降低是妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的指示。
在一個有關的方面，本發明涉及通過提供組分來測量和/或對比可溶內皮糖蛋白多肽或核酸的水平和參照樣品，來診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)或具有其素因的裝置，其中與正常參照值相比可溶內皮糖蛋白水平的變化，診斷受試者的妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)。在優選的實施方案中，該裝置包含側向流(lateral flow)或測驗片格式的膜，所述膜用于測量和對比尿樣品中的多肽水平。
該裝置也可以包含用于對比在來自受試者的樣品中的可溶內皮糖蛋白和至少一種sFlt-1、VEGF和PlGF核酸分子或多肽相對于參照樣品的水平的組分，其中可溶內皮糖蛋白和至少一種sFlt-1、VEGF和PlGF核酸分子或多肽的水平的變化，診斷受試者的先兆子癇或子癇或發展先兆子癇或子癇的傾向。在一個優選的實施方案中，該裝置包含用于對比可溶內皮糖蛋白和至少一種sFlt-1、VEGF和PlGF多肽的水平的度量組分。
本文所述的任一種診斷方法和試劑盒也可以用于監控已經診斷為患有先兆子癇或子癇或處于患有先兆子癇或子癇的危險中的受試者，以監控治療過程中的受試者或確定有效治療劑量。在一個實例中，在治療性監控中使用的試劑盒可以具有參照可溶內皮糖蛋白值，它是先兆子癇或子癇的指示，其中受試者樣品的可溶內皮糖蛋白值相對于參照樣品的降低，可以用于指示治療化合物的治療功效或有效劑量。在優選的實施方案中，試劑盒貼有標簽，或包含關于用于治療性監控或治療劑量確定的說明書，且治療性化合物可以包含在試劑盒中。單獨地，或與sFlt-1、VEGF或PlGF蛋白或核酸的水平或其任意組合結合，測量可溶內皮糖蛋白蛋白或核酸的水平。在其它優選的實施方案中，將可溶內皮糖蛋白的水平與參照樣品相對比，后者是妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的指示，且可溶內皮糖蛋白相對于參照樣品的水平的變化(例如，降低)，是治療性化合物的治療功效或有效劑量的指示。在一個實例中，在施用治療過程中或之后測得的可溶內皮糖蛋白多肽或核酸的水平相對于施用治療之前的值的降低(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)，指示著妊娠相關的高血壓病癥的改善。在另一個實例中，測量血清或血漿中的可溶內皮糖蛋白的絕對水平，并用于監控化合物的治療功效。例如，優選地以使可溶內皮糖蛋白的水平小于25ng/ml、優選地小于20ng/ml的劑量，施用治療性化合物。
在包含測量sFlt-1的上述治療性監控方面的實施方案中，sFlt-1多肽或核酸水平的降低，指示著先兆子癇或子癇的改善。在另一個實施方案中，以使sFlt-1多肽的水平小于2ng/ml的劑量，施用治療性化合物。在包含測量VEGF或PlGF的實施方案中，在施用治療過程中或之后測得的VEGF或PlGF多肽或核酸的水平相對于治療之前的值的增加，指示著先兆子癇或子癇的改善。在除了測量可溶內皮糖蛋白以外包含測量sFlt-1、VEGF或PlGF的實施方案中，該方法可以包含，使用度量計算sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之間的關系，其中受試者樣品中所述水平之間的關系相對于參照樣品的變化，是先兆子癇或子癇的診斷指標。這樣的度量的一個實例是PAAI。在該實例中，受試者PAAI值的降低(例如，小于20，優選地小于10)指示著先兆子癇或子癇的改善。PAAI的降低(例如，小于20，優選地小于10)也可以指示治療性化合物的有效劑量。另一個實例是下面的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數，其中該值的增加是妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的診斷指標。
在與診斷或監控治療性處理有關的方面的優選的實施方案中，使用免疫學測定(如ELISA)或蛋白印跡測量多肽。可溶內皮糖蛋白的水平可以是游離的、結合的(即，結合在配體上)或總的(即，游離的+結合的)可溶內皮糖蛋白的水平，以及由降解或酶切割產生的可溶內皮糖蛋白的水平。對于任一種監控方法，可以在兩個或更多個場合完成水平的測量，且測量之間的水平的變化是先兆子癇或子癇的診斷指標。
在另一個方面，本發明提供了鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含使表達內皮糖蛋白核酸分子的細胞接觸候選化合物，并對比候選化合物接觸的細胞中的核酸分子的表達水平和候選化合物未接觸的對照細胞中的表達水平，其中內皮糖蛋白核酸分子的表達的變化，將該候選化合物鑒別為可以用于改善妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物。
在另一個方面，本發明提供了鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含使表達可溶內皮糖蛋白多肽的細胞接觸候選化合物，并對比候選化合物接觸的細胞中的多肽表達水平和候選化合物未接觸的對照細胞中的多肽表達水平，其中可溶內皮糖蛋白多肽的表達的變化，將該候選化合物鑒別為可以用于改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物。在一個實施方案中，使用免疫學測定、酶促測定或免疫測定，測定表達的變化。在一個實施方案中，表達的變化是可溶內皮糖蛋白的水平的降低。表達的變化可以源自轉錄的變化或翻譯的變化。
在另一個方面，本發明提供了鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含使表達可溶內皮糖蛋白多肽的細胞接觸候選化合物，并對比候選化合物接觸的細胞中的可溶內皮糖蛋白多肽的生物學活性和候選化合物未接觸的對照細胞中的生物學活性水平，其中可溶內皮糖蛋白多肽的生物學活性的變化，將該候選化合物鑒別為可以改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物。在一個實施方案中，變化是可溶內皮糖蛋白的生物學活性的降低，如使用血管生成測定、生長因子結合測定或任一種本文所述的測定所測得的。
在另一個方面，本發明提供了鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含檢測可溶內皮糖蛋白多肽和候選化合物的結合，其中結合可溶內皮糖蛋白多肽的化合物可以用于改善妊娠相關的高血壓病癥。
在另一個方面，本發明提供了鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的化合物的方法，其包含檢測在有候選化合物存在下，可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合，其中與不存在候選化合物時可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合相比結合的降低，將該候選化合物鑒別為可以用于改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物。在一個實施方案中，生長因子是TGF-β家族成員。
在另一個方面，本發明提供了鑒別阻止可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合的多肽的方法。該方法包含，檢測在有候選多肽存在下，可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合，其中與不存在候選多肽時可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合相比結合的降低，將該候選多肽鑒別為阻止可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合的多肽。在一個實施方案中，生長因子是TGF-β家族成員。
在一個有關的方面，本發明提供了根據前述方面鑒別出的化合物，其中該化合物是特異性地結合可溶內皮糖蛋白多肽、并阻止可溶內皮糖蛋白多肽結合TGF-β家族成員的多肽。在一個優選的實施方案中，該多肽是結合可溶內皮糖蛋白的抗體，優選地是特異性地結合可溶內皮糖蛋白的抗體。
盡管本文所述的方法具體地提及先兆子癇和子癇，但應當理解，本發明的診斷和監控方法也適用于與高血壓有關的一般妊娠并發癥，包括但不限于妊娠高血壓、HELLP綜合征和具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠。
就本發明的目的而言，在下面定義了下列縮寫和術語。
“變化”指通過標準的本領域已知的方法，如下面描述的那些，檢測的基因或多肽表達水平的變化(提高或降低)。如本文所使用的，變化包括表達水平10％的變化、優選表達水平25％的變化、更優選表達水平40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的變化。“變化”還指本發明任一多肽(例如，可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF)的生物學活性的變化(提高或降低)。如本文所使用的，變化包括生物學活性10％的變化、優選生物學活性25％的變化、更優選生物學活性40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大的變化。可溶內皮糖蛋白的生物學活性的實例是血管生成測定和使用已知配體(如活化素-A、BMP 2、BMP-7、TGF-β1和TGF-β3)的結合測定。通過本領域標準的或本文所述的配體結合測定、免疫測定和血管生成測定，可以測量可溶內皮糖蛋白的生物學活性。這樣的測定的一個實例是，體外matrigel內皮管形成測定，其中內皮糖蛋白信號傳導的拮抗作用導致毛細管形成的大量喪失(Li等，Faseb Journal 1455-64(2000))。PlGF或VEGF的生物學活性的其它實例包括通過免疫測定、配體結合測定或斯卡查德圖分析測得的與受體的結合，以及通過BrdU標記、細胞計數實驗、或DNA合成的定量測定(如3H-胸苷摻入)測得的細胞增殖或遷移的誘導。sFlt-1的生物學活性的實例包括通過免疫測定、配體結合測定或斯卡查德圖分析測得的與PlGF和VEGF的結合。本文描述了測定每種多肽的生物學活性的其它實例。
“反義核堿基寡聚體”指核堿基寡聚體，不管多長，其與內皮糖蛋白基因的編碼鏈或mRNA互補。“核堿基寡聚體”指包括至少8個核堿基、優選至少12個、且最優選至少16個堿基的鏈的化合物，它們通過連接基團連接在一起。在此定義中包括天然的和非天然的寡核苷酸，修飾和未修飾的，以及寡核苷酸模擬物，如蛋白核酸、鎖定核酸和阿糖核酸。很多核堿基和連接基團都可用于本發明的核堿基寡聚體中，包括在引入本文作為參考的美國專利公開號20030114412(見例如，公開文本的27-45段)和20030114407(見例如，公開文本的35-52段)中描述的那些。所述核堿基寡聚體還可靶向翻譯起始和終止位點。優選地，反義核堿基寡聚體包含約8-30個核苷酸。反義核堿基寡聚體還可包含至少40、60、85、120或更多個連續的核苷酸，它們與內皮糖蛋白mRNA或DNA互補，且可像全長mRNA或基因一樣長。
“體重指數”指使用身高和體重測量產生的數字，它會給出體重是否屬于健康范圍的一般信息。通常用于確定體重指數的公式是，以千克計的人體重除以以米計的人身高的平方，或體重(kg)/(身高(m))2。
“化合物”指任意的小分子化合物、抗體、核酸分子、或多肽，或其片段。特別用于本發明的治療方法的化合物可以使可溶內皮糖蛋白的水平或生物學活性改變(優選地降低)至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。
“嵌合抗體”指多肽，其至少含有與另一種蛋白的至少部分相連的抗體分子的抗原結合部分(通常，免疫球蛋白的恒定結構域)。
“雙鏈RNA(dsRNA)”指包含有義和反義鏈的核糖核酸分子。dsRNA通常用于介導RNA干擾。
“內皮糖蛋白”也稱作CD 105，指具有內皮糖蛋白生物學活性的哺乳動物生長因子(見Fonsatti等，Oncogene 226557-6563，2003；Fonsatti等，Curr.Cancer Drug Targets 3427-432，2003)，且與下述GenBank編號中的任一個定義的蛋白同源AAH29080和NP_031958(小鼠)；AAS67893(大鼠)；NP_000109、P17813、VSP_004233和CAA80673(人)；和A49722(豬)，或記載在美國專利號6,562,957中。內皮糖蛋白是同源二聚體細胞膜糖蛋白，其在來自胎盤的增殖中的血管細胞和合胞體滋養層中高水平地表達。內皮糖蛋白存在兩種不同的同工型，L和S，它們的不同之處是在胞質尾的47個氨基酸。兩種同工型都包含在本文使用的術語內皮糖蛋白中。內皮糖蛋白結合TGF-β家族成員，且在有TGF-β存在下，內皮糖蛋白可以結合TGF-β信號傳導受體RI和RII，并加強對生長因子的響應。內皮糖蛋白生物學活性包含結合TGF-β家族成員，如活化素-A、BMP 2、BMP-7、TGF-β1和TGF-β3；誘導血管生成，調節細胞增殖、附著、遷移、侵入；和激活內皮細胞。內皮糖蛋白生物學活性的測定是本領域已知的，且包括配體結合測定或斯卡查德圖分析；用于測量細胞增殖的BrdU標記、細胞計數實驗或DNA合成的定量測定(如3H-胸苷摻入)；和血管生成測定，如在本文或在McCarty等，Intl.J.Oncol.215-10，2002；Akhtar等Clin.Chem.4932-40，2003；和Yamashita等，J.Biol.Chem.2691995-2001，1994中所述的那些。“可溶內皮糖蛋白”指任何循環的、非膜結合形式的內皮糖蛋白，其至少包括蛋白的胞外部分的部分(見

圖1)。可溶內皮糖蛋白可以源自蛋白水解酶對膜結合形式的內皮糖蛋白的切割。一個潛在的切割位點是在氨基酸437處，從而產生可溶內皮糖蛋白多肽，其包括內皮糖蛋白多肽的氨基酸1-437(見圖2A和2B)。盡管不希望受理論的約束，可溶內皮糖蛋白保留的胞外配體結合結構域可能允許它結合配體如TGF-β1和TGF-β3，從而造成TGF-β的缺乏。另外，由于內皮糖蛋白是內皮特異性的分子，所以TGF-β缺乏可能在內皮細胞中是最大的。可溶內皮糖蛋白也可以包含循環降解產物或片段，其源自內皮糖蛋白的酶切割，且保持內皮糖蛋白生物學活性。現在尚不清楚可溶內皮糖蛋白的生物學功能，但是預測會造成TGF-β和其它已知配體的缺乏。通過測量游離活化素A或游離TGF-β3的水平，或通過使用本領域已知的或本文所述的血管生成測定，可以測定可溶內皮糖蛋白生物學活性。
“內皮糖蛋白核酸”指編碼任一種上述的內皮糖蛋白蛋白的核酸。例如，人內皮糖蛋白的基因由14個外顯子組成，其中外顯子1編碼信號肽序列，外顯子2-12編碼胞外結構域，外顯子13編碼跨膜結構域，且外顯子14編碼C-末端胞質結構域(見圖1、2A和2B)。合意地，內皮糖蛋白核酸編碼可溶內皮糖蛋白(見圖2A)。
“表達”指通過標準的本領域已知的方法檢測基因或多肽。例如，多肽表達常常通過蛋白印跡檢測，DNA表達常常通過DNA印跡或聚合酶鏈反應(PCR)檢測，而RNA表達常常通過RNA印跡、PCR、或RNA酶保護測定檢測。
“片段”指多肽或核酸分子的部分。優選地，該部分含有，參照核酸分子或多肽的整個長度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個核苷酸或氨基酸。優選地，可溶內皮糖蛋白的片段包含4-437個氨基酸和10-1311個核苷酸。
“胎齡”指胎兒齡，其從母親的最后月經期的第一天開始計起，通常按周計。
“妊娠高血壓”指妊娠20周后沒有蛋白尿的高血壓的發展。
“先兆子癇或子癇的歷史”指以前在受試者自身或相關家族成員中診斷的先兆子癇或子癇或妊娠誘發的高血壓。
“同源的”指在比較序列的長度上，與已知基因或蛋白序列具有至少30％同源性、更優選40％、50％、60％、70％、80％、且最優選90％或更高同源性的任何基因或蛋白序列。“同源的”蛋白還可具有比較蛋白的至少一種生物學活性。通常，就蛋白而言，比較序列的長度為至少10個氨基酸，優選地20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400個或至少437個氨基酸或更多。就核酸而言，比較序列的長度通常為至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200或至少1311個核苷酸或更多。“同源性”還指用于產生抗體的表位與抗體針對的蛋白或其片段之間的相當大相似性。在該情況下，同源性指足以引發可以特異性地識別討論中的蛋白的抗體產生的相似性。
“人源化抗體”指能夠結合預定抗原的免疫球蛋白氨基酸序列變體或其片段。通常，抗體包含輕鏈和重鏈的至少可變結構域。抗體還可以包含重鏈的CH1、鉸鏈、CH2、CH3或CH4區。人源化抗體包含主要具有人免疫球蛋白氨基酸序列的構架區(FR)和主要具有非人免疫球蛋白氨基酸序列(“輸入”序列)的互補性決定區(CDR)。
通常，人源化抗體具有從非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。通常，人源化抗體基本上包含至少一個、且通常兩個可變結構域(Fab、Fab′、F(ab′)2、Fabc、Fv)的全部，其中全部或基本上全部CDR區與非人免疫球蛋白的那些相對應，且全部或基本上全部FR區是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體最優地將包含免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少部分，通常是人免疫球蛋白恒定區的部分。“互補性決定區(CDR)”指在每個免疫球蛋白輕鏈和重鏈中的可變區的3個高變序列。“構架區(FR)”指位于免疫球蛋白輕鏈和重鏈的3個高變序列(CDR)的任一側的氨基酸序列。
人源化抗體的FR和CDR區不需要與親代序列準確對應，例如，輸入CDR或共有FR可以通過置換、插入或缺失至少一個殘基來誘變，從而使得在該位點的CDR或FR殘基不與共有或輸入抗體相對應。然而，這種突變將不是廣泛的。通常，至少75％、優選90％、且最優選95％的人源化抗體殘基將與親代FR和CDR序列的殘基相對應。
“雜交”指在各種嚴格性條件下，在互補多核苷酸序列或其部分之間配對以形成雙鏈分子(見，例如，Wahl和Berger，MethodsEnzymol.152399，1987；Kimmel，Methods Enzymol.152507，1987)。例如，嚴格的鹽濃度通常低于約750mM NaCl和75mM檸檬酸三鈉，優選低于約500mM NaCl和50mM檸檬酸三鈉，且最優選低于約250mM NaCl和25mM檸檬酸三鈉。低嚴格性雜交可在沒有有機溶劑(例如甲酰胺)存在的條件下獲得，而高嚴格性雜交可在有至少約35％甲酰胺、且最優選至少約50％甲酰胺存在下獲得。嚴格的溫度條件通常包括至少約30℃、更優選至少約37℃、且最優選至少約42℃的溫度。各種其它參數，如雜交時間，去污劑如十二烷基硫酸鈉(SDS)的濃度，以及包含或不包含載體DNA，都是本領域技術人員熟知的。通過根據需要組合這些不同條件，實現各種嚴格性水平。在一個優選的實施方案中，雜交在30℃，在750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉和1％SDS中進行。在一個更優選的實施方案中，雜交在37℃，在500mM NaCl、50mM檸檬酸三鈉、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml變性鮭精DNA(ssDNA)中進行。在一個最優選的實施方案中，雜交在42℃，在250mM NaCl、25mM檸檬酸三鈉、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中進行。對這些條件的有用變化對于本領域技術人員是顯而易見的。
對于絕大多數應用而言，雜交之后的洗滌步驟還可在嚴格性方面有變化。洗滌嚴格性條件可由鹽濃度和溫度來限定。如上所述，洗滌嚴格性可通過降低鹽濃度或提高溫度來提高。例如，洗滌步驟的嚴格鹽濃度優選低于約30mM NaCl和3mM檸檬酸三鈉，且最優選低于約15mM NaCl和1.5mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴格溫度條件通常包含至少約25℃、更優選至少約42℃、且最優選至少約68℃的溫度。在一個優選的實施方案中，洗滌步驟將在25℃，在30mM NaCl、3mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中進行。在一個更優選的實施方案中，洗滌步驟將在42℃，在15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中進行。在一個最優選的實施方案中，洗滌步驟將在68℃，15mMNaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1％SDS中進行。這些條件的其它變化對于本領域技術人員是顯而易見的。雜交技術是本領域技術人員熟知的，且在下面描述，例如Benton和Davis(Science 196180，1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 723961，1975)；Ausubel等(Current Protocols in Molecular Biology，WileyInterscience，New York，2001)；Berger和Kimmel(Guide to MolecularCloning Techniques，1987，Academic Press，New York)；和Sambrook等，Molecular CloizingA Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory Press，New York。
“子宮內發育遲緩(IUGR)”指導致出生重量比胎兒胎齡的預測胎兒重量低10％的綜合征。目前世界衛生組織(World HealthOrganization)有關低出生重量的標準是重量低于2,500gm(5 lbs.8oz.)，或根據美國通過種族、經產數和嬰兒性別得出的胎齡出生重量表，低于胎齡的第10百分位(Zhang和Bowes，Obstet.Gynecol 86200-208，1995)。這些低出生重量的嬰兒還被稱作“小于胎齡兒(SGA)”。已知先兆子癇是與IUGR或SGA有關的狀況。
“度量”指一種測量。度量可用于，例如，比較目標多肽或核酸分子的水平。示例性的度量包含但不限于，數學公式或算法，如比率。所用度量是這樣的，其可最好地區別患有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的受試者與正常對照受試者之間的可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF、PlGF的水平，或其任意組合。根據所用度量，妊娠相關的高血壓病癥的診斷指標可明顯高于或低于參照值(例如，與未患妊娠相關的高血壓病癥的對照受試者相比)。通過測量游離的、結合的(即，結合于生長因子)或總的(即，游離的+結合的)可溶內皮糖蛋白的量，可以確定可溶內皮糖蛋白水平。通過測量游離的、結合的(即，結合于生長因子)或總的sFlt-1(游離的+結合的)的量，可以測量sFlt-1水平。通過測量游離PlGF或游離VEGF(即，未結合于sFlt-1)的量，可以確定VEGF或PlGF水平。一個示例性的度量是[sFlt-1/(VEGF+PlGF)]，也稱作先兆子癇抗血管生成指數(PAAI)。另一個實例是下面的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數(sFlt-1+0.25(可溶內皮糖蛋白多肽))/PlGF。可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數的值的增加，是先兆子癇或子癇的診斷指標。另一個示例性的度量如下 (可溶的內皮糖蛋白(enodglin)+sFlt-1)/PlGF。本發明的任一個度量還可以包含母親的BMI或嬰兒的GA。
“先兆子癇抗血管生成指數(PAAI)”指用作抗血管生成活性的指標的sFlt-1/VEGF+PlGF比率。大于10、更優選地大于20的PAAI，是妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或先兆子癇的危險)的指示。
“可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數”指(sFlt-1+0.25可溶內皮糖蛋白)/PlGF比率。例如，75或更高、優選地100或更高、或更優選地200或更高的值，是與高血壓有關的妊娠并發癥(如先兆子癇或子癇)的指示。
“可操作地連接的”指在適宜的分子(例如，轉錄激活物蛋白)與調節序列結合時，基因和調節序列以允許基因表達的方式連接。
“藥學上可接受的載體”指對于所治療的哺乳動物而言生理學上可接受的且仍然保留與其一起施用的化合物的治療性質的載體。一種示例性的藥學上可接受的載體物質是生理鹽水。其它生理學上可接受的載體和它們的制劑是本領域技術人員已知的，且在下列文獻中描述，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences，(第20版)，ed.A.Gennaro，2000，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA。
“胎盤生長因子(PlGF)”指哺乳動物生長因子，它與GenBank編號P49763限定的蛋白同源，且具有PlGF生物學活性。PlGF是屬于VEGF家族的糖基化同源二聚體，且可通過可變剪接機理以兩個不同的同工型發現。PlGF由胎盤中的細胞滋養層及合胞體滋養層表達，且PlGF生物學活性包含誘導內皮細胞(特別是滋養層細胞)的增殖、遷移及活化。
“多態性”指可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子中的基因變異、突變、缺失或添加，它是發展先兆子癇或子癇的素因的指示。這樣的多態性是熟練的技術人員已知的，且記載在，例如，Raab等(Biochem.J.339579-588，1999)和Parry等(Eur.JImmunogenet.26321-323，1999)。多態性可以存在于基因的啟動子序列、可讀框、內含子序列或非翻譯3′區中。內皮糖蛋白基因的這樣的多態性的已知實例包括內含子7中的6堿基GGGGGA插入，在外顯子7的3′末端以外的26個堿基處(Ann.Neurol.41683-6，1997)。
“妊娠相關的高血壓病癥”指與血壓升高有關或特征在于血壓升高的任何狀況或疾病或妊娠。這些狀況中包括先兆子癇(包括過早先兆子癇、重度先兆子癇)、子癇、妊娠高血壓、HELLP綜合征(溶血、升高的肝酶、低血小板)、胎盤分離(abruption placenta)、慢性高血壓、具有子宮內發育限制的妊娠和具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠。應當指出，盡管具有SGA嬰兒的妊娠并非經常與高血壓有關，但它也包含在該定義中。
“先兆子癇”指多系統病癥，其特征在于具有蛋白尿或水腫或兩者的高血壓、腎小球功能障礙、腦水腫、肝水腫或凝結異常，這是由于妊娠或新近妊娠的影響。所有形式的先兆子癇，如過早的、輕度的、中度的和重度先兆子癇，都包含在該定義中。先兆子癇通常發生在妊娠第20周后。先兆子癇通常被定義為下列癥狀的一些組合(1)妊娠20周后，收縮血壓(BP)＞140mmHg且舒張BP＞90mmHg(通常測量2次，間隔4-168小時)，(2)新發作的蛋白尿(利用測驗片進行尿分析為1+，24-小時尿收集中的蛋白＞300mg，或單次隨機的尿樣品的蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)產后12周高血壓及蛋白尿消除。重度先兆子癇通常被定義為(1)舒張BP＞110mmHg(通常測量2次，間隔4-168小時)或(2)蛋白尿，其特征在于24-小時尿收集中的蛋白測量值為3.5g或更高，或利用測驗片測量，2份隨機的尿樣品具有至少3+蛋白。在先兆子癇中，高血壓和蛋白尿通常彼此在7天內發生。在重度先兆子癇中，可同時出現嚴重高血壓、嚴重蛋白尿和HELLP綜合征(溶血、升高的肝酶、低血小板)或子癇，或每次僅出現一個癥狀。HELLP綜合征的特征在于血小板減少癥(＜100000細胞/μl)、提高的LDH(＞600IU/L)和提高的AST(＞70IU/L)的跡象。有時候，重度先兆子癇可導致癲癇發作的發展。這種嚴重的綜合征形式被稱作“子癇”。子癇還可包含幾種器官或組織的功能障礙或損害，如肝臟(例如，肝細胞損害、門管周壞死)和中樞神經系統(例如，腦水腫和腦出血)。認為癲癇發作的病因是由腦水腫和腎臟小血管病灶痙攣發展繼發的。
“過早先兆子癇”指在＜37周或＜34周發作癥狀的先兆子癇。
“蛋白”或“多肽”或“多肽片段”指任何多于2個氨基酸的鏈，不管翻譯后的修飾(例如，糖基化或磷酸化)，其構成天然存在的多肽或肽的全部或部分，或構成非天然存在的多肽或肽。
“參照樣品”指用于比較目的的任何樣品、標準或水平。“正常的參照樣品”可以是從相同受試者采取的在先樣品，來自不患有任何妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的妊娠受試者的樣品，來自不患有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的妊娠受試者的樣品，妊娠且在妊娠早期(例如，在前三個月或次三個月，或在檢測到妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)之前)采取樣品的受試者，妊娠且不具有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)歷史的受試者，未妊娠的受試者，在已知正常濃度(即，不指示妊娠相關的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇)的純化參照多肽的樣品。“參照標準或水平”指源自參照樣品的值或數字。正常的參照標準或水平可以是源自正常受試者的值或數字，所述正常受試者與樣品受試者在至少一項下面的標準方面匹配胎兒的胎齡、母親年齡、妊娠之前的母親血壓、妊娠過程中的母親血壓、母親的BMI、胎兒體重、先兆子癇或子癇的以前診斷和先兆子癇或子癇的家族史。“陽性參照”樣品、標準或值是源自已知患有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的受試者的樣品或值或數字，所述受試者與樣品受試者在至少一項下面的標準方面匹配胎兒的胎齡、母親年齡、妊娠之前的母親血壓、妊娠過程中的母親血壓、母親的BMI、胎兒體重、妊娠相關的高血壓病癥的以前診斷和妊娠相關的高血壓病癥的家族史。
“降低或抑制”指通過前述測定(見“表達”)檢測的，與未處理的樣品相比，引起蛋白或核酸水平共降低優選20％或更多、更優選40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多的變化的能力。
“樣品”指組織活組織檢查、細胞、體液(例如，血液、血清、血漿、尿、唾液、羊水或腦脊液)或從受試者得到的其它樣品。合意地，生物樣品包括可溶內皮糖蛋白核酸分子或多肽或二者。
“小干擾RNA(siRNA)”指分離的dsRNA分子，優選長度超過10個核苷酸(nt)，更優選長度超過15個核苷酸，且最優選長度超過19個核苷酸，其用于鑒別將要降解的靶基因或mRNA。19-25個核苷酸是siRNA的最優選大小。siRNA還可包含短發夾RNA，其中siRNA雙鏈體的兩個鏈都包含在單一RNA分子中。siRNA包含任何形式的dsRNA(更大dsRNA的蛋白酶剪切產物、部分純化的RNA、基本純的RNA、合成的RNA、重組產生的RNA)，以及與天然存在的RNA不同之處在于一個或多個核苷酸的添加、缺失、置換和/或變化的改變的RNA。這種改變可包含非-核苷酸物質的添加，例如向19、20、21、22、23、24或25nt RNA的末端添加或內部添加(在RNA的一個或多個核苷酸上)。在優選的實施方案中，RNA分子包含3′羥基。本發明RNA分子中的核苷酸還可包含非鏈的核苷酸，包括非天然存在的核苷酸或脫氧核糖核苷酸。共同地，將所有這種改變的RNA稱作RNA的類似物。本發明的siRNA只需與具有介導RNA干擾(RNAi)的能力的天然RNA充分相似。如本文所使用的，RNAi指通過向細胞或生物中引入小干擾RNA或dsRNA所致的特定mRNA分子的ATP-依賴性的靶向切割和降解。如本文所使用的，“介導RNAi”指區別或鑒別要降解哪個RNA的能力。
“可溶內皮糖蛋白結合分子”指特異性地結合可溶內皮糖蛋白多肽的蛋白或小分子化合物。可溶內皮糖蛋白結合分子可以是，例如，抗體、抗體相關肽、可溶內皮糖蛋白結合抗體的一個或多個CDR區或可溶內皮糖蛋白相互作用蛋白。
“可溶的Flt-1(sFlt-1)”(也稱作sVEGF-R1)指可溶形式的Flt-1受體，其與GenBank編號U01134定義的蛋白同源，且具有sFlt-1生物學活性。sFlt-1多肽的生物學活性可使用任何標準方法測定，例如，通過測定與VEGF結合的sFlt-1。sFlt-1缺少Flt-1受體的跨膜結構域和胞質酪氨酸激酶結構域。sFlt-1可以以高親和力結合VEGF和PlGF，但不能誘導增殖或血管生成，并因此與Flt-1和KDR受體在功能上有所不同。sFlt-1最初從人臍內皮細胞純化，且隨后表明在體內由滋養層細胞產生。如本文所使用的，sFlt-1包含任何sFlt-1家族成員或同工型。sFlt-1也可以指源自Flt-1受體的酶切割且保留sFlt-1生物學活性的降解產物或片段。在一個實例中，從胎盤釋放出的特定金屬蛋白酶可以切割Flt-1受體的胞外結構域，以將Flt-1 N-末端部分釋放到循環中。
“特異性地結合”指識別并結合本發明的多肽、但基本上不識別并結合樣品(例如生物學樣品)中的其它分子的化合物或抗體，其自然包含本發明的多肽。在一個實例中，特異性地結合可溶內皮糖蛋白的抗體不結合膜結合的內皮糖蛋白。在另一個實例中，特異性地結合可溶內皮糖蛋白的抗體識別內皮糖蛋白的氨基酸1-437內的區域，所述區域是可溶內皮糖蛋白獨有的，而全長內皮糖蛋白沒有。
“受試者”指哺乳動物，包括但不限于，人或非人哺乳動物，如牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓。在該定義中包含妊娠的、產后的和未妊娠的哺乳動物。
“基本上相同”指，當最佳地比對時，例如，使用下述的方法，與第二個核酸或氨基酸序列(例如，內皮糖蛋白或可溶內皮糖蛋白序列)共有至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核酸或氨基酸序列。“相當大的同一性”可以用于指各種類型和長度的序列，如全長序列、表位或免疫原性肽、功能結構域、編碼和/或調節序列、外顯子、內含子、啟動子和基因組序列。通過屬于本領域技術范圍內的各種方式，可以確定兩個多肽或核酸序列之間的百分比同一性，例如，使用可公開得到的計算機軟件，如Smith Waterman Alignment(Smith，T.F.和M.S.Waterman(1981)J Mol Biol 147195-7)；包含在GeneMatcher PlusTM中的“BestFit”(Smith和Waterman，Advancesin Applied Mathematics，482-489(1981))，Schwarz和Dayhof(1979)Atlas of Protein Sequence and Structure，Dayhof，M.O.，Ed pp353-358；BLAST程序(Basic Local Alignment Search Tool；(Altschul，S.F.，W.Gish，等(1990)J Mol Biol 215403-10)，BLAST-2，BLAST-P，BLAST-N，BLAST-X，WU-BLAST-2，ALIGN，ALIGN-2，CLUSTAL，或Megalign(DNASTAR)軟件。另外，本領域技術人員可以確定用于測量比對的適當參數，包括在對比的序列長度上達到最大比對所需的任何算法。通常，就蛋白而言，對比序列的長度是至少10個氨基酸，優選地20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、200、250、300、350、400或至少437個氨基酸或更多。就核酸而言，對比序列的長度通常是至少25、50、100、125、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1000、1100、1200或至少1311個核苷酸或更多。應當理解，為了確定序列同一性的目的，當對比DNA序列和RNA序列時，胸腺嘧啶核苷酸相當于尿嘧啶核苷酸。保守置換通常包含下列組內的置換甘氨酸、丙氨酸；纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷酰胺；絲氨酸、蘇氨酸；賴氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“先兆子癇的癥狀”指下列任何一個(1)妊娠20周后，收縮血壓(BP)＞140mmHg且舒張BP＞90mmHg，(2)新發作的蛋白尿(利用測驗片進行尿分析為1+，24小時尿收集中的蛋白＞300mg，或隨機尿的蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)產后12周高血壓及蛋白尿消除。先兆子癇的癥狀還可包含腎功能障礙和腎小球內皮增生或肥大。“子癇的癥狀”指由于妊娠或新近妊娠的影響所致的下列癥狀中任何一個的發展癲癇發作、昏迷、血小板減少癥、肝水腫、肺水腫和腦水腫。
“轉化生長因子β(TGF-β)”指哺乳動物生長因子，其具有TGF-β生物學活性，且是在脊椎動物中普遍存在的結構上有關的旁分泌多肽家族的成員，且是后生動物生長、分化和形態發生因子大家族的原型(綜述見，Massaque等Ann Rev Cell Biol 6597-641(1990)；Massaque等Trends Cell Biol 4172-178(1994)；Kingsley Gene Dev.8133-146(1994)；和Sporn等J Cell Biol 1191017-1021(1992)。如上面的Kingsley所述，TGF-β超家族具有至少25個成員，且可以分成具有高度相關序列的不同亞家族。最明顯的亞家族包含下面的TGF-β亞家族，其包含至少4個與TGF-β1的相似性比與TGF-β超家族的其它成員更高的基因；活化素亞家族，其包含同源-或異源-二聚體或兩個亞基抑制素β-A和抑制素β-B。包括哺乳動物因子BMP2和BMP4的decapentaplegic亞家族，當植入皮下或肌肉中時，可以誘導異位骨和軟骨的形成。包括許多哺乳動物同源物成員的60A亞家族具有骨誘導活性，包括BMP5-8。TGF-β超家族的其它成員包括總分化因子1(GDF-1)、GDF-3/VGR-2、背蛋白、結節的(nodal)、苗勒氏(mullerian)抑制物質(MIS)和神經膠質衍生的神經營養生長因子(GDNF)。應當指出，DPP和60A亞家族的彼此相關性比與TGF-β超家族的其它成員的相關性更緊密，且經常一起歸入稱作DVR(dpp和vg1相關的)的更大分子集合的部分。除非在它使用的上下文中可以看出，在貫穿本說明書中使用的術語TGF-β應當理解為，通常指適合的TGF-β超家族的成員(Massague等，Annu.Rev.Biochem.67753-91，1998；Josso等，Curr.Op.Gen.Dev.，7371-377，1997)。TGF-β起調節許多細胞類型的生長、分化、運動性、組織重建、神經發生、創傷修復、細胞凋亡和血管生成的功能。TGF-β也抑制許多細胞類型的細胞增殖，并可以刺激基質蛋白的合成。
“治療量”指施用給患有先兆子癇或子癇的患者時，足以引起本文所述先兆子癇或子癇癥狀的定性或定量減輕的量。“治療量”還指當施用給患有先兆子癇或子癇的患者時，如通過本文所述的測定測得的，足以引起內皮糖蛋白或sFlt-1表達水平降低、或VEGF或PlGF表達水平提高的量。
“治療”指為了治療目的，施用化合物或藥物組合物。“治療疾病”或用于“治療性處理”指給已經患病的受試者施用治療，以改善受試者狀況。優選地，基于下述任何一個特征癥狀的鑒別，或使用本文所述的診斷方法，診斷受試者患有與高血壓有關的妊娠并發癥，如先兆子癇或子癇。“預防疾病”指預防性地處理還沒有發病，但易感或另外有發展特定疾病危險的受試者。優選地，使用本文所述的診斷方法，確定受試者有發展先兆子癇或子癇的危險。因此，在權利要求和實施方案中，治療是為了治療或預防目的而施用于哺乳動物的。
“滋養層”指覆蓋胚泡的中外胚層細胞層，其侵蝕子宮粘膜，且胚胎通過它從母體接受營養；該細胞有助于胎盤的形成。
“血管內皮生長因子(VEGF)”指哺乳動物生長因子，其與美國專利號5,332,671；5,240,848；5,194,596；和Charnock-Jones等(Biol.Reproduction，481120-1128，1993)中定義的生長因子同源，且具有VEGF生物學活性。VEGF以糖基化同源二聚體的形式存在，且包含至少4種不同的可變剪接的同工型。天然VEGF的生物學活性包括，促進血管內皮細胞或臍靜脈內皮細胞的選擇性生長，并誘導血管生成。如本文所使用的，VEGF包含任何VEGF家族成員或同工型(例如，VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF189、VEGF165或VEGF121)。優選地，VEGF是VEGF121或VEGF165同工型(Tischer等，J.Biol.Chem.266，11947-11954，1991；Neufed等，Cancer Metastasis 15153-158，1996)，其在引入本文作為參考的美國專利號6,447,768；5,219,739；和5,194,596中描述。還包含VEGF的突變體形式，如在Gille等(J.Biol.Chem.2763222-3230，2001)中描述的KDR-選擇性VEGF和Flt-選擇性VEGF。如本文所使用的，VEGF也包括任何修飾形式的VEGF，如LeCouter等(Science 299890-893，2003)所述的那些。雖然優選人VEGF，但本發明不限于人形式，且包含VEGF的其它動物形式(例如，小鼠、大鼠、狗或雞)。
“載體”指DNA分子，其通常來源于質粒或噬菌體，向其中可插入或克隆DNA片段。重組載體將包含一個或多個獨特的限制位點，且能夠在規定的宿主或載體生物中自主復制，從而使得克隆的序列可復制。載體包含與基因或編碼區可操作地連接的啟動子，這樣，轉染進受體細胞后，可表達RNA。
從其優選實施方案的下列描述以及權利要求中，可以明白本發明的其它特征和優點。
附圖簡述本專利或申請文件含有至少一份彩色繪制的附圖。在請求并支付必需的費用后，專利局會提供本專利或專利申請公開文件的具有彩色附圖的副本。
圖1是顯示內皮糖蛋白蛋白的示意圖。SP信號肽，ZP透明帶結構域，CL潛在切割位點(氨基酸437)，以釋放可溶內皮糖蛋白，TM跨膜結構域，Cyto胞質結構域。
圖2A顯示了可溶內皮糖蛋白的預測的cDNA序列(SEQ ID NO1)。圖2B顯示了可溶內皮糖蛋白的預測的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖3是顯示來自正常妊娠的胎盤(N)、來自輕度先兆子癇妊娠的胎盤(p)和來自重度先兆子癇妊娠的胎盤(P)的內皮糖蛋白mRNA水平的RNA印跡。
圖4是顯示胎盤中的內皮糖蛋白蛋白水平的蛋白印跡。樣品來自兩個先兆子癇患者p32和p36，其在2003呈遞給Beth Israel DeaconessMedical Center，且產婦血清來自妊娠婦女。使用從Santa CruzBiotechnology，Inc.，(Santa Cruz，CA)得到的N-末端抗體，探測蛋白印跡，其顯示了胎盤中的110kD帶和存在于胎盤和血清樣品中的更小的63kD帶。
圖5中的圖顯示了可溶內皮糖蛋白在具有正常妊娠、輕度先兆子癇、重度先兆子癇和并發早產的無先兆子癇妊娠的婦女中的循環濃度。在分娩前24小時內，得到所有血液樣品。使用購自R&DSystems，MN(目錄號DNDG00)的ELISA試劑盒，測量可溶內皮糖蛋白。這些數據表明，在臨床疾病時，先兆子癇患者中的可溶內皮糖蛋白水平顯著升高。
圖6中的圖顯示了在各個胎齡組窗口期間，5個不同研究組的妊娠婦女在整個妊娠中的平均可溶內皮糖蛋白濃度。
圖7中的圖顯示了在各個胎齡組窗口期間，5個不同研究組的妊娠婦女在整個妊娠中的平均sFlt1濃度。
圖8中的圖顯示了在各個胎齡組窗口期間，5個不同研究組的妊娠婦女在整個妊娠中的平均PlGF濃度。
圖9中的圖顯示了在臨床癥狀之前采取的樣品的先兆子癇抗血管生成的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數值。
圖10中的圖顯示了根據臨床過早的先兆子癇(PE＜37周)之前的周數的可溶內皮糖蛋白的平均濃度。
圖11中的圖顯示了根據臨床過早的先兆子癇(PE＜37周)之前的周數的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數值。
圖12中的圖顯示了對于在癥狀之前和之后的足孕先兆子癇(PE＞37周)，整個妊娠過程中的可溶內皮糖蛋白水平的變化。
圖13中的圖顯示了對于在癥狀之前和之后的足孕先兆子癇(PE＞37周)，整個妊娠過程中的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數水平的變化。
圖14中的圖顯示了在妊娠高血壓期間和在妊娠高血壓之前(妊娠高血壓前1-5周(在妊娠的33-36周))的婦女和血壓正常對照中測得的可溶內皮糖蛋白水平。
圖15中的圖顯示了在妊娠高血壓期間和在妊娠高血壓之前(妊娠高血壓前1-5周(在妊娠的33-36周))的婦女和血壓正常對照中測得的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數水平。
圖16中的圖顯示了在33-36周妊娠窗口期間，在患有重度SGA、輕度SGA的婦女和血壓正常對照中測得的可溶內皮糖蛋白水平。
圖17中的圖顯示了在33-36周妊娠窗口期間，在患有重度SGA、輕度SGA的婦女和血壓正常對照中測得的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數水平。
圖18中的圖顯示了相同妊娠患者中的sFlt1和可溶內皮糖蛋白的濃度的彼此關系圖。
圖19顯示了在25.2周采取的先兆子癇胎盤的內皮糖蛋白(紅色)和平滑肌肌動蛋白(綠色)的雙免疫熒光染色的顯微照片。用于檢測內皮糖蛋白的抗體將全長內皮糖蛋白和可溶內皮糖蛋白都染色。適當的妊娠窗口的對照胎盤源自早產患者。
圖20顯示了在41.3周采取的先兆子癇胎盤的內皮糖蛋白(紅色)和平滑肌肌動蛋白(綠色)的雙免疫熒光染色的顯微照片。用于檢測內皮糖蛋白的抗體將全長內皮糖蛋白和可溶內皮糖蛋白都染色。適當的妊娠窗口的對照胎盤源自早產患者。
圖21A是使用先兆子癇胎盤和血清兩者進行內皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印跡實驗得到的放射自顯影圖照片。圖21B是使用先兆子癇胎盤進行內皮糖蛋白的免疫沉淀法和蛋白印跡實驗得到的放射自顯影圖照片。3種不同的N和P樣品代表著單個的患者。就兩幅圖而言，使用商業上可得到的單克隆抗體進行免疫沉淀法，并使用多克隆抗體進行蛋白印跡。產生的這兩種抗體都針對內皮糖蛋白蛋白的N-末端區，并檢測全長和截短的可溶內皮糖蛋白蛋白兩者。
圖22中的圖顯示了使用在生長因子減少的matrigel中的HUVEC進行血管生成測定的結果。在有可溶內皮糖蛋白或sFlt1或二者存在下，進行血管生成測定，并定量內皮管長度。C-代表對照，E-代表1μg/ml的可溶內皮糖蛋白，且S代表1μg/ml的sFlt1。E+S代表1μg/mlE+1μg/ml sFlt1的組合。數據代表著3個獨立實驗的平均值。
圖23中的圖顯示了如材料和方法中所述，使用伊文思藍(Evansblue)泄漏，在小鼠中評估的幾種器官床中的微血管通透性。C-對照(GFP)，E-可溶內皮糖蛋白，S-sFlt1，且S+E-sFlt1+可溶內皮糖蛋白。數據代表著4個獨立實驗的平均值。
圖24中的圖顯示了在有劑量范圍為200pg/ml-200ng/ml的TGF-β1(B1)和TGF-β3(B3)存在下，進行微血管反應性實驗的大鼠腎微血管直徑的百分比變化。在有1μg/ml可溶內皮糖蛋白(E)存在下，重復這些相同的實驗。顯示的這些數據代表著4個獨立實驗的平均值。
圖25中的圖顯示了在有1ng/ml VEGF(V)、TGF-β1(B1)和組合(V+B1)存在下，腎微血管的血管直徑的百分比變化。還顯示了在有各1μg/ml的sFlt1(S)和可溶內皮糖蛋白(E)(V+B1+S+E)存在下，該組合的作用。數據代表著4個獨立實驗的平均值。
圖26A是在處死時從注射了sFlt1和對照腺病毒(CMV)的組合的妊娠大鼠采取的血液樣品的外周涂片的照片。圖26B是在處死時從注射了sFlt1和表達可溶內皮糖蛋白的腺病毒的組合的妊娠大鼠采取的血液樣品的外周涂片的照片，并表現出活性溶血，如由裂紅細胞和升高的網狀細胞計數所證實的。箭頭代表裂紅細胞。
圖27A-D的一系列顯微照片顯示了表8所述的各種動物組的腎組織學(H&E染色)。圖27A顯示了對照組的腎組織學，沒有腎小球內皮增生的跡象。圖27B顯示了可溶內皮糖蛋白注射組的腎組織學，沒有腎小球內皮增生的跡象。圖27C顯示了sFlt1注射的大鼠的腎組織學，顯示出中等內皮增生(用箭頭指示)。圖27D顯示了可溶內皮糖蛋白和sFlt1注射的大鼠的腎組織學，顯示出非常腫脹的腎小球和嚴重的腎小球內皮增生，在足細胞內存在蛋白再吸收小滴。在60X(原始放大率)拍攝所有光顯微照片。
詳細描述我們已經發現，在從患有妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇或子癇)的婦女采集的血清樣品中，可溶內皮糖蛋白水平提高。可溶內皮糖蛋白可以由蛋白水解酶切割膜結合形式的胞外部分來形成。過量的可溶內皮糖蛋白可以耗盡胎盤的必需量的這些必需的血管生成和促有絲分裂因子。因而，可溶內皮糖蛋白是妊娠相關的高血壓病癥(包括先兆子癇和子癇)的極好的診斷標記。此外，我們已經發現，干擾可溶內皮糖蛋白結合生長因子的治療劑，降低可溶內皮糖蛋白表達或生物學活性的試劑，或提高生長因子的水平的試劑，可以用于治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥，如先兆子癇或子癇。這類試劑包含，但不限于，可溶內皮糖蛋白的抗體，降低可溶內皮糖蛋白的水平的反義或RNAi的寡核苷酸，提高生長因子的水平的化合物，阻止膜結合形式的內皮糖蛋白的蛋白酶剪切、從而預防可溶內皮糖蛋白的釋放的化合物，和結合可溶內皮糖蛋白并封閉生長因子結合位點的小分子。本發明也涉及測量可溶內皮糖蛋白的水平的方法，作為妊娠相關的高血壓病癥(包括先兆子癇和子癇)的早期診斷和控制的檢測工具。
盡管本文提供的詳細描述具體地涉及可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF，但本領域技術人員會明白，該詳述也應用于可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的家族成員、同工型和/或變體。
診斷學本發明涉及基于檢測可溶內皮糖蛋白的測定，以檢測妊娠相關的高血壓病癥，如先兆子癇、子癇，或發展這樣狀況的傾向。盡管本文所述的方法具體地涉及先兆子癇和子癇，但應當理解，本發明的診斷和監控方法適用于任何妊娠相關的高血壓病癥，包括但不限于，妊娠高血壓、具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠、HELLP、慢性高血壓、先兆子癇(輕度、中度和重度)和子癇。
在受試者樣品中測量內皮糖蛋白的水平，無論是游離的、結合的還是總的水平，并將其用作先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的指標。
患有先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的受試者，會表現出可溶內皮糖蛋白多肽的表達的增加。可溶內皮糖蛋白多肽可包含全長可溶內皮糖蛋白、降解產物、可溶內皮糖蛋白的可變剪接的同工型、可溶內皮糖蛋白的酶切割產物等。特異性地結合可溶內皮糖蛋白多肽的抗體，可以用于診斷先兆子癇或子癇，或鑒別處于發展這樣狀況的危險中的受試者。在本發明的方法中有用的抗體的一個實例是針對內皮糖蛋白的N-末端區的單克隆抗體，其在商業上可從Santa CruzBiotechnology，Inc.(目錄號sc-20072)得到。已知許多種測量這樣的多肽的表達中的變化的規程，包括免疫學方法(如ELISA和RIA)，且其提供診斷先兆子癇或子癇或發展這樣狀況的危險的基礎。另外，可溶內皮糖蛋白多肽水平的提高，可診斷患有先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的受試者。
升高水平的可溶內皮糖蛋白是先兆子癇或子癇的陽性指標。例如，如果可溶內皮糖蛋白的水平相對于參照升高(例如，10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多)，則認為這是先兆子癇或子癇的陽性指標。另外，可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平相對于正常水平的任何可檢測的變化，是子癇、先兆子癇或發展這樣狀況的傾向的指示。通常，在非妊娠狀態期間，可溶內皮糖蛋白的循環血清濃度范圍是2-7ng/ml，而在正常妊娠期間，是10-20ng/ml。認為升高的可溶內皮糖蛋白的血清水平(大于15ng/ml、優選地大于20ng/ml、且最優選地大于25ng/ml或更高)，是先兆子癇的陽性指標。
在一個實施方案中，與sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸的水平、或其任意組合結合，測量可溶內皮糖蛋白的水平。測量sFlt-1、VEGF和PlGF的方法，記載在這里整體引作參考的PCT公開號WO2004/008946和美國公開號20040126828中。在其它優選的實施方案中，還測量體重指數(BMI)和胎兒的胎齡，并包括診斷度量。
在一個實施方案中，使用包含可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF、或其中的任意組合的度量，來確定至少兩種蛋白的水平之間的關系是否可指示先兆子癇或子癇。在一個實例中，度量是PAAI(sFlt-1/VEGF+PlGF)，其與可溶內皮糖蛋白測量結合，用作抗血管生成指數，后者可診斷先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向。如果可溶內皮糖蛋白的水平相對于參照樣品升高(例如，1.5倍、2倍、3倍、4倍或甚至高達10倍或更高)，且PAAI大于10、更優選地大于20，則認為受試者患有先兆子癇、子癇，或處于發展它們的迫切危險中。PAAI(sFlt-1/VEGF+PlGF)比率僅僅是可以用作診斷指標的有用度量的一個實例。它無意限制本發明。實際上，可以檢測受試者中相對于正常對照的可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF的水平的變化或其任意組合的任何度量，都可以用作診斷指標。另一個實例是下面的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數(sFlt-1+0.25(可溶內皮糖蛋白多肽))/PlGF。可溶內皮糖蛋白度量的該值的增加，是先兆子癇或子癇的診斷指標。超過100、優選地超過200的可溶內皮糖蛋白指數是先兆子癇或子癇的診斷指標。另一個實例是下面的指數(可溶內皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF。該指數還可以包含母親的BMI或嬰兒的GA。
標準方法可用于測量任何體液(包含但不限于，尿、血清、血漿、唾液、羊水或腦脊液)中的可溶內皮糖蛋白、VEGF、PlGF或sFlt-1多肽的水平。這類方法包含免疫測定，ELISA，使用針對可溶內皮糖蛋白、VEGF、PlGF或sFlt-1的抗體的蛋白印跡，以及定量酶免疫測定技術，如Ong等(Obstet.Gynecol.98608-611，2001)和Su等(Obstet.Gynecol.，97898-904，2001)描述的那些。ELISA測定是測量可溶內皮糖蛋白、VEGF、PlGF或sFlt-1的水平的優選方法。優選地，測量可溶內皮糖蛋白。
源自內皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸序列的寡核苷酸或更長的片段，可以用作探針，來不僅監控表達，而且鑒別具有內皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF或VEGF核酸分子的遺傳性變異、突變或多態性的受試者，這些是發展先兆子癇或子癇的素因的指示。這些多態性可以影響核酸或多肽表達水平或生物學活性。這樣的多態性是熟練的技術人員已知的且記載在，例如，上面的Raab等和Parry等(Eur.JImmunogenet.26321-3，1999)。例如，已經描述了內皮糖蛋白基因的多態性，且其中的許多與稱作遺傳性出血性毛細管擴張(telengiectasia)I型(HHT1)的顯性血管病癥有關。這些突變中的許多會導致不穩定的可溶形式的內皮糖蛋白的生成，從而導致在HHT患者的內皮細胞和單核細胞中發現的內皮糖蛋白降低的表達(Raab等，同上)。在另一個實例中，GenBank數據庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)的調查揭示了該基因和Flt-1/sFlt-1的啟動子區的至少330種已知多態性。相對于正常參照樣品的遺傳性變異、突變或多態性的檢測，可以用作先兆子癇、子癇或發展先兆子癇或子癇的傾向的診斷指標。
這種基因變化可存在于基因的啟動子序列、可讀框、內含子序列或非翻譯3’區中。有關基因變化的信息，可用于診斷受試者患有先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向。如全文所述，可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平或生物學活性的特定變化，或其任意組合，可以與先兆子癇或子癇或它們的素因的可能性相關聯。結果，本領域技術人員在檢測了給定突變后，可以測定蛋白的一種或多種生物學活性，以確定該突變是否會引起或增加先兆子癇或子癇的可能性。
在一個實施方案中，患有先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的受試者將表現出編碼內皮糖蛋白(優選地可溶內皮糖蛋白)或sFlt-1的核酸的表達的增加，或PlGF或VEGF水平的變化。用于檢測這種變化的方法是本領域的標準方法，且由上面的Ausubel等描述。在一個實例中，使用RNA印跡或實時PCR檢測內皮糖蛋白(優選地可溶內皮糖蛋白)、sFlt-1、PlGF或VEGF mRNA水平。
與能夠檢測內皮糖蛋白或可溶內皮糖蛋白核酸分子的PCR探針(包含基因組序列或緊密相關分子)雜交，可用于和源自患有先兆子癇或子癇或處于發展這樣狀況的危險中的受試者的核酸序列雜交。探針的特異性，不論其是從高特異性區(例如5’調節區)還是從低特異性區(例如，保守基序)制造的，以及雜交或擴增的嚴格性(最高、高、中等或低)，都可確定探針是否與天然存在的序列、等位基因變體或其它相關序列雜交。雜交技術可用于鑒別可溶內皮糖蛋白核酸分子中指示先兆子癇或子癇的突變，或可用于監控編碼可溶內皮糖蛋白多肽的基因的表達水平(例如，通過RNA印跡，Ausubel等，同上)。
在另一實施方案中，通過直接分析內皮糖蛋白或可溶內皮糖蛋白核酸分子的序列，可診斷受試者發展先兆子癇或子癇的傾向。
本文所述的任一種核酸或多肽的測量，可以發生在至少兩個不同的場合，并將與正常參照水平相比隨時間推移產生的水平的變化，用作先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的指標。
存在于患有先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的任一種可溶內皮糖蛋白多肽或核酸的水平，與正常對照受試者的水平相比，或與以前從相同受試者的相同體液得到的采樣相比，可以增加少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。從一次測量至下一次測量，存在于患有先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內皮糖蛋白多肽或核酸的水平，可以隨時間推移改變少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
與患有先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內皮糖蛋白的水平結合測量的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平，與正常對照中的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平相比，可以改變少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更多。從一次測量至下一次測量，與患有先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的受試者的體液中的可溶內皮糖蛋白的水平結合測量的sFlt-1、VEGF或PlGF的水平，可以隨時間推移改變少至10％、20％、30％或40％或多至50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％。
在一個實施方案中，在發作先兆子癇癥狀前的妊娠早期，收集受試者的體液樣品(例如，尿、血漿、血清、羊水或腦脊液)。在另一實例中，樣品可以是在發作先兆子癇癥狀前的妊娠早期收集的組織或細胞。組織和細胞的非限制性實例包含胎盤組織、胎盤細胞、內皮細胞和白細胞如單核細胞。在人類中，例如，在妊娠的前三個月、次三個月或第三個三個月期間，收集孕婦肘前靜脈的產婦血清樣品。優選地，在前三個月(例如在4、6、8、10或12周)期間，或其中的任何時間間隔進行測定，或在次三個月(例如在14、16、18、20、22或24周)期間，或其中的任何時間間隔進行測定。這樣的測定還可在次三個月結束時或第三個三個月時進行，例如，在26、28、30、32、34、36或38周，或其中的任何時間間隔。優選地，在該時間段內，將可溶內皮糖蛋白的水平測量兩次。就產后先兆子癇或子癇的診斷而言，可溶內皮糖蛋白的測定可在產后進行。就發展先兆子癇或子癇的傾向的診斷而言，在發作妊娠之前進行測定。在一個實例中，就治療的監控和控制而言，在診斷先兆子癇后、在妊娠過程中進行測定。
在一個特定的實例中，可在妊娠過程中收集系列血液樣品，并通過ELISA測定可溶內皮糖蛋白多肽的水平。在另一個實例中，在次三個月期間和第三個三個月的早期收集樣品，且從第一次取樣到下一次取樣的可溶內皮糖蛋白的水平的增加，是先兆子癇或子癇或發展任一種的傾向的指示。
本發明也包含測量受試者體液(優選地尿)中的可溶內皮糖蛋白(例如，TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)配體的任一種配體，且可溶內皮糖蛋白配體水平的變化(例如，增加或減少)是先兆子癇或子癇的指示。
在獸醫實踐中，可在妊娠過程中的任何時間進行測定，但優選地在妊娠早期、發作先兆子癇癥狀前進行。已知妊娠期限在物種之間廣泛變化，測定時間選擇將由獸醫決定，但通常與人類妊娠過程的測定時間選擇相對應。
可以單獨地，或與本文所述的任何其它診斷方法結合地，使用本文所述的診斷方法，以更準確地診斷先兆子癇或子癇的存在、嚴重程度或估計的發作時間。此外，本文所述的診斷方法可與用于準確診斷先兆子癇或子癇的存在、嚴重程度或估計的發作時間的任何其它診斷方法結合使用。
本文所述診斷方法還可用于監控并控制受試者的先兆子癇或子癇。在一個實例中，施用治療，直到血液、血漿或血清可溶內皮糖蛋白水平小于25ng/ml。在另一個實例中，如果測得受試者具有比正常對照升高水平的可溶內皮糖蛋白，則可以施用治療，直到血清PlGF水平升高到約400pg/mL。在該實施方案中，重復測量可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、PlGF和VEGF的水平，或它們中的任一種或全部，作為不僅診斷疾病，而且監控先兆子癇和子癇的治療和控制的方法。
診斷試劑盒本發明還提供診斷試驗試劑盒。例如，診斷試驗試劑盒可包含可溶內皮糖蛋白的抗體，和用于檢測、且更優選用于評價抗體與可溶內皮糖蛋白多肽之間的結合的工具。對于檢測，標記抗體或可溶內皮糖蛋白多肽，且抗體或可溶內皮糖蛋白多肽是基質-結合的，這樣在抗體與可溶內皮糖蛋白多肽之間結合后，通過測定附著到基質上的標記的量，就可以確定可溶內皮糖蛋白多肽-抗體的相互作用。常規的ELISA是本領域已知的檢測抗體-基質相互作用的常見方法，且可以與本發明的試劑盒一起提供。實際上，可在任何體液(包含但不限于尿、血清、血漿、唾液、羊水或腦脊液)中檢測可溶內皮糖蛋白多肽。本發明也提供了包含可溶內皮糖蛋白核酸的診斷試驗試劑盒，所述可溶內皮糖蛋白核酸可以用于檢測和確定可溶內皮糖蛋白核酸的水平。測定可溶內皮糖蛋白多肽的水平相對于參照(如存在于正常對照中的水平)的變化的試劑盒，可用作本發明方法中的診斷試劑盒。
本發明的診斷試劑盒可以包含用于檢測美國專利申請公開號20040126828、20050025762和2005017044和PCT公開號WO2004/008946和WO 2005/077007所述的sFlt-1、VEGF或PlGF多肽或核酸的抗體或核酸。
合意地，試劑盒包含進行上述的任一種診斷方法必需的所有組分。例如，試劑盒合意地包含膜，其中在該膜上固定化了可溶內皮糖蛋白結合試劑或結合可溶內皮糖蛋白結合試劑的試劑。該膜可以支持在測驗片結構上，在那里通過將測驗片結構置于樣品中，將樣品沉積于膜上，或該膜可以支持在側向流盒中，在那里通過盒子中的開口，將樣品沉積于膜上。
診斷試劑盒通常還包含關于試劑盒組分的預期用途的標簽或說明書，和用于確立標準曲線的參照樣品或純化的蛋白。在一個實例中，試劑盒含有關于使用試劑盒來診斷先兆子癇、子癇或發展先兆子癇或子癇的傾向的說明書。在另一個實例中，試劑盒含有關于使用試劑盒來監控治療先兆子癇或子癇的治療性處理或劑量方案的說明書。診斷試劑盒也可以包含關于使用試劑盒來確定受試者樣品的PAAI或可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數、并將PAAI或可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數與參照樣品值相對比的標簽或說明書。應當理解，參照樣品值將取決于試劑盒的預期用途。例如，可以將樣品與正常參照值相對比，其中PAAI或可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數或可溶內皮糖蛋白值的增加，是先兆子癇或子癇或發展先兆子癇或子癇的傾向的指示。在另一個實例中，用于治療性監控的試劑盒可以具有參照PAAI或可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數值或可溶內皮糖蛋白值，它是先兆子癇或子癇的指示，其中與參照樣品相比受試者樣品的PAAI或可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數值的降低或可溶內皮糖蛋白值的降低，可以用于指示治療性化合物的治療功效或有效劑量。
篩選測定如上面所討論的，可溶內皮糖蛋白核酸或多肽的水平在患有先兆子癇、子癇或發展這樣狀況的傾向的受試者中升高。基于這些發現，本發明的組合物可用于候選化合物的高通量低成本篩選，以鑒別調節可溶內皮糖蛋白多肽或核酸分子的表達的那些，所述表達在患有先兆子癇或子癇的受試者中發生變化。
許多方法都可用于進行篩選測定，以鑒別改變可溶內皮糖蛋白核酸分子的表達的新候選化合物。在一個工作實施例中，將各種濃度的候選化合物加入到表達可溶內皮糖蛋白核酸序列的培養細胞的培養基中。示例性的細胞培養物包含滋養層(例如，BEWO、JAR和JEG細胞)和HUVEC。可以用蛋白酶(例如，基質金屬蛋白酶)處理表達高水平的膜結合形式的內皮糖蛋白的細胞，所述蛋白酶切割內皮糖蛋白的胞外結構域以形成可溶內皮糖蛋白。然后，這些細胞可以用于篩選新候選化合物。然后測量基因表達，例如，通過微陣列分析、RNA印跡分析(Ausubel等，同上)或RT-PCR，其中使用從核酸分子制備的任何適宜片段作為雜交探針。將在有候選化合物存在下的基因表達水平與在缺少候選化合物的對照培養基中測量的水平相比較。促進可溶內皮糖蛋白基因、核酸分子或多肽、或其功能等價物的表達的降低的化合物，被認為可用于本發明中；可使用這類分子，例如，作為治療受試者的先兆子癇或子癇的治療劑。
在另一個工作實施例中，可使用相同的一般方法和標準的免疫學技術，如使用對可溶內皮糖蛋白多肽特異性的抗體進行的蛋白印跡或免疫沉淀法，在多肽產生水平測量候選化合物的作用。例如，免疫測定可用于檢測或監控本發明至少一種多肽在生物中的表達。能夠結合這種多肽的多克隆或單克隆抗體(如上所述產生的)，可用于任何標準免疫測定形式(例如，ELISA、蛋白印跡或RIA測定)中，以測量所述多肽的水平。在某些實施方案中，促進可溶內皮糖蛋白多肽表達或生物學活性的降低的化合物，被認為是特別有用的。同樣，可使用這類分子，例如，作為延遲、改善或治療受試者的先兆子癇或子癇、或先兆子癇或子癇癥狀的治療劑。
在另一個工作實施例中，可篩選候選化合物中特異性地結合可溶內皮糖蛋白多肽的那些。這種候選化合物的功效取決于它與這類多肽或其功能等價物相互作用的能力。使用任意數目的標準結合技術和功能測定(例如，上面的Ausubel等描述的那些)，可容易地測定這種相互作用。在一個實施方案中，可體外測試候選化合物的特異性地結合本發明多肽的能力。在另一實施方案中，可通過降低可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子(如TGF-β、TGF-β3、活化素-A、BMP-2和BMP-7)的結合，測試候選化合物降低可溶內皮糖蛋白多肽的生物學活性的能力。
在另一個工作實施例中，將可溶內皮糖蛋白核酸表達成具有可檢測的報道分子的轉錄或翻譯融合體，并在異源啟動子(如誘導型啟動子)的控制下，在分離的細胞(例如，哺乳動物或昆蟲細胞)中表達。然后，使表達融合蛋白的細胞與候選化合物接觸，并將可檢測的報道分子在該細胞中的表達與可檢測的報道分子在未處理的對照細胞中的表達進行比較。降低可溶內皮糖蛋白可檢測的報道分子的表達的候選化合物，是可用于治療先兆子癇或子癇的化合物。在優選實施方案中，候選化合物改變與核酸融合的報道基因或核酸的表達。
在一個特定的工作實施例中，使用基于層析的技術，可以鑒別結合可溶內皮糖蛋白多肽的候選化合物。例如，通過標準技術，可以從被工程改造以表達多肽(例如，上述那些)的細胞，純化本發明的重組多肽，且可將其固定化在柱上。然后，使候選化合物的溶液通過柱，且基于結合多肽并固定化在柱上的能力，鑒別對可溶內皮糖蛋白多肽特異性的化合物。為了分離化合物，洗滌柱，以除去非-特異性結合的分子，然后使目標化合物從柱上釋放，并收集。類似的方法可用于分離與多肽微陣列結合的化合物。如果需要，可以進一步純化(例如，通過高效液相層析)通過該方法(或任何其它適宜方法)分離的化合物。此外，還可測試這些候選化合物的降低可溶內皮糖蛋白多肽的活性的能力。也可以使用通過該方法分離的化合物，例如，作為治療人受試者的先兆子癇或子癇的治療劑。認為鑒定為以小于或等于10mM的親和常數結合本發明多肽的化合物，特別適用于本發明。或者，任何體內蛋白相互作用檢測系統，例如，任何雙雜交測定，均可用于鑒別結合本發明多肽的化合物或蛋白。
潛在的拮抗劑包含結合可溶內皮糖蛋白核酸序列或可溶內皮糖蛋白多肽的有機分子、肽、肽模擬物、多肽、核酸以及抗體。
可溶內皮糖蛋白DNA序列還可用于發現和開發治療先兆子癇或子癇的治療性化合物。編碼的蛋白在表達后，可用作藥物篩選的靶。此外，通過標準技術(Ausubel等，同上)，可分離編碼所編碼蛋白的氨基末端區的DNA序列、或Shine-Delgarno序列、或其它翻譯促進序列。
任選地，在上述任何測定的任一個中鑒別的化合物，被證實可以用于測定降低可溶內皮糖蛋白的生物學活性的化合物。
本發明的小分子優選地具有低于2,000道爾頓、更優選300-1,000道爾頓、且最優選400-700道爾頓的分子量。優選地，這些小分子是有機分子。
試驗化合物和提取物通常，根據本領域已知的方法，從天然產物或合成的(或半-合成的)提取物的大文庫或化學文庫或多肽或核酸文庫中，鑒別能夠降低可溶內皮糖蛋白多肽的活性的化合物。藥物發現與開發領域的技術人員將理解，試驗提取物或化合物的準確來源對于本發明的篩選程序并不特別重要。用于篩選的化合物可包含已知化合物(例如，用于其它疾病或病癥的已知治療劑)。或者，事實上，使用本文所述方法，可篩選任意數目的未知的化學提取物或化合物。這種提取物或化合物的實例包含但不限于，基于植物、真菌、原核生物或動物的提取物、發酵液體培養基、和合成化合物，以及現有化合物的修飾。還有很多方法也可用于隨機地生成或定向地合成(例如，半合成或全合成)任意數目的化合物，包含但不限于，基于糖、脂類、肽、及核酸的化合物。合成化合物文庫在商業上可從Brandon Associates(Merrimack，NH)和Aldrich Chemical(Milwaukee，WI)得到。或者，細菌、真菌、植物和動物提取物形式的天然化合物文庫，在商業上可從很多來源得到，包含Biotics(Sussex，UK)、Xenova(Slough，UK)、Harbor Branch Oceangraphics Institute(Ft.Pierce，FL)和PharmaMar，U.S.A.(Cambridge，MA)。此外，如果需要，按照本領域已知的方法，例如，通過標準的提取和分級分離方法，可以產生天然的及合成產生的文庫。此外，如果需要，使用標準的化學、物理或生物化學的方法，可以很容易地修飾任何文庫或化合物。
此外，藥物發現與開發領域的技術人員可容易地理解，不論何時，都應該應用反篩選(dereplication)(例如，分類反篩選、生物學反篩選和化學反篩選、或其任意組合)或除去已知脫換物(molt)-破壞活性的材料的復制或重復的方法。
當發現粗提取物可降低可溶內皮糖蛋白多肽活性、或結合可溶內皮糖蛋白多肽時，進一步分級分離陽性的先導提取物，是分離負責所觀察到的作用的化學組分所必需的。因此，提取、分級分離和純化方法的目的是，認真表征和鑒別粗提取物內的降低可溶內皮糖蛋白多肽的活性的化學實體。這種異質提取物的分級分離和純化方法是本領域已知的。如需要，根據本領域已知方法，化學地修飾可用作治療人先兆子癇或子癇的治療劑的化合物。
治療本發明涉及用于治療或預防受試者的先兆子癇或子癇的方法和組合物。假設患有先兆子癇、子癇或具有這樣狀況的素因的受試者中的可溶內皮糖蛋白的水平升高，則降低可溶內皮糖蛋白多肽或核酸分子的表達水平和/或生物學活性的任何試劑，都可以用于本發明的方法中。這樣的試劑包含化合物如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2或BMP7，其可以破壞可溶內皮糖蛋白結合配體；特異性地結合可溶內皮糖蛋白的純化的抗體或抗原結合片段；反義核堿基寡聚體；和用于介導RNA干擾的dsRNA。其它有用的化合物包括可以改變可溶內皮糖蛋白的生物學活性的任意化合物，例如，如通過血管生成測定所測得的。下面詳細描述了示例性的治療方法。這些方法也可以與如PCT公開號WO 2004/008946和美國專利公開號20040126828所述的降低sFlt-1水平、或升高VEGF或PlGF水平、或降低sFlt-1水平的方法相組合。
靶向TGF-β信號傳導途徑的治療劑TGF-β是至少25種生長因子的家族的原型，所述生長因子在許多細胞類型中調節生長、分化、運動性、組織重建、神經發生、創傷修復、細胞凋亡和血管生成。TGF-β也抑制許多細胞類型的細胞增殖，并可以刺激基質蛋白的合成。除了在它使用的上下文中可以看出以外，在貫穿本說明書中使用的術語TGF-β應當理解為，通常指適合的TGF-β超家族的任一個或所有成員。可溶內皮糖蛋白結合TGF-β家族的幾個特定成員，包括TGF-β1、TGF-β3、活化素、BMP-2和BMP-7，且可以用于耗盡發育中的胎兒或胎盤的必需的促有絲分裂因子和血管生成因子。本發明涉及提高這些配體的水平來結合可溶內皮糖蛋白和中和可溶內皮糖蛋白的作用的方法。
純化的蛋白在本發明的一個優選的實施方案中，給受試者施用純化形式的任何可溶內皮糖蛋白配體，如TGF-β家族蛋白，包含但不限于TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7，以治療或預防先兆子癇或子癇。
純化的TGF-β家族蛋白包含任何下述的蛋白其氨基酸序列與TGF-β1或TGF-β3或任何已知TGF-β家族成員的氨基酸序列同源，更合意地基本相同，其可誘導血管生成。非限制性實例包含來自R&D Systems，MN的人TGF-β1(Cat#240-B-002)和人TGF-β3(Cat#243-B3-002)。
抑制內皮糖蛋白(endgolin)的蛋白酶剪切的治療性化合物我們已經鑒別了內皮糖蛋白的胞外結構域中的潛在切割位點，蛋白水解酶會在這里切割膜結合形式的內皮糖蛋白，從而釋放出可溶形式的胞外結構域。我們的切割位點的序列比對表明，基質金屬蛋白酶(MMP)負責切割和釋放可溶內皮糖蛋白。或者，組織蛋白酶或彈性蛋白酶也可以參與切割事件。MMP也稱作膠原酶、明膠酶和溶基質素，且存在26個已知的家族成員(綜述見Whittaker和Ayscough，Cell Transmissions 171(2001))。優選的MMP是MMP9，已知它在先兆子癇患者的胎盤中受到上調(Lim等，Am.J.Pathol.1511809-1818，1997)。通過酶原的激活和內源抑制劑(如金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPS))的抑制，控制MMP的活性。MMP的抑制劑是鋅結合蛋白。存在4種已知的內源抑制劑(TIMP 1-4)，其綜述見上面的Whittaker等。一種優選的MMP抑制劑是膜型-MMP1的抑制劑，已經表明它會切割β聚糖，即與內皮糖蛋白(enodglin)共有相似性的一種分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.2797721-7733(2004))。此外，已經鑒別出了許多種天然存在的和合成的MMP抑制劑，且其綜述也見上面的Whittaker等。實例包含針對MMP的抗體，和各種化合物，包括馬馬司他、巴馬司他、CT1746、BAY 12-9566、普馬司他(prinomastat)、CGS-27023A、D9120、BMS275291(BristolMyers Squibb)和trocade，其中的一些現在處于臨床試驗中。已知MMP、組織蛋白酶或彈性蛋白酶在釋放和上調可溶內皮糖蛋白水平中的潛在作用，本發明也提供了已知抑制參與可溶內皮糖蛋白的切割和釋放的任意MMP、組織蛋白酶或彈性蛋白酶的活性的任意化合物(如上述的那些)在治療或預防受試者的先兆子癇或子癇中的用途。
增加可溶內皮糖蛋白結合蛋白的治療性化合物本發明提供了已知刺激或升高可溶內皮糖蛋白結合蛋白(包含但不限于TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7)的血清水平的任意化合物在治療或預防受試者的先兆子癇中的用途。可以單獨地，或與上述純化的蛋白或用于提高本文所述的TGF-β家族蛋白蛋白水平的任何其它方法組合地，使用這些化合物。在一個實例中，在每天兩次100-200mg的劑量，使用環孢菌素來刺激TGF-β1生產。
除了可以提高可溶內皮糖蛋白結合蛋白的血清水平的化合物的用途以外，本發明提供了與本文所述的任一種治療方法結合使用的任意慢性高血壓藥物治療的用途。用于治療妊娠過程中的高血壓的藥物治療包含甲基多巴、鹽酸肼苯噠嗪或拉貝洛爾。對于這些藥物治療中的每一種而言，施用方式和劑量可由醫師或按照制造商的說明書確定。
改變可溶內皮糖蛋白的抗血管生成活性的治療性化合物使用血管生成測定，可以鑒別其它治療性化合物。例如，將具有升高水平的可溶內皮糖蛋白的先兆子癇血清加入matrigel管形成測定中，將誘導抗血管生成狀態。然后，可以將測試化合物加入測定中，且抗血管生成狀態逆轉10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多，表明該化合物可以降低可溶內皮糖蛋白的生物學活性，且可用作治療性化合物。
治療性核酸近來的工作表明，將能夠表達內皮細胞促分裂原(如VEGF)的核酸(DNA或RNA)遞送到血管損傷部位，將誘導受損血管的增殖和再次內皮化(reendothelialization)。雖然本發明不涉及血管損傷，但這些用于向內皮細胞遞送核酸的普通技術也可用于本發明中，以用于遞送編碼可溶內皮糖蛋白結合蛋白(如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7)的核酸。該技術也可以用于遞送編碼蛋白的核酸，所述蛋白已知已知抑制參與可溶內皮糖蛋白的切割和釋放的任意MMP、組織蛋白酶或彈性蛋白酶的活性，如上述的那些，以用于治療或預防受試者的先兆子癇或子癇。這些普通技術在美國專利號5,830,879和6,258,787中描述，它們引入本文作為參考。
在本發明中，核酸可以是任何核酸(DNA或RNA)，包含編碼可溶內皮糖蛋白結合蛋白(如TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7)的基因組DNA、cDNA和mRNA。使用本領域的常規操作，例如，重組DNA、PCR擴增，可獲得編碼所需蛋白的核酸。
遞送核酸的方式對于本文所述的任一種核酸應用，可以使用標準的施用核酸的方法。例如，為了簡化編碼可溶內皮糖蛋白結合蛋白的核酸的操作和處理，優選地將核酸插入到與啟動子可操作地連接的盒中。啟動子必須能夠驅動可溶內皮糖蛋白結合蛋白在所需靶宿主細胞中的表達。適宜啟動子的選擇可很容易實現。優選地，人們可使用高表達啟動子。適宜啟動子的實例是763-堿基對巨細胞病毒(CMV)啟動子。還可使用勞斯肉瘤病毒(RSV)(Davis等，Hum.Gene Ther.4151-159，1993)和小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)啟動子。某些蛋白可使用它們的天然啟動子表達。還可包含可增強表達的其它元件(例如，產生高水平表達的增強子或系統，如tat基因和tar元件)。重組載體可以是質粒載體，如pUC118、pBR322或其它已知的質粒載體，它包含，例如，大腸桿菌(E.coli)復制起點(見，Sambrook等，MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratorypress，1989)。質粒載體還可包含選擇標記，如氨芐青霉素抗性的β內酰胺酶基因，前提是，標記多肽不會不利地影響所治療生物的代謝。所述盒還可結合合成遞送系統(如PCT公開號WO95/22618中公開的系統)中的核酸結合部分。
可通過適合所用載體的任何方法，將核酸引入到細胞中。許多這類方法都是本領域熟知的(Sambrook等，同上和Watson等，“Recombinant DNA”，Chapter 12，第2版，Scientific AmericanBooks，1992)。通過如磷酸鈣沉淀、電穿孔、脂質體-介導的轉染、基因槍、顯微注射、病毒殼體-介導的轉移、聚凝胺-介導的轉移或原生質體融合等方法，可以轉移重組載體。關于脂質體制備、內含物的靶向和遞送的程序的綜述，見Mannino和Gould-Fogerite(BioTechniques，6682-690，1988)，Felgner和Holm(Bethesda Res.Lab.Focus，1121，1989)以及Maurer(Bethesda Res.Lab.Focus，1125，1989)。
重組載體(質粒載體或病毒載體)的轉移，可通過直接注射到羊水中或通過靜脈內遞送來完成。
還可使用利用腺病毒載體或腺伴隨載體(AAV)進行的基因遞送。腺病毒存在于許多動物物種中，致病性并不高，且可在分裂中的和休眠的細胞中同等復制。作為一般規律，基因遞送所用的腺病毒缺少病毒復制所需的一個或多個基因。用于遞送可溶內皮糖蛋白結合蛋白的復制-缺陷型重組腺病毒載體，可根據本領域已知的技術生產(見，Quantin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，892581-2584，1992；Stratford-Perricadet等，J Clin.Invest.，90626-630，1992；和Rosenfeld等，Cell，68143-155，1992)。基因療法在子宮內使用的實例，見美國專利號6,399,585。
一旦轉染，核酸就由損傷部位的細胞表達一段時間，這段時間足以提高可溶內皮糖蛋白結合蛋白的血清水平。因為含有核酸的載體通常沒有被摻入到細胞基因組中，所以目標蛋白的表達只進行有限的時間。通常，在治療水平表達蛋白約2天到幾周，優選約1-2周。DNA的再次應用，可用于提供治療性蛋白表達的額外時間段。
抑制可溶內皮糖蛋白表達的治療性核酸本發明還涉及反義核堿基寡聚體在直接下調可溶內皮糖蛋白mRNA的表達中的用途。通過結合互補核酸序列(有義或編碼鏈)，反義核堿基寡聚體能夠抑制蛋白表達，可能是通過RNA酶H對RNA鏈的酶促切割。優選地，反義核堿基寡聚體能夠降低表達升高水平的可溶內皮糖蛋白的細胞中的可溶內皮糖蛋白蛋白表達。優選地，與用對照寡核苷酸處理的細胞相比，可溶內皮糖蛋白蛋白表達降低了至少10％，優選地20％或更大，更優選地40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。選擇和制備反義核堿基寡聚體的方法是本領域熟知的。使用反義核堿基寡聚體下調VEGF表達的實例，見美國專利號6,410,322，其引入本文作為參考。測定蛋白表達水平的方法也是本領域熟知的，且包含蛋白印跡、免疫沉淀法和ELISA。
本發明還涉及RNA干擾(RNAi)在抑制可溶內皮糖蛋白的表達中的用途。RNA干擾(RNAi)是近來發現的轉錄后基因沉默(PTGS)的機理，其中與目標基因或mRNA相對應的雙鏈RNA(dsRNA)被引入到生物中，從而導致對應mRNA的降解。在RNAi反應中，dsRNA分子的有義和反義鏈被加工成長度為21-23個核苷酸(nt)且具有2-核苷酸3’尾的小RNA片段或區段。或者，可以合成合成的dsRNA，它們長21-23nt，且具有2-核苷酸3’尾，純化，并用于反應中。這些21-23nt dsRNA被稱作“指導RNA”或“短干擾RNA”(siRNA)。
然后，siRNA雙鏈體與核酸酶復合物結合，該核酸酶復合物由靶向且破壞內源mRNA的蛋白構成，所述內源mRNA與復合物內的siRNA具有同源性。雖然仍然不清楚復合物內的蛋白的特性，但復合物的功能是，通過siRNA鏈中的一條和內源mRNA之間的堿基配對相互作用，靶向同源的mRNA分子。然后，從siRNA的3’末端切割下約12nt的mRNA，并降解。以這種方式，可靶向特定基因并將其降解，由此導致靶定的基因的蛋白表達的喪失。也可以化學地合成siRNA，或從化學地合成siRNA的公司(例如，Dharmacon ResearchInc.，Pharmacia或ABI)得到。
dsRNA的特殊要求和修飾在PCT公開號WO01/75164(引入本文作為參考)中描述。盡管dsRNA分子的長度可發生變化，但最優選地，使用siRNA分子，它是21-23核苷酸dsRNA，具有特征性的2-3-核苷酸3’突出端，通常為(2’脫氧)胸苷或尿嘧啶。siRNA通常包含3’羥基。還可使用單鏈的siRNA以及平端形式的dsRNA。為了進一步提高RNA的穩定性，可使3’突出端穩定化以防降解。在一個這樣的實施方案中，通過包含嘌呤核苷酸(如腺苷或鳥苷)，穩定化RNA。或者，用修飾的類似物置換嘧啶核苷酸，例如，用(2’-脫氧)胸苷置換尿苷2-核苷酸突出端是可耐受的，且不會影響RNAi的功效。2’羥基的不存在顯著提高組織培養基中突出端的核酸酶抗性。
或者，可以使用PCT公開號WO01/75164(引入本文作為參考)中提出的方法中的任一種，或使用RNA體外轉錄的標準程序和Elbashir等(Genes&Dev.，15188-200，2001)描述的dsRNA退火程序，制備siRNA。還可按照上面Elbashir等所述，獲得siRNA，即在加工dsRNA以產生約21-約23個核苷酸的siRNA的條件下，在合胞體囊胚層果蠅(Drosophila)胚胎的無細胞的果蠅裂解物中溫育與靶基因序列相對應的dsRNA，然后使用本領域技術人員已知的技術分離。例如，凝膠電泳可用于分離21-23nt RNA，然后可以從凝膠切片洗脫。此外，層析(例如，大小排阻層析)、甘油梯度離心及用抗體進行的親和純化，都可用于分離21-23nt RNA。
許多種方法可以用于將dsRNA或寡核苷酸轉染或導入進哺乳動物細胞。例如，存在幾種商業上可得到的轉染試劑，包括但不限于TransIT-TKOTM(Mirus，目錄號MIR 2150)、TransmessengerTM(Qiagen，目錄號301525)和OligofectamineTM(Invitrogen，目錄號MIR 12252-011)。每種轉染試劑的規程都可從生產商得到。
在本發明中，dsRNA或siRNA與可溶內皮糖蛋白mRNA的mRNA序列互補，且可降低或抑制可溶內皮糖蛋白的表達。優選地，與用對照dsRNA或siRNA處理的細胞相比，可溶內皮糖蛋白蛋白的表達降低了至少10％，更優選地25％，且最優選地至少40％、50％、60％、70％、80％、90％或更大。測定蛋白表達水平的方法也是本領域熟知的，且包含蛋白印跡、免疫沉淀法和ELISA。
在本發明中，所用核酸包含以任何方式提高核酸穩定性或功能的任何修飾。實例包含對磷酸主鏈、核苷酸間的連接或糖部分的修飾。
在早期妊娠中有用的基于可溶內皮糖蛋白的治療性化合物已經表明，全長內皮糖蛋白信號傳導的抑制增強絨毛外植塊培養物中的滋養層侵襲力(Caniggia I等，Endocrinology，1997，1384977-88)。因此，可溶內皮糖蛋白可能增強早期妊娠過程中的滋養層侵襲力。因此，提高不患有妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向的婦女在早期妊娠時的可溶內皮糖蛋白水平的組合物，對于促進胎盤形成是有益的。提高可溶內皮糖蛋白水平的組合物的實例包括純化的可溶內皮糖蛋白多肽、可溶內皮糖蛋白編碼核酸分子和提高可溶內皮糖蛋白的水平或生物學活性的化合物或生長因子。
基因和蛋白表達的測定下面的方法可以用于評價蛋白或基因表達，并確定任一種上述方法在提高可溶內皮糖蛋白結合蛋白水平、或降低可溶內皮糖蛋白蛋白水平中的功效。
使用諸如ELISA、蛋白印跡或使用特異性抗體的免疫測定的方法，測量受試者血清的可溶內皮糖蛋白的水平。也可以測量受試者血清的TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7或已知結合可溶內皮糖蛋白的任意蛋白配體的水平。用于測量蛋白的血清水平的方法包括ELISA、蛋白印跡或使用特異性抗體的免疫測定。此外，可以進行體外血管生成測定，以確定受試者的血液是否已經從抗血管生成狀態轉化成促血管生成狀態。這樣的測定記載在實施例4中。認為陽性結果是可溶內皮糖蛋白、TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7或已知結合可溶內皮糖蛋白的任意蛋白配體的水平增加了至少10％、20％、優選地30％、更優選地至少40％或50％、且最優選地至少60％、70％、80％、90％或更多。也可以將陽性結果視作，使用體外血管生成測定測得，從抗血管生成狀態至促血管生成狀態轉化了至少10％、優選地20％、30％、40％、50％、且最優選地至少60％、70％、80％、90％或更多。
也可以測量來自受試者的血清或尿樣品中的編碼TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7或可溶內皮糖蛋白的核酸或多肽的水平。存在幾種本領域已知的測定基因表達的方法。一些實例包括，從受試者的血液樣品制備RNA，并使用RNA進行RNA印跡、基于PCR的擴增、或RNA酶保護測定。認為陽性結果是可溶內皮糖蛋白、TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7核酸的水平增加了至少10％、20％、優選地30％、更優選地至少40％或50％、且最優選地至少60％、70％、80％、90％或更多。
使用抗體進行治療性處理在從患有先兆子癇的孕婦采集的血清樣品中發現的提高水平的可溶內皮糖蛋白，表明可溶內皮糖蛋白可起“生理學庫”的作用，以結合胎兒或胎盤的正確發育和血管生成所需的滋養層細胞和母體內皮細胞的功能性生長因子，并將其耗盡。使用化合物(如抗體)來結合可溶內皮糖蛋白并中和可溶內皮糖蛋白的活性(例如，結合TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2、BMP7)，可以通過增加游離的TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2和BMP7，幫助預防或治療先兆子癇或子癇。這種增加將使胎盤發育和胎兒營養所需的滋養層增殖、遷移和血管生成能夠增加，且使全身的母體內皮細胞健康。
本發明提供了特異性地結合可溶內皮糖蛋白的配體-結合結構域的抗體。所述抗體用于中和可溶內皮糖蛋白的活性，且認為最有效的機理是通過直接封閉TGF-β1、TGF-β3、活化素-A、BMP2或BMP7的結合位點，然而，不排除其它機理。用于治療目的的抗體的制備和使用方法在幾個專利中描述，包含美國專利號6,054,297；5,821,337；6,365,157；和6,165,464，且它們引入本文作為參考。抗體可以是多克隆的或單克隆的；優選單克隆抗體。
單克隆抗體，特別是源自嚙齒類動物(包含小鼠)的那些已經用于治療各種疾病；然而，它們的用途有限制，包括誘導引起治療功效的快速清除和降低的人抗-小鼠免疫球蛋白反應。例如，嚙齒類動物單克隆抗體在臨床使用中的主要限制是，在治療過程中的抗-球蛋白反應(Miller等，Blood，62988-995 1983；Schroff等，Cancer Res.，45879-885，1985)。
本領域已經嘗試通過構建“嵌合”抗體來克服這個問題，其中動物抗原-結合可變結構域與人恒定結構域偶聯(美國專利號4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，816851-6855，1984；Boulianne等，Nature，312643-646，1984；Neuberger等，Nature，314268-270，1985)。這種嵌合抗體的生產和使用在下面描述。
結合可溶內皮糖蛋白的配體的競爭性抑制，可用于預防或治療先兆子癇或子癇。這種提高可拯救內皮功能障礙，并使促血管生成/抗血管生成因子的平衡向著血管生成的方向移動。
本發明單克隆抗體的混合物可用作先兆子癇或子癇的有效治療。該混合物可包含少至2、3或4種不同抗體，或多至6、8或10種不同抗體。此外，本發明抗體可與抗-高血壓藥物(例如，甲基多巴、鹽酸肼苯噠嗪、或拉貝洛爾)或用于治療先兆子癇、子癇或與先兆子癇或子癇有關的癥狀的任何其它藥物治療結合使用。
抗體的制備特異性地結合sFlt-1受體的單克隆抗體可通過本領域已知的方法生產。這些方法包括由Kohler和Milstein(Nature，256495-497，1975)和Campbell(“Monoclonal Antibody Technology，TheProduction and Characterization of Rodent and HumanHybridomas”，Burdon等，Eds.，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam，1985)描述的免疫學方法，以及由Huse等(Science，246，1275-1281，1989)描述的重組DNA方法。
單克隆抗體可從培養的雜交瘤細胞的上清液制備，或從通過將雜交瘤細胞腹膜內地接種到小鼠中誘導的腹水制備。最初由Kohler和Milstein(Eur.J.Immunol，6，511-519，1976)描述的雜交瘤技術已經廣泛用于生產雜交細胞系，其分泌高水平的抗許多特定抗原的單克隆抗體。
免疫接種宿主動物或從其培養的抗體產生性細胞的途徑和程序，通常與用于抗體刺激和產生的確定的且常規的技術一致。通常，將小鼠用作試驗模型，然而，任何哺乳動物受試者(包含人受試者)或源自它的抗體產生性細胞，都可按照本發明方法進行操作，以作為產生哺乳動物(包含人)雜交細胞系的基礎。
免疫接種之后，免疫淋巴樣細胞與骨髓瘤細胞融合，以產生雜交細胞系，它們可被無限培養和傳代培養，以產生大量單克隆抗體。就本發明的目的而言，為融合選擇的免疫淋巴樣細胞是淋巴細胞和它們的正常分化的后代，采集自免疫的動物的淋巴結組織或脾組織。優選使用脾細胞，因為它們可提供關于小鼠系統更濃且更方便的抗體產生性細胞來源。骨髓瘤細胞提供融合的雜合體連續繁殖的基礎。骨髓瘤細胞是源自漿細胞的腫瘤細胞。鼠骨髓瘤細胞系可從例如美國典型培養物保藏中心(ATCC；Manassas，VA)獲得。還描述過人骨髓瘤和小鼠-人異源骨髓瘤細胞系(Kozbor等，J.Immunol.，1333001-3005，1984；Brodeur等，Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications，Marcel Dekker，Inc.，New York，pp.51-63，1987)。
雜交細胞系可在細胞培養基中體外維持。一旦確立了雜交瘤細胞系，就可在多種營養足夠的培養基(如次黃嘌呤-氨基蝶呤-胸苷(HAT)培養基)中維持。此外，雜交細胞系可以以許多常規方式貯藏并保存，包含冷凍和在液氮下貯藏。可使冷凍的細胞系復蘇，并無限培養，重新開始合成和分泌單克隆抗體。通過常規方法，如沉淀、離子交換層析、親和層析等，回收組織培養上清液中分泌的抗體。
抗體可在任何哺乳動物中制備，包含小鼠、大鼠、兔、山羊和人。抗體可以是下列免疫球蛋白種類之一的成員IgG、IgM、IgA、IgD或IgE及其亞類，且優選是IgG抗體。
盡管用于產生單克隆抗體的優選動物是小鼠，但本發明不限于此；事實上，可使用人抗體，并證實是優選的。這類抗體可使用人雜交瘤獲得(Cole等，“Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy”，Alan R.Liss Inc.，p.77-96，1985)。在本發明中，可以使用通過剪接具有適宜抗原特異性的小鼠抗體分子的基因和人抗體分子的基因而生產嵌合抗體的技術(Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.81，6851-6855，1984；Neuberger等，Nature 312，604-608，1984；Takeda等，Nature 314，452-454，1985)；這類抗體包含在本發明的范圍之內并在下面描述。
作為細胞融合技術的另一選擇，EB病毒(EBV)無限增殖化B細胞可用于生產本發明的單克隆抗體(Crawford等，J Gen.Virol.，64697-700，1983；Kozbor和Roder，J.Immunol.，41275-1280，1981；Kozbor等，Methods Enzymol.，121120-140，1986)。通常，該程序由從適宜來源(通常是感染的細胞系)分離EB病毒，并使靶抗體分泌細胞暴露于含病毒的上清液組成。洗滌細胞，并在適宜的細胞培養基中培養。隨后，可通過EB病毒核抗原的存在，鑒別存在于細胞培養物中的病毒轉化的細胞，且可使用本領域已知的標準方法，鑒別轉化的抗體分泌細胞。產生單克隆抗體(如重組DNA)的其它方法，也包含在本發明的范圍內。
可溶內皮糖蛋白免疫原的制備可溶內皮糖蛋白本身可作為免疫原使用，或可與載體蛋白或其它物體(如瓊脂糖珠)結合使用。可溶內皮糖蛋白可從已知表達內源性蛋白的細胞(如人臍靜脈內皮細胞)純化(滋養層或HUVEC；Burrows等，Clin.Cancer Res.11623-1634，1995；Fonsatti等，Clin.CancerRes.62037-2043，2000)。可以用蛋白水解酶(例如，基質金屬蛋白酶)處理表達膜結合的內皮糖蛋白的細胞，以切割胞外結構域，從而產生可溶形式。此外，使用標準的重組DNA技術，可以將編碼可溶內皮糖蛋白的核酸分子或其部分插入到已知載體中，以用于在宿主細胞中表達。適合可溶內皮糖蛋白表達的宿主細胞包括桿狀病毒細胞(例如，Sf9細胞)、細菌細胞(例如，大腸桿菌)和哺乳動物細胞(例如，NIH3T3細胞)。
此外，可合成肽，并將其用作免疫原。制備肽抗體的方法是本領域熟知的，且通常需要將肽與適宜的載體分子(如血清清蛋白)偶聯。肽包含與GenBank編號AAH29080和NP_031958(小鼠)、AAS67893(大鼠)、NP_000109，P17813、VSP_004233和CAA80673(人)、和A49722(豬)相對應的可溶內皮糖蛋白氨基酸序列的任一部分基本相同的任何氨基酸序列。肽可以是任何長度，優選10個氨基酸或更長，更優選25個氨基酸或更長，且最優選地40、50、60、70、80、100、200、300、400、437個氨基酸或更長。優選地，所述氨基酸序列與任意人內皮糖蛋白序列的序列至少60％、更優選85％、且最優選90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％一致。肽可以是商業獲得的，或使用本領域熟知的技術制備的，如，例如Merrifield固相方法(Science，232341-347，1985)。所述程序可使用商業得到的合成儀，如Biosearth 9500自動化肽機器，使用氟化氫實現阻斷氨基酸的切割，且使用Waters Delta Prep 3000儀器，在15-20μm VydacC4 PrepPAK柱上，通過制備型HPLC純化肽。
抗體的功能等價物本發明還包含本說明書中描述的抗體的功能等價物。功能等價物包括所具有的氨基酸序列與本發明抗體可變區或高變區的氨基酸序列基本上相同的多肽。功能等價物具有可與所述抗體的結合特性相比較的結合特性，且包括，例如，嵌合的、人源化的和單鏈抗體及其片段。生產這種功能等價物的方法記載在，例如，PCT公開號WO93/21319；歐洲專利申請號239,400；PCT公開號WO 89/09622；歐洲專利申請號338,745；歐洲專利申請號332424；以及美國專利號4,816,567中；每篇均引入本文作為參考。
嵌合抗體優選地具有基本上或排它地源自人抗體恒定區的恒定區、以及基本上或排它地源自除人以外的哺乳動物可變區序列的可變區。這類人源化抗體是嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白鏈或其片段(如Fv、Fab、Fab′、F(ab′)2或抗體的其它抗原-結合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。使非人抗體人源化的方法是本領域熟知的(綜述見Vaswani和Hamilton，Ann Allergy AsthmaImmunol.，81105-119，1998和Carter，Nature Reviews Cancer，1118-129，2001)。通常，人源化抗體具有從非人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非人氨基酸殘基常常被稱作輸入殘基，它們通常是從輸入可變結構域得到的。可以基本上按照本領域已知的方法進行人源化(Jones等，Nature，321522-525，1986；Riechmann等，Nature，332323-329，1988；和Verhoeyen等，Science，2391534-1536，1988)，其中用嚙齒類動物的CDR或其它CDR序列置換人抗體的相應序列。因此，這種人源化抗體是嵌合抗體，其中基本上小于完整的人可變結構域的序列已經被來自非人的相應序列置換(見，例如，美國專利號4,816,567)。實際上，人源化抗體通常是人抗體，其中有些CDR殘基(且很可能有些FR殘基)被來自嚙齒類動物類似位點的殘基置換(Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2593-596，1992)。
制備人源化抗體的其它方法描述在美國專利號5,821,337和6,054,297以及Carter(同上)中，它們全部引入本文作為參考。人源化抗體選自任一免疫球蛋白種類，包含IgM、IgG、IgD、IgA和IgE，以及任何同種型，包含IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。當不需要細胞毒性活性時，如在本發明中，恒定結構域優選為IgG2類。人源化抗體可包含來自超過一個種類或同種型的序列，且選擇特定的恒定結構域來最優化所需的效應子功能，在本領域普通技術范圍之內。
人抗體還可使用本領域已知的各種技術產生，包含噬菌體展示文庫(Marks等，J.Mol.Biol.，222581-597，1991和Winter等，Annu.Rev.Immunol.，12433-455，1994)。Cole等和Boerner等的技術還可用于制備人單克隆抗體(Cole等，同上；Boerner等，J.Immunol.，14786-95，1991)。
除人以外的適宜的哺乳動物包括可從其制備單克隆抗體的任何哺乳動物。除人以外的哺乳動物的實例包括，例如，兔、大鼠、小鼠、馬、山羊或靈長類動物；優選小鼠。
抗體的功能等價物還包括單鏈抗體片段，也稱作單鏈抗體(scFv)。單鏈抗體片段是重組多肽，其通常結合抗原或受體；這些片段包含與抗體可變輕鏈序列(VL)的至少一個片段連接的抗體可變重鏈氨基酸序列(VH)的至少一個片段，其中具有或沒有一個或多個相互連接的接頭。這種接頭可以是短的、柔性的肽，選擇它們來確保VL和VH結構域一旦連接即發生正確的三維折疊，以便維持單鏈抗體片段所來源的完整抗體的靶分子結合特異性。通常，VL或VH序列的羧基末端通過這種肽接頭與互補的VL和VH序列的氨基酸末端共價連接。單鏈抗體片段可通過分子克隆、抗體噬菌體展示文庫或類似技術產生。這些蛋白可在真核生物細胞或原核生物細胞(包含細菌)中產生。
單鏈抗體片段包含這樣的氨基酸序列，其具有在本說明書中描述的完整抗體的至少一個可變區或CDR，但缺少那些抗體的恒定結構域的一些或全部。這些恒定結構域不是抗原結合所必需的，但構成完整抗體結構的主要部分。單鏈抗體片段可因此克服與使用含恒定結構域的部分或全部的抗體有關的某些問題。例如，單鏈抗體片段傾向于無生物學分子與重鏈恒定區之間的不需要的相互作用，或其它不需要的生物學活性。此外，單鏈抗體片段明顯小于完整抗體，且因此比完整抗體具有更大的毛細管通透性，從而允許單鏈抗體片段局部化，并更有效地結合靶抗原結合部位。另外，抗體片段可在原核細胞中相對大規模地產生，由此促進它們的產生。此外，相對較小的單鏈抗體片段使它們與完整抗體相比不太可能誘導受體的免疫反應。
功能等價物還包括具有與完整抗體的結合特性相同或可比較的結合特性的抗體片段。這種片段可包含一個或兩個Fab片段或F(ab′)2片段。優選地，抗體片段包含完整抗體的全部6個CDR，雖然含有少于所有這樣的區域(如3、4或5個CDR)的片段也是功能性的。
此外，功能等價物可以是下列免疫球蛋白種類之一的成員，或可組合所述成員IgG、IgM、IgA、IgD或IgE，及其亞類。
抗體功能等價物的制備抗體等價物是通過本領域已知方法制備的。例如，可從完整抗體酶促地制備抗體片段。優選地，抗體等價物是從編碼這種等價物的DNA制備的。通過使編碼全長抗體所需的DNA部分以外全部缺失，可以制備編碼抗體片段的DNA。
通過重組基本上或排它地編碼人恒定區的DNA和編碼基本上或排它地源自除人以外的哺乳動物的可變區序列的可變區的DNA，可以制備編碼嵌合抗體的DNA。通過重組編碼除了基本上或排它地源自相應人抗體區的CDR之外的恒定區和可變區的DNA和編碼基本上或排它地源自除人以外的哺乳動物的CDR的DNA，可以制備編碼人源化抗體的DNA。
編碼抗體片段的DNA分子的適宜來源包括表達全長抗體的細胞，如雜交瘤。所述片段本身可作為抗體等價物使用，或可如上所述重組成等價物。
本部分所述的DNA缺失和重組可通過已知方法進行，如在上列公開的專利申請中描述的那些。
抗體篩選和選擇使用標準的本領域已知的方法分離并純化單克隆抗體。例如，可使用標準的本領域已知的方法，如針對可溶內皮糖蛋白肽抗原的ELISA或蛋白印跡分析，篩選抗體。這種技術的非限制性實例描述在美國專利號6,365,157的實施例II和III中，其引入本文作為參考。
抗體的治療用途當體內用于治療或預防先兆子癇或子癇時，將本發明抗體以治療有效量施用給受試者。優選地，腸胃外施用所述抗體或通過連續輸注靜脈內施用所述抗體。給藥和劑量方案取決于疾病的嚴重程度和受試者的整體健康狀況。施用的抗體的量通常為約0.001-約10mg/kg受試者體重、優選0.01-約5mg/kg受試者體重。
對于腸胃外施用，將抗體與藥學上可接受的腸胃外載體一起配制成單位劑量注射形式(溶液、懸浮液、乳狀液)。這種載體本身是無毒且無治療性的。這種載體的實例是水、鹽水、林格液、葡萄糖溶液以及5％人血清清蛋白。還可使用不含水的載體，如固定油以及油酸乙酯。可將脂質體用作載體。所述載體可包含少量添加劑，如提高等滲性和化學穩定性的物質，例如緩沖劑及防腐劑。通常以約1mg/ml-10mg/ml的濃度，在這種載體中配制抗體。
聯合療法任選地，先兆子癇或子癇治療可與任何其它標準的先兆子癇或子癇療法聯合施用；這樣的方法是熟練的技術人員已知的，且包括美國專利申請公開號20040126828、20050025762和2005017044和PCT公開號WO 2004/008946和WO 2005/077007中所述的方法。
施用的劑量和方式優選地，在妊娠過程中施用治療，以用于治療或預防先兆子癇或子癇，或在妊娠后施用治療，以治療產后先兆子癇或子癇。施用技術和劑量依賴于化合物類型(例如，化合物、純化的蛋白、抗體、反義、RNAi或核酸載體)而變化，且是本領域技術人員熟知的或容易確定的。
本發明的治療性化合物可與藥學上可接受的稀釋劑、載體或賦形劑一起，以單位劑量形式施用。施用可以是腸胃外、靜脈內、皮下、經口或局部直接注射到羊水中。通過連續輸注而靜脈內遞送，是施用本發明治療性化合物的優選方法。
所述組合物的形式可以是經口施用的丸劑、片劑、膠囊、液體或持續釋放的片劑；或用于靜脈內、皮下或腸胃外施用的液體；或用于局部施用的聚合物或其它持續釋放載體。
用于制備制劑的本領域熟知的方法見，例如，“RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy”(20th ed.，ed.A.R.GennaroAR.，2000，Lippincott Williams&Wilkins，Philadelphia，PA)。用于腸胃外施用的制劑可包含，例如，賦形劑、無菌水、鹽水、聚(亞烷基)二醇如聚乙二醇、植物來源的油或氫化萘。生物相容的、可生物降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，可用于控制化合物的釋放。納米顆粒(nanoparticulate)制劑(例如，可生物降解的納米顆粒、固體脂類納米顆粒、脂質體)可用于控制化合物的生物分布。其它潛在有效的腸胃外遞送系統包括乙烯乙酸乙烯酯共聚物顆粒、滲透泵、可植入的輸注系統及脂質體。制劑中化合物的濃度取決于多種因素，包含所施用藥物的劑量以及施用途徑。
所述化合物可任選地作為藥學上可接受的鹽(如制藥工業通常使用的無毒酸加成鹽或金屬絡合物)來施用。酸加成鹽的實例包括，有機酸如乙酸、乳酸、雙羥萘酸(pamoic)、馬來酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、琥珀酸、苯甲酸、棕櫚酸、辛二酸、水楊酸、酒石酸、甲磺酸、甲苯磺酸、三氟乙酸等；聚合酸如鞣酸、羧甲基纖維素等；和無機酸如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸等。金屬絡合物包括鋅、鐵等。
用于經口使用的制劑包括，含有與無毒的藥學可接受賦形劑相混合的活性成分的片劑。這些賦形劑可以是，例如，惰性稀釋劑或填充物(例如，蔗糖和山梨糖醇)、潤滑劑、助流劑和抗結合劑(例如，硬脂酸鎂、硬脂酸鋅、硬脂酸、二氧化硅、氫化植物油或滑石)。
經口使用的制劑還可以咀嚼片劑的形式提供，或以硬膠囊的形式提供，其中將活性成分與惰性固體稀釋劑混合，或以軟膠囊的形式提供，其中將活性成分與水或油性介質混合。
施用化合物的劑量和時間選擇取決于各種臨床因素，包含受試者的整體健康狀況和先兆子癇癥狀的嚴重程度。一般而言，一旦檢測出先兆子癇或發展先兆子癇的傾向，則使用純化蛋白的連續輸注來治療或預防所述狀況的進一步發展。治療可持續1-100天，更優選1-60天，且最優選1-20天時間段，或直到妊娠結束。劑量可根據每種化合物以及狀況的嚴重程度而變化，并通過滴定來獲得穩態的血清濃度，即10-20ng/ml可溶內皮糖蛋白；和/或1-500pg/mL游離VEGF或游離PlGF或二者，優選地1-100pg/mL，更優選地5-50pg/mL、且最優選地5-10pg/mL VEGF或PlGF或1-5ng sFlt-1。
本文所述的診斷方法可以用于監控在治療過程中的先兆子癇或子癇，或確定治療性化合物的劑量。在一個實例中，在治療過程中施用治療性化合物，并確定PAAI。如果PAAI小于20、優選地小于10，則認為治療劑量是有效劑量。在另一個實例中，在治療過程中施用治療性化合物，并確定可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數。如果可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數小于200、優選地小于100，則認為治療劑量是有效劑量。
受試者監控使用本發明的方法和組合物，可以監控患有先兆子癇、子癇或發展這樣的狀況的傾向的受試者的疾病狀況或治療。例如，監控存在于體液(如尿、血漿、羊水或CSF)中的可溶內皮糖蛋白多肽的表達。可溶內皮糖蛋白監控可以與監控sFlt-1、VEGF或PlGF多肽的表達的方法相結合。這種監控可以用于，例如，評價特定藥物在受試者中的功效或評價疾病發展。降低可溶內皮糖蛋白核酸分子或多肽的表達的治療在本發明中特別有用。
實施例下面的實施例意在解釋本發明。它們無意以任何方式限制本發明。
實施例1.先兆子癇孕婦中提高水平的內皮糖蛋白mRNA和蛋白在鑒別在先兆子癇中起病理學作用的新的分泌因子的嘗試中，我們使用Affymetrix U95A微陣列芯片進行了患有先兆子癇的17位孕婦和13位正常孕婦的胎盤組織的基因表達譜分析。我們發現，內皮糖蛋白的基因在患有先兆子癇的婦女中被上調。
為了證實內皮糖蛋白在先兆子癇中的上調，我們進行RNA印跡以分析與血壓正常的孕婦相比的先兆子癇孕婦中的胎盤內皮糖蛋白mRNA水平(圖3)，并進行蛋白印跡以測量與血壓正常的孕婦相比的先兆子癇孕婦中的內皮糖蛋白的血清蛋白水平(圖4)。先兆子癇被定義為(1)妊娠20周后，收縮血壓(BP)＞140mmHg且舒張BP＞90mmHg，(2)新發作的蛋白尿(利用測驗片進行尿分析為1+，24小時尿收集中的蛋白＞300mg，或隨機的尿蛋白/肌酸酐比＞0.3，和(3)產后12周，高血壓及蛋白尿消除。排除患潛在的高血壓、蛋白尿或腎病的患者。基于是否存在腎炎范圍的蛋白尿(24小時尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)，將患者分成輕度先兆子癇和重度先兆子癇。輕度先兆子癇組中的平均尿蛋白/肌酸酐比為0.94+/-0.2，而重度先兆子癇組為7.8+/-2.1。各組的平均胎齡如下正常38.8+/-0.2周、輕度先兆子癇34+/-1.2周、重度先兆子癇31.3+/-0.6周和早產的29.5+/-2.0周。分娩后立即獲得胎盤樣品。從每個胎盤隨機采集4份樣品，放在RNA later穩定溶液(Ambion，Austin，TX)中，并在-70℃貯藏。使用Qiagen RNAeasy Maxi試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)進行RNA分離。
用內皮糖蛋白的編碼區中的400堿基對探針(UnigeneHs.76753)和作為標準化對照的GAPDH探針探測的RNA印跡顯示了胎盤內皮糖蛋白mRNA的增加。用內皮糖蛋白氨基末端的抗體探測的蛋白印跡顯示了與血壓正常的孕婦相比，先兆子癇孕婦中內皮糖蛋白蛋白的胎盤和產婦血清水平兩者的增加。
實施例2.證實先兆子癇患者的胎盤和血清中的可溶內皮糖蛋白多肽用于測量先兆子癇婦女的胎盤和血清中的內皮糖蛋白蛋白水平的蛋白印跡分析提示了更小的蛋白(63kDa)的存在，它存在于先兆子癇孕婦的胎盤和血清中。我們已經證實，該更小的片段是內皮糖蛋白的胞外結構域。該截短形式可能是從胎盤合胞體滋養層(syncitiotrophoblast)和內皮細胞流出的，并在先兆子癇患者中過量地循環。該可溶形式的內皮糖蛋白可以通過結合正常血管健康必需的循環配體，起抗血管生成劑的作用。
實施例3.具有正常妊娠的婦女對先兆子癇妊娠的婦女中的可溶內皮糖蛋白的循環濃度為了對比正常的、輕度先兆子癇或重度先兆子癇婦女的血清中的循環的可溶內皮糖蛋白的水平，我們對取自這些婦女的血液樣品進行了ELISA分析。以是否存在腎炎范圍的蛋白尿(24小時尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)為基礎，將患者分成輕度和重度先兆子癇。輕度先兆子癇組中的平均尿蛋白/肌酸酐比是0.94+/-0.2，而重度先兆子癇組是7.8+/-2.1(圖5)。如前所述(Maynard等，J.Clin.Invest.111649-658，2003)，使用從R&D Systems，MN(目錄號DNDG00)商業上得到的ELISA試劑盒，進行ELISA。
實施例4.血管生成的模型測定內皮管測定可以用作血管生成的體外模型。將生長因子減少的Matrigel(7mg/mL，Collaborative Biomedical Products，Bedford，MA)放在預冷的48孔細胞培養平板的孔(100μl/孔)中，并在37℃溫育25-30分鐘，以允許聚合。用10％患者血清處理第3-5代人臍靜脈內皮細胞(30,000+在300μl沒有血清的內皮基礎培養基中，Clonetics，Walkersville，MD)，鋪平板到Matrigel包被的孔上，并在37℃溫育12-16小時。然后通過4X倒置相差顯微鏡(NikonCorporation，Tokyo，日本)評價管形成，并使用Simple PCI成像分析軟件進行分析(管面積和總長度)。
實施例5.作為婦女的先兆子癇和子癇的診斷指標的可溶內皮糖蛋白蛋白水平(Romero研究)該研究設計用于評價在臨床先兆子癇的過程中是否改變可溶內皮糖蛋白和它是否可以用于預測婦女的先兆子癇和子癇。
在Wayne State University/NICHD Perinatology Branch，Detroit，MI的Roberto Romero博士的協助下，完成了該研究。如Chaiworapongsa等(The Journal of Maternal-Fetal and NeonatalMedicine，January 2005，17(1)3-18)以前所述，使用庫存的生物學樣品數據庫，進行了回顧縱向案例對照研究。所有婦女都在Sotero del Rio Hospital，Santiago，智利登記產前臨床，并直到分娩。在前和次三個月中，以4-周時間間隔安排產前診斷，且在第三個三個月直至分娩，每2周安排產前診斷。對于下面的6個時間間隔中的每一個，只選擇每位患者的血漿樣品一次妊娠的(1)7-16周，(2)16-24周，(3)24-28周，(4)28-32周，(5)32-37周，和(6)＞37周。對于每個先兆子癇病例，通過在臨床診斷先兆子癇時的胎齡(+/-2周)匹配，選擇一個對照。診斷先兆子癇的臨床標準與上面的Chaiworapongsa等以前所述的相同。
血漿內皮糖蛋白水平的測量將保藏在-70℃的血漿樣品解凍，并使用從R&D systems，Minneapolis，MN.(目錄號DNDG00)商業上得到的ELISA試劑盒，測量一批血漿可溶內皮糖蛋白水平。
統計學分析使用協方差分析來評價在調整血液取樣的胎齡和樣品保藏時間間隔后，注定發展先兆子癇的患者和正常妊娠之間的可溶內皮糖蛋白的血漿濃度差異。使用卡方或Fisher準確檢驗來對比比例。使用的統計包是SPSS V.12(SPSS Inc.，Chicago，IL)。假定的顯著性為p值小于0.05。
結果在表1中描述了研究群體的臨床特征。患有先兆子癇的組包括比對照組更多的未經產的婦女，且比對照組更早分娩。重要的是，先兆子癇組的胎兒出生重量更小，且存在更高比例的攜帶小于胎齡兒(SGA)嬰兒的婦女。
表1.研究群體的臨床特征
將值表達為平均值±標準差或數字(％)GA胎齡在表2中描述了患有先兆子癇的患者的臨床特征。32位(72％)患者患有重度先兆子癇，而10位患者患有嚴重的早發先兆子癇，確定其發作＜34周。
表2.患有先兆子癇的患者的臨床特征
將值表達為平均值±標準差或數字(％)α(n＝26)；β(n＝42)在表3中顯示了在6胎齡窗口中測量的對照和先兆子癇婦女的血清可溶內皮糖蛋白水平。在先兆子癇中，將它們的樣品分成2組臨床先兆子癇(在先兆子癇癥狀時采取的樣品)和臨床前先兆子癇(在臨床癥狀之前采取的樣品)。數據表明，在中期妊娠(妊娠的24-28周)時，注定發展先兆子癇的婦女中的血清可溶內皮糖蛋白濃度開始升高，并在妊娠28-32周變成對照的至少3倍。當與胎齡匹配的對照相比較時，從患有臨床先兆子癇的婦女采取的血液樣品顯示出非常急劇的(幾乎10-15倍)升高。
表3.正常妊娠和先兆子癇的血漿可溶內皮糖蛋白濃度
pβ在先兆子癇的臨床表現時和正常妊娠的樣品之間比較將值表達為平均值±標準差δ2位先兆子癇患者在臨床表現時不能獲得血液樣品為了檢查血漿可溶內皮糖蛋白濃度和臨床診斷先兆子癇的時間間隔之間的關系，根據從血液采樣到臨床診斷的時間間隔，將處于不同胎齡的先兆子癇患者的血漿樣品分成5組(1)在臨床診斷時，(2)臨床表現前2-5.9周，(3)臨床表現前6-10.9周，(4)臨床表現前11-15.9周，和(5)臨床表現前16-25周。表4中的數據證實，在注定發展先兆子癇的婦女中，在發作先兆子癇癥狀之前6-10.9周，血漿可溶內皮糖蛋白水平開始升高，且在出現癥狀之前2-5.9周，是至少3倍。
表4.正常和先兆子癇孕婦中的血漿可溶內皮糖蛋白濃度
將值表達為平均值±標準差δ2位先兆子癇患者在臨床表現時不能獲得血液樣品為了檢查血漿可溶內皮糖蛋白濃度鑒別注定發展先兆子癇的患者的診斷潛力，將患者分成早發先兆子癇(PE＜34周)和晚發先兆子癇(PE＞34周)。對于患有早發先兆子癇的患者，從妊娠的約16-24周開始，先兆子癇(臨床診斷前)的平均血漿可溶內皮糖蛋白水平顯著高于正常妊娠(表5)，其中在24-28周和28-32周妊娠窗口中具有非常大的不同。相反地，對于患有晚發先兆子癇的患者，僅僅在28-32周，臨床前先兆子癇的血漿可溶內皮糖蛋白濃度顯著高于正常妊娠，其中在妊娠的32-36周具有非常大的不同(表6)。
表5.正常孕婦和在妊娠34周或更早發展臨床先兆子癇的患者中的血漿可溶內皮糖蛋白濃度
pβ在先兆子癇的臨床表現時和正常妊娠的樣品之間比較將值表達為平均值±標準差δ2位先兆子癇患者在臨床表現時不能獲得血液樣品表6.正常孕婦和先兆子癇患者(妊娠34周)中的血漿可溶內皮糖蛋白濃度
pβ在先兆子癇的臨床表現時和正常妊娠的樣品之間比較將值表達為平均值±標準差總結這些實驗的結果證實，當與胎齡匹配的對照相比較時，患有臨床先兆子癇的婦女具有非常高水平的循環可溶內皮糖蛋白。結果還證實，注定發展先兆子癇(臨床前先兆子癇)的婦女具有比預測正常妊娠的婦女更高的血漿可溶內皮糖蛋白水平。在發作臨床癥狀前至少6-10周，可以檢測到可溶內皮糖蛋白水平的增加。最后，這些結果證實，早發和晚發先兆子癇都具有升高的循環可溶內皮糖蛋白濃度，但是該變化在早發先兆子癇中更顯著。
實施例6.作為婦女的先兆子癇和子癇的診斷指標的可溶內皮糖蛋白蛋白水平(CPEP研究)如上所述，我們已經發現，在先兆子癇胎盤中，上調可溶內皮糖蛋白，即一種促血管生成蛋白TGF-β的細胞表面受體，并在內皮和合胞體滋養層上表達。在上述實驗中，我們已經表明，在先兆子癇中，過量的可溶內皮糖蛋白通過胞外結構域的脫落，從胎盤釋放進循環中；可溶內皮糖蛋白然后可以與sFlt1(一種結合胎盤生長因子(PlGF)和VEGF的抗血管生成因子)協同作用，以造成內皮功能障礙。為了檢驗該假說，我們將發展先兆子癇的婦女和患有其它妊娠并發癥(如妊娠高血壓(GH)和并發小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠)的那些婦女在整個妊娠過程中的可溶內皮糖蛋白、sFlt1和游離PlGF的血清濃度，與具有血壓正常的對照妊娠的婦女的所述濃度進行了對比。在NIH的Richard Levine博士的協助下完成了該研究。
該研究有兩個基本目的。第一個目的是，確定與血壓正常的對照相比，在發作先兆子癇和其它妊娠病癥(如妊娠高血壓或并發小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠)之前，是否可以檢測到升高的可溶內皮糖蛋白、sFlt1的血清濃度，和降低的PlGF水平。第二個目的是，在患有先兆子癇、妊娠高血壓或SGA的婦女中，其中分別檢查在發作臨床癥狀之前和之后得到的樣品，和在血壓正常對照中，描述可溶內皮糖蛋白、sFlt-1和游離PlGF的產婦血清濃度相對于胎齡的時間進程。
方法臨床信息該研究是4,589位參與鈣預防先兆子癇試驗(Calcium for Pre-eclampsia Prevention trial)(CPEP)的健康未經產婦女群體(cohort)中嵌套(nested)的妊娠并發癥(過早的先兆子癇、足孕先兆子癇、妊娠高血壓、具有SGA嬰兒的妊娠、血壓正常的對照妊娠)的病例對照研究。從每個研究組中，選擇120個隨機病例。研究方法與最近進行的先兆子癇的嵌套病例對照研究相同(Levine等，N.Eng.J.Med.2004，350672-83)。從每個婦女得到研究登記之前(13-21周)、在26-29周、在36周和在懷疑高血壓或蛋白尿時的血液樣品。在生產和分娩開始之前的妊娠過程中的任何時間收集的所有血清樣品都適合用于研究。病例包括120位婦女，其發展足孕先兆子癇、妊娠高血壓或SGA，且其分娩活產或死產男嬰(無已知的結構或染色體異常)，且從她們得到基線血清樣品。對于過早的先兆子癇，研究了來自CPEP群體的定義為(PE＜37周)的所有72位患者。在上面的Levine等(2004)中，描述了診斷先兆子癇的臨床標準。在從發作妊娠高血壓前1天至隨后7天的時間間隔中，要求所有妊娠高血壓病例都具有正常的尿蛋白測量。使用Zhang&Bowes的胎齡出生重量表，它是種族、未經產和嬰兒性別特異性的，將SGA定義為＜第10和＜第5(嚴重SGA)百分位。從分娩活產或死產嬰兒(無已知的主要的結構畸形或染色體異常)的沒有先兆子癇或妊娠高血壓或SGA的婦女，隨機地選擇對照，并一個對照對應一個病例地匹配臨床中心、在收集第一個血清樣品時的胎齡(±1周)、冷凍貯藏時間(±1年)和凍融次數。共研究了1674個血清樣品。進行胎齡的匹配，以控制sFlt-1、VEGF和PlGF水平的胎齡-相關的差異。進行冷凍貯藏時間的匹配，以使由冷凍貯藏過程中可能的降解引起的差異最小化。進行臨床中心的匹配，以控制先兆子癇比率在不同中心之間顯著不同的事實，這可能是由于疾病的病理生理學的差異。此外，中心可能使用略有不同的收集、制備和保藏樣品的方法。還進行融化次數的匹配，以確保病例和對照已經同等地進行凍融降解。
ELISA測量由不知道臨床結果的單個研究助理，在Karumanchi實驗室中進行各種血管生成標記的ELISA。
從R&D systems(Minneapolis，MN)得到可溶內皮糖蛋白(DNDG00)、sFlt1(DVR100)、PlGF(DPG00)的商業上可得到的ELISA試劑盒。
統計學分析使用T-檢驗來對比對數變換后的各種測量值，以確定顯著性。認為P＜0.05是統計學上顯著的。
結果在圖6-8中，顯示了在如該方法中所述的各個胎齡組窗口期間，5個不同研究組的妊娠婦女在整個妊娠中的平均可溶內皮糖蛋白(圖6)、sFlt1(圖7)和PlGF(圖8)濃度。對于先兆子癇組和妊娠高血壓組，在這里未顯示在發作臨床癥狀后采取的樣品。與胎齡-匹配的對照樣品相比，從過早的先兆子癇前9-11周開始，可溶內皮糖蛋白和sFlt1升高，且游離PlGF降低，在先兆子癇發作后，分別達到5倍(46.4vs9.8ng/ml，P＜.0001)、3倍(6356vs2316pg/ml，P＜.0001)和1/4(144vs546pg/ml，P＜.0001)的水平。對于足孕先兆子癇，可溶內皮糖蛋白從12-14周開始升高，游離PlGF從9-11周開始降低，且sFlt1在先兆子癇發作前＜5周升高。在妊娠10-42周，sFlt1和游離PlGF的血清濃度在具有SGA或平均胎齡兒/大于胎齡兒(AGA/LGA)嬰兒的妊娠之間沒有顯著差異。從17-20周開始，SGA妊娠的血清可溶內皮糖蛋白適度增加(7.2vs5.8ng/ml，P＝.03)，與AGA/LGA妊娠中的12.9ng/ml相比，在輕度和嚴重SGA的37-42周，分別達到15.7和43.7ng/ml的濃度(嚴重SGA vs AGA/LGA，P＝.002)。在妊娠高血壓研究中，與GA-匹配的對照樣品相比，在妊娠高血壓前＜1-5周，可溶內皮糖蛋白的適度增加是顯而易見的，在發作妊娠高血壓后，達到可溶內皮糖蛋白的2倍的水平(29.7vs12.5ng/ml，P＝.002)。在21-32周得到的樣品的調整的隨后早產PE的優勢比(odds ratio)，與所有其它四分位相比，是對照可溶內皮糖蛋白濃度的最高四分位(＞7.2ng/ml)，為9.8(95％CI 4.5-21.5)。
將先兆子癇的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數定義為(sFlt1+0.25可溶內皮糖蛋白)/PlGF。在貫穿5個不同研究組的各個胎齡組中，計算該指數。在圖9中顯示了在臨床癥狀之前采取的樣品的先兆子癇抗血管生成的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數。早在妊娠17-20周時，觀察到升高的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數值，并似乎隨著妊娠向嚴重過早的先兆子癇的發展，變得更急劇。在足孕先兆子癇、SGA和GH中，當與對照婦女相比較時，在妊娠末期(33-36周)存在適度升高。
圖10和11描述了根據臨床過早的先兆子癇(PE＜37周)之前的周數，可溶內皮糖蛋白的平均濃度(圖10)和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數(圖11)。甚至早在發作過早的先兆子癇之前的9-11周，注定發展先兆子癇的婦女的可溶內皮糖蛋白和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數升高2-3倍，其中在臨床癥狀之前的1-5周急劇升高(＞5倍)。
圖12和13顯示了在癥狀之前和之后，在貫穿足孕先兆子癇(PE＞37周)的妊娠中，可溶內皮糖蛋白(圖12)和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數(圖13)的變化。從妊娠33-36周開始，觀察到可溶內皮糖蛋白和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數的升高，在臨床先兆子癇時達到平均2倍的水平。
圖14和15顯示了當與血壓正常的對照相比較時，在妊娠高血壓期間、在妊娠高血壓之前1-5周(在妊娠的33-36周期間)的婦女中測得的可溶內皮糖蛋白(圖14)和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數(圖15)的適度升高。
圖16和17顯示了當與對照妊娠相比較時，在33-36周妊娠窗口期間，在患有嚴重SGA的婦女且不是所有患有SGA的婦女中測得的可溶內皮糖蛋白(圖16)和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數(圖17)的適度升高。
總結該研究的結果表明，當與正常對照妊娠相比較時，在妊娠33周之前測量時，在注定發展過早的先兆子癇的婦女和患有臨床過早的先兆子癇(PE＜37周)的婦女中的可溶內皮糖蛋白水平和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數水平急劇升高。因此可溶內皮糖蛋白水平和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數水平(在33周之前)不僅可以用于診斷過早的先兆子癇，而且可以用于預測先兆子癇。似乎早在先兆子癇癥狀之前10-12周，可溶內皮糖蛋白水平和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數水平就開始升高。
當在妊娠晚期(33-36周妊娠窗口)測量時，可溶內皮糖蛋白水平和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數水平在足孕先兆子癇(PE＞37周)中也顯著升高，并在妊娠高血壓和嚴重SGA中適度升高。因此，當在妊娠33周之后測量時，可溶內皮糖蛋白水平和可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數水平也可以用于鑒別其它妊娠并發癥，如SGA和妊娠高血壓。
實施例7.可溶內皮糖蛋白參與先兆子癇的發病機理我們已經表明，在先兆子癇胎盤中，上調可溶內皮糖蛋白，即一種促血管生成蛋白TGF-β的細胞表面受體，并在內皮和合胞體滋養層上表達。我們還已經表明，在先兆子癇中，過量的可溶內皮糖蛋白通過胞外結構域的脫落，從胎盤釋放進循環中。下面所述的實驗用于檢驗下述假說，即可溶內皮糖蛋白可以與sFlt1(一種結合胎盤生長因子(PlGF)和VEGF的抗血管生成因子)協同作用，以造成內皮功能障礙。
材料和方法試劑從R&D systems(Minneapolis，MN)得到重組人內皮糖蛋白、人sFlt1、小鼠內皮糖蛋白、小鼠sFlt1、人TGF-β1、人TGF-β3、小鼠VEGF。從Santa Cruz Biotechnology，Inc.得到針對人內皮糖蛋白N-末端區的小鼠單克隆抗體(目錄號sc 20072)和多克隆抗體(sc20632)。從R&D systems，MN得到人sFlt1、小鼠sFlt1和人可溶內皮糖蛋白的ELISA試劑盒。
腺病毒的產生以前已經描述了針對sFlt1的腺病毒和對照腺病毒(CMV)(Maynard等，J.Clin.Invest.111649658(2003))，并在RichardMulligan博士的協助下，在Harvard Medical Core facility產生。為了產生可溶內皮糖蛋白腺病毒，我們使用了Adeasy試劑盒(Stratagene)。簡而言之，使用人cDNA全長內皮糖蛋白克隆(Invitrogen，CA)作為模板，并使用下面的寡核苷酸作為引物，PCR擴增了人可溶內皮糖蛋白(Thr 27-Leu 586)正向5′-ACG AAG CTTGAA ACA GTC CAT TGT GAC CTT-3′(SEQ ID NO3)，和反向5′TTA GAT ATC TGG CCT TTG CTT GTG CAA CC-3′(SEQ ID NO4)。將擴增的PCR片段首先亞克隆進pSecTag2-B(Invitrogen，CA)，并確認DNA序列。使用pSecTag2 B-可溶內皮糖蛋白作為模板，PCR擴增編碼His-標記的人可溶內皮糖蛋白的哺乳動物表達構建體，并亞克隆進pShuttle-CMV載體(Stratagene；Kpn1和Sca1位點)，即一種腺病毒轉移載體，以用于進行腺病毒產生。然后，使用根據生產商說明書的標準操作規程，產生表達可溶內皮糖蛋白(sE)的腺病毒，并通過蛋白印跡確認表達。然后，如以前所述的(Kuo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 984605-4610(2001))，在293細胞上擴增證實的克隆，并在CsCl2密度梯度上進行純化。通過光學吸光度方法(Sweeney等，Virology，2002，295284-288)，滴定最終產物。以從以前使用基于標準噬斑稀釋的滴定測定試劑盒(BD Biosciences Clontech，PaloAlto，CA，Cat.No.Kl 653-1)和光學吸光度方法滴定的病毒制備物(prep)衍生的公式為基礎，將效價表達為噬斑形成單位(pfu)/mL。
患者在得到適當的IRB-批準的同意后，在Beth Israel DeaconessMedical Center招募該研究的所有患者。將先兆子癇定義為(1)以前血壓正常的患者在妊娠20周后，收縮BP＞140且舒張BP＞90，(2)新發作的蛋白尿(利用測驗片進行尿分析為1+，或24-小時尿收集中的蛋白＞300mg，或隨機的尿蛋白/肌酸酐比＞0.3)，和(3)產后12周高血壓及蛋白尿消除。排除患有基線高血壓、蛋白尿或腎病的患者。為了該研究的目的，以是否存在腎病范圍的蛋白尿(24小時尿收集中的蛋白＞3g或尿蛋白/肌酸酐比大于3.0)為基礎，將患者分成輕度和重度先兆子癇。當患者具有血小板減少癥(＜100000細胞/μl)、升高的LDH(＞600IU/L)和升高的AST(＞70IU/L)的跡象時，定義為HELLP綜合征。包含健康的孕婦作為對照。包含8位因為其它醫學原因早產的患者作為另外的對照。在分娩后立即得到胎盤樣品。在征得知情的同意后，在分娩時(分娩胎盤之前0-12小時)，從妊娠患者收集血清。這些實驗得到了Beth Israel Deaconess Medical Center的Institutional Review Board的批準。
ELISA和蛋白印跡使用來自R&D systems，MN的商業試劑盒，根據生產商的說明書，進行各種蛋白(sFlt1，可溶內皮糖蛋白)的ELISA。如別處所述(Maynard等，同上)，使用蛋白印跡和ELISA來檢查大鼠血漿中腺病毒感染的轉基因的表達。
免疫沉淀(IP)實驗將隨后為蛋白印跡的IP用于鑒別和表征先兆子癇患者的胎盤組織和血清樣品中的可溶內皮糖蛋白。用冷PBS洗滌人胎盤組織，并在勻漿緩沖液[10mM Tris-HCl，pH 7.4；15mM NaCl；60mM KCl；1mM EDTA；0.1mM EGTA；0.5％NonidetP-40；5％蔗糖；購自Roche(Indianapolis，IN)的蛋白酶混合物]中裂解10分鐘。然后，用抗人單克隆小鼠內皮糖蛋白抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，SantaCruz，CA)，對胎盤裂解物進行免疫沉淀。根據生產商的說明書，使用免疫純的IgG定向試劑盒(Pierce Chemical Co.，Rockford，Illinois，美國)，通過定向偶聯3-5mg純化的抗體到2ml A蛋白-瓊脂糖上，制備免疫親和柱。然后，用含有蛋白酶混合物的RIPA緩沖液充分洗滌柱，并用0.1mol/L甘氨酸-HCl緩沖液pH 2.8洗脫結合的蛋白。將洗脫液收集在含有1mol/L Tris-HCl緩沖液的0.5-ml級分中。合并含有蛋白的級分，并用CENTRICON離心濃縮器(MilliporeCorp.，Bedford，Massachusetts，美國)濃縮9至10倍。在4-12％梯度凝膠(Invitrogen)上分離免疫沉淀的樣品，并將蛋白轉移到聚偏1，1-二氟乙烯(PVDF)膜上。使用多克隆抗人兔內皮糖蛋白第一抗體(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)，通過蛋白印跡檢測內皮糖蛋白蛋白。
內皮管測定將生長因子減少的matrigel(7mg/mL，Collaborative BiomedicalProducts，Bedford，MA)放在預冷的48孔細胞培養平板的孔(100l/孔)中，并在37℃溫育30分鐘，以允許聚合。用重組蛋白的各種組合(可溶內皮糖蛋白、sFlt1或二者)處理HUVEC細胞(30,000+在300μl沒有血清的內皮基礎培養基中，Clonetics，Walkersville，MD)，鋪平板到Matrigel包被的孔上，并在37℃溫育12-16小時。然后通過4X倒置相差顯微鏡(Nikon Corporation，Tokyo，日本)評價管形成，并使用Simple PCI成像分析軟件進行定量分析(管面積和總長度)。
微血管通透性實驗經眶后靜脈叢，給Balb-C小鼠注射1×108pfu表達GFP或可溶內皮糖蛋白或sFlt1或其組合的腺病毒，并在48小時后進行微血管通透性測定。通過腹膜內(IP)注射0.5ml阿佛丁，麻醉小鼠。將100ml 1％伊文思藍染料(溶于PBS中)注射進尾靜脈。40分鐘后，通過心臟穿刺，給小鼠灌注含有2mM EDTA的PBS 20分鐘。收獲器官(腦、肺、肝、腎)，并在甲酰胺中溫育3天，以洗脫伊文思藍染料。使用620nm波長，測量甲酰胺溶液的OD。
腎微血管反應性實驗使用大鼠腎微血管(70-170μm內徑)，如以前所述(Maynard等，同上)，進行微血管反應性實驗。在所有實驗組中，在用U46619(血栓烷激動劑)預收縮微血管至在40mmHg擴張壓下的基線直徑的40-60％后，檢查腎微血管的松弛反應。一旦達到穩定狀態張力，就以標準化的次序，檢查對各種試劑(如TGF-β1或TGF-β3或VEGF)的反應。所有藥物都是腔外地(extraluminally)施用的。
動物模型通過尾靜脈注射，給妊娠的和非妊娠的Sprague-Dawley大鼠注射2×109pfu腺病毒(Ad CMV或Ad sFlt1或Ad sE或Ad sFlt1+AdsE)。在妊娠的第8-9天(次三個月早期)注射妊娠的大鼠，并在妊娠的第16-17天(第三個三個月早期)測量血壓。用戊巴比妥鈉(60mg/kg，腹膜內地(i.p.))麻醉之后，測量大鼠的血壓。分離頸動脈，并插入與壓力轉換器(Millar Instruments，Houston，TX)相連的3-Fr高保真度微尖(microtip)導管。記錄血壓，并求10分鐘時間段內的平均值。在安死術之前得到血液、組織和尿樣品。在測量血壓的當天(注射腺病毒后第8天)，測量血漿水平，從而認識到腺病毒注射后7-10天與這些蛋白的表達的峰水平相對應。通過蛋白印跡，初步證實了循環sFlt-1和可溶內皮糖蛋白水平，然后使用商業上可得到的鼠ELISA試劑盒(R&D Systems，Minneapolis，MN)進行定量。通過兩個標準測驗片，測量兩種尿清蛋白，并使用商業上可得到的大鼠清蛋白ELISA試劑盒(Nephrat試劑盒，Exocell Inc，Philadelphia，PA)，通過競爭性酶聯免疫測定進行定量。使用苦味酸比色方法試劑盒(Metra肌酸酐測定試劑盒，Quidel Corp，SanDiego，CA)，測量尿肌酸酐。使用商業上可得到的試劑盒(ThermoElectron，Louisville，CO)，測量AST和LDH。使用自動血細胞計數器(Hemavet 850，Drew Scientific Inc，Oxford，CT)，測量來自大鼠血液的血小板計數。對血液外周涂片進行瑞特染色，以檢測循環血液中的裂紅細胞。測量血壓和收集樣品后，處死大鼠，并收獲器官用于組織學。計數產仔數，并稱量單個胎盤和胎兒的重量。將收獲的腎置于布安氏液中，用石蠟包埋，切片，并用H&E、PAS或Masson氏三色染料染色。
統計學對比將結果表達為平均值±平均值的標準誤(SEM)，并通過使用ANOVA分析方差，進行多個組之間的對比。當p＜0.05時，報告顯著差異。
結果先兆子癇患者中升高的可溶內皮糖蛋白使用表7所述患者的血清樣品，我們測量了各個組的先兆子癇患者和對照妊娠患者中的可溶內皮糖蛋白的循環濃度。
表7各個患者組的臨床特征和循環可溶內皮糖蛋白
*P＜0.05，**P＜0.005在輕度先兆子癇中，可溶內皮糖蛋白的平均血清濃度至少高2倍，而在重度先兆子癇患者中高3-4倍。在并發HELLP綜合征的先兆子癇患者中，可溶內皮糖蛋白濃度為胎齡匹配的對照樣品的至少5-10倍。另外，妊娠患者中的可溶內皮糖蛋白水平與sFlt1水平相關聯(圖18)。關聯的R2值是0.6。(應當指出，這里報道的sFlt-1循環濃度是以前公布的至少4-5倍(Maynard等，同上)。這是由于來自R&D systems的新ELISA試劑盒的靈敏度的差異，其在測定稀釋液中缺少尿素，因此總是產生比以前公布的更高的值)。換而言之，具有最高水平的可溶內皮糖蛋白的患者也具有最高循環水平的sFlt1。可溶內皮糖蛋白的起源最可能是胎盤的合胞體滋養層，如在我們的胎盤免疫組織化學上看到的增強染色所證實的(圖19和20)。這些圖表明，內皮糖蛋白蛋白由合胞體滋養層表達，并在先兆子癇中極大地上調。我們的蛋白印跡數據(圖21A和21B)和RNA印跡還證實，可溶內皮糖蛋白是內皮糖蛋白蛋白的胞外結構域的脫落形式，其大小約65kDA，在先兆子癇胎盤中過量地表達，且它在先兆子癇胎盤中過量地循環。該蛋白的預測長度是約437個氨基酸。
可溶內皮糖蛋白是抗血管生成分子，并誘導血管功能障礙我們使用血管生成的體外模型來理解可溶內皮糖蛋白的功能。可溶內皮糖蛋白適當地抑制內皮管形成，sFlt1的存在會進一步對其進行強化(圖22)。在先兆子癇中，已經報道除了內皮功能障礙外，還存在增強的微血管通透性，如由水腫和增強的依文斯藍結合的清蛋白胞外泄漏所證實的。為了觀察可溶內皮糖蛋白是否誘導微血管泄漏，我們使用用可溶內皮糖蛋白和sFlt處理了48小時的小鼠。可溶內皮糖蛋白和sFlt1的組合，誘發肺、肝和腎中清蛋白泄漏的急劇增加，和腦中的適度泄漏，如使用伊文思藍測定所證實的(圖23)。單獨的可溶內皮糖蛋白誘發肝中的適度泄漏。這些數據表明，可溶內皮糖蛋白和sFlt1組合是有效的抗血管生成分子，且可以誘發顯著的血管泄漏。
為了評價可溶內皮糖蛋白的血流動力學作用，在大鼠腎微血管中進行了一系列微血管反應性實驗。我們首先研究了TGF-β1和TGF-β3(內皮糖蛋白的兩種已知的配體)的作用。TGF-β1和TGF-β3都誘發血管直徑的劑量依賴性的增加。重要的是，在過量可溶內皮糖蛋白存在下，兩種TGF的作用都顯著減弱(圖24)。最后，VEGF和TGF-β1的組合誘發血管舒張，后者受到過量可溶內皮糖蛋白和sFlt1的阻斷(圖25)。這表明，sFlt1和可溶內皮糖蛋白可以對抗血管生成生長因子(如VEGF和TGF-β1)誘發的生理性血管舒張，并誘發高血壓。
可溶內皮糖蛋白和sFlt1的體內作用為了評價可溶內皮糖蛋白和sFlt1對血管的作用，我們借助于妊娠大鼠中的腺病毒表達系統。在妊娠的第8天，通過尾靜脈將編碼對照基因(CMV)或可溶內皮糖蛋白或sFlt1或sFlt1+可溶內皮糖蛋白的腺病毒注射進Sprague-Dawley大鼠。在第17天，檢查動物的先兆子癇表型。表8包括血流動力學和生物化學數據。
表8.腺病毒處理的大鼠動物模型的血流動力學和生物化學數據
MAP-平均動脈壓(舒張壓+1/3脈壓)；Alb/Creat-清蛋白/肌酸酐比；LDH-乳酸脫氫酶；AST-天冬氨酸轉氨酶。
*當與對照組相比較時，P＜0.05胎兒體重是每組隨機選擇的4個胎兒的總和。
sFlt1的平均循環濃度，在sFlt1組中是410ng/ml，且在sFlt1+sE組中是430ng/ml。sE的平均循環濃度，在sE組中是318ng/ml，且在sFlt1+sE組中是319ng/ml。
單獨的可溶內皮糖蛋白誘發輕度高血壓。sFlt1誘發高血壓和蛋白尿兩者，如以前所報道的。重要的是，sFlt1和可溶內皮糖蛋白的組合誘發嚴重的高血壓、腎病范圍的蛋白尿、胎兒的生長限制和發展HELLP綜合征的生物化學跡象(升高的LDH、升高的AST和減少血小板計數)(表8)。通過揭示裂紅細胞和網織細胞增多的外周涂片，證實了可溶內皮糖蛋白+sFlt1組中的溶血跡象(圖26A-B)。最后，腎組織學也證實了可溶內皮糖蛋白+sFlt1組的嚴重的腎小球內皮增生(圖27A-27D)。
總結這些結果證實，可溶內皮糖蛋白在先兆子癇胎盤中受到上調，且在先兆子癇患者中以非常高的水平存在。最高水平的可溶內皮糖蛋白存在于患有HELLP綜合征的患者中，該HELLP綜合征是先兆子癇的最嚴重形式之一。這些結果還證實，可溶內皮糖蛋白水平與妊娠患者中升高的sFlt1相關聯，且在存在更高的循環sFlt1水平的那些患者中更高。此外，這些結果證實，可溶內皮糖蛋白是抗血管生成分子，并在許多內皮測定(如血管生成測定、微血管通透性測定和微血管反應性實驗)中破壞內皮功能。重要的是，可溶內皮糖蛋白可以放大sFlt1在這些體外內皮測定中的毒性結果。而且，在體內測定中，可溶內皮糖蛋白的腺病毒表達誘發輕度高血壓，而沒有任何顯著的蛋白尿。但是，在有sFlt1存在下，可溶內皮糖蛋白誘發顯著的血管損傷，如由嚴重高血壓、蛋白尿、腎小球內皮增生、HELLP綜合征的發展和胎兒生長限制的存在所證實的。這些數據表明，可溶內皮糖蛋白在產婦先兆子癇綜合征的病因中起重要作用，并強調了對中和可溶內皮糖蛋白以用于治療先兆子癇的試劑的需要。
可溶內皮糖蛋白釋放的機理可能是內皮糖蛋白分子的胞外區的蛋白酶剪切。在先兆子癇組織中受到上調的特定蛋白酶可以作為候選分子。一個實例是膜類型的基質金屬蛋白酶-1(MT1-MMP)，已經表明它切割β聚糖，即與內皮糖蛋白共有相似性的一種分子(Velasco-Loyden等，J.Biol.Chem.2797721-33(2004))。因此，這些蛋白酶的抑制劑可以作為治療先兆子癇的有價值的靶。
其它實施方案為了解釋的目的，提供了本發明的具體的實施方案的描述。它們不意欲是窮盡性的，也無意將本發明的范圍限制為本文所述的具體形式。盡管已經參照幾個實施方案描述了本發明，但本領域的技術人員應當理解，在不脫離如權利要求書所述的本發明的精神和范圍的情況下，可以進行各種修改。本文中提到的所有專利、專利申請和出版物均引作參考。
其它實施方案在權利要求書中。
序列表序列表<110>Beth Israel Deaconess Medical Center et al.
<120>診斷和治療妊娠并發癥的方法<130>01948/106W02<150>60/613,170<151>2004-09-24<160>4<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1311<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<400>1atggaccgcg gcacgctccc tctggctgtt gccctgctgc tggccagctg cagcctcagc60cccacaagtc ttgcagaaac agtccattgt gaccttcagc ctgtgggccc cgagagggac120gaggtgacat ataccactag ccaggtctcg aagggctgcg tggctcaggc ccccaatgcc180atccttgaag tccatgtcct cttcctggag ttcccaacgg gcccgtcaca gctggagctg240actctccagg catccaagca aaatggcacc tggccccgag aggtgcttct ggtcctcagt300gtaaacagca gtgtcttcct gcatctccag gccctgggaa tcccactgca cttggcctac360aattccagcc tggtcacctt ccaagagccc ccgggggtca acaccacaga gctgccatcc420ttccccaaga cccagatcct tgagtgggca gctgagaggg gccccatcac ctctgctgct480gagctgaatg acccccagag catcctcctc cgactgggcc aagcccaggg gtcactgtcc540ttctgcatgc tggaagccag ccaggacatg ggccgcacgc tcgagtggcg gccgcgtact600ccagccttgg tccggggctg ccacttggaa ggcgtggccg gccacaagga ggcgcacatc660ctgagggtcc tgccgggcca ctcggccggg ccccggacgg tgacggtgaa ggtggaactg720
agctgcgcac ccggggatct cgatgccgtc ctcatcctgc agggtccccc ctacgtgtcc780tggctcatcg acgccaacca caacatgcag atctggacca ctggagaata ctccttcaag840atctttccag agaaaaacat tcgtggcttc aagctcccag acacacctca aggcctcctg900ggggaggccc ggatgctcaa tgccagcatt gtggcatcct tcgtggagct accgctggcc960agcattgtct cacttcatgc ctccagctgc ggtggtaggc tgcagacctc acccgcaccg1020atccagacca ctcctcccaa ggacacttgt agcccggagc tgctcatgtc cttgatccag1080acaaagtgtg ccgacgacgc catgaccctg gtactaaaga aagagcttgt tgcgcatttg1140aagtgcacca tcacgggcct gaccttctgg gaccccagct gtgaggcaga ggacaggggt1200gacaagtttg tcttgcgcag tgcttactcc agctgtggca tgcaggtgtc agcaagtatg1260atcagcaatg aggcggtggt caatatcctg tcgagctcat caccacagcg g 1311<210>2<211>437<212>PRT<213>智人(Homo sapiens)<400>2Met Asp Arg Gly Thr Leu Pro Leu Ala Val Ala Leu Leu Leu Ala Ser1 5 10 15Cys Ser Leu Ser Pro Thr Ser Leu Ala Glu Thr Val His Cys Asp Leu20 25 30Gln Pro Val Gly Pro Glu Arg Gly Glu Val Thr Tyr Thr Thr Ser Gln35 40 45Val Ser Lys Gly Cys Val Ala Gln Ala Pro Asn Ala Ile Leu Glu Val50 55 60
His Val Leu Phe Leu Glu Phe Pro Thr Gly Pro Ser Gln Leu Glu Leu65 70 75 80Thr Leu Gln Ala Ser Lys Gln Asn Gly Thr Trp Pro Arg Glu Val Leu85 90 95Leu Val Leu Ser Val Asn Ser Ser Val Phe Leu His Leu Gln Ala Leu100 105 110Gly Ile Pro Leu His Leu Ala Tyr Asn Ser Ser Leu Val Thr Phe Gln115 120 125Glu Pro Pro Gly Val Asn Thr Thr Glu Leu Pro Ser Phe Pro Lys Thr130 135 140Gln Ile Leu Glu Trp Ala Ala Glu Arg Gly Pro Ile Thr Ser Ala Ala145 150 155 160Glu Leu Asn Asp Pro Gln Ser Ile Leu Leu Arg Leu Gly Gln Ala Gln165 170 175Gly Ser Leu Ser Phe Cys Met Leu Glu Ala Ser Gln Asp Met Gly Arg180 185 190Thr Leu Glu Trp Arg Pro Arg Thr Pro Ala Leu Val Arg Gly Cys His195 200 205Leu Glu Gly Val Ala Gly His Lys Glu Ala His Ile Leu Arg Val Leu210 215 220Pro Gly His Ser Ala Gly Pro Arg Thr Val Thr Val Lys Val Glu Leu225 230 235 240
Ser Cys Ala Pro Gly Asp Leu Asp Ala Val Leu Ile Leu Gln Gly Pro245 250 255Pro Tyr Val Ser Trp Leu Ile Asp Ala Asn His Asn Met Gln Ile Trp260 265 270Thr Thr Gly Glu Tyr Ser Phe Lys Ile Phe Pro Glu Lys Asn Ile Arg275 280 285Gly Phe Lys Leu Pro Asp Thr Pro Gln Gly Leu Leu Gly Glu Ala Arg290 295 300Met Leu Asn Ala Ser Ile Val Ala Ser Phe Val Glu Leu Pro Leu Ala305 310 315 320Ser Ile Val Ser Leu His Ala Ser Ser Cys Gly Gly Arg Leu Gln Thr325 330 335Ser Pro Ala Pro Ile Gln Thr Thr Pro Pro Lys Asp Thr Cys Ser Pro340 345 350Glu Leu Leu Met Ser Leu Ile Gln Thr Lys Cys Ala Asp Asp Ala Met355 360 365Thr Leu Val Leu Lys Lys Glu Leu Val Ala His Leu Lys Cys Thr Ile370 375 380Thr Gly Leu Thr Phe Trp Asp Pro Ser Cys Glu Ala Glu Asp Arg Gly385 390 395 400Asp Lys Phe Val Leu Arg Ser Ala Tyr Ser Ser Cys Gly Met Gln Val405 410 415
Ser Ala Ser Met Ile Ser Asn Glu Ala Val Val Asn Ile Leu Ser Ser420 425 430Ser Ser Pro Gln Arg435<210>3<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>3acgaagcttg aaacagtcca ttgtgacctt 30<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>4ttagatatct ggcctttgct tgtgcaacc 29
權利要求
1.治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥的方法，所述方法包含給所述受試者施用能特異性地結合可溶內皮糖蛋白的化合物的步驟，其中所述施用的時間和量足以治療或預防所述受試者的所述妊娠相關的高血壓病癥。
2.權利要求1的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥選自先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠。
3.權利要求2的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
4.權利要求1的方法，其中所述化合物是純化的可溶內皮糖蛋白抗體或可溶內皮糖蛋白抗原結合片段。
5.權利要求1的方法，其中所述化合物是生長因子。
6.權利要求5的方法，其中所述生長因子選自轉化生長因子(TGF)-β1或TGF-β3、活化素A、骨形態發生蛋白(BMP)-2或BMP-7。
7.權利要求1的方法，還包含施用選自下述的化合物純化的sFlt-1抗體、sFlt抗原結合片段、煙堿、茶堿、腺苷、硝苯地平、米諾地爾、硫酸鎂、血管內皮生長因子(VEGF)和胎盤生長因子(PlGF)。
8.權利要求7的方法，其中所述VEGF是VEGF121或VEGF165。
9.權利要求1的方法，還包含給受試者施用抗高血壓化合物的步驟。
10.權利要求1的方法，其中所述受試者是妊娠的人。
11.權利要求1的方法，其中所述受試者是產后的人。
12.權利要求1的方法，其中所述受試者是非人類。
13.權利要求12的方法，其中所述受試者選自牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗和貓。
14.治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥的方法，所述方法包含給所述受試者施用增加能結合可溶內皮糖蛋白的生長因子的水平的化合物的步驟，其中所述施用的量和時間足以治療或預防所述受試者的所述妊娠相關的高血壓病癥。
15.權利要求14的方法，其中所述生長因子選自TGF-β1、TGF-3β、活化素A、BMP-2和BMP-7。
16.權利要求14的方法，其中所述化合物選自環孢菌素、α生育酚、美西麥角、溴隱亭和愛道美。
17.治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥的方法，所述方法包含給所述受試者施用抑制生長因子結合可溶內皮糖蛋白多肽的化合物，其中所述施用足以治療或預防所述受試者的所述妊娠相關的高血壓病癥。
18.權利要求17的方法，其中所述化合物結合可溶內皮糖蛋白，并阻斷生長因子結合。
19.治療或預防受試者的妊娠相關的高血壓病癥的方法，所述方法包含給所述受試者施用能降低可溶內皮糖蛋白表達或生物學活性的化合物，其中所述施用足以治療或預防所述受試者的所述妊娠相關的高血壓病癥。
20.權利要求19的方法，其中所述化合物是抑制選自基質金屬蛋白酶(MMP)、組織蛋白酶和彈性蛋白酶的蛋白水解酶的化合物。
21.權利要求20的方法，其中所述MMP是MMP9。
22.權利要求20的方法，其中MMP是膜類型基質金屬蛋白酶-1。
23.權利要求19的方法，其中所述化合物包含與內皮糖蛋白核酸序列的至少部分至少95％互補的反義核堿基寡聚體，其中所述施用足以治療或預防所述受試者的所述妊娠相關的高血壓病癥。
24.權利要求23的方法，其中所述反義核堿基寡聚體是8-30個核苷酸長。
25.權利要求19的方法，其中所述化合物包含雙鏈RNA分子，其具有一條與內皮糖蛋白核酸序列的至少部分至少95％互補的鏈，其中所述施用足以治療或預防所述受試者的所述妊娠相關的高血壓病癥。
26.權利要求25的方法，其中所述雙鏈RNA是19-25個核苷酸長的小干擾RNA(siRNA)。
27.權利要求19的方法，所述化合物包含特異性地結合可溶內皮糖蛋白的純化的抗體或抗原結合片段。
28.權利要求14、17或19的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥選自先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有小于胎齡兒(SGA)嬰兒的妊娠。
29.權利要求28的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
30.權利要求1或19的方法，其中所述方法還包含監控所述受試者的所述妊娠相關的高血壓病癥，其中所述監控包括測量來自所述受試者的樣品中的可溶內皮糖蛋白多肽的水平。
31.權利要求30的方法，其中所述樣品是血清或血漿，且小于25ng/ml的可溶內皮糖蛋白多肽水平指示著所述妊娠相關的高血壓病癥的改善。
32.權利要求30的方法，其中在兩個或更多個場合進行所述的水平測量，且測量之間的所述水平的降低指示著所述妊娠相關的高血壓病癥的改善。
33.權利要求30的方法，其中將所述水平的測量與陽性參照樣品相比較，且可溶內皮糖蛋白的水平相對于所述陽性參照樣品的降低，指示著所述受試者的所述妊娠相關的高血壓病癥的改善。
34.權利要求30的方法，其中所述監控用于確定化合物的治療劑量。
35.權利要求30的方法，其中使用免疫學測定進行所述測量。
36.權利要求30的方法，其中所述可溶內皮糖蛋白的水平是游離的、結合的或總的可溶內皮糖蛋白的水平。
37.權利要求30的方法，其中所述可溶內皮糖蛋白的水平是由降解或酶切割產生的內皮糖蛋白多肽的水平。
38.權利要求30的方法，其中所述監控包含測量sFlt-1、VEGF或PlGF多肽中的至少一種在來自所述受試者的樣品中的水平。
39.權利要求38的方法，還包含使用度量計算所述可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的水平之間的關系，其中受試者樣品相對于參照樣品的所述水平之間的關系的變化，是所述受試者的妊娠相關的高血壓病癥的診斷指標。
40.權利要求39的方法，其中所述度量是先兆子癇抗血管生成指數(PAAI)[sFlt-1/VEGF+PlGF]。
41.權利要求40的方法，其中小于20的PAAI值指示著所述先兆子癇或子癇的改善。
42.權利要求39的方法，其中所述度量是可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數[(sFlt-1+0.25可溶內皮糖蛋白)/PlGF]或[(可溶內皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF]。
43.權利要求39的方法，其中所述度量用于確定治療性化合物的劑量。
44.權利要求43的方法，其中以使PAAI小于20的劑量施用所述治療性化合物。
45.權利要求1或19的方法，其中所述方法還包含監控所述受試者的妊娠相關的高血壓病癥，其中所述監控包含測量內皮糖蛋白核酸分子在來自所述受試者的樣品中的水平。
46.權利要求45的方法，其中將所述內皮糖蛋白核酸的水平與參照樣品相比較，且受試者樣品中所述水平相對于所述參照的變化，是所述受試者的妊娠相關的高血壓病癥的診斷指標。
47.特異性地結合可溶內皮糖蛋白的抗體或其抗原結合片段。
48.權利要求47的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或抗原結合片段阻止生長因子與可溶內皮糖蛋白的結合。
49.權利要求48的抗體或其抗原結合片段，其中所述生長因子選自TGF-β1、TGF-β3、活化素A、BMP-2和BMP-7。
50.權利要求47的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是單克隆抗體。
51.權利要求47的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段是人或人源化抗體。
52.權利要求47的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體缺少Fc部分。
53.權利要求47的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體是F(ab′)2、Fab或Fv結構。
54.權利要求47的抗體或其抗原結合片段，其中所述抗體或其抗原結合片段存在于藥學上可接受的載體中。
55.診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥或具有其素因的方法，所述方法包含測量來自受試者的樣品中的可溶內皮糖蛋白多肽的水平。
56.權利要求55的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、慢性高血壓、HELLP綜合征和具有SGA嬰兒的妊娠。
57.權利要求56的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
58.權利要求55的方法，其中所述可溶內皮糖蛋白的水平是游離的、結合的或總的可溶內皮糖蛋白的水平。
59.權利要求55的方法，其中大于20ng/ml的可溶內皮糖蛋白水平是妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向的診斷指標。
60.權利要求55的方法，其中使用免疫學測定進行所述測量。
61.權利要求60的方法，其中所述免疫學測定是ELISA。
62.權利要求55的方法，其中所述可溶內皮糖蛋白多肽水平相對于正常參照的增加是妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向的診斷指標。
63.權利要求55的方法，其中在兩個或更多個場合進行所述水平測量，且測量之間的所述水平的變化是妊娠相關的高血壓病癥的診斷指標。
64.權利要求55的方法，其中所述監控還包含測量sFlt-l、VEGF或PlGF多肽中的至少一種在來自所述受試者的樣品中的水平。
65.權利要求64的方法，還包含使用度量計算可溶內皮糖蛋白、sFlt-1、VEGF或PlGF的所述水平之間的關系，其中受試者樣品相對于參照樣品的所述水平之間的關系的變化，是所述受試者的妊娠相關的高血壓病癥的診斷指標。
66.權利要求65的方法，其中所述度量是先兆子癇抗血管生成指數(PAAI)[sFlt-1/VEGF+PlGF]。
67.權利要求66的方法，其中大于10的PAAI值是所述受試者的妊娠相關的高血壓病癥的診斷指標。
68.權利要求65的方法，其中所述度量是可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數[(sFlt-1+0.25可溶內皮糖蛋白)/PlGF]。
69.權利要求68的方法，其中大于100的可溶內皮糖蛋白抗血管生成指數值是所述受試者的妊娠相關的高血壓病癥的診斷指標。
70.權利要求65的方法，其中所述度量是[(可溶內皮糖蛋白+sFlt-1)/PlGF]。
71.權利要求66、68或70的方法，其中所述度量還包含母親的體重指數或胎兒的胎齡。
72.診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥或具有其素因的方法，所述方法包含測量內皮糖蛋白核酸分子在來自所述受試者的樣品中的水平，并將它與參照相比較，其中所述水平相對于參照的變化，診斷妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向。
73.權利要求72的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、HELLP綜合征、慢性高血壓或具有小于胎齡兒嬰兒的妊娠。
74.權利要求73的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
75.權利要求72的方法，其中所述水平的變化是增加。
76.權利要求72的方法，其中所述內皮糖蛋白核酸是可溶內皮糖蛋白核酸。
77.權利要求72的方法，還包含測量sFlt-1、VEGF或PlGF核酸分子中的至少一種在來自所述受試者的樣品中的水平，并將其與參照樣品相對比，其中所述水平的變化診斷妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向。
78.診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥或具有其素因的方法，所述方法包含確定來自所述受試者的樣品中的內皮糖蛋白基因的核酸序列，并將其與參照序列相對比，其中受試者核酸序列的改變所述受試者中基因產物的表達水平的變化，診斷受試者患有妊娠相關的高血壓病癥或有發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向。
79.權利要求78的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、妊娠高血壓、HELLP綜合征、慢性高血壓或具有小于胎齡兒嬰兒的妊娠。
80.權利要求79的方法，其中所述妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇或子癇。
81.權利要求55、72或78的方法，其中所述樣品是所述受試者的體液，其中所述可溶內皮糖蛋白通常是可檢測到的。
82.權利要求81的方法，其中所述體液選自尿、羊水、血液、血清、血漿和腦脊液。
83.權利要求55、72或78的方法，其中所述樣品是細胞或組織。
84.權利要求83的方法，其中所述細胞選自內皮細胞、白細胞、單核細胞或源自胎盤的細胞。
85.權利要求83的方法，其中所述組織是胎盤組織。
86.權利要求55、72或78的方法，其中所述受試者是未妊娠的人、妊娠的人、產后的人或非人類，且所述方法診斷發展先兆子癇或子癇的傾向。
87.權利要求86的方法，其中所述非人類選自牛、馬、綿羊、豬、山羊、狗或貓。
88.權利要求72的方法，其中在兩個或更多個場合進行所述水平測量，且測量之間的所述水平的變化是所述妊娠相關的高血壓病癥的診斷指標。
89.權利要求55、72或78的方法，其中所述方法用于在發作癥狀前至少4周診斷妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向。
90.試劑盒，其用于診斷受試者的妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向，其包含具有內皮糖蛋白核酸序列的核酸分子或其互補序列或其任意組合，和將所述核酸分子用于妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向的說明書。
91.權利要求90的試劑盒，其中所述試劑盒還包含VEGF、sFlt-1或PlGF的核酸序列，或其互補序列，或其任意組合。
92.權利要求90的試劑盒，其中所述內皮糖蛋白核酸是可溶內皮糖蛋白核酸。
93.試劑盒，其用于診斷受試者的妊娠相關的高血壓病癥，其包含可溶內皮糖蛋白結合分子，和使用所述可溶內皮糖蛋白結合分子來診斷妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向的說明書。
94.權利要求93的試劑盒，其中所述可溶內皮糖蛋白結合分子是特異性地結合可溶內皮糖蛋白的抗體或其抗原結合片段。
95.權利要求93的試劑盒，其中所述試劑盒還包含VEGF、sFlt-1或PlGF結合分子。
96.權利要求90或93的試劑盒，其中所述妊娠相關的高血壓病癥是先兆子癇、子癇、慢性高血壓、HELLP綜合征、妊娠高血壓或具有SGA嬰兒的妊娠。
97.鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含使表達內皮糖蛋白核酸分子的細胞接觸候選化合物，并對比所述候選化合物接觸的所述細胞中的所述內皮糖蛋白核酸分子的表達水平和所述候選化合物未接觸的對照細胞中的表達水平，其中所述內皮糖蛋白核酸分子的表達的變化，將所述候選化合物鑒別為改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物。
98.權利要求97的方法，其中所述變化是所述可溶內皮糖蛋白核酸分子的水平的降低。
99.鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含使表達可溶內皮糖蛋白多肽的細胞接觸候選化合物，并對比所述候選化合物接觸的所述細胞中的所述可溶內皮糖蛋白多肽的表達水平和所述候選化合物未接觸的對照細胞中的多肽表達水平，其中所述內皮糖蛋白多肽的表達的變化，將所述候選化合物鑒別為改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物。
100.權利要求99的方法，其中使用免疫學測定、酶法測定或免疫測定來測量所述表達的變化。
101.權利要求99的方法，其中所述表達的變化是可溶內皮糖蛋白水平的降低。
102.權利要求99的方法，其中所述表達的變化是轉錄或翻譯的變化。
103.鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含使表達可溶內皮糖蛋白多肽的細胞接觸候選化合物，并對比所述候選化合物接觸的所述細胞中的所述多肽的生物學活性和所述候選化合物未接觸的對照細胞中的生物學活性水平，其中所述內皮糖蛋白多肽的生物學活性的變化，將所述候選化合物鑒別為改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物。
104.鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含檢測在有候選化合物存在下，可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合，其中與沒有所述候選化合物存在時所述可溶內皮糖蛋白多肽和所述生長因子之間的結合相比所述結合的降低，將所述候選化合物鑒別為改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物。
105.鑒別阻止可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合的多肽或其片段的方法，所述方法包含檢測在有所述候選多肽存在下，可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合，其中與沒有所述候選多肽存在時所述可溶內皮糖蛋白多肽和所述生長因子之間的結合相比所述結合的降低，將所述候選多肽鑒別為阻止可溶內皮糖蛋白多肽和生長因子之間的結合的多肽。
106.鑒別改善妊娠相關的高血壓病癥的化合物的方法，所述方法包含檢測可溶內皮糖蛋白多肽和候選化合物之間的結合，其中結合所述可溶內皮糖蛋白多肽的化合物改善所述妊娠相關的高血壓病癥。
全文摘要
本文公開了通過測量可溶內皮糖蛋白的水平或生物學活性，診斷妊娠相關的高血壓病癥或發展妊娠相關的高血壓病癥的傾向的方法。本文還公開了使用改變可溶內皮糖蛋白水平或生物學活性的化合物來治療妊娠相關的高血壓病癥(如先兆子癇和子癇)的方法。
文檔編號A61K39/395GK101065667SQ200580040164
公開日2007年10月31日 申請日期2005年9月26日 優先權日2004年9月24日
發明者S·A·卡魯曼基, V·舒克哈特姆 申請人:貝絲以色列女執事醫療中心