專利名稱：：用于骨折愈合的半固體混合纖維蛋白成骨細胞成分及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分及其制備方法。本發明尤其涉及一種用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分，其提供了一種含有成骨細胞和纖維蛋白混合物的治療劑，可以注入到患病區域使骨結合來治療嚴重的骨折，及其制備方法。
背景技術：
：一般地，簡單的骨折可以通過固定幾個星期骨折部位完全愈合，但是嚴重的骨折或骨缺陷需要骨移植。大多數醫生首選的骨移植方法是自體移植，包括從患者身體的某一部位收集骨，尤其是髂脊，接下來移植到患者的患病區域。由于移植的是患者自己的骨骼，這種方法能得到極好的結果。然而，這種自體移植的缺點是這種手術方法會伴隨有嚴重的疼痛，并且存在多種潛在問題，在骨接受區可能出現敏感度和感覺降低，為了骨移植需要額外的手術，長時間的住院治療，痊愈醫療費用增加。另外，在身體里沒有足夠的額外骨骼用于移植，這種自體移植為了保護貢獻部位需克服許多困難。據報道如果脊髓手術迫使大量骨移植，由于骨自體移植引起的并發癥發病率高達23%。為了緩解自體移植上述缺點的異體移植，主要是從尸體獲得骨，不必為了骨移植做額外二次手術，但是具有致命的缺點，例如在滅菌過程中骨強度降低，出現移植排斥，具有被傳染性疾病感染的可能性，例如肝炎和艾滋病。另外，異體移植具有以下缺點低骨形成作用，免疫反應，骨吸收及相關骨骼再骨折，應用范圍窄。因此，這種手術方法由于食品藥品監督部門為了抵制感染加強骨組織庫管理乂人1993年底開始減少。同時，骨髓注射是基于Huggins(1931),Friedenstein(1973),和Ashton(1980)聲明的技術，其中來自骨髓的骨原細胞促進并推動骨形成。骨髓注射在治療骨折時通常單獨使用，但也在骨移植中使用。與其它骨移植技術不同，這用骨髓注射供體不需切開皮膚，有利于降低供體發病率，沒有并發癥或副作用。其后，盡管大量臨床應用病例獲得好結果被報道，骨髓注射的缺點是不具有健全的理論基礎，獲得的相當一部分結果間不具有一致性，從一個位置收集的骨髓數量是有限的，骨髓中的骨原細胞的數量是相當有限的。
發明內容因此，基于上述問題本發明的目的在于提供一種用于骨結合含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分及其制備方法，通過向骨結合的部位注射成骨細胞和纖維蛋白的混合物，無臨床移植排異，通過注射適于一定程度的這用成分可以獲得有效、快速的骨結合，為了減輕由于注射的成骨細胞從骨結合區域逃逸而造成的非必要區域骨組織形成及成骨細胞通過血流增生的問題，這個問題是由于單獨注射成骨細胞懸浮液而造成的。本發明的另一個目的是提供一種用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分及其制備方法，當成骨細胞和纖維蛋白的混合物注射到骨結合部位時，進行外科手術只需一個最小的切口，通過筒單有效地注射成骨細胞和纖維蛋白的混合物獲得骨結合，利用放射線無需在相關受損區域切口。與本發明的一個方面一致，上述及其它目的通過提供一種制備用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分來實現，包括從骨組織中分離成骨細胞，在DMEM(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium)或者a-MEM(MinimumEssentialMedium,AlphaModification)中培養/增生分離的成骨細胞，制備成骨細胞懸浮液；及將成骨細胞懸浮液與凝固因子混合制備成骨細胞治療劑。其中，凝固因子是凝血酶和纖維蛋白原的混合物。其中，治療劑的制備步驟包括凍干的凝血酶溶解在液體DMEM或者cx-MEM中，將l-100IU/mL的溶解凝血酶與成骨細胞混合溶液混合；凍干的纖維蛋白原溶解在液體DMEM或者oc-MEM中，將20-100mg/mL的溶解纖維蛋白原與含有凝血酶的成骨細胞混合溶液混合。與本發明的另一個方面一致，提供了一種上述方法制備的成骨細胞成分，與現有技術相比，本發明具有以下優點與本發明一種用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分及其制備方法相一致，如上所述，能夠使骨移植，通過向骨結合的部位注射成骨細胞和纖維蛋白的混合物，無臨床移植排異，通過注射適合的一定程度的成分可以獲得有效、快速的骨結合，為了減輕由于注射的成骨細胞從骨結合區域逃逸而造成的非必要區域骨組織形成及成骨細胞通過血流增生的問題，這個問題是由于單獨注射成骨細胞懸浮液而造成的。另外，本發明可以使骨移植，當成骨細胞和纖維蛋白的混合物注射到骨結合部位時，進行外科手術只需一個最小的切口，通過簡單有效地注射成骨細胞和纖維蛋白的混合物獲得骨結合，利用放射線無需在相關受損區域切口。圖1是纖維蛋白聚合級聯作用圖；圖2是纖維蛋白基質聚合作用示意圖；圖3是本發明制備用于骨結合的半固體成骨細胞成分方法流程圖；圖4是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射纖維蛋白和成骨細胞混合物的照片；圖5是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射含有纖維蛋白和成骨細胞混合物的治療劑6周后的X光照片；圖6是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射含有纖維蛋白和成骨細胞混合物的治療劑6周后用蘇木精-曙紅染色的組織切片照片。圖7是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射纖維蛋白和成骨細胞混合物6周后用曼森氏三色法(Masson，sTrichrome)染色的組織切片照片。圖9是在回圏中消耗所剩余的反應電動勢突波曲線示意圖。具體實施方式本發明一種用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分及其制備方法將參考附圖做進一步詳細描述。為了克服骨相關錯亂和疾病傳統治療方法的不足，例如移植和骨移植，通過培育成骨細胞，自體成骨細胞移植技術作為最后的治療方法在受損部位無副作用，與傳統治療方法的改進共同發展。然而，為了獲得早期骨結合，需要將成骨細胞與基質混合來治療多種病變，因此，沒有分享治療的益處，注射僅僅由液體成骨細胞構成的成骨細胞懸浮液可能治療多種骨疾病。可以這樣說，含有成骨細胞和纖維蛋白混合物的半固體成骨細胞治療劑是一種更先進的基于細胞治療用于液體成骨細胞懸浮液注射方法的產品。傳統的液體成骨細胞懸浮液注射方法，包括單獨移植成骨細胞，僅僅可以治療有限類型的骨缺陷，并且要遭受一些由于注入的成骨細胞從骨形成位點逃逸，骨組織在非必要區域形成，及經過血流在其它位點增生的相關問題。相反地，本發明含有纖維蛋白的半固體成骨細胞治療劑由成骨細胞和纖維蛋白的混合物組成，因此可以快速有效地治療較大范圍的骨折和嚴重的骨疾病。具報道，纖維蛋白膠在動物模型中可以促進新血管形成(SchlagG.ClinicalOrthopedics,1988)，可有效提高在骨替換中用于移植方法的移植材料的適應性，例如去除礦物質的骨粉末、生物活性玻璃、羥磷灰石及珊瑚顆粒，用于移植手術的材料。另外，纖維蛋白膠是一種用于骨基質的有效生物活性劑運載工具。上述舉例的生物活性劑可以由TGF-卩-1(Transforminggrowthfactor-beta-1)和TGF-(3-relatedBMP(Transforminggrowthfactor-betarelatedBonemorphogeneticprotein)制備。最近，纖維蛋白膠作為有效傳遞細胞的基質組成材料在組織工程學的應用引起了大量關注(HuangQ.TissueEngineering2002)。纖維蛋白膠的上述特征導致了快速的骨結合過程，現有成分中包含成骨細胞和纖維蛋白膠作為基質材料，應用于骨結合。參考附圖，圖1是纖維蛋白聚合級聯作用圖，圖2是纖維蛋白基質聚合作用示意圖。為了骨折愈合，首先要固定骨折區域，及確保供給骨折區域區域足夠的血液和壓力。骨折一旦發生通常會伴隨其周邊的皮膚、肌肉、韌帶、血管神經和關節損傷。依據組織學，骨折康復過程包括三個階段發炎、修復和再造，這些階段是連續交疊不能嚴格區分的。發炎階段，骨折區域附近的骨基質、血管和軟組織，例如骨膜、肌肉，由于骨折引起的外傷也會損傷，導致骨膜下的髓腔血腫。壞死細胞釋放的炎癥衍生物導致血管舒張，血漿滲出，因此引起急性水腫。在發炎階段后，伴隨著新基質形成的開始轉換到修復階段。修復階段以骨折區域組織血腫開始。血肺形成纖維蛋白支架，接受修復細胞。然后，修復細胞中的生長因子或者在修復細胞中形成的其它蛋白導致細胞遷移和增生，構成修復基質，這是骨折復原的第一步。在骨折恢復階段，大多數細胞生成的骨組織與肉芽組織在骨折區域一起出現，形成胼胝體，月并胝體在骨折區域周圍由纖維組織、軟骨和編織骨組成。胼胝體的礦化作用由成骨細胞的一系列作用開始。由成骨細胞合成的基質包括大量規則間隔的I型膠原纖維，其可在本階段提供磷酸4丐絡合物沉淀的條件。然而，本修復階段不是骨結合完成的階段，從而導致不成熟骨折胼胝體具有較正常骨組織弱的骨強度。因此，在再造階段，這樣的骨折胼胝體獲得正常骨組織展示的強度。關于再造階段，在胼胝體內的編織骨由成熟的板層骨替換，非必要的過量的胼胝體被逐漸吸收。基于放射性同位素檢測的結果，入X光照片所示，在骨結合完成后，骨折區域功能完全回復正常狀態的一段時間內，骨折區域放射性同位素的活性增強。因此，再造階段在骨折臨床結合后要持續幾年。圖3是本發明制備用于骨結合的半固體成骨細胞成分方法的流程圖。參考圖3，制備用于骨結合含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分的方法，包括從骨組織中分離成骨細胞，在DMEM(Dulbecco，sModifiedEagle'sMedium)或者a-MEM(MinimumEssentialMedium,AlphaModification)中培育/增生分離的成骨細胞，制備成骨細胞懸浮液(S100);將上述成骨細胞懸浮液與凝固因子混合，制備成骨細胞治療劑(S200)。其中，凝固因子是凝血酶和纖維蛋白原的混合物。其中，制備治療劑的步驟包括將凍干的凝血酶溶解在液體DMEM或者cc隱MEM中，將濃度為1IU/mL-100IU/mL的溶解的凝血酶與成骨細胞混合溶液混合(S210);將凍干的纖維蛋白原溶解在液體DMEM或者oc-MEM中，然后將濃度為20-100mg/mL的溶解的纖維蛋白原與上述含有凝血酶的成骨細胞混合溶液混合(S220)。其中，凝血酶的濃度決定纖維蛋白聚合時間。因此，依賴凝血酶的濃度，纖維蛋白的聚合時間可由4小時降低到3秒鐘。凝血酶適用于濃縮本發明的成分，當該成分為了骨折結合而注射時，該成分適于阻止成骨細胞和凝固因子從受損部位泄漏，在受損區域注射該成分可以加速基質形成，形成用于骨形成的成骨細胞最佳蛋白纖維氣孔基質本發明實施例用于骨結合含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分的效果將結合附圖做進一步詳細說明。首先，從相關組織中分離成骨細胞，在DMEM或者a-MEM中培養4個星期，增生足夠數量的成骨細胞。然后，將上述成骨細胞懸浮于DMEM或者(x-MEM中，制備成骨細胞懸浮液。在室溫制備醫學級纖維蛋白膠，纖維蛋白原溶解在適量含有凍干纖維蛋白原的液體DMEM或者a-MEM中。另外，凝血酶溶解在適量含有凍干凝血酶的液體DMEM或者a-MEM中。向溶解的凝血酶中加入1/5體積的液體成骨細胞懸浮液，混勻。混有凝血酶的成骨細胞懸浮液與等量的纖維蛋白原混合，制備500^成骨細胞成分。30只新西蘭白兔，重約3kg，忽略性別，分成骨移植對照組和移植實驗組，實驗組使用用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分，每組15只兔子。根據Henry的方法，在兔的前臂制造縱向切口，從而暴露橈骨骨干，用鋸制造尺寸為15mm的骨損傷，完全去除骨損傷區域的骨膜。對照組，先從長骨收集松質骨，移植到骨損傷區域，然后縫合皮膚和皮200580049294.6說明書第7/8頁下組織。實驗組，小心縫合皮膚和皮下組織，骨損傷區域成為未用空間，3周后注射成骨細胞成分，如圖4所示。在實驗開始后的3，6和9周拍攝X光照片，骨結合用相關要點近端和遠端的骨切開術區域任務來評估，分別依賴于骨結合程度和獲得要點的數量。表l決定骨折缺口結合的方法<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2實驗組和對照組骨移植9周后結果<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>圖5是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射含有纖維蛋白和成骨細胞混合物的半固體成骨細胞治療劑6周后的X光照片，可以看出骨折完全結合。圖6是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射含有纖維蛋白和成骨細胞混合物的半固體成骨細胞治療劑6周后用蘇木精-曙紅染色的組織切片照片，可以看出單獨形成了骨島。圖7是在兔前臂大小為15mm的骨折部位注射纖維蛋白和成骨細胞混合物6周后用曼森氏三色法(Masson，sTrichrome)染色的組織切片照片，證實了膠原質沿著預訂方式伸長，展示了骨形成和血管形成進展(紅色橢圓形點線)。從而，本發明提供了無免疫排斥骨移植，當由于嚴重的骨折而使骨結合無法進行時，用成骨細胞與纖維蛋白混合，并將混合物注入受損部位用于骨結合，通過注射適合程度的成分，顯示了有效快速的骨結合效果。如前所述，本發明一種用于骨結合含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分及其制備方法，可以促進骨折再結合，向骨結合部位注射成骨細胞和纖維蛋白的混合物無臨床移植排斥，通過注射適合程度的成分可以有效、快速促進域骨組織形成及成骨細胞通過血流增生的問題，這個問題是由于單獨注射成骨細胞懸浮液而造成的。另外，本發明可以使骨折再結合，當成骨細胞和纖維蛋白注入到骨結合區域時，實施的外科手術只需最小的切口，通過成骨細胞和纖維蛋白混合物在相關受損區域利用》文射線，例如X射線，無切口簡單而有效的注射，獲得骨結合。盡管本發明的首選實施例揭示了發明目的，但是技術的改進、增加及替換仍在本發明的保護范圍內。權利要求1、一種制備用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分的方法，其特征在于，包括從骨組織中分離成骨細胞，在DMEM(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)或者α-MEM(MinimumEssentialMedium，AlphaModification)中培育/增生分離的成骨細胞，制備成骨細胞懸浮液；及將成骨細胞懸浮液與凝固因子混合，制備成骨細胞治療劑。2、根據權利要求1所述制備用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分的方法，其特征在于，凝固因子是凝血酶和纖維蛋白原的混合物。3、根據權利要求1所述制備用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分的方法，其特征在于，治療劑的制備步驟包括將凍干的凝血酶溶解于液體DMEM或a-MEM，然后將濃度為1-100IU/mL的凝血酶與成骨細胞混合溶液混合；及將凍干的纖維蛋白原溶解于液體DMEM或a-MEM,然后將濃度為20mg/mL_100mg/mL的纖維蛋白原與含有凝血酶的成骨細胞混合溶液混合4、由權利要求1所述制備用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分的方法，其特征在于，制備用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分的方法制備的成骨細胞成分。全文摘要本發明是有關于一種用于骨結合的含有纖維蛋白的半固體成骨細胞成分及其制備方法。該方法包括從骨組織中分離成骨細胞，在DMEM(Dulbecco’sModifiedEagle’sMedium)或者α-MEM(MinimumEssentialMedium，AlphaModification)中培育/增生分離的成骨細胞，制備成骨細胞懸浮液；及將成骨細胞懸浮液與凝固因子混合，制備成骨細胞治療劑。文檔編號A61K35/32GK101247814SQ200580049294公開日2008年8月20日申請日期2005年8月3日優先權日2005年6月13日發明者張在德,張晶皓,樸炫信,李璽邦,鄭修真,高暢權申請人:世源世龍股份有限公司