作為g蛋白－偶聯受體拮抗劑的環肽的制作方法

專利名稱：作為g蛋白－偶聯受體拮抗劑的環肽的制作方法
技術領域：
本發明涉及新型環狀的化合物，其具有調節G蛋白-偶聯受體活性的能力。這些化合物優選地作為拮抗劑。在優選的實施方案中，本發明提供了環狀的肽類和肽類似物C5a受體拮抗劑，其對多形核白細胞和巨噬細胞上的C5a受體具有活性。本發明的化合物為強活性的且具有選擇性，并可用于多種炎性疾病的治療。
背景技術：
所有的參考文獻，包括在本說明書中引用的任何專利或專利申請，這里都引入作為參考。但并不表示任何參考構成了現有技術。參考文獻的討論表述的是其作者聲稱的內容，但本申請者保留審查所引用文獻的正確性以及相關性的權利。應該清楚地理解，盡管這里參考料許多現有技術公開，但是這種參考并不表示這些文獻中的任何一種在澳大利亞或在任何其它的國家形成了本技術領域的通用知識。
G蛋白-偶聯受體在人體中廣泛分布，包括約60％的已知的細胞受體類型，并調節針對很寬范圍內源性配體的細胞跨膜的信號轉導。它們參與一系列生理和病理生理過程，包括但不限于與心血管、中樞及外周神經系統、生殖、代謝、消化、免疫炎性、以及生長失調以及其它細胞調節性和增殖性失調相關的過程。選擇性調節G蛋白-偶聯受體的藥物具有重要的治療應用。這些受體逐漸被認作重要的藥物靶標，由于其在信號轉導中的至關重要的作用(G protein-coupled Receptors，IBC Biomedical Library Series，1996)。
研究最為集中的G蛋白-偶聯受體之一為C5a受體。C5a為已知的最強活性的趨化劑之一，并將嗜中性粒細胞和巨噬細胞征集至損傷部位，改變其形態；誘導脫粒作用；增加鈣轉移、血管滲透性(水腫)以及嗜中性粒細胞粘附性；收縮平滑肌；刺激炎性介質的釋放，包括組胺、TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8、全列腺素以及白三烯以及溶酶體酶系的釋放；促進氧自由基的形成；并增加抗體的產生(Gerard和Gerard，1994).
C5a的過表達或下調參與免疫系統介導的炎性疾病的發病機理，例如在類風濕性關節炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、全身性紅斑狼瘡、組織移植排斥、缺血性心臟病、再灌注損傷、膿毒性休克、牛皮癬、齒齦炎、動脈粥樣硬化、阿耳茨海默(氏)病、肺損傷和體外透析后綜合征以及多種其他的疾病中(Whaley 1987；Sim 1993)。
限制C5a的促炎性作用的試劑具有抑制慢性炎癥以及其伴隨的疼痛和組織損傷的潛能。由于這些原因，防止C5a與其受體結合的分子可用于治療補體激活驅動的慢性炎性疾病。這些化合物也為補體介導免疫性機理的研究提供來了有價值的新的信息。
在我們的前述申請No.PCT/AU98/00490中，其所有公開這里引入作為參考，我們描述了一些人C5a碳-端類似物的三維結構，并利用這種信息設計了與人C5a受體(C5aR)結合的新化合物，作為C5a激動劑或拮抗劑。以前認為推定的拮抗劑可能同時需要C端精氨酸和C-端羧酸酯以滿足受體結合和拮抗劑活性(Konteatis等，1994)。在PCT/AU98/00490中，我們證實事實上對與C5aR的高親和力結合或對拮抗劑活性而言，末端羧酸酯一般并不是必須的。但我們發現目前還沒有意識到的結構特征，一種扭轉(turn)構型，是嗜中性粒細胞上人C5a受體高親和力結合的關鍵性識別特征。我們利用這種發現涉及了受限的結構模板，所述模板能使疏水基團聚集成疏水排列以與C5a受體相互作用。
通過考察在我們前述申請中活性最強的化合物中的每一個氨基酸殘基位置結構變化的效果，我們現在已經開發出人嗜中性粒細胞C5a受體環拮抗劑的其他實例，并鑒定出具有許多強C5aR拮抗劑活性的化合物。這些化合物各包括環狀骨架(scaffold)，其滿足在稍早PCT/AU98/00490申請中顯示的一般性三維結構需求，但我們已經發現某些取代基與環相連可以導致令人驚奇的最出乎意料的結果，產生高和低的拮抗劑活性，而這種情形不能由前述申請PCT/AU98/00490準確預測。這些令人驚奇的新發現使得我們提煉并更好地定義C5a受體拮抗活性地必須藥效團。這里描述的出乎意料的結構-活性關系有助于定義人多形核白細胞(嗜中性粒細胞)上的C5a受體拮抗活性的精細藥效團結構。該藥效團預期也適于人和哺乳動物其他細胞上的C5a受體。
發明概述本發明一方面提供了式I的環狀肽或類肽，其為G蛋白-偶聯受體拮抗劑的化合物，基本上沒有激動劑活性 其中A為H、烷基、芳基、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、NH-芳基、NH-酰基、NH-苯甲酰基、NHSO3、NHSO2-烷基、NHSO2-芳基、OH、O-烷基或O-芳基；B為烷基、芳基、苯基、芐基、萘基或吲哚基，或D-或L-氨基酸例如L-苯基丙氨酸或L-苯基甘氨酸的側鏈，但不為甘氨酸、D-苯基丙氨酸、L-高苯基丙氨酸、L-色氨酸、L-高色氨酸、L-酪氨酸或L-高酪氨酸的側鏈；C為小的取代基，例如D-，L-或高-氨基酸例如甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、或硫代脯氨酸的側鏈，但優選地不為體積大的取代基例如異亮氨酸、苯基丙氨酸，或環己基丙氨酸；D為中性D-氨基酸例如D-亮氨酸、D-高亮氨酸、D-環己基丙氨酸、D-高環己基丙氨酸、D-纈氨酸、D-正亮氨酸、D-高-正亮氨酸、D-苯基丙氨酸、D-四氫異喹啉、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、或D-酪氨酸的側鏈，但優選地不為小的取代基例如甘氨酸或D-丙氨酸的側鏈、大體積的平面側鏈例如D-色氨酸，或體積大的帶電側鏈例如D-精氨酸或D-賴氨酸；
E為體積大的取代基，例如選自L-苯基丙氨酸、L-色氨酸和L-高色氨酸的氨基酸的側鏈，或為L-1-萘基(napthyl)或L-3-苯并噻吩基丙氨酸，但不為D-色氨酸、L-N-甲基色氨酸、L-高苯基丙氨酸、L-2-萘基L-四氫異喹啉、L-環己基丙氨酸、D-亮氨酸、L-芴丙氨酸，或L-組氨酸的側鏈；F為L-精氨酸、L-高精氨酸、L-瓜氨酸，或L-刀豆氨酸的側鏈，或生物電子等排體，即，側鏈其中末端胍或脲基受限制，但是碳骨架被不同結構的替換，但是側鏈以整體的形式與靶蛋白的反應與母體基團的方式一樣；X為-(CH2)nNH-或(CH2)n-S-，其中n為1～4的整數，優選地2或3；-(CH2)2O-；-(CH2)3O-；-(CH2)3-；-(CH2)4-；-CH2COCHRNH-；或CH2CHCOCHRNH-，且其中R為任何常用或不常用的氨基酸的側鏈，條件是化合物不是下述的化合物1。
在C中，順式和反式形式的羥基脯氨酸和硫代脯氨酸都可以使用。
優選地A為乙酰胺基、氨基甲基或取代的或未取代的磺酰胺基。
優選地其中A為取代的磺酰胺，取代基為1～6，優選地1～4碳原子烷基鏈，或苯基或甲苯甲酰基基。
優選地G蛋白-偶聯受體為C5a受體。但是，我們發現我們早期申請的先導化合物對抗利尿激素和神經激肽受體也具有明顯的結合親和力，因此這些受體也包括在本發明的范圍之內。
在特別優選的技術方案中，化合物具有C5aR拮抗劑活性，并且沒有C5a激動劑活性。
本發明的環狀化合物優選地為拮抗劑人、哺乳動物細胞包括但不限于，人分葉核白細胞和人巨噬細胞上的C5a受體。本發明的化合物優選地強烈地且選擇性地與C5a受體結合，并更優選地在亞微摩爾濃度(sub-micromolar濃度)具有強拮抗劑活性。更優選地化合物地受體親和力IC50＜25μM，并且拮抗劑活性IC50＜1μM。
更優選地，化合物選自這里描述的2～6、10～15、17、19、20、22、25、26、28、30、31、33～37、39～45、47～50、52～58和60～70化合物。更優選的化合物為化合物33、化合物60或化合物45。
在本說明書中，術語“烷基”為直鏈、支鏈、或環狀、取代的或未取代的1～6，優選地1～4個碳原子的烷基鏈。更優選地，烷基為甲基。術語“酰基”為取代的或未取代的1～6，優選地1～4個碳原子酰基。更優選地酰基為乙酰基。術語“芳基”應理解為取代的或未取代的碳環或雜環芳基，其中所述環優選地為5或6員。
“常見”氨基酸為L-氨基酸，選自甘氨酸、亮氨酸、異高氨酸、纈氨酸、丙氨酸、苯基丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、蛋氨酸、精氨酸、賴氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和組氨酸。
“非常見”氨基酸包括但不限于，D-氨基酸、高-氨基酸、N-烷基氨基酸、脫氫氨基酸、除苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸以外的芳香氨基酸、鄰-，間-或對-氨基苯甲酸、鳥氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、正亮氨酸、δ-谷氨酸、氨基丁酸、L-芴基丙氨酸、L-3-苯并噻吩基丙氨酸以及α，α-二取代的氨基酸。
根據第二方面，本發明提供了一種包括本發明化合物以及可藥用載體或賦性劑的組合物。
本發明的組合物可配制成適于口服、腸胃外、吸入、鼻內、透皮或其他局部應用，但優選口服或局部應用。對于局部應用，可使用溶媒例如二甲基亞砜(sulphonate)或丙二醇。取決于處理的組織表面，可優選其他溶劑。
可以預期絕大多數如果不是所有的本發明化合物在代謝酶的存在下穩定，例如消化刀、血液、肺的那些酶或細胞內酶。所述穩定性可用本技術領域普通技術人員公知的常規方法很方便地進行測定。
通過任何期望的途徑給藥的合適制劑可用標準的方法制備得到，例如參考公知的教材例如RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，Vol.II，2000(20th edition)，A.R.Gennaro(ed)，Williams & Wilkins，Pennsylvania。
第三方面，本發明提供了一種治療G蛋白-偶聯受體介導病理疾病的方法，包括對需要這種治療的哺乳動物或脊椎動物施用有效量的本發明的化合物。
優選地G蛋白-偶聯受體介導的疾病為C5a受體介導的疾病，并更優選地涉及C5a的過表達或表達下調。這些疾病包括但不限于類風濕性關節炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、全身性紅斑狼瘡、組織移植排斥、缺血性心臟病、再灌注損傷、膿毒性休克、齒齦炎、纖維癥、動脈粥樣硬化、多發性硬化癥、阿耳茨海默(氏)病、哮喘、癡呆、中樞神經系統疾病、肺損傷、體外透析后綜合征、以及皮膚炎性疾病例如牛皮癬、濕疹和接觸性皮炎。
在優選的實施方案中，疾病為類風濕性關節炎。
在第二優選的實施方案中，所述疾病為再灌注損傷。在第二實施方案中，應該很清楚地理解，不適用式I的限制性條件。
盡管本發明沒有以任何方式限制到治療任何具體的動物或種屬，特別地預期本發明化合物可用于人的醫學治療，并也可用于獸醫治療，特別是相伴動物例如貓和狗，家畜例如牛、馬和羊，以及動物園動物，包括非人靈長類、大的牛科動物、貓科動物、碲類動物和犬科動物。可以治療的其他物種包括爬行類、魚類或兩棲類動物。
本發明化合物可以任何合適的劑量和任何適合的途徑進行給藥。口服、局部、透皮或鼻內給藥為優選的給藥方式，因為這些途徑具有更強的便利性以及可接受性。局部應用也可包括制劑例如子宮托或陰道或直腸栓給藥或水性滴劑用于對耳或眼睛局部給藥。有效劑量將取決于治療疾病的特性、以及治療個體的年齡、體重以及潛在的健康狀況。這可由醫師或獸醫進行判斷。利用本領域公知的方法很容易通過反復試驗進行確定合適的劑量水平。
在本發明中，應該清楚地理解術語“包括”意思為“包括但不限于”，并且術語“包括”具有相應的含義。
附圖簡述

圖1顯示靜脈內(A)、口服(B)和局部(C)AcF-[OPdChaWR]以及適當對照(D)施用對皮膚阿蒂斯反應相關聯的脈管滲漏的抑制。
圖2顯示了靜脈內(A)、口服(B)和局部(C)AcF-[OPdChaWR]以及適當的局部對照(D)施用對皮膚阿蒂斯反應關聯的循環TNFα升高的抑制情況。
圖3顯示靜脈內、口服和局部AcF-[OPdChaWR]應用后皮膚阿蒂斯反應相關聯的病理指數的下降。
圖4顯示C5a拮抗劑對消化道缺血-再灌注誘導的腸水腫的效果。
圖5顯示C5a拮抗劑對消化道缺血-再灌注誘導的嗜中性白血球減少的效果。
圖6顯示C5a拮抗劑對消化道缺血-再灌注誘導的血清TNFα上升的效果。
圖7顯示C5a拮抗劑對消化道缺血-再灌注誘導的血清觸珠蛋白升高的效果。
圖8顯示C5a拮抗劑對消化道缺血-再灌注誘導的天冬氨酸轉氨酶的效果。
圖9顯示C5a拮抗劑對消化道缺血-再灌注的組織病理的效果。
圖10顯示在第2天到+14天經口施用AcF-[OPdChaWR]對關節炎性右膝關節腫脹的抑制。
圖11顯示對右膝關節關節灌洗液中TNF-α和IL-6水平的抑制。“未處理”表示動物未用AcF-[OPdChaWR]處理，但是右膝在致敏后用抗原刺激。
圖12顯示皮膚應用3D53的DMSO/蒸餾H2O或PG/H2O溶液在15分鐘之內在循環血漿中出現C5a拮抗劑，并且明顯的水平持續至少4小時。點代表每組中(n＝6-8)的平均值±SEM。
圖13顯示局部應用C5a拮抗劑對C5a-誘導的嗜中性白血球減少的抑制。結果以時間0點基線的百分變化進行表述。
圖14顯示局部應用C5a拮抗劑抑制大鼠中靜脈內注射LPS的全身作用。數據標明施用多種C5a拮抗劑，或者通過i.v.(1mg/kg)，或皮膚局部應用(50mg/kg總應用劑量溶劑載體50％DMSO/50％H2O)，抑制i.v.LPS(1mg/kg)引起的嗜中性白血球減少。(a)3D53(化合物1)；(b)化合物45；(c)化合物17。
圖15顯示C5a拮抗劑AcF-[OPdChaWR]在大鼠再灌注過程中對下列指標血清水平增加的影響(A)肌酸激酶(CK)和(B)乳酸脫氫酶(LDH)。數據為平均值±SEM(n＝6-10)。*P＜0.05所有的藥物處理組vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05所有的藥物處理組vs.假手術。
圖16顯示C5a拮抗劑，AcF-[OPdChaWR]在再灌注后2、3和4小時對大鼠中下列指標血清水平增加的影響(A)丙氨酸轉氨酶(ALT)和(B)天冬氨酸轉氨酶(AST)。數據為平均值±SEM(n＝6-10)。*P＜0.05所有的藥物處理組vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05所有的藥物處理組vs.假手術。
圖17顯示大鼠中下列指標的水平(A)循環PMNs、(B)肌肉髓過氧化物酶(MPO)、(C)肺MPO和(D)肝臟MPO。水平為試驗完成后在大鼠上測得。數據為平均值±SEM(n＝4-10)。*P＜0.05vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05vs.假手術。
圖18顯示在試驗結束時取得的大鼠肝臟勻漿樣品中的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。數據為平均值±SEM(n＝4-10)。*P＜0.05vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05vs.假手術。
圖19顯示試驗結束時大鼠后肢肌肉的水腫(濕重-干重比)量。數據為平均值±SEM(n＝4-10)。*P＜0.05vs.缺血/再灌注(I/R)-只有；P＜0.05vs.假手術。
發明詳述通常，術語″治療″等這里用來指影響研究對象、組織或細胞得到需要的藥理和/或生理效果。效果可為預防性的，全部或部分地預防疾病或征兆或癥狀，以及和/或為治療性地，部分或全部治愈疾病。這里所用的″治療″包含脊椎動物、哺乳動物，特別是人中的任何的疾病的治療或預防，并包括預防傾向于患病并且診斷還沒有患病的研究對象中疾病的發生；抑制疾病，即，終止其發展；或疾病的減輕或改善作用，即引起疾病作用的轉歸。
本發明包括用于改善疾病的多種藥物組合物。根據本發明的一種實施方案的藥物組合物通過將式I化合物、類似物、衍生物或其鹽以及一種或多種藥物活性物質式I化合物與一種或多種藥物活性物質的組合用載體、賦性劑和添加劑或佐劑一起制備成適合對研究對象給藥的形式而進行制備。
經常施用的載體或佐劑包括碳酸鎂、二氧化鈦、乳糖、甘露醇以及其他糖類、滑石粉、乳蛋白、明膠、淀粉、維生素、纖維素及其衍生物、動植物油、聚乙二醇以及溶劑，例如無菌水、乙醇、甘油以及多羥基醇類。靜脈內溶媒包括液體和營養補充劑。防腐劑包括抗菌劑、抗氧化劑、螯合劑以及惰性氣體。其他的可藥用載體包括水性溶劑、無毒性賦性劑，包括鹽類、防腐劑、緩沖劑等，如例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，20th ed.Williams& Wilkins(2000)和The British National Formulary 43rd ed.(British MedicalAssociation and Royal Pharmaceutical Society of Great Britain，2002；http//bnf.rhn.net)中所描述的，其內容這里引入作為參考。可藥用組合物的pH以及各種成分的確切濃度根據本領域普通技術常規進行調節。參見Goodmanand Gilman′s The Pharmacological Basis for Therapeutics(7th ed.，1985)。
可藥用組合物優選地以單位劑量進行制備和給藥。固體單位劑量包括片劑、膠囊以及栓劑。對研究對象進行治療的時候，依據化合物的活性、給藥方式、疾病的性質以及嚴重程度、對象的年齡以及體重，可以使用不同的劑量。在某些情況下，更高或更低的日劑量是合適的。日劑量的給藥可下述方式實現通過單個單位劑量的單次給藥或數個更小劑量單位給藥，以及也可以通過在特定的時間間隔多次施用細分劑量。
本發明的藥物組合物可以治療有效量進行局部或全身給藥。用于這種用途的有效量當然地取決于疾病的嚴重程度以及研究對象的體重以及一般狀況。典型地，體外使用的劑量將為原位施用組合物的量有用的指導，并且動物模型可用來判斷治療細胞毒性副作用的有效劑量。在Langer，Science，2491527，(1990)中描述了多種需要考慮的因素。口服應用的制劑可為硬明膠膠囊的形式，其中所述活性成分與惰性固體稀釋劑，例如，碳酸鈣、磷酸鈣或高嶺土進行混合。其也可為軟明膠膠囊的形式，其中所述活性成分與水或油介質例如花生油、液體石蠟或橄欖油混合。
水性懸浮劑通常包含活性物質以及適于制備水性懸浮劑的賦性劑。這些賦性劑可為助懸劑例如羧甲基纖維素鈉、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、藻酸鈉、聚乙烯吡咯烷酮、黃蓍膠以及阿拉伯樹膠；分散或潤濕劑，其可為天然存在的磷脂例如卵磷脂；(b)亞烷基氧化物與脂肪酸的縮合物，例如，硬脂酸聚氧乙烯酯；(c)環氧乙烷與長鏈脂肪醇的縮合產物，例如heptadecaethylenoxy十六烷醇；(d)環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇的部分酯的縮合產物，例如聚氧乙烯山梨醇單油酸酯，或(e)環氧乙烷與衍生自脂肪酸和己糖醇酐的部分酯的縮合產物，例如聚氧乙烯山梨聚糖單油酸酯。
藥物組合物可為無菌注射水性或油性懸浮液的形式。所述懸浮劑可依照已知的方法進行配制，利用合適的分散或潤濕劑以及助懸劑例如上面述及的那些。無菌注射制劑也可為在無毒性腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑無菌注射溶液或懸浮液，例如，1，3-丁二醇溶液。在可用的可接受的溶媒和溶劑中，有水、Ringer氏溶液以及等張氯化鈉溶液。此外，無菌、固化油通常用作溶劑或懸浮介質。為了這種目的，可使用任何溫和的固化油，包括合成的甘油單酯或甘油二酯。此外，脂肪酸例如油酸可用于注射制劑。
式I化合物可以脂質體給藥系統進行給藥，例如小單層脂質體、大單層脂質體以及多層脂質體。脂質體可由多種磷脂例如膽固醇、十八烷酰胺或磷脂酰膽堿形成。
本發明式I化合物的劑量水平一般為約0.5mg～20mg千克體重的水平，優選的劑量水平為約0.5mg～約10mg千克體重每天(為約0.5g～約3g每人每天)。可與載體物質混合制備單一劑量的活性成分的量將根據要處理的宿主以及具體的給藥途徑而變化。例如，人口服制劑可包含約約5mg～1g的活性化合物以及適當量方便量的載體物質，后者可在約5～95％總組合物的范圍內變化。單位劑量形式通常包含約5mg～500mg活性成分。
但是，應該理解為具體的劑量水平將取決于多種因素包括具體使用化合物的活性、年齡、體重、健康狀況、性別、飲食、給藥時間、給藥途徑、排除速率、藥物組合以及進行治療的具體疾病嚴重程度。
此外，一些本發明化合物將與水或常見的有機溶劑形成溶劑合物。這些溶劑合物包括在本發明范圍之內。
本發明的化合物還可與其他化合物組合以提供有效的組合。因此包括藥物活性成分與本發明式I化合物的任何化學兼容的組合。
應該清楚地理解為前述有關藥物制劑、給藥途徑、劑量水平等論述同等地適用于化合物1。
這里使用的縮寫如下
在說明書中，常規的單字母和三字母代碼用來表示氨基酸。
術語“3D53”和“PMX53”是同義詞，并表示化合物Ac-Phe-[Om-Pro-dCha-Trp-Arg]；術語“LP-10”和“PMX-201”是同義詞，并表示化合物Ac-Phe-[Om-Pro-dCha-Trp-Cit]；以及術語“LP-16”和“PMX-205”是同義詞，并表示化合物HC-[Orn-Pro-dCha-Trp-Arg]，其中“HC”表示氫化肉桂酰基(hydrocinnamate)。
本發明現在只參考下述一般性方法以及實驗例進行描述。
我們發現目前已經測試的所有式I化合物具有廣泛的類似的藥理活性，與化合物1(這里也指為3D53或PMX53)的活性類似，盡管單個具體化合物的物理化學性質、活性以及生物利用度隨具體的取代基有一定程度的變化。因此，我們預期化合物1得到的體外或體內結果可以適當地預測在相應分析中式I化合物的活性。
一般方法保護的氨基酸和樹脂得自Novabiochem。TFA、DIPEA和DMF(肽合成級)購自Auspep。所有其他的物質為試劑級，除非另有說明。制備級別的反相HPLC制備在Vydac C18反相柱(2.2×25cm)上進行，并且分析性反相HPLC分離在Waters Delta□Pak PrepPak C18反相柱(0.8×10cm)上進行，利用溶劑A＝水/0.1％TFA和溶劑B＝水10％/乙腈90％，0.09％TFA的梯度混合物。肽的分子量用電噴霧質譜測定，在三重四極質譜儀(PE SCIEX API III)上記錄，如(Haviland等，1995)中所述。1H-NMR譜在Bruker ARX 500MHz或Varian Unity 400譜儀上記錄。質子歸屬利用2D NMR實驗(DFCOSY。TOCSY，NOESY)進行判斷。
化合物通過質譜和反相分析性HPLC進行分析。
化合物合成線性肽序列通過本技術領域人員公知的手工逐步標準的固相肽合成(SPPS)技術進行制備。氨基酸或肽端HBTU用DIEA進行原位中和。偶聯用標準的定量茚三酮測定進行監控。利用Boc化學進行氨基酸的臨時的Nα-保護，用TFA處理2次1分鐘去除Boc基團。肽在NovabiochemBoc-D-Arg(Tos)-PAM或Boc-L-Arg(Tos)-PAM樹脂上進行合成，取代值為約0.2-0.5mmol/g。用液體HF(10mL)、對甲酚(1mL)在-5℃處理1-2小時將肽完全脫保護丙裂解。肽用反相HPLC(例如梯度0％B～75％B，60分鐘)純化并經電噴霧質譜經分析。
或者，線性肽可用Fmoc化學進行合成，利用HBTU/DIEA活化Fmoc-D-Arg(Mtr)-Wang樹脂。Fmoc基團的去除利用50％哌啶/DMF處理2個1分鐘。裂解和脫保護使用95％TFA/2.5％TIPS/2.5％H2O得到Mtr-保護的肽，可用RP-HPLC純化。
環化線性肽的一般步驟涉及將肽(1當量)和BOP(5當量)溶解在DMF(10mM肽濃度)中，并劇烈攪拌，然后加入DIEA(15當量)。盡管在絕大多數情況下反應在2小時內完成，一般將溶液室溫攪拌過夜。在高真空30℃下在旋轉蒸發儀上除去DMF，然后經RP-HPLC純化。對于包含游離N端的環狀肽，將Fmoc基團用作環化步驟中臨時的N-端保護基。在高真空30℃下在旋轉蒸發儀上除去DMF，并且然后將肽用30％哌啶/DMF室溫處理1小時以除去Fmoc基團。然后高真空除去溶劑，并經RP-HPLC純化。下面描述了代表性的環肽的合成。
NMR結構測定在Varian Unity 400譜儀在24℃參照溶劑測定測試化合物(3mg的750μl d6-DMSO溶液，δ2.50)的1H-NMR譜。二維1H□NMR NOESY(馳豫接力2.0s，混合時間50-300ms)，DFQ□COSY和TOCSY(混合時間75ms)實驗以相靈敏的模式獲得并記錄。對所有實驗，獲得時間＝0.186s，譜寬＝5500Hz，復合點數(t1維)＝1024。數據及進行零填充并且在二維方向傅立葉轉換成1024實點。
化合物1的NMR數據利用TRIAD軟件(Tripos Assoc.)在SiliconGraphics Indy工作站上進行處理。將2DNOE交叉峰進行積分并表征為強(1.8-2.5)、中(2.3-3.5)以及弱(3.3-5.0)。從上和下距離限制編目利用Diana2.8(69距離限制，包括對相鄰殘基27以及更遠6)利用剩余二面角限制(REDAC)策略計算初步的三維結構。利用MARDIGRAS精確地計算上和下距離限制。在本階段，檢查肽可能存在的氫鍵，并將其添加為距離限制。將50個最低能量Diana結構進行有限分子動力學(RMD)以及能量最小化(REM)。最初，REM由50步最速下降組成，然后100步成對梯度最小化。RMD通過將結構加熱至300K刺激1ps，然后500K刺激1ps進行。用2ps將溫度逐漸降至300K最后在200K保持2ps。用50步最速下降，200步成對梯度然后300步Powell最小化執行REM。檢查最后的結構以得到相對于骨架重原子(N、Cα和C具有平均成對rms差異。50個結構的20個對所有骨架原子(O，N，C)具有平均rmsd＜0.5。
受體-結合分析分析按照下述方法進行，用新鮮的人PMNs，如以前所述(Sanderson等，1995)的方法分離得到，利用緩沖液50mM HEPES、1mM CaCl2，5mMMgCl2、0.5％牛血清白蛋白、0.1％桿菌肽以及100μM苯基甲基磺酰氯(PMSF)進行。在4℃分析中，將緩沖液、未標記的重組人C5a(Sigma)或肽、Hunter/Bolton標記的125I-C5a(～20pM)(New England Nuclear，MA)以及PMNs(0.2×106)依次加入到Millipore Multiscreen分析板(HV 0.45)中，終體積為200μL/孔。4℃孵育60分鐘后，過濾樣品并將板用緩沖液洗滌1次。將濾器干燥，沖壓并在LKBγ計數器終計數。非特異性結合通過包含1mM肽或100nM C5a進行評價，一般為總結合的10-15％。
利用非線性回歸和用Dunnett post-test統計進行數據分析。
利用髓過氧化物酶釋放分析評價拮抗劑活性細胞的分離如以前所述(Sanderson等，1995)并與細胞松弛素B孵育(5μg/mL，15分鐘，37℃)。將包含0.15％明膠和肽的Hank′s平衡鹽溶液加到96孔板(總體積100μL/孔)中，然后加入25μL細胞(4×106/mL)。為了評價各肽拮抗C5a的能力，將細胞與各肽在37℃孵育5分鐘，然后加入C5a(100nM)并繼續孵育5分鐘。然后將50μL磷酸鈉(0.1M，pH 6.8)加到各孔中，將板冷卻到室溫，并將25μL等體積的二甲氧基對二氨基聯苯(5.7mg/mL)和H2O2(0.51％)的新鮮混合物加入到各孔中。在10分鐘的時候加入2％疊氮鈉終止反應。在Bioscan 450板讀取器上測定450nm處的吸光度，相對于對照值(無肽)進行校正，并通過非線性回歸進行分析。
消炎活性的體內分析下述公知的體內分析體系用來評價本發明化合物的消炎活性。用非線性回歸分析和Student’s t-檢驗、變量分析方法分析所有的分析數據，p＜0.05作為具有顯著意義的臨界水平。
(a)角叉(菜)膠爪水腫對麻醉的(腹腔注射氯胺酮和甲苯噻嗪)Wistar大鼠(150-200g)或小鼠注射無菌空氣(第1天20ml，第4天10ml)進入背部的皮下組織。6天后可以使用形成的腔，將角叉(菜)膠(2ml，1％w/w的0.9％鹽水溶液)注射到空氣袋中，10小時后收集流出液。第6天后每天施用測試化合物，并通過空氣袋流出液中的細胞差分計數分析它們的消炎效果。注射后的合適的時間處死動物，并用2ml的0.9％鹽水灌洗空腔；灌洗液轉移到肝素化的管中并用血細胞計數器和Diff-Quik染色細胞離心制劑對細胞進行計數。
或者，通過足部注射注射角叉(菜)膠在Wistar大鼠中發展的常規的角叉(菜)膠爪水腫可用來引起水腫，后者在2小時內可見，在4小時發展到極限。測試化合物在炎性原(inflammagen)前40分鐘施用，并通過2和4小時后的爪的微彎腳器測定評價其效果。參見Fairlie，D.P.等(1987)。還參見Walker和Whitehouse(1978)。
(b)佐劑誘發的關節炎。
在大鼠(3系)中誘導佐劑誘發的關節炎，通過免疫(注射熱滅活的結核分支桿菌Mycobacterium tuberculosis)或化學(用avridine)方法，通過與油性溶媒一起在尾部接種佐劑，例如Freund氏佐劑(參見Whitehouse，M.W.，Hahdbook of Animal Models for the Rheumatic Diseases，Eds.Greenwald，R.A.；Diamond，H.S.；Vol.1，pp.3-16，CRC Press)。
在13天內，佐劑誘發的關節炎顯示為尾部的局部炎癥以及潰瘍、所有四爪的總體腫脹、爪和耳朵的炎性損傷、體重下降以及發熱。這些癥狀，與人體中的那些炎性疾病類似(Winter和Nuss，1966)，可用藥物例如消炎痛或環孢霉素減輕，在人中也顯示處有益的效果(例如Ward和Cloud，1966)。在第14天不用藥物處理，關節炎大鼠將出現爪肥大、白蛋白減少以及血清中上升的急性階段反應蛋白，以及外源性物質的肝代謝下降，顯示為延長的巴比妥-誘導的睡眠時間。
為了評價化合物的活性，在用關節炎原接種(第0天)后的第10～13天，將化合物經口(≤10mg/kg/天)或腹膜內(腹腔注射)給藥4天。如果化合物具有活性，或者炎癥不可見，或尾部或前爪的炎癥顯著減輕，用微卡鉗測量爪厚度以及尾部體積進行評估，以及炎性損傷的總體檢查。在第18天，將動物通過頸部錯位處死，除非沒有關節炎癥狀，在這期間在得到倫理委員會允許的基礎上繼續觀察。實驗交錯排列以使通量最大化，在進行化合物之間的早期比較。這種常規分析被認同為確證用于人體的抗炎劑的方法。
藥代動力學雌性和雄性Wistar大鼠(200-250g)用1mL的zoletil(50mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg；Lyppard，Australia)進行麻醉，經腹膜內注射。在大鼠的下腹部區域剃出5×10cm的區域并作記號，在該區域應用藥物劑量。包含10mg/ml的C5a拮抗劑儲存液以各種濃度的水溶解在溶劑丙二醇或二甲基亞碸中，并用抹刀均勻地涂抹在大鼠的剃毛的腹部區域。用加熱墊來保持大鼠的體溫，并在第1小時每隔15分鐘采集血液樣品，之后每1小時采集1次共3小時。
立即將血樣品加入到包含肝素(500單位/μL)管中并離心(11000xg)。取出各樣品的血漿層并在-20℃儲存。加入氘代的內標2H3CO-F-[OPdChaWR]50μL，5μg/mL的50％乙腈/水溶液)并渦旋。將樣品進一步用高效液相色譜(HPLC)級的乙腈進行1∶3稀釋并快速渦旋(20sec)，然后離心(11000xg)。該方法導致樣品中大血漿蛋白沉淀，并將藥物從血漿中完全萃取出來。樣品的液體部分放置在1mL Eppendorf管中并儲存待分析。
這些樣品轉移至96孔板中并用GeneVac離心蒸發器蒸發至干，然后用流動相重建于孔(20μL)中。樣品的分析用液相色譜(LCMS)進行，利用裝配有多孔板自動進樣器和PE Sciex Qstar Pulsar ESI-TOF質譜儀的Agilent 1100series HPLC。從藥物內標標準峰面積比的標準曲線確定濃度。標準的制備通過將適當量的藥物以及內標加入到未處理的大鼠血漿中，并用與實驗樣品同樣的方法進行提取和制備。
實施例1環狀化合物的合成環肽AcF-[OPdChaWR](1)的合成。線性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Trp-Arg以0.20mmole規模用Boc化學方法進行合成，利用HBTU/DIEA活化并在Boc-L-Arg(Tos)-PAM樹脂(338mg，SV＝0.591mmol/g)進行原位中和。樹脂(457mg)的裂解和脫保護通過將樹脂用HF(10ml)和對甲酚(1ml)在-5～0℃處理1-2小時而實現，得到粗肽(160mg，90％)。環化涉及將粗肽(41mg，45μmol)、BOP(126mg，0.28mmol)和DIEA(158μL，0.9mmol)在DMF(57mL)中攪拌15小時。真空去除溶劑并將環狀肽經rpHPLC純化(18.8mg，47％)Rt＝10.8分鐘(梯度70％A/30％B～0％A/100％B，30分鐘)。MS[M+H]+(計算值)＝896.5，[M+H]+(實驗值)＝896.5。
環狀AcF-[OPdPheWR](33)的合成。線性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dPhe-Trp-Arg用Boc化學方法利用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Boc-L-Arg(Tos)-PAM樹脂上進行合成。樹脂的裂解和脫保護通過將樹脂用HF(10ml)和對甲酚(1ml)在-5～0℃處理1-2小時而實現，得到粗肽。環化涉及將粗肽(85mg)、BOP(200mg)和DIEA(222μL)在DMF(10mL)中攪拌15小時。真空去除溶劑并將環狀肽經rpHPLC純化(31mg)Rt＝16.7分鐘(梯度70％A/30％B～0％A/100％B，30分鐘)。MS[M+H]+(計算值)＝890.5，[M+H]+(實驗值)＝890.5。
環狀AcF-[OPdChaFR](60)的合成。線性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-Phe-Arg用Boc化學方法利用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Boc-L-Arg(Tos)-PAM樹脂上進行合成。樹脂的裂解和脫保護通過將樹脂用HF(10ml)和對甲酚(1ml)在-5～0℃處理1-2小時而實現，得到粗肽。環化涉及將粗肽(104mg)、BOP(57mg)和DIEA(103μL)在DMF(1mL)中攪拌15小時。真空去除溶劑并將環狀肽經rpHPLC純化(52mg)。Rt＝11.37分鐘(梯度70％A/30％B～0％A/100％B，15分鐘)。MS[M+H]+(計算值)＝857.5，[M+H]+(實驗值)＝857.4。
環肽AcF-[OPdCha(N-Me-Phe)R](64)的合成。線性肽Ac-Phe-Orn-Pro-dCha-(N-Me-Phe)-Arg-OH用Fmoc化學進行合成，利用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Novabiochem的Fmoc-L-Arg(pbf)-Wang樹脂(0.35mmol/g)上進行，利用甲基-L-Phe(281mg，2當量)、Fmoc-dCha(275mg，2當量)、Fmoc-Pro(472mg，4當量)、Fmoc-Orn(Boc)(477mg，3當量)、Fmoc-Phe(542mg，4當量)和Ac2O(4當量)。樹脂的裂解和脫保護通過用95％TFA(15mL)處理樹脂1小時而實現，乙醚沉淀后得到粗肽(150mg)。環化涉及將rpHPLC純化的肽(100mg)、BOP(200mg)和DIEA(222μL)在DMF(2mL)中攪拌4小時。真空去除溶劑并將環狀肽經rpHPLC純化(50mg)Rt＝33分鐘(梯度70％A/30％B～0％A/100％B，30分鐘)。MS[M+H]+(計算值)＝871.5，[M+H]+(實驗值)＝871.5。
環肽AcF-[{Orn-(δN-Me)}PdChaWR](66)的合成。Boc-(δN-Me-Orn)-OH按照報道的方法(Pol.J.Chem.1988，62，257-261)進行合成。線性肽Ac-Phe-[Om-(δN-MeCbz)]-Pro-dCha-Trp-Arg-OH利用Boc化學進行合成，用HBTU/DIEA活化以及原位中和在Novabiochem Boc-L-Arg(tosyl)Pam樹脂(0.41mmol/g)上進行。將樹脂用HF/對甲苯酚處理2小時實現樹脂的裂解和脫保護，用乙醚沉淀后得到粗肽。環化涉及將RP-HPLC純化的肽(100mg)、BOP(200mg)和DIEA(222μL)在DMF(2mL)中攪拌4小時。真空去除溶劑，并將環狀肽經rpHPLC純化。Rt＝11.5分鐘(35％B)。MS[M+H]+(計算值)＝910.5，[M+H]+(實驗值)＝910.5。
純化及表征粗肽用制備性rp-HPLC利用Vydac C18反相柱(2.2×25cm)純化。使用1mL/分鐘的溶劑A～溶劑B梯度并在214nm檢測。收集級分并用離子噴霧質譜(ISMS)測定正確的分子量，用分析性rp-HPLC檢測純度，在WatersDelta-Pak PrepPak C18反相柱(0.8×10cm)(變化 梯度例如0～75％B，60分鐘)上進行。乙腈為HPLC級(BDH Laboratories)且TFA為合成級(Auspep)。
表1顯示了用來制備環狀化合物1-70的反應實例，以及它們用電噴霧質譜(Mass Spec Found)以及在指定洗脫條件下反相HPLC(rp-HPLC)保留時間(Rt分鐘)的表征。
表2描述了各個化合物的結構，并列出了它們用髓過氧化物酶分析測量各自的對人分葉核白細胞(嗜中性粒細胞)上C5a受體的受體結合親和力以及拮抗劑活性。
表1表2中所列環狀化合物的合成和表征總結
*Tyr-O-芐基為使用的氨基酸，但是產物涉及重排成芐基取代基取代的間-C-取代酪氨酸(見化合物70的結構)。
實施例2環狀化合物的拮抗劑活性表2顯示了實施例1中合成的化合物的結構，以及它們各自用髓過氧化物酶分析測定的對人分葉核白細胞(嗜中性粒細胞)C5a受體的受體結合親和力和拮抗劑活性。
化合物1-9、16-18、20、21、23、24、27-32、36、38、44、51和59包括在我們較早專利申請PCT/AU98/00490公開的結構通式的寬范圍內。但是，表2證實事實上，在這些化合物中，只有1-6、17、20、28、30、31、36和44對人嗜中性粒細胞C5a受體具有可觀的拮抗劑活性(IC50＜1μM)。其他化合物，7-9、16、18、21、23、24、27、29、32、38、51以及59沒有顯示可觀的拮抗劑活性和/或受體親和力，在所有的情況下IC50＞1μM。
另一方面，化合物10-15、19、22、25、26、33-35、37、39-43、45、47-50、52-58以及60-70沒有包括在PCT/AU98/00490范圍內，盡管它們的確涉及與所述申請中公開的相同或類似的環狀骨架。表2顯示了這些新化合物中，10-12、14、15、25、33、35、40、45、48、52、58、60、66和68-70具有可觀的拮抗劑活性(IC50＜1μM)。然而，其他的化合物(13、19、22、26、34、37、39、41-43、47、49、50、53-57、61-65和67)沒有顯示可觀的拮抗劑活性和/或受體親和力，在這些情況下，IC50＞1μM。
表2中的這些結果使我們能夠進一步定義并提煉C5a受體拮抗劑活性所需要的活性藥效團的限制條件，以得到或預測亞微摩爾活性的拮抗劑。
表270個C5a受體環狀拮抗劑的實例的結構以及對人分葉核白細胞的活性C5aR拮抗劑實例





“C5a結合IC50”指與人PMNs實現50％最大結合所需要的化合物濃度。“C5a拮抗劑IC50”指實現50％拮抗從C5a-刺激的人PMNs髓過氧化物酶釋放所需要的化合物濃度。框中的區域表示結構之間相對變化的位置。化合物1為從我們前述申請PCT/AU98/00490中得到的先導化合物，這里也包括用于比較。
實施例3環狀C5a拮抗劑這些環狀拮抗劑以及它們明顯的受體-結合親和力和拮抗劑活性的一些實例顯示在3中，其中使用了單字母來表示氨基酸。“d”表示氨基酸的右旋(D)形式。“ND”表示沒有測定。
表3作為C5a拮抗劑的新化合物
Ms＝甲磺酰基，Ts＝甲苯磺酰基，MeSuc＝甲基琥珀酸酯，Suc＝琥珀酸酯，Ahx＝6-氨基己酸酯，HPhe＝高苯基丙氨酸，Phg＝苯基甘氨酸，HC＝氫化肉桂酰胺基(Hydrocinnamate)ND＝未測定
Hyp＝反式-羥基脯氨酸，Thp＝順式-硫代脯氨酸
Aic-氨基茚滿羧酸Tic-四氫異喹啉dhCha-D-高環己基丙氨酸
hPhe＝高苯基丙氨酸，2Nal＝2-萘基丙氨酸，1Nal＝1-萘基丙氨酸，Bta＝苯并噻吩基丙氨酸，Flu＝芴基丙氨酸，Tyr-O-烷基＝酪氨酸的O-烷基化類似物。Tic＝四氫異喹啉
Can＝L-刀豆氨酸，Cit＝瓜氨酸，hArg＝高精氨酸
1Nal＝1-萘基丙氨酸，Dap＝2，3-二氨基丙酸，dPhe＝D-苯基丙氨酸實施例4藥效團提煉在表2結果的基礎上，我們發展了人分葉核白細胞上C5a受體拮抗活性需要的提煉的藥效團，如下所述位置“A”能容忍大量基團，包括H(例如化合物17、18)、烷基、芳基、NH2、NH烷基、N(烷基)2、NH芳基、NH酰基(例如化合物1、3、4、5、6)、NH苯甲酰基(例如化合物2)、OH、O烷基、O芳基、NHSO2烷基(例如化合物10)、NHSO2芳基(例如化合物11)，對活性沒有不利的作用。
位置“A”取代基的寬容忍性表示在環狀肽骨架的附加基團方面受體中有相當的空間。該位置因此可用來添加取代基以改變拮抗劑的水和脂質溶解性，從而提高拮抗劑的口服或透皮吸收。該位置也可連接標記例如熒光標記，對靶細胞有高度親和力的拮抗劑或多肽序列，例如與C5a氨基酸1-69類似的序列。
位置“B”可為烷基、芳基、苯基、芐基、萘基或吲哚、或D-或L-氨基酸的側鏈，例如L-苯基丙氨酸(化合物1)、或L-苯基甘氨酸(化合物12)。不應為D-苯基丙氨酸(化合物8)、L-高苯基丙氨酸(化合物7)、L-酪氨酸(化合物9)、L-高酪氨酸、甘氨酸(化合物13)、L-色氨酸(化合物16)、或L-高色氨酸的側鏈。
位置“B”不能容忍寬范圍的取代基。似乎L-苯基丙氨酸的芐基不能容忍許多取代，并且不能變得更大。該位置看起來是受體結合所需要的，而不是對拮抗活性本身重要，因為修飾的最大效果是在受體親和力方面，如IC50測定所示。
位置“C”應該為小取代基，例如D-或L-氨基酸的側鏈例如脯氨酸(化合物1)、L-纈氨酸(化合物20)、丙氨酸、反式-羥基脯氨酸(化合物25)，或順式-硫代脯氨酸(化合物26)。不應該為大的取代基例如L-異高氨酸(化合物21)、D-或L-苯基丙氨酸(化合物22、23)、L-環己基丙氨酸(化合物24)的側鏈。
“D”位置應該為大體積的取代基，例如D-氨基酸如D-亮氨酸(化合物31)、D-高亮氨酸、D-環己基丙氨酸(化合物1)、D-高環己基丙氨酸(化合物28)、D-纈氨酸(化合物29)、D-正亮氨酸(化合物36)、D-高-正亮氨酸、D-苯基丙氨酸(化合物33)、D-四氫異喹啉(化合物35)、D-谷氨酰胺(化合物37)、D-谷氨酸(化合物38)、或D-酪氨酸(化合物40)的側鏈。不應該為更小的取代基，例如甘氨酸、D-丙氨酸(化合物30)的側鏈，體積大的平面側鏈如D-色氨酸(化合物32)、大的帶電側鏈如D-精氨酸(化合物39)或D-賴氨酸(化合物43)，或L-氨基酸如L-環己基丙氨酸(化合物27)。骨架上位置“D”處小的D-氨基酸以及小的或大的L-氨基酸將導致C5a受體親和力的極大下降。
位置“E”選自L-色氨酸(化合物1)和L-高色氨酸，而不是D-色氨酸(化合物59)或L-N-甲基色氨酸(化合物47)的大側鏈；L-苯基丙氨酸(化合物60)而不是L-高苯基丙氨酸(化合物61)；L-萘基(化合物52)而不是L-2-萘基(化合物53)；L-3-苯并噻吩基丙氨酸(化合物58)。不應該是L-環己基丙氨酸(化合物50)、D-亮氨酸(化合物51)、L-芴基丙氨酸(化合物54)、甘氨酸(化合物55)、L-四氫異喹啉(化合物56)，或L-組氨酸(化合物57)的側鏈。
環狀肽骨架位置“E”的取代基對C5a受體的拮抗活性至關重要。該位置的取代基可限制構象變化，后者通常與拮抗劑反應相關聯。這可能是“阻滯”殘基，其將拮抗劑固定在受體中并防止受體的構象重組，而構象重組這一點是激動活性必須的。
位置“F”可為下列基團的側鏈L-精氨酸(化合物1)、L-高精氨酸(化合物44)、L-瓜氨酸(化合物45)；或L-刀豆氨酸(化合物48)。而不應該是D-或L-賴氨酸(化合物47)、D-或L-高賴氨酸、或甘氨酸(化合物49)。該位置的取代基大小對得到高受體親和力很重要。瓜氨酸化合物具有未帶電的側鏈，但是與該位置的精氨酸相比，仍然具有可觀的拮抗劑活性。
位置“X”可為-(CH2)nNH-或-(CH2)n-S-，其中n為1～4的整數，優選地2或3，-(CH2)2O-、-(CH2)3O-、-(CH2)3-，-(CH2)4-、-CH2COCHRNH-、或-CH2-NHCOCHRNH-其中R為任何常見的或不常見的L-或D-氨基酸的側鏈。該基團提供了環化連接，例如在化合物1的Arg和Phe殘基之間，從而影響環狀骨架的結構。此外，該連接基上的取代基例如R能潛在地與受體殘基相互作用以增加拮抗劑地親和力。
環上氨基酸成分的N-甲基化傾向于降低化合物的受體結合親和力和拮抗劑活性(例如64，65)，盡管鳥氨酸的δ氮的N-甲基化事實上對拮抗劑活性無影響。
骨架上的多重變化對得到相對于1的活性增加的拮抗劑是不利的。因此盡管L-Phe對1中的L-Trp是一種合適的置換(例如60)，拮抗劑活性改變很小，1的組合改變，例如L-Phe代替Trp以及或者L-高Phe代替Arg(例如67)或對氯-苯基丙氨酸代替Arg(例如68)，導致下降的受體親和力以及下降的拮抗劑活性。類似地，當1中的L-Trp用L-Phe代替且D-Cha用D-Phe代替，化合物失去了根本的活性(例如62)。盡管1中的D-Cha改變為D-Phe仍然導致拮抗劑活性的保持(例如33)，當與L-Phe代替L-Trp的置換一起時候(62)，這種變化就是有害的。
明顯地，這些殘基在與受體結合中存在協調性，由于單一變化的一種(例如33，60)產生的活性高于兩種變化一起進行(例如62)的情形。當Arg被仍然含帶電氨基的芳香基團替代的時候(69)，活性顯著下降，如當60中的Phe被取代的酪氨酸所替換(70)得到的結果那樣。
所有這些變化指出了環狀骨架上什么能或什么不能用來得到人PMNC5a受體親和力和拮抗劑活性。已經公認在其他細胞類型上的C5a受體對側鏈具有不同的容忍性，但是環狀骨架仍然構成活性化合物的基礎。
實施例5大鼠中逆向被動阿蒂斯反應逆向被動腹膜阿蒂斯反應按照以前公開的方法進行誘導(Strachan等，2000)，一組大鼠在腹膜抗體沉積之前用AcF-[OPdChaWR](1)經口強飼(10mgkg-1的10％乙醇/90％鹽水溶液至終體積200μl)或抗體沉淀30分鐘之前適當地口服溶媒對照進行處理。雌性Wistar大鼠(150-250g)用氯胺酮(80mg kg-1腹腔注射)和甲苯噻嗪(12mg kg-1腹腔注射)進行麻醉。
將大鼠的側面小心地剃毛并在每側清楚地描繪5個不同的位置。注射抗體10分鐘之前，將埃文斯藍(15mg kg-1i.v.)、雞卵清蛋白(20mg kg-1i.v.)注射到股靜脈誘導在各個皮膚位置逆向被動阿蒂斯反應。在大鼠每側2個分開的皮膚位置以雙份注射兔抗雞卵清蛋白(只有鹽水、100、200、300或400μg抗體，終注射體積30μL)，每只大鼠有10個注射位置。將大鼠放置在加熱墊上，并在4小時的處理期間保持麻醉狀態，定期采集血液樣品。血液在冰上自發地凝結，并且收集血清樣品并保存在-20℃。皮膚阿蒂斯反應誘導4小時后，將麻醉的大鼠安樂死，并從各阿蒂斯反應位點采集10mm2面積的皮膚。將皮膚樣品在10％緩沖的福爾馬林中至少保存10天，然后利用蘇木精和曙紅染色進行組織學分析。此外，另一組皮膚樣品放置在1mL甲酰胺中過夜，在650nm處測定埃文斯藍萃取液的吸光度，作為血清滲漏到皮膚中的指標。圖1顯示了用AcF-[OPdChaWR]靜脈內、口服或局部前處理后皮內注射0-400μg位置-1的兔抗雞卵清蛋白后皮膚沖壓提取液的光密度。數據顯示為650nm處吸光度與血漿吸光度的百分比的平均值±SEM(n＝3-6)。*表示當與阿蒂斯對照值相比P值≤0.05的情況。
將大鼠用C5aR拮抗劑，AcF-[OPdChaWR](1)的TFA鹽進行處理，或者靜脈內(0.3-1mgkg-1的包含10％乙醇的200μL鹽水，皮膚阿蒂斯開始之前10min)、經口(0.3-10mgkg-1的200μL鹽水，包含10％乙醇，經口強飼，在處理之前18小時斷食的大鼠的皮膚阿蒂斯之前30分鐘)或局部(200-400μg位置-1，皮膚阿蒂斯反應開始之前10分鐘)，或用適當的溶媒對照。拮抗劑局部應用涉及應用20μl的10-20mgmL-1溶液，溶解在10％二甲基亞碸(DMSO)中，在阿蒂斯反應開始之前10分鐘將其直接涂抹在各側皮膚上，。
從用埃文斯藍處理的大鼠鹽水-只有注射位置只作為抗原對照，從用埃文斯藍加上局部只有DMSO處理大鼠的鹽水-單用注射位置用作溶媒對照，用埃文斯藍加上或者靜脈內、口服或局部拮抗劑處理大鼠的鹽水-單用注射位置作為拮抗劑對照，并且埃文斯藍加上皮膚兔抗雞卵清蛋白作為抗體對照。局部應用肽AcF-[OPGWR]作為無活性肽對照，其具有與AcF-[OPdChaWR](1)類似的化學組成以及溶解性，但是在分離的人PMNs中IC50結合親和力＞1mM。AcF-[OPGWR]也溶解在10％DMSO中，并阿蒂斯反應開始之前10分鐘以400μg位置-1的劑量進行局部應用。
TNFα測定血清TNFα濃度用酶聯免疫吸附分析(ELISA)試劑盒進行測量。所用的抗體對為兔抗大鼠TNFα抗體偶聯生物素化的鼠抗-大鼠TNFα抗體。圖2顯示用AcF-[OPdChaWR]靜脈內、口服或局部預處理大鼠組的皮膚阿蒂斯反應開始后定期的時間間隔的血清TNFα濃度。數據顯示為平均值±SEM(n＝3-6)。*表示與阿蒂斯對照值相比，P值＜0.05。
白介素-6測定如前所述地ELISA方法用來測量血清和腹膜洗液白介素-6(IL-6)濃度(Strachan等，2000)。
病理學評價將大鼠皮膚樣品在10％緩沖的福爾馬林中固定至少10天，并用蘇木精和曙紅利用標準的組織學技術進行染色。皮膚樣品以盲檢的方式分析病例證據，大鼠PMN浸潤程度以0-4級進行評分。皮膚阿蒂斯反應開始產生間質嗜中性粒細胞的增加，按照下述方式進行定量。切片評分為0，如果沒有檢測到異常。評分為1表示血管中出現增加的PMNs，但是炎性細胞沒有遷移出內腔。評分2和3表示在組織間隙中出現增加數目的PMNs，并且在血管的周圍出現更明顯的炎性細胞聚集。表示嚴重病理異常的最大評分4存在于下述特征的皮膚切片中，伴隨PMNs過量浸潤到組織中并且這些細胞遷移出血管。圖3顯示皮內注射增加量的抗體導致皮膚樣品病理指數評分的劑量響應增加(A)。顯示了用AcF-[OPdChaWR]靜脈內(B)(n＝3)、經口(C)(n＝3)和局部(D)(n＝3)預處理的大鼠中皮膚樣品進行皮內注射鹽水或400μg位置-1抗體(n＝5)的試驗數據。數據顯示為平均值±SEM。*當與阿蒂斯值相比，用無參數的t-檢驗P≤0.05。
實施例6C5a拮抗劑對大鼠中腸缺血-再灌注損傷模型的影響所有實驗之前12小時，將雌性Wistar大鼠(250-300g，n＝132)禁食并且只給予水。將動物經腹膜內注射80mgkg-1氯胺酮和10mgkg-1甲苯噻嗪進行麻醉，并在整個過程中，將大鼠放置在加熱墊上以保持正常的體溫。通過中線切開打開腹部以暴露腸系膜上動脈(SMA)。從通過一定長度的聚乙烯管打環的縫合絲形成一種非-創傷性閉合動脈裝置。通過牽引至環的末端閉合SMA。將聚乙烯導管插入股靜脈以輸入1mgkg-1AcF-[OPdChaWR](1)的5％乙醇溶液或無菌無熱源鹽水，體積0.2ml。用2分鐘完成輸液。經口施用AcF-[OPdChaWR](1)(0.3、1、10mgkg-1)在閉合之前60分鐘通過強飼(0.2ml鹽水的25％乙醇溶液)而實現。腸缺血通過將SMA夾住30分鐘進行誘導，之后移去閉合縫合，然后監控再灌注120分鐘。假手術大鼠按照同樣的方式進行處理，除了省略脈管閉合，并且輸注0.2ml無菌、無熱源鹽水或強飼0.2ml鹽水的25％乙醇溶液。在估計PMN數目的時間期間180分鐘內以定期的時間間隔將血樣品(50μL)收集到肝素化的Eppendorf管中。在不同系列的同樣實驗中，在180分鐘的定期時間間隔點采集全血并在冰上凝結，并且收集血清或血漿樣品并在-20°℃保存以進行后續的腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、觸珠蛋白(Hp)和天冬氨酸轉氨酶(AST)濃度的測定。在120分鐘再灌注期間結束的時候，將動物用過量的戊巴比妥進行安樂死。取出閉合的回腸部分，將內腔用鹽水洗滌，并將腸吸干然后稱重。將樣本在烤箱中在80℃干燥24小時得到組織的干重。通過評價濕和干組織重量比判斷腸水腫。此外，富集缺血和正常腸樣本，并用鹽水洗滌并立即在10％緩沖的甲醛-鹽水固定以進行組織學研究。
圖4顯示與假手術動物相比，缺血-再灌注后小腸的濕干重之比顯著地升高。與未處理的缺血-再灌注(I/R)動物相比，用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和10mg/kg p.o.處理顯著地減少組織水腫。數據顯示為平均值±SEM(每組中，n＝4-6)。*，P＜0.05vs.假手術動物。+，P＜0.05vs.I/R動物。
嗜中性白血球減少分析將用于PMN計數的血(50μL)放置在肝素化的管中并在等體積的Histopaque 1083(Sigma，U.S.A.)上分層，分離PMNs并在血細胞計數器上進行細胞計數。PMN的濃度值表示為SMA閉合之前即刻得到的值的平均百分數±SEM。
圖5顯示與假手術動物(A，B)相比，消化道缺血-再灌注引起顯著的循環PMN濃度下降。用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.(A)和10mg/kg p.o.(B)進行前處理的大鼠顯著地抑制缺血-再灌注誘導的嗜中性白血球減少。1mg/kg p.o.(B)處理的動物顯示沒有抑制嗜中性白血球減少。數據顯示為平均值±SEM(每組n＝6)。*等于P＜0.05vs.對照動物。線顯示30分鐘缺血期。
腫瘤壞死因子-α測定血清TNF-α濃度用酶聯免疫吸附分析(OptEIA，Pharmingen，USA)，按照生產者的說明。血清樣品中TNF-α的濃度從標準曲線通過線性回歸分析進行測定。
圖6顯示與假手術動物相比，消化道缺血-再灌注產生顯著的血清TNF-α升高。用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1-10mg/kg p.o.前處理的大鼠完全抑制血清TNF-α水平的變化。數據顯示為平均值±SEM(每組n＝6)。*，P＜0.05vs.假手術動物。線顯示30分鐘缺血期。
觸珠蛋白分析血清Hp利用Hp分析試劑盒(Tridelta Development Ltd.U.K)進行測量，根據生產者的說明。血清樣品中的Hp濃度利用線性回歸從標準曲線中測定。
圖7顯示與假手術動物相比，消化道缺血-再灌注產生顯著增加的血清觸珠蛋白。用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1，10mg/kg p.o.進行大鼠前處理顯著地抑制血清觸珠蛋白水平的增加。數據顯示為平均值±SEM(每組n＝4-6)。*，P＜0.05vs.假手術動物。+，P＜0.05vs.I/R動物。
天冬氨酸轉氨酶分析血漿AST(AST/GOT；Sigma，USA)濃度在收集血漿48小時內根據生產者的說明進行測量。血漿AST濃度從校準曲線得到。結果以Sigma-Franke(SF)單位/ml進行表述。
圖8顯示與假手術動物相比，消化道缺血-再灌注導致顯著增加的血漿天冬氨酸轉氨酶。與未處理的I/R動物相比，用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1，10mg/kg處理顯著地降低消化道缺血-再灌注誘導的天冬氨酸轉氨酶。數據顯示為平均值±SEM(每組n＝6)。*，P＜0.05vs.假手術動物。+，P＜0.05vs.I/R動物。
組織病理學將樣本在10％甲醛-鹽水中固定，包埋在石蠟中，連續切片，并用蘇木精和曙紅染色。以盲檢的方式，讓一位訓練的觀察者讀片并評分。腸組織損傷的程度利用前述0～8級分級評分進行判斷(Chiu等，1970)。
圖9顯示與假手術動物相比，消化道缺血-再灌注導致顯著的腸損傷。與未處理的I/R動物相比，用C5a受體拮抗劑AcF-[OPdChaWR]1mg/kg i.v.和1，10mg/kg處理顯著地降低消化道缺血-再灌注誘導的組織損傷。數據顯示為平均值±SEM(每組n＝6)。*，P＜0.05vs.I/R動物。
實施例7大鼠單關節抗原-誘導的關節炎雌性Wistar大鼠(150-250g)從Central Animal Breeding House，Universityof Queensland獲得。將甲基化的牛血清白蛋白(mBSA)(0.5mg)溶解在Freund全佐劑(0.5mg)中并超聲以產生均勻的懸浮液。在第1天和第7天每只大鼠接受皮下注射這種懸浮液(0.5mL)。在第12-28天，將大鼠隔離到分離的籠子中，每天監測體重以及進食和進水情況。大鼠接受包含AcF-[OPdChaWR](1)或者普通自來水龍頭水或飲用水。每天監測體重和進水情況，并且大鼠在試驗的12-28天接受日劑量為1mg/kg/天的C5aR拮抗劑AcF-[OPdChaWR](1)。在第14天，將大鼠麻醉并將其后肢剃光。每只大鼠接受通過關節內(100μl)注射在左膝注射mBSA(0.5mg)，右膝接受鹽水。膝蓋只接受鹽水處理的大鼠接受正常的飲水并作為鹽水對照，大鼠接受AcF-[OPdChaWR](1)飲用水溶液的大鼠的鹽水處理膝蓋作為拮抗劑對照。
在第28天將大鼠安樂死，并將全血收集到Eppendorf管中并在冰上凝結。將血樣品離心(11,000rpm×3分鐘)并收集血清并在-20℃儲存直至用ELISA進行血清細胞因子分析。將各膝蓋莢膜用100μL鹽水灌洗，并用血細胞計數器進行總細胞計數。此外，將部分膝關節洗液滴到玻璃載波片上，并使之空氣干燥。一旦干燥，將細胞用不同的染料(DiffQuick)進行染色，并用40x鏡頭顯微鏡進行差示細胞計數。將各關節的其余洗液在-20℃儲存直至后續用ELISA進行關節內細胞因子水平分析。去除各膝關節，并用解剖刀將皮膚分離并進行固定。將膝關節樣品在10％緩沖的福爾馬林儲存≥10天。然后將膝關節用蒸餾水洗滌并在飽和的EDTA溶液中放置21天進行脫鈣并包埋在石蠟中。
膝組織樣品利用上述實施例6中描述的標準組織學技術進行制備并用蘇木精和曙紅染色。以盲檢的方式分析組織載波片。組織切片用0-4級評分，0分表示無異常，隨著滑液細胞增殖、炎性細胞浸潤、軟骨破壞以及出血的出現，評分升高。沒有樣品中出現明顯的骨侵蝕。在進行TNFα和IL-6水平ELISA分析時候將血清和滑液樣品解凍。從標準曲線測定濃度，利用前述實施例6中描述的ELISA方法。
圖10顯示在第-2～+14天經口施用AcF-[OPdChaWR]對關節炎右膝關節腫脹的抑制，而圖11顯示在右膝關節關節洗液中TNF-α和IL-6水平的抑制。未處理指動物未用AcF-[OPdChaWR]處理但是在敏化后右膝用抗原刺激。
實施例8C5a拮抗劑局部皮膚應用本發明教導了局部應用C5a拮抗劑可用來治療涉及補體系統激活的局部炎性疾病。在該實施例中，我們證實局部應用C5a拮抗劑也可產生全身藥理作用，并在循環系統出現相應濃度的C5a拮抗劑。
在局部皮膚應用后，考察了環狀拮抗劑的體內藥理性質。使用了內血毒癥模型，其中1mg/kg Escherichia coli脂多糖(LPS；血清型55B5，Sigma，USA，以100mg ml-1的水溶液4℃儲存)，經i.v注射到大鼠中，產生循環PMN水平和血壓的急性變化。這些參數在有和無C5aR拮抗劑(1mg/kg i.v或50mg/kg/大鼠局部)條件下測定。該研究顯示局部應用C5a受體拮抗劑是一種有效的轉運化合物的方法，觀察到全身性藥理活性。
將重200-250g的雌性Wistar大鼠用來進行體內測試所有的C5a受體拮抗劑。將大鼠按照前述方法進行麻醉，并轉移到加熱墊上以保證在整個試驗過程中保持體溫。將導管插入到股靜脈中，用縫合線進行保護，并充滿100μL肝素化鹽水。對大鼠施用拮抗劑或溶媒，靜脈內(1mg kg-1的200μL鹽水，包含10％乙醇，LPS刺激之前10分鐘)或局部(10mg位置-1的50％二甲基亞砜/H2O，補體刺激之前60分鐘)。在拮抗劑或溶媒對照的iv用藥10分鐘之后或局部用藥60分鐘之后，對大鼠經股導管i.v輸注LPS(1mg kg-1i.v的100μL鹽水溶液)、重組人C5a(2μgkg-1的100μL溶液)，或溶媒對照。所有i.v輸注試劑在2分鐘時間注射完畢，然后注射100μL鹽水以保證藥物的完全輸送。
在藥物和LPS或C5a給藥的時間點，從尾靜脈采集全血樣品(0.1mL)。并在相對于注射LPS(時間0點)的-15、0、5、10、15、30、60、90、120和150分鐘采集樣品，并放置在含肝素(500單位/mL)的管中。為了分離PMNs，將100μL血在200μL的Histopaque 1077(Sigma U.S.A.)溶液上分層并在400xg室溫(25℃)離心30分鐘。分出富含血小板的血漿上清液層、單核細胞和淋巴細胞界面以及Histopaque的分離層并棄去，留下富含PMN和紅細胞層。將9mL冷蒸餾水(4℃)加入到殘留的沉淀中并振蕩40秒以溶解紅血細胞。將Dulbecco’s磷酸鹽緩沖的鹽水(10x濃度)加入以恢復等張性。然后將細胞在400xg在10℃離心15分鐘。將得到的上清液棄去，剩下PMNs沉淀。將PMNs進一步用9mL鹽水洗滌，并再在400xg在10℃離心10分鐘。再將得到的上清液棄去，將得到的沉淀再懸浮于100μL鹽水中并充分混合。在血細胞計數器上對PMNs計數。將各時間點的細胞數計算為補體刺激或LPS之前時間0點的細胞總數的百分比。
將用于本研究的雌性Wistar大鼠分成下述處理組(a)單用LPS，其中輸注100μL 5％乙醇(-15分鐘)+1mg/kg LPS(0分鐘)；(b)乙醇對照，其中在-15分鐘輸注100μL5％乙醇以考察乙醇對大鼠中測定參數的影響；
(c)拮抗劑對照，其中在-15分鐘經i.v.輸注1mg/kg環狀拮抗劑；(d)i.v拮抗劑+LPS，其中輸注1mg/kg環狀拮抗劑(-15分鐘)以及1mg/kgLPS(0分鐘)；以及(e)局部-應用拮抗劑+LPS，其中10mg/大鼠的拮抗劑涂抹在大鼠的腹部，然后在0分鐘的時候iv輸注LPS。
將C5a拮抗劑例如3D53(PMX53)以應用劑量50mg/kg對大鼠皮膚給藥在循環血漿中產生藥理顯著水平的藥物。藥物在多種溶劑，例如二甲基亞砜(DMSO)、丙二醇(PG)以及水以及多種組合中的應用導致循環中出現藥物的藥理相關濃度，如圖12中所示。這表明皮膚應用3D53的DMSO/蒸餾水或丙二醇(PG)/水溶液導致在15分鐘內在循環血漿中出現C5a拮抗劑，并且顯著的水平持續至少4小時。
實施例9皮膚應用后C5a拮抗劑的全身性作用如實施例8中所示，對動物皮膚局部應用C5a拮抗劑在循環中產生藥理相關的藥物水平。為了顯示這些水平具有全身性活性，測定了這些循環水平的C5a拮抗劑抑制中性白細胞減少癥的效果，后者為i.v.給藥C5a時的作用。
將C5a受體拮抗劑3D53以(10mg/大鼠)的50％丙二醇和50％蒸餾水進行給藥。將組合物均勻地涂抹在腹部皮膚(4×8cm2)上30分鐘，然后將C5a經i.v.注射2μg/kg的200μl鹽水溶液。在下列時間點采集血樣-30(藥物給藥前)、0(C5a注射前)以及5、15、30、60和120分鐘以測定循環PMNs。如圖13中所示，局部應用化合物3D53的確預防C5a的中性白細胞減少癥作用。
實施例10局部應用C5a拮抗劑抑制LPS的全身性效果將C5a拮抗劑，3D53(化合物1)以及化合物17和化合物45以劑量10mg/大鼠在50％DMSO/50％H2O中進行局部應用，如上所述。皮膚應用拮抗劑60分鐘后，將LPS以1mg/kg劑量經i.v.進行注射。在LPS注射后，監測循環PMN水平150分鐘，并計算PMN水平相對于注射LPS時間0點的百分變化。得到的結果，如圖14中所示，表明局部應用的每種C5a拮抗劑抑制響應i.v.LPS的嗜中性白血球減少，并且這種抑制可與i.v.注射藥物后觀察到的抑制相比。
實施例11在腹主動脈瘤手術后以及外傷性壓傷后，下肢缺血-再灌注(I/R)損傷是一個嚴重的問題(Kerrigan和Stotland，1993)。骨骼肌肉組織的缺血和隨后的再灌注刺激受影響肌肉的炎性反應，以及在其他組織中誘導損傷(Gute等，1998)。在嚴重的肢體缺血情況下，發生的再灌注與多全身性組織衰竭導致的高死亡率相關聯(Defraigne和Pincemail，1997)。為了考察C5a受體拮抗劑對大鼠中下肢缺血-再灌注(I/R)后多種局部和遠端損傷參數的抑制能力，將大鼠后肢進行缺血2小時和再灌注4小時。這種止血帶刺激模型已經被慣犯地用作下肢I/R損傷的模型。
將大鼠進行雙后肢缺血2小時和再灌注4小時。藥物處理大鼠或在缺血前10分鐘或再灌注之前10分鐘接受AcF-[OPdChaWR](1mg/kg)i.v.，或缺血之前30分鐘口服(10mg/kg)。測定循環中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)、丙氨酸和天冬氨酸轉氨酶(ALT/AST)、肌酸酐、血尿氮(BUN)、分葉核白細胞(PMNs)和鈣(Ca++)和鉀(K+)的水平。這些生化指標公知可以反映I/R事件后的組織或器官損傷。其他測量的參數包括肺、肝臟和肌肉中的尿蛋白水平、肌肉水腫和髓過氧化物酶(MPO)濃度以及肝臟勻漿中的TNF-α濃度。與假手術動物相比，這些參數中沒有觀察到明顯的變化，表明單用藥物沒有這些標志物變化所定義的副作用。肢體I/R損傷特征為CK、LDH、ALT、AST、肌酸酐、BUN、蛋白尿、PMNs、血清K+、肌肉水腫、器官MPO以及肝臟勻漿TNF-α濃度的顯著升高，但是血清Ca++濃度的顯著下降。當大鼠接受AcF-[OPdChaWR]處理的時候，這些參數均有顯著改善。
本研究按照National Health & Medical Research Council of Australia的指導規則進行，并且實驗方案得到University of Queensland Animal EthicsCommittee的批準。重250-300g的雌性Wistar大鼠禁食過夜，然后通過腹腔注射注射6mg/kg甲苯噻嗪和120mg/kg氯胺酮進行麻醉。通過另外注射氯胺酮維持實驗過程中的麻醉。將大鼠放置在加熱墊上以保持正常的體溫，并將聚乙烯導管插入到右頸靜脈以輸入C5a拮抗劑或7％乙醇/鹽水。雙后肢缺血按照下述方式誘導通過在每只后肢較大轉節上應用乳膠o-環(市售環形物；Hayes Veterinary Supplies，Brisbane，Australia)。缺血2小時后，切開乳膠環并去除并將肢體再灌注4小時。使用了6個實驗組
(a)假手術，(b)只有缺血，(c)只有I/R-，(d)I/R+C5a拮抗劑(1mg/kg，i.v.)，缺血前10分鐘給藥，(e)I/R+C5a拮抗劑(10mg/kg，p.o.)，缺血前30分鐘給藥，以及(f)I/R+C5a拮抗劑(1mg/kg，i.v.)，再灌注前10分鐘給藥。
假手術動物不進行任何缺血或再灌注，并且只有缺血的動物用止血帶2小時沒有后續的再灌注。其他所有實驗組進行2小時缺血以及4小時的再灌注。假手術、只有缺血以及I/R組在缺血前10分鐘輸注7％乙醇/鹽水之，而不是藥物。在整個實驗過程中，從尾靜脈采血，并且血清或血漿在4℃或-20℃保存以進行后續的生化分析。在研究的最后階段收集尿液以測定尿蛋白水平。在實驗結束的時候，將大鼠實行安樂死，并取出肺、肝臟以及腓腸肌肌肉部分并評估水腫、嗜中性粒細胞集聚以及進行肝臟TNF-α研究。
所有的實驗結果表示為平均值±平均值的標準誤差(SEM)。數據分析利用GraphPad Prism 3.0軟件(GraphPad Software，Inc.USA)進行。假手術和只有I/R-組之間的統計學比較利用單變量(one-way)分析然后進行Dunnett比較后檢驗(post-test)分析。統計學顯著判斷標準為P＜0.05。
(a)肌酸激酶和乳酸脫氫酶的抑制利用CK試劑盒(Sigma，St.Louis，USA)根據生產廠家說明，測量缺血后即刻、以及再灌注1、2和3小時后以及在實驗結束時采得的血清樣品中的肌酸激酶(CK)的循環水平。在只接受I/R動物中，止血帶放松后10分鐘采集血清以進行CK測定。再灌注2小時后采集的樣品進行1∶5稀釋。
測量缺血即刻，再灌注1、2和3小時后以及實驗結束時血清樣品中的乳酸脫氫酶(LDH)循環水平。在只接受I/R動物中，止血帶放松后10分鐘采集血清以進行LDH測定。根據廠家說明利用LDH試劑盒(Sigma)LDH測定濃度，再灌注2小時后取得的樣品進行1∶4稀釋。對于這兩種酶，將所有的樣品在4℃保存并在收集后24小時內分析。結果用Sigma-Franke(SF)單位/mL表示。
如圖15中所示，在再灌注1、2、3和4小時后，雙后肢I/R產生CK和LDH循環水平升高，兩種酶水平都在4小時后達到峰值。與假手術大鼠相比，只有缺血的大鼠沒有顯示出明顯的CK或LDH水平升高(CK，58.3±23.5單位/mL；LDH，269.5±72.8單位/mL；P＞0.05；n＝4)。與假手術大鼠相比，在只有I/R的大鼠中，止血帶釋放10分鐘后，這些酶的水平沒有顯著的增加(CK，73.9±28.1單位/mL；LDH，395.3±123.2單位/mL；P＞0.05；n＝4)，表明在4小時期間再灌注-依賴的升高。再灌注顯著地升高CK和LDH的血漿水平(P＜0.05)。缺血之前用C5a拮抗劑處理的大鼠，或者i.v.(1mg/kg)或口服(10mg/kg)，具有類似的顯著地下降的CK和LDH水平，與只接受I/R大鼠相比(P＜0.05)。此外，再灌注之前用C5a拮抗劑(1mg/kg)i.v.處理的大鼠也顯示出顯著的CK和LDH水平的抑制，具有與缺血前處理大鼠類似的幅度(P＜0.05)。所有藥物處理大鼠在再灌注期間的這些酶的水平顯著地高于假手術大鼠組的水平，顯示C5a拮抗劑的部分抑制作用(P＜0.05)。
(b)丙氨酸轉氨酶和天冬氨酸轉氨酶的抑制測量實驗結束以及再灌注后2和3小時取得的血漿樣品中丙氨酸轉氨酶(ALT)和天冬氨酸轉氨酶(AST)的循環水平。只接受I/R的動物在止血帶釋放后10分鐘采集血清以測定ALT和AST。用ALT/AST試劑盒(GPT/GOT；Sigma)，根據廠家說明測定ALT和AST的濃度，測定在收集血漿24小時之內進行，血漿分析前儲存在4℃。結果以SF單位/mL表示。
如圖16中所示，再灌注2、3或4小時后，肢體I/R導致血漿中ALT和AST的升高，兩種酶4小時后達到濃度峰值。與假手術大鼠相比，只接受2小時缺血的大鼠的ALT或AST水平沒有顯著升高(ALT，12.9±4.6單位/mL；AST，91.4±10.4單位/mL；P＞0.05；n＝4)。在只接受I/R大鼠中，止血帶松開10分鐘后，與假手術大鼠相比，兩種酶的水平沒有顯著增加(ALT，18.1±4.4單位/mL；AST，105.9±21.3單位/mL；P＞0.05；n＝4)，再次表明再灌注-依賴的升高。在所有3組用C5a拮抗劑處理的大鼠中發現具有類似的ALT和AST水平的顯著下降，與只接受I/R大鼠相比(P＜0.05)。再灌注4小時后，而不是在2或3小時，與假手術大鼠相比，藥物處理大鼠具有顯著地上升的ALT水平(P＜0.05；圖16A)。與此形成對比的是，與假手術大鼠相比，這些藥物處理大鼠在所有測量時間點具有升高的AST水平，表明C5a拮抗劑對ALT和AST的不同抑制作用(P＜0.05；圖16B)。
(c)鉀和鈣離子血清水平變化的抑制在各實驗結束后以及對只接受I/R動物止血帶釋放10分鐘后，用火焰光度計(Corning 435；Corning，U.S.A.)測量鉀離子(K+)的血清水平。在實驗結束后以及對只接受I/R的動物在止血帶釋放10分鐘后，利用鈣試劑盒(Sigma)測量血清鈣離子(Ca++)濃度。將樣品儲存在-20℃并在收集后2周內測量K+和Ca++水平。結果以mmol/L表示，并總結在表1中。
表1缺血以及再灌注4小時后大鼠血清陽離子水平的改變
數據為平均值±SEM.
a大鼠數b缺血/再灌注*P＜0.05vs I/R-只有P＜0.05vs假手術血尿氮、肌酸酐以及尿蛋白的抑制實驗結束時采集的血清樣品中血尿氮(BUN)循環水平的測量利用尿氮試劑盒(Sigma)根據廠家說明進行。將樣品儲存在-20℃并在收集后2周內分析。實驗結束時采集的血清樣品中肌酸酐的循環水平利用肌酸酐試劑盒(Sigma)根據廠家說明進行。在實驗結束之前1小時收集的尿樣品中的蛋白濃度利用蛋白試劑盒(Sigma)根據廠家說明進行。將樣品儲存在4℃并在收集后24小時內分析。所有這三種參數以mg/dL表示，如表2中所示。
表2缺血以及再灌注4小時后大鼠腎臟損傷標志物的改變
數據為平均值±SEM.
a大鼠數b血尿氮c缺血/再灌注d沒有檢測到*P＜0.05vs I/R-只有P＜0.05vs假手術與假手術大鼠相比，再灌注4小時后在只接受I/R-大鼠中觀察到高鉀血癥(P＜0.05)。與只接受I/R的大鼠相比，在所有3組藥物處理組中的大鼠具有顯著地下降的K+水平，再灌注之前處理的大鼠顯示出接近正常的水平(P＜0.05)。缺血以及再灌注4小時后，與假手術動物相比，只接受I/R的大鼠具有顯著地下降的血清Ca++濃度(P＜0.05)。在所有3組藥物處理組中的大鼠顯示出類似的I/R-誘導的Ca++水平下降的抑制作用(P＜0.05)。藥物處理I/R大鼠中以及只有缺血大鼠中K+和Ca++二者的水平與假手術大鼠中的二者水平沒有顯著的差別(P＞0.05)。在只接受I/R-大鼠中止血帶釋放10分鐘后這些離子的水平(K+，5.27±0.49mmol/L；Ca++，2.50±0.17mmol/L；P＞0.05；n＝4)與假手術大鼠中的水平也沒有顯著的差別。
與假手術大鼠相比，缺血以及再灌注4小時后，只接受I/R大鼠具有顯著升高的血清BUN和肌酸酐水平以及增加的尿蛋白濃度(P＜0.05)。與假手術大鼠相比，單獨缺血2小時沒有引起這些參數中的任何一種上升(P＞0.05)。與只接受I/R大鼠相比，在所有3組用C5a拮抗劑處理的大鼠具有顯著地降低的這些參數水平(P＜0.05)，并且與假手術大鼠相比，這些水平沒有顯著的不同(P＞0.05)。
分葉核白細胞數目以嗜中性粒細胞聚集的抑制測量缺血之前即刻采集以及在實驗結束時采集的血樣品中的循環PMNs，按照Strachan等，(2000)描述的方法。最終樣品中的PMNs數表述被缺血前數目的平均百分比±SEM。
如圖17A中所示，與假手術大鼠相比，再灌注4小時后只接受I/R大鼠中的循環PMNs顯著地升高(P＜0.05)。與假手術大鼠相比，只有缺血處理的大鼠沒有顯著的PMNs升高(P＞0.05)。在所有的3組藥物處理組中大鼠的PMN數與假手術大鼠中的數值沒有顯著的不同(P＞0.05)，并且與只接受I/R大鼠相比，顯著地下降(P＜0.05)，缺血前用i.v.(1mg/kg)處理的大鼠顯示出最大的抑制作用。
嗜中性粒細胞向大鼠中肝臟、肺和肌肉的浸潤通過測量髓過氧化物酶(MPO)的活性水平來判斷。在實驗結束時，得到肺(～0.5g)、肝臟(～1g)以及左下肢肌肉(～1g)并稱重然后用1mL磷酸鹽緩沖的鹽水(PBS)進行勻漿。然后將樣品進行超聲處理，肝臟和肺樣品20秒，或肌肉樣品60秒。離心后(14,000xg，10分鐘，22℃)，將得到的上清夜立即用來測量MPO水平。分析混合物由o-dianasidine(2.85mg/mL；Sigma)、過氧化氫酶(0.85％)以及1∶40稀釋的樣品的PBS溶液組成。底物加入5分鐘后，讀取450nM處的吸光度，并將結果以吸光度單位/克組織表示。
將在大鼠后肢肌肉、肺以及肝臟MPO的活性水平作為進入組織組織的嗜中性粒細胞的測定(Kyriakides等，2000)。如圖17B、C和D中所示，與假手術大鼠大鼠相比，只接受I/R大鼠的后肢肌肉、肺以及肝臟中的MPO活性有顯著的升高(P＜0.05)，而假手術大鼠、只有缺血大鼠在這些組織的任何一種中MPO的活性沒有顯著的增加(P＞0.05)。與只接受I/R大鼠相比，所有3組藥物處理大鼠在所有的組織中有顯著下降的MPO活性(P＜0.05)，與假手術大鼠相比，其水平沒有顯著的不同(P＞0.05)。
對肝臟勻漿TNF-α的抑制肝臟勻漿上清樣品中TNF-α水平的測量，利用酶聯免疫吸附分析試劑盒(OptEIA，Pharmingen，USA)，如以前所述(Strachan等，2000)方法進行。將來自肝臟勻漿樣品上清液進行1∶10稀釋然后用于分析。將上清儲存在-20℃，并在收集后2周內分析樣品。結果以ng/g組織表示。如圖18中所示，與假手術大鼠的樣品相比，來自只接受I/R大鼠的肝臟勻漿樣品顯著增加的TNF-α濃度(P＜0.05)。只有缺血大鼠中的TNF-α水平與假手術大鼠沒有顯著的不同(P＞0.05)。與只接受I/R的大鼠相比，在藥物處理大鼠中，所有3組具有類似的下降的TNF-α濃度(P＜0.05)，與假手術動物相比，沒有顯著的不同(P＞0.05)。
肌肉水腫的抑制將在實驗結束時得到的右后肢肌肉(～1g)稱重并在80℃烤箱放置24小時，然后再稱重。測定濕干重比，并作為肌肉水腫的測定指標。如圖19中所示，與假手術動物相比，只接受I/R大鼠后肢肌肉的濕干重比顯著地增加(P＜0.05)。只有缺血動物中的比例與假手術動物沒有顯著的不同(P＞0.05)。與只接受I/R大鼠相比，在所有3組藥物處理大鼠中，存在類似的下降的濕重-干重比(P＜0.05)，并且這些值與假手術動物中的值沒有顯著的不同(P＞0.05)。
結果表明接受2小時的止血帶-誘導的雙后肢缺血以及再灌注4小時的大鼠遭受局部損傷以及肺、肝臟以及腎臟損傷，如用多種組織壓力指標測定。與假手術動物相比，只接受缺血的大鼠在疾病標志物方面沒有顯著的改變。與假手術動物相比，再灌注10分鐘后從接受只有I/R處理的動物采集的血也沒有顯著的CK、LDH、AST、ALT、K+或Ca++血漿或血清水平改變。局部骨骼肌肉損傷的嚴重性通過再灌注后4小時肌肉水腫以及嗜中性粒細胞聚集以及再灌注期間血清CK和LDH的增加來評估。胞質CK發現主要在肌肉中，并且時可靠的肌肉組織損傷標志物(Tay等，2000)。乳酸脫氫酶也是一種見于肌肉的胞質酶，但是也存在于許多其他組織中(Carter等，1998)。因此，LDH是一種特異性稍差的肌肉損傷測量，但是仍然可作為一般組織損傷的測量。
在接受缺血以及再灌注處理的動物的肺、肝臟以及腎臟中檢測遠端器官損傷指標。通過測量肺軟組織中嗜中性粒細胞聚集的增加來評價肺損傷。通過測量肝TNF-α以及嗜中性粒細胞聚集的增加，以及通過測量ALT和AST血漿水平來定量肝損傷。盡管ALT和AST血漿水平的增加典型地可用作肝臟病理學地標志物，但是這兩種酶也見于肌肉中，因此部分增加任何地源于肌肉，而不是肝臟損傷(Tay等，2000)。骨骼肌肉I/R后腎機能障礙較為常見(Tanaka等，1995)。我們發現I/R大鼠中血清BUN和血漿肌酸酐增加。但是，肌酸酐，并且特別是BUN，也源自肌肉，并且觀察到的增加也可源于肌肉損傷(Carter等，1998)。我們發現I/R大鼠中蛋白尿右相當大的增加，表明一定程度的腎損傷。
已經發現，在該模型中，C5a拮抗劑AcF-[OPdCha WR]抑制許多局部組織以及遠端器官損傷的疾病標志物。這些結果表明C5a在骨骼肌肉I/R損傷病理生理中的關鍵作用。由于人中下肢缺血和再灌注較高的并發癥發病率，本發明的C5a受體拮抗劑代表了的一種將來可能的這些并發癥的治療，特別是當I/R損傷可以預計的情況，例如在手術操作中。C5a拮抗劑阻滯促炎性細胞因子產生以及嗜中性粒細胞轉運的能力可能是其疾病調節特性中的關鍵因素。這里的口服活性證實這種藥物性質可廣泛用于臨床情況。
討論本發明描述了一系列包含構象限制的扭轉環狀分子，其具有結合細胞的預先構成，也可于人C5a結合。本發明化合物的主要特征在于環狀骨架表現處的預先構成的扭轉構型，其至少3各疏水基團聚集到相鄰的空間，創造了疏水表面‘結構部分(patch)’。
拮抗劑的這種扭轉構象將使環狀肽與跨膜區域中在或鄰近于人C5a的C-端也結合的C5a受體位置結合。
這里描述的結果能夠設計和開發甚至更強活性的構象限制的小分子C5a拮抗劑。理論上這些環狀拮抗劑的特征也可用來設計不相關的非-肽模板，其類似地取代基投射成與當這些C5a受體拮抗劑受體結合時候占據的類似的三維空間，取代基相應于或類似于這里描述的環狀肽骨架相連的那些基團。
與非環狀肽相比，環狀肽作為候選藥物具有數種重要的優點(Fairlie等1995，Fairlie等，1998，Tyndall和Fairlie，2001)。本說明書描述的環狀化合物對蛋白水解降解穩定，在人血或血漿、在人或大鼠胃液，或在消化酶例如胃蛋白酶、胰蛋白酶和糜蛋白酶存在下在37℃至少穩定7小時。與之相反，由L-氨基酸組成的短的線性肽在這些條件下數分鐘內快速降解成其組成氨基酸。第二個優點在于環狀和非肽分子采用的受限的單一構象，與非環狀或線性肽相比，后者具有足夠的靈活性在溶液中采取多種結構而不是受體-結合需要的一種結構。第三，環狀化合物例如本發明描述的那些通常具有更大的脂溶性，作為藥物與非環肽相比，具有更高的藥物生物利用度，非環肽幾乎不能經口給藥。第四，環狀分子的血漿半衰期通常比肽類長。
對本領域普通技術人員很明顯的是，盡管本發明為了清楚和理解進行進行了一定程度的詳細描述，在不偏離本發明說明書的發明概念的基礎上，可以對這里描述的實施方案和方法進行多種修飾和改變。
這里引用的參考文獻列在后頁中，這里引入作為作為參考。
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權利要求
1.下列通式表示的環狀肽或類肽化合物，其為G蛋白-偶聯受體拮抗劑，且基本上無激動劑活性， 其中A為H、烷基、芳基、NH2、NH-烷基、N(烷基)2、NH-芳基、NH-酰基、NH-苯甲酰基、NHSO3、NHSO2-烷基、NHSO2-芳基、OH、O-烷基、或O-芳基；B為烷基、芳基、芐基、萘基或吲哚基、或為L-苯基丙氨酸或L-苯基甘氨酸的側鏈；C為甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、脯氨酸、羥基脯氨酸、或硫代脯氨酸的側鏈；D為D-亮氨酸、D-高亮氨酸、D-環己基丙氨酸、D-高環己基丙氨酸、D-纈氨酸、D-正亮氨酸、D-高-正亮氨酸、D-苯基丙氨酸、D-四氫異喹啉、D-谷氨酰胺、D-谷氨酸、或D-酪氨酸的側鏈；E為L-1-萘基或L-3-苯并噻吩基丙氨酸、或為選自L-苯基丙氨酸、L-色氨酸和L-高色氨酸的氨基酸側鏈；F為L-精氨酸、L-高精氨酸、L-瓜氨酸、或L-刀豆氨酸的側鏈、或其生物電子等排體；X為-(CH2)nNH-或(CH2)n-S-，其中n為1～4的整數；-(CH2)2O-；-(CH2)3O-；-(CH2)3-；-(CH2)4-；-CH2COCHRNH-；或CH2CHCOCHRNH-，且其中R為任何常見或不常見氨基酸的側鏈，條件是化合物不是AcF-[OPdChaWR](化合物1)。
2.根據權利要求1的化合物，其中n為2或3。
3.根據權利要求1或2的化合物，其中A為乙酰胺基、氨基甲基，或取代的或未取代的磺酰胺基。
4.根據權利要求3的化合物，其中取代酰胺上的所述取代基為1～6碳原子的烷基鏈，或苯基或甲苯甲酰基。
5.根據權利要求的4化合物，其中烷基鏈為1～4碳原子鏈。
6.根據權利要求1～5中任一項的化合物，其中所述化合物具有C5a受體、抗利尿激素受體或神經激肽受體拮抗劑活性。
7.權利要求的6的化合物，其中所述化合物具有C5aR拮抗劑活性，并且沒有C5a激動劑活性。
8.根據權利要求1～7中任一項的化合物，其中所述化合物具有亞微摩爾濃度的拮抗劑活性。
9.根據權利要求的8化合物，其中所述化合物的受體親和力IC50＜25μM，且拮抗劑活性IC50＜1μM。
10.根據權利要求9的化合物，選自化合物2～6、10～15、17、19、20、22、25、26、28、30、31、33～37、39～45、47～50、52～58和60～70。
11.根據權利要求10的化合物，其中所述化合物為化合物33、化合物60或化合物45。
12.一種組合物，包括根據權利要求1～11中任一項的化合物以及可藥用載體或賦性劑。
13.一種治療G蛋白-偶聯受體介導的病理疾病的方法，包括向需要這種治療的哺乳動物施用治療有效量的根據權利要求1～12中任一項的化合物的步驟。
14.根據權利要求13的方法，其中所述的G蛋白-偶聯受體介導的疾病為C5a受體介導的疾病。
15.根據權利要求14的方法，其中所述疾病涉及C5a的過表達或表達下調。
16.根據權利要求15的方法，其中所述疾病選自類風濕性關節炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、全身性紅斑狼瘡、組織移植排斥、缺血性心臟病、再灌注損傷、膿毒性休克、齒齦炎、纖維癥、動脈粥樣硬化、多發性硬化癥、阿耳茨海默氏病、哮喘、癡呆、中樞神經系統疾病、肺損傷、體外透析后綜合征以及皮膚炎性疾病例如牛皮癬、濕疹和接觸性皮炎。
17.一種治療再灌注損傷的方法，包括對需要這種治療的哺乳動物施用有效量的根據權利要求1～12中任一項的化合物或化合物1的步驟。
18.根據權利要求17的化合物，其中化合物為這里描述的化合物33、化合物60和化合物45。
19.一種組合物，包括根據權利要求1～18中任一項的化合物以及可藥用載體或賦形劑。
20.一種治療治療G蛋白偶聯受體介導病理疾病的方法，包括向需要這種治療的哺乳動物施用有效量的權利要求1～18中任一項的化合物。
21.權利要求20的方法，其中G蛋白偶聯受體介導的疾病為C5a受體介導的疾病。
22.根據權利要求21的方法，其中所述疾病涉及C5a的過表達或表達下調。
23.根據權利要求22的方法，其中所述疾病選自類風濕性關節炎、成人呼吸窘迫綜合征(ARDS)、全身性紅斑狼瘡、組織移植排斥、缺血性心臟病、再灌注損傷、膿毒性休克、齒齦炎、纖維癥、動脈粥樣硬化、多發性硬化癥、阿耳茨海默氏病、哮喘、癡呆、中樞神經系統疾病、肺損傷、體外透析后綜合征以及皮膚炎性疾病例如牛皮癬、濕疹和接觸性皮炎。
24.一種治療再灌注損傷的方法，包括對需要這種治療的哺乳動物施用有效量的根據權利要求1～8中任一項的化合物或化合物1的步驟。
全文摘要
本發明涉及具有調節G蛋白－偶聯受體活性能力的新型環狀化合物。所述化合物優選地作為拮抗劑。在優選的實施方案中，本發明提供了環狀的肽和類肽C5a受體拮抗劑，其具有拮抗分葉核白細胞和巨噬細胞C5a受體上的活性。本發明的化合物有效且具有選擇性，可用于治療多種炎性疾病。
文檔編號A61P9/10GK1847261SQ20061000679
公開日2006年10月18日 申請日期2002年10月17日 優先權日2001年10月17日
發明者史蒂夫·泰勒, 伊恩·A·希爾斯, 戴維·費爾利 申請人:昆士蘭大學