專利名稱：抗腫瘤的靶向粘附斑激酶fak的rna干擾藥物的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種抗腫瘤的藥物，尤其是靶向腫瘤細胞表達的FAK的RNA干擾抗腫瘤藥物。
背景技術：
目前用于白血病治療的方法有很多，包括化療、放療、骨髓移植等。但是化療和放療對病人的身體傷害很大，且容易產生并發癥，療效也并不穩定，對于某些不敏感的患者幾乎毫無作用。骨髓移植療效強于放化療，但是很難找到與患者完全匹配的配型。RNA干擾策略是近年來發展比較迅速的一項新的抗腫瘤治療策略，它一般是針對腫瘤內異常表達的基因進行特異性治療，此類基因在正常的細胞很少表達或不表達，因而此類治療方法副作用小，且不存在配型困難的問題，有著廣泛的應用前景。
RNA干擾技術是利用小干擾RNA片段(siRNA)來高效地封閉目的基因的技術。它采用與目的基因同源的19-25核苷酸長的干擾RNA(smallinterfering RNA，siRNA)轉染至靶細胞，與細胞內的內切酶形成誘導沉默復合體(RISC)，RISC以siRNA為模板特異地識別其同源基因mRNA并對其進行遞進式剪切，形成強有效的瀑布效應，誘導序列特異性的mRNA降解，細胞表現特定基因的缺陷表型。該策略可以將癌癥基因關閉，而僅有一個堿基突變則喪失RNA干擾作用，對正常細胞影響甚微，特異性強。siRNA無論在體內還是體外都比反義技術有更多優勢，因此更廣泛地應用在基因治療的領域中。
粘附斑激酶(FAK)屬于非受體胞內區酪氨酸激酶家族，可以調節正常細胞的很多功能，包括增殖、周期、遷移、存活。由于FAK的這些調節功能和腫瘤的進展有很大的聯系，所以FAK成為研究腫瘤遷移、浸潤、增殖、存活的熱點。已經在多種腫瘤中發現了FAK基因的異常表達，見RNAinterference targeting focal adhesion kinase enhances pancreatic adenocarinomagemcitabine chemosensitivity.Biochemical and Biophysical ResearchCommunications.2003；311786-792。并與腫瘤的進展有很大聯系，這為FAK成為腫瘤治療的靶點提供了依據。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種抗腫瘤的靶向粘附斑激酶的RNA干擾藥物，采用RNAi技術，在mRNA水平針對粘附斑激酶基因的siRNA對腫瘤細胞系中的粘附斑激酶基因進行干擾，能有效抑制粘附斑激酶基因的表達，從而更加高效安全地對腫瘤進行治療。
本發明采用的技術方案是該藥物主要組分包括一段干擾RNA序列，該序列是針對FAK基因mRNA選取的一段siRNA序列，稱之為RNAi-FAK，所述RNA干擾藥物為RNAi-FAK核苷酸序列，該RNAi-FAK核苷酸序列為5’-GCGAUUAUAUGUUAGAGAU-3’其針對的FAK靶點為5’-GCGATTATATGTTAGAGAT-3’(FAK基因中457號位點至475號位點)。
所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物的siRNA核苷酸片段可以是由化學合成所得到的，也可以是由相應的DNA片段裝載進載體內表達得到的，相應的DNA片段也是由化學合成法制備。關于核酸鏈的合成技術，其方法詳見《生物化學》(P598，高等教育出版社，第三版，王鏡巖、朱圣庚、徐長法)。
給藥途徑可采用直接siRNA注射法、脂質體包裹siRNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法中的一種。
1、裸siRNA直接注射將裸siRNA直接注射到機體的肌肉、皮內、皮下、粘膜、靜脈內。這種方法簡單易行。
2、脂質體包裹siRNA直接注射法包裹siRNA的脂質體能與組織細胞發生膜融合，而將RNA攝入，減少了核酸酶對RNA的破壞。注射途徑同裸siRNA直接注射。
3、金包被DNA基因槍轟擊法將質粒DNA包被在金微粒子表面，用基因槍使包被DNA的金微粒子高速穿入組織細胞。
4、繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法選擇一種容易進入某組織器官的細菌，將其繁殖基因去掉，然后用質粒DNA轉化細菌，當這些細菌進入某組織器官后，由于不能繁殖，則自身裂解而釋放出質粒DNA。如可口服的減毒沙門氏菌。
本發明采用RNAi技術，在mRNA水平針對FAK基因的RNAi，能抑制腫瘤細胞增殖，推遲細胞周期，抑制腫瘤耐藥和促進腫瘤細胞分化。研制的RNAi能有效抑制粘附斑激酶FAK的表達，為RNAi技術應用于白血病的治療提供了實驗證據和有效新藥。
圖1是轉染后，兩組細胞內FAK mRNA的轉錄情況；圖2是轉染后，兩組細胞內FAK蛋白的表達情況；圖3是用siRNA處理以后，k562細胞的增殖情況的改變。
具體實施例方式
下面結合附圖和具體實施方式
對本發明的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物作進一步的詳細說明小片段RNA的制備和細胞轉染1)采用化學合成法。將所選擇RNA片段提交上海生工生物工程技術服務有限公司(以下簡稱上海生工)利用RNA合成儀合成所選取的RNA片段5’-GCGAUUAUAUGUUAGAGAU-3’。
2)質粒表達法。將選擇片段對應的DNA序列提交上海生工利用DNA合成儀合成，裝入能夠產生shRNA的pGE-1質粒(invitrogene)中，用該片段轉染細胞后在細胞內產生siRNA。
本發明采用的K562細胞系是人慢性粒系白血病的細胞系。細胞接種于含10％的小牛血清的RPMI1640(Gibco BRL公司產品)培養液，置于37℃、體積分數為5％的CO2培養箱中常規培養。轉染前5×104/ml密度接種于24孔培養板中，優化轉染條件，我們使用脂質體lipofactamine 2000(invitrogen)分別將RNAi-FAK和si-neg轉染入k562細胞中，48小時后進行下一步實驗。
1.RNAi對FAK基因mRNA表達的情況mRNA的檢測采用半定量RT-PCR分析。技術路線1)半定量RT-PCR按TRIzol總RNA抽提試劑盒提取總RNA。電泳鑒定RNA的質量，紫外光分光光度計定量。逆轉錄反應體系(40μl)組成DEPC處理水17μl，Oligo(dT)2μl，dNTP(10mmol/l)2μl，總RNA4μl，5×first-strand buffer8μl，DTT4μl，RNasin 1μl，逆轉錄酶2μl(試劑購自Invitrogen公司)。
PCR反應體系按常規(試劑購自Invitrogen公司)。FAK基因PCR反應條件95℃預變性10min，95℃ 10s、55℃ 45s、72℃ 60s，共25個循環。用軟件gene runner輔助設計引物，由上海生工生物工程公司合成，引物序列和擴增產物大小如下β-actin作為內對照。引物序列和擴增產物大小如下β-actin上游引物5’-CAGAGCAAGAGAGGCATCC-3’下游引物5’-CTGGGGTGTTGAAGGTCTC-3’擴增片段217bp擴增產物用含0.5μg/mlEB1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，并用chemimage軟件分析。
半定量RT-PCR檢測顯示，轉染目的片段組的FAK mRNA水平下調。轉染RNAi-FAK組的減少70％(p＜0.01)，陰性對照組(轉染無義干擾片段的k562細胞)中的FAK mRNA與未轉染組之間沒有顯著性差異(p＞0.05)。見圖1，結果表明，我們所選取的siRNA有效地抑制了FAK基因的轉錄。
2.FAK蛋白表達檢測FAK蛋白表達水平的檢測采用Western-Blot技術。收集細胞后加入裂解液各200μl，經8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉移到硝酸纖維素膜，蛋白封閉液封閉膜4℃過夜；一抗為鼠抗人FAK單克隆抗體(1∶500稀釋)，室溫搖床孵育2小時，二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠多克隆抗體(1∶1000稀釋)，室溫孵育1h，化學熒光顯色。actin作為內對照，一抗為鼠抗人actin單克隆抗體(1∶500稀釋)，其余條件同FAK。
Western-Blot檢測顯示，轉染目的片段組的FAK蛋白水平下降。轉染RNAi-FAK的k562中FAK蛋白減少68.5％(p＜0.01)，陰性對照組(轉染無義干擾片段的k562)中的FAK蛋白水平與未轉染組之間沒有顯著性差異(p＞0.05)。見圖2，結果表明，所選取的siRNA有效地抑制了FAK基因的表達。
3.干擾FAK基因后k562細胞增殖的檢測采用四唑鹽(MTT)染色法來測定細胞的增殖。計數2000個細胞用200μl完全培養基種入96孔板中，37℃、體積分數為5％的CO2環境下培養48小時，加入20g/ml的MTT，孵育4小時，離心去除上清，每孔加入150μl二甲基亞楓，劇烈震蕩10分鐘，測定OD490。
轉染組細胞與對照細胞在同等條件下培養48小時，以MTT染色法測定細胞的增殖程度。發現干擾FAK可以有效的抑制k562細胞的增殖。見圖3，通過MTT比色法，發現所選取siRNA有效地抑制了k562細胞的增殖。
4.干擾FAK基因后k562細胞凋亡的檢測采用磷脂酰絲氨酸外翻分析(Annexin V法)方法檢測細胞耐藥性。在加入20μg/ml阿糖胞苷作用48小時后，檢測FAK基因被干擾后耐藥性的改變。檢測方法參照試劑盒說明書進行。收集細胞后每管(2-3)×105個細胞，用100μl labeling solution重懸，各加入Annexin V和PI1μl，避光室溫反應15min，然后每管補300μl labeling solution，流式細胞儀檢測。
采用20μg/ml阿糖胞苷作為凋亡誘導劑。Annexin V/P I結果顯示，阿糖胞苷作用48小時后，轉染目的片段組細胞的凋亡率為75.16±5.61％，陰性對照組細胞的凋亡率36.84±9.28％，轉染組的凋亡率明顯高于未轉染組(p＜0.01)，對照組的凋亡率與未轉染組無顯著性差異(p＞0.05)，提示FAK被干擾后能夠降低細胞耐藥性。
5.干擾FAK基因后k562細胞周期的檢測采用流式細胞儀測定細胞周期。在去血清作用48小時后，收集細胞，檢測FAK基因被干擾后細胞周期的變化。收集細胞后70％(體積分數)乙醇4℃固定過夜；加入RNA酶至50μg/ml，37℃水浴消化30min，然后加入400μlPI(50μg/ml)，室溫存放15min后上流式細胞儀檢測。
各組k562細胞經去血清處理48小時后，通過流式細胞儀檢測細胞周期。各組細胞在各個細胞周期的比例數如表1所示。結果提示FAK被抑制后，G0/G1期細胞比例較未轉染組增高(p＜0.05)，陰性對照組與未轉染組沒有顯著性差異(p＞0.05)。可見，FAK被干擾后，細胞周期被推遲，抑制細胞的生長。
表1
*p＜0.05
6.干擾FAK基因后k562細胞分化的改變采用聯苯胺染色法測定細胞的分化程度。5×10-7M阿糖胞苷作用48小時后，將細胞涂片，用聯苯胺染色的方法檢查細胞的分化情況，顯微鏡下計數200個細胞，共計5個區域以上。以藍色細胞為分子，全部細胞數為分母，計算細胞的分化率。
各組k562細胞用阿糖胞苷處理48小時后，用聯苯胺染色，顯微鏡下計數陽性細胞，我們發現FAK被干擾組，陽性細胞為68.33±4.86％，而對照組只有39.5±4.77％，提示FAK被干擾后，可以增加細胞的分化。
權利要求
1.一種抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是RNA干擾藥物包括一段序列為5’-GCGAUUAUAUGUUAGAGAU-3’的RNA核苷酸片段。
2.根據權利要求1所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是其針對的FAK靶點為5’-GCGATTATATGTTAGAGAT-3’---(457-475)。
3.根據權利要求1或2所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是所述的RNA核苷酸片段可以是由化學合成所得到的。
4.根據權利要求1或2所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是所述RNA核苷酸片段可以是由相應的DNA片段裝載進載體內表達得到的。
5.根據權利要求1所述的抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，其特征是給藥途徑可采用直接siRNA注射法、脂質體包裹siRNA直接注射法、金包被DNA基因槍轟擊法、繁殖缺陷細菌攜帶質粒DNA法中的一種。
全文摘要
本發明公開了一種抗腫瘤的靶向粘附斑激酶FAK的RNA干擾藥物，該藥物主要組分包括一段干擾RNA序列，該序列是針對FAK基因mRNA選取的一段siRNA序列，稱之為RNAi－FAK，所述RNA干擾藥物為RNAi－FAK核苷酸序列，該RNAi－FAK核苷酸序列為5′－GCGAUUAUAUGUUAGAGAU－3′。其針對的FAK靶點為5′－GCGATTATATGTTAGAGAT－3’。本發明采用RNAi技術，在mRNA水平針對FAK基因的RNAi，能抑制腫瘤細胞增殖，推遲細胞周期，抑制腫瘤耐藥和促進腫瘤細胞分化，能有效抑制粘附斑激酶基因的表達，從而更加高效安全地對腫瘤進行治療。
文檔編號A61P35/02GK101036789SQ200610013319
公開日2007年9月19日 申請日期2006年3月17日 優先權日2006年3月17日
發明者韓忠朝, 梁琳慧 申請人:中國醫學科學院血液學研究所