專利名稱：一種λ－卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及一種λ-卡拉膠寡糖的應用，尤其涉及λ-卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應用。
背景技術：
血管增生是在原來存在的血管結構上長出新血管的生物學過程，許多病理條件下可以發生異常的血管增生，如炎癥、糖尿病性視網膜病、風濕性關節炎等，特別是腫瘤的形成與轉移更是依賴于新血管的形成。因此抑制過度的新血管增生已經成為治療有關疾病有效的重要策略，并且該策略不會產生骨髓抑制、胃腸道反應或脫發等毒副反應，也不易產生耐藥性。
體內血管增生涉及的細胞主要是血管內皮細胞，其過程包括小血管基底膜和基質的降解，內皮細胞在趨化因子的作用下發生遷移，內皮細胞增殖，管腔形成并相互連接等。研究顯示，在新血管形成過程中涉及一種硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(HSPG)，它廣泛分布于內皮細胞表面和細胞外基質內，作為血管生長因子的輔助受體發揮調節作用，對維持細胞外基質的穩定性、影響細胞侵襲、遷移和粘附都有重要的作用。因此外源性給予肝素樣硫酸化物質可干擾HSPG的調節作用，從而影響血管生成；如蘇拉明和多硫酸戊聚糖已用于臨床治療；來源于褐藻的多硫酸化巖藻糖能夠抑制血管生長因子與受體的結合；國際專利(PCT/AU96/00238)也公開了一類硫酸化寡糖的制備，制備的產物是單糖單位間以1-2，1-3，1-4和/或1-6糖苷鍵連接的聚合物，其目的是對乙酰肝素酶的有效抑制作用，從而可以用來抑制人類的血管形成、腫瘤轉移及各類炎癥。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種λ-卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應用；其在腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病的治療和預防時用作血管增生的抑制劑。
本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為本發明提供一種具有下述結構式的λ-卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應用
其中n＝2-20。
所述的λ-卡拉膠寡糖是來自于紅藻多糖的λ型卡拉膠的降解產物，平均分子量為3351Da。
所述的λ型卡拉膠降解時所用的介質為經過酸處理的陽離子交換樹脂。
用該寡糖為活性成分可制備成保健品、藥物或食品用來治療和預防各種疾病引起的血管增生，由于λ-卡拉膠寡糖是從紅藻多糖中降解得到的低分子量糖，具有重復的α-(1-4)-D-半乳吡喃糖-β-(1-3)-D-半乳吡喃糖的二糖單元骨架結構，其結構單元內含有高硫酸基團，可以用作外源性給予肝素樣硫酸化物質，干擾體內的HSPG的調節作用，所以其可以在腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病引起的血管增生用作血管增生抑制劑，抑制各種疾病引起的血管增生。
本發明的優點在于其原料來源于純天然的海洋藻類，該λ-卡拉膠寡糖具有無毒、低副作用的特點，使用安全性高；該寡糖其結構單元內含有高硫酸基團，可以用作外源性給予肝素樣硫酸化物質，干擾體內的HSPG的調節作用，所以其可以在腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病引起的血管增生用作血管增生抑制劑，抑制各種疾病引起的血管增生；該寡糖具有明確的單糖化合物寡聚體，其作用機理比較明確，并且抑制活性較好；可用于制藥及保健品、食品等領域中，預防和治療由于各種疑難雜癥所引起的各種血管增生和形成。
圖1A為對照組的雞胚尿囊膜上血管形成顯微鏡示意圖；圖1B為對照組的雞胚尿囊膜組織切片顯微鏡示意圖；圖2A實驗組的雞胚尿囊膜血管形成的顯微鏡示意圖；圖2B為實驗組的雞胚尿囊膜組織切片顯微鏡示意圖；圖3為實驗組的臍靜脈內皮細胞的管腔形成顯微鏡示意圖；圖4為對照組的臍靜脈內皮細胞的管腔形成顯微鏡示意圖。
具體實施例方式
以下結合具體實施例對本發明作進一步詳細描述。本發明不僅局限于此。
制備例1將角叉菜屬植物紅藻Chondrus ocellatu 20g于40℃烘干，粉碎成100目，加適量水(藻水比為1∶80)，沸水浴攪拌1小時后，紗布過濾，濾渣重復提取一次，合并兩次濾液，自來水透析24小時，蒸餾水透析24小時。在高速離心機上離心分離后取上清液在冰箱里凍透，95％酒精融化脫水，85％酒精浸洗二次，紅外燈下干燥。將此角叉菜多糖加3000ml水溶解，加入KCl至最終濃度為0.3mol/L，在冰水浴中攪拌1h，5000rpm離心30mins，得上清液，減壓濃縮，冰箱中凍透過夜、95％酒精脫水，烘干、得λ-卡拉膠1.45g。
將λ-卡拉膠配成1.5％的溶液，按體積比1∶4加入介質為001×7型陽離子交換樹脂到溶液中，在90℃水浴，攪拌反應6h，過濾去除樹脂，濾液減壓濃縮至近干，冷凍干燥得到λ-卡拉膠寡糖0.98g；按端基法測定寡糖平均分子量為3351Da。
制備例2用市售的λ-卡拉膠作為寡糖的作為制備原料，制備λ-卡拉膠寡糖方法同上。
試驗例1雞胚尿囊膜(CAM)模型用新鮮海蘭種蛋以消毒水擦干其表面，取胚齡4d的胚蛋，分為對照組和實驗組，每組8枚；將蛋剝于杯中，胚蛋在37℃，60％相對濕度的孵箱中孵至CAM展開，培育8天，此時將剪好的約為1mm3的無菌明膠海綿置于對照組和實驗組的尿囊絨毛膜上，吸取5μl(相當于200μg活性成分/egg)卡拉膠寡糖加到無菌明膠海綿上置于實驗組的尿囊絨毛膜上，而對照組以磷酸緩沖液代替寡糖樣品。雞蛋在孵箱中繼續孵育兩天，待雞胚尿囊膜毛細血管網徹底形成后，取出雞蛋，以載體為中心剪下雞胚尿囊膜，在10％甲醛中固定12-24h，顯微觀察，分別隨機各選取4個視野計數血管分支點數(對照組為57±6.78條；實驗組為23±0.85條)。另外各做組織學切片，片厚5μm，HE染色，封片將對照組和實驗組的作比較，分別得到圖1、圖2的實驗結果。
本實驗例使用雞胚尿囊膜作為血管新生的模型，在雞胚生長至約第10天，對照組的雞胚尿囊膜內形成大量的血管網圖1A，實驗組使用λ-卡拉膠寡糖(200μg/egg)會使血管新生明顯減少圖2A，實驗組的結果圖2A與對照組的結果圖1A比較，血管密度明顯減少，并且膜內的微血管數也大大減少；從中對比得出使用λ-卡拉膠寡糖(200μg/egg)對血管生成的抑制率達到54.90％；其組織切片的結果也顯示，實驗組的結果圖2B比對照組的結果圖1B在尿囊膜內的毛細血管明顯減少。
試驗例2臍靜脈內皮細胞模型本實驗例以人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)為模型，取HUVEC 150μl，細胞密度3×104/cells，加入到預鋪以無血清MEM培養基(MEM為一種培養基的名稱縮寫)1∶1稀釋的Matrigel(基底膜基質)的96孔板內，37℃下凝固30分鐘的培養基中，實驗組的人臍靜脈內皮細胞中加入λ-卡拉膠寡糖，體系的最終濃度為125μg/ml(ml是細胞溶液的量)，37℃孵育48h后，顯微鏡下分別觀察各自的管腔的形成情況，分別得到圖3、圖4的結果。
在此試驗中，對照組的結果圖3顯示鏡下可見明顯的管腔出現，實驗組的結果圖4顯示鏡下可見管腔無法生成，所以對HUVEC施用125μg/ml的λ-卡拉膠寡糖即可以破壞內皮細胞管腔的生成。
權利要求
1.一種具有下述結構式的λ-卡拉膠寡糖在制備血管增生的抑制劑的應用 其中n＝2-20。
2.如權利要求1所述的應用，其特征在于所述的λ-卡拉膠寡糖是來自于紅藻多糖的λ型卡拉膠的降解產物，平均分子量為3351Da。
3.如權利要求2所述的應用，其特征在于所述的λ型卡拉膠降解時所用的介質為經過酸處理的陽離子交換樹脂。
全文摘要
本發明涉及一種λ－卡拉膠寡糖的應用，尤其涉及在制備血管增生的抑制劑的應用；其在腫瘤、炎癥、糖尿病等疾病的治療和預防時用作血管增生的抑制劑；本發明的原料來源于純天然的海洋藻類，使用安全性高，具有無毒、低副作用的特點；其作用機理比較明確，并且抑制活性較好；可廣泛應用于制藥及保健品、食品等領域中，防止和治療由于各種疑難雜癥所引起的各種血管增生和形成。
文檔編號A61P35/00GK1899293SQ20061005258
公開日2007年1月24日 申請日期2006年7月21日 優先權日2006年7月21日
發明者陳海敏, 嚴小軍, 徐繼林 申請人:寧波大學