專利名稱：中藥地筍抗腫瘤、抗氧化有效部位及其制備方法和用途的制作方法
技術領域：
本發明涉及中藥地筍有效部位及其制備方法；本發明還涉以所說部位為有效成分的藥物組合物；本發明還涉及所說有效部位在制備藥物，特別是在制備抗氧化和抗腫瘤及其相關藥物中的應用。
背景技術：
地筍(Rhezoma Lycopi)始載于《嘉祐本草》，為唇形科植物毛葉地瓜兒苗Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel.的地下根莖，其味甘，性辛、溫。具有活血、益氣、消水的功能。用于治療吐血，衄血，產后腹痛帶下等癥。
其地上部分為中藥澤蘭，是一種常用活血化瘀中藥，主要活性成分為酚酸、黃酮類化合物。臨床用于治療心腦血管疾病，療效顯著。現代藥理學研究表明澤蘭具有改善微循環、利膽保肝、抗菌等作用。
隨著人類生活水平的提高，心血管疾病已成為當今世界上威脅人類健康的最嚴重疾病之一，其發病率和死亡率已超過腫瘤性疾病而躍居第一。因此，預防和治療心血管疾病和腫瘤藥物的研究，日益成為醫藥界的研究熱點。近年來的研究發現，心血管、腫瘤等多種疾病的產生和發展與體內多余自由基對組織細胞的損傷有密切關系。
目前，對于地筍的研究報道較少。藥理活性研究結果表明，地筍醇提物和水提物均未出現明顯的小鼠急性毒性；地筍醇提物具有解痙、抗炎、抗應激能力、降低紅細胞壓積作用；地筍水提物具有抗炎、抗應激能力、升高紅細胞壓積作用。化學成分研究顯示，地筍含有豐富的淀粉、蛋白質、礦物質、糖類以及三萜酸類。迄今為止，尚未見到有關地筍有效部位及其制備方法和抗氧化、抗腫瘤作用方面的報道。
本發明的目的之一，是提供一種地筍抗氧化有效部位及其制備方法。
本發明的目的之二，是提供一種地筍抗腫瘤有效部位及其制備方法。
本發明的目的之三，是提供一種以所說部位為有效成分的藥物組合物。
本發明的目的之四，是提供所說有效部位在制備抗氧化、抗腫瘤及相關藥物中的應用。
發明內容
本發明利用高通量方法，篩選地筍各萃取部位的抗氧化及抗腫瘤活性，確定了具有抗氧化和抗腫瘤活性的地筍有效部位及其制備方法。
本發明所說地筍提取物有效部位，選自用正己烷提取地筍得到的正己烷部位以及用乙酸乙酯和正丁醇萃取得到的乙酸乙酯部位和正丁醇部位之一及其組合。
乙酸乙酯部位(RLE-E)和正丁醇部位(RLE-B)主要含有酚酸類和黃酮類成分，具有抗氧化作用，其中乙酸乙酯部位經過HPLC和LC-MS鑒定含有迷迭香酸、咖啡酸、原兒茶醛、原兒茶酸；正己烷部位(RLE-H)與乙酸乙酯部位(RLE-E)具有治療腫瘤的作用，其中正己烷部位(RLE-H)主要含有脂肪酸、三萜酸、萜類等成分。
本發明的活性部位可以經過提取、濃縮、系列萃取得到，其制備方法可以采用以下步驟1)以毛葉地瓜兒苗根莖為原料，正己烷回流提取，濾液回收溶劑得正己烷部位(RLE-H)；殘渣用乙醇回流提取，濾液回收溶劑，得浸膏(RLE)；2)將浸膏用水分散，依次采用不同極性溶劑萃取，得到各相關部位。
本發明還提供了以所說方法制備的各活性部位的藥物組合物。所說藥物組合物是以本發明的活性部位為有效成分，與藥學上可接受的載體所組成的。本發明的藥物組合物以適合藥用的制劑形式存在，這些制劑形式可以是片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、緩釋片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、緩釋膠囊劑、口服液、合劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、粉針劑、凍干粉針劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、滴丸劑、貼劑等。
本發明進一步提供了各活性部位在制備治療和/或預防氧化或腫瘤藥物中的應用。本發明為此進行了相關試驗，其中抗氧化活性試驗以清除超氧陰離子自由基能力、還原Fe3+能力及抑制脂質過氧化能力為活性指標；抗腫瘤活性試驗以抑制HepG2和HL-60細胞增殖能力為活性指標。實驗結果表明，乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有明顯的體外清除超氧陰離子自由基的能力(RLE-EIC50＝38.30±5.52；RLE-B IC50＝27.91±5.36)、還原Fe3+能力(樣品濃度為50μg/mL時，RLE-E OD＝0.6443±0.0810；RLE-B OD＝0.3078±0.0576)及抗大鼠肝微粒體脂質過氧化活性(RLE-E IC50＝45.95±3.97；RLE-B IC50＝52.97±1.01)，具有抗氧化作用，可用于制備抗氧化藥物；正己烷部位(RLE-H)在體外細胞毒實驗中，可抑制HepG2的增殖(IC50＝156.57±5.41)；乙酸乙酯部位(RLE-E)在體外細胞毒實驗中可抑制HL-60的增殖(IC50＝121.93±2.02)，具有細胞毒作用，可用于制備抗腫瘤藥物。
具體實施例方式下面所列實施例有助于本領域技術人員更好地理解本發明，但不以任何方式限制本發明。
實施例1有效部位的制備方法取毛葉地瓜兒苗(Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel.)根莖120g，用正己烷回流提取兩次，第一次600mL提取2小時，第二次400mL提取1小時，過濾，合并濾液，回收正己烷，得正己烷部位(RLE-H)；殘渣分別用70％和50％乙醇回流提取兩次，第一次1200mL提取2小時，第二次960mL提取1.5小時，過濾，合并濾液，回收乙醇，得浸膏(RLE)；將浸膏用150mL水溶解后，依次用乙酸乙酯(150mL/次*5次)，正丁醇(150mL/次*5次)萃取，分別回收溶劑，得到乙酸乙酯部位(RLE-E)、正丁醇部位(RLE-B)和水部位(RLE-W)。
實施例2清除超氧陰離子活性試驗采用魯米諾(Sigma公司)增強化學發光法測定PMS/NADH(還原型輔酶I)體系生成的超氧陰離子。實驗反應總體積為100μL，反應體系中包括NADH(73μmol/L)，PMS(硫酸甲酯酚嗪)(15μmol/L)，luminol(100μmol/L)，硼砂/鹽酸緩沖液(0.05M，pH 8.91)及不同濃度的樣品。將待測樣品及各反應試劑加入BMG不透明96孔板(Hitachi公司)，反應由PMS引發，反應液振蕩混勻后立即上Topcount化學發光測定儀(Hitachi公司)檢測發光強度值(countper second，CPS)，測定溫度19.1℃，每孔測定3秒鐘。樣品對超氧陰離子的清除率按下式計算清除率(％)＝(CPS空白-CPS樣品)/CPS空白×100％，(表1)其中CPS空白-空白對照組化學發光強度值；CPS樣品-加樣品組化學發光強度值。
實施例3還原Fe3+能力測定待測樣品還原能力的測定根據文獻(Suzuki YJ，Tsuchiya M，Packer L..FreeRadic Res Commun.1991，15(5)255-263.)方法進行改進。以去離子水分別配制2mM的FeCl3和鄰菲羅林(北京化學試劑公司)溶液，于實驗前將二者按1∶1體積比混合。混合液加入96孔細胞培養板，90μl/孔，然后加入不同濃度的待測樣品10μl/孔，陽性對照組加入維生素C(Vit C，Sigma公司)，空白對照組以去離子水代替待測樣品。振蕩混勻后于室溫下靜置30分鐘，用Zenyth 200rt可見/紫外全波長分光光度計(Anthos Co.Austria)測定各孔吸光度值，測定波長516nm(表1)。
實施例4抑制脂質過氧化實驗①大鼠肝微粒體的提取Wistar大鼠，雄性，體重200±20g(購自中國醫學科學院動物研究所)，禁食不禁水過夜，斷頭處死。用冷的TMS緩沖液(Tris-HCl0.05mmol/L，蔗糖0.2mmol/L，MgCl2溶液3mmol/L，pH 7.4)經肝門靜脈沖洗肝臟，至肝臟顏色變為土黃色。迅速取出肝臟剔除筋膜并剪碎，于冰浴下用玻璃勻漿器制成肝勻漿(5mL TMS/g肝臟)。勻漿1000g，4℃離心5min，取上清1.2×104g，4℃離心20分鐘，再將上清1.05×105g，4℃離心60分鐘，沉淀即為肝微粒體。將其重懸于TMS緩沖液中，用Lowry法進行微粒體蛋白定量，并稀釋至蛋白含量為15g/L。肝微粒體儲存于-20℃冰箱備用。
②Fe2+-半胱氨酸反應系統誘導肝微粒體脂質過氧化TMS稀釋肝微粒體至蛋白濃度為1500μg/mL，在96孔板檢測樣品抗脂質過氧化活性。反應液總體積100μL(肝微粒體50μL；FeSO420μL；半胱氨酸(1mmol/L，Sigma)20μL，不同被試物質10μL，空白對照加等體積生理鹽水)，混勻后，37℃孵育30分鐘，然后加入100μL；TBA反應液(硫代巴比妥酸)，封板膜封96孔板后60℃水浴加熱30分鐘，在Zenyth200st分光光度計上測定各孔吸光度值，測定波長532nm。按照下面的公式計算樣品對硫酸亞鐵/半胱氨酸誘導的肝微粒體脂質過氧化反應的抑制活性抑制率(％)＝(A空白-A樣品)/A空白×100％(表1)其中A空白空白的吸光度值；A樣品樣品的吸光度值。
實施例5抗腫瘤活性試驗取人肝癌細胞株(HepG2)和人急性早幼粒白血病細胞株(HL-60)(購自美國ATCC)，以含10％胎牛血清(Hyclone公司)的RPMI-1640完全培養基(Sigma公司)，在37℃，飽和濕度，含體積分數為5％CO2、95％空氣的二氧化碳培養箱中常規培養，2-3天傳代一次。取對數生長期細胞，以0.125％胰酶(Sigma公司)消化后，PBS(磷酸鹽緩沖液)(0.05mol/L，pH 7.4)洗滌2次，完全培養基重新懸浮，顯微鏡下細胞計數板計數并調整細胞濃度為1×105/mL，鋪96孔細胞培養板，100μL/孔，培養過夜，使細胞貼壁。加入待測樣品，10μL/孔，空白孔加10μL生理鹽水，培養48小時。棄去上清，PBS洗滌細胞2次，加入含0.04％四氮唑溴MTT(Amresco公司)的培養基，100μL/孔，再培養4小時。棄去上清，加DMSO 100μL/孔，振蕩10分鐘使生成物formazan(甲瓚)充分溶解，在Zenyth200st酶標儀上測定各孔吸光度值，測定波長570nm。腫瘤細胞增殖抑制活性率按照下式計算抑制率(％)＝(A空白-A樣品)/A空白×100％(表1)計算50％細胞殺傷時的藥物濃度(IC50)，IC50采用加權直線回歸法進行處理。
表1 地筍及不同極性部位抗氧化和抗腫瘤活性篩選
注**P＜0.01 vs control.，IC50±s，n＝3結果表明采用本發明制備工藝得到的乙酸乙酯部位(RLE-E)和正丁醇部位(RLE-B)具有顯著的抗氧化活性；正己烷部位(RLE-H)和乙酸乙酯部位(RLE-E)具有抗腫瘤活性。
權利要求
1.一組具有抗氧化和抗腫瘤作用的地筍活性部位，其特征是所說部位選自用正己烷提取地筍得到的正己烷部位(RLE-H)以及用乙酸乙酯和正丁醇萃取得到的乙酸乙酯部位(RLE-E)和正丁醇部位(RLE-B)之一及其組合。
2.如權利要求1所說的有效部位，其中乙酸乙酯部位(RLE-E)和正丁醇部位(RLE-B)主要含有酚酸類和黃酮類成分，具有抗氧化作用，經HPLC和LC-MS鑒定，乙酸乙酯部位含有迷迭香酸、咖啡酸、原兒茶醛和原兒茶酸；正己烷部位(RLE-H)主要含有脂肪酸、三萜酸及萜類成分，具有抗腫瘤作用。
3.一種制備如權利要求1所述活性部位的方法，其特征是所說方法包括以下步驟1)毛葉地瓜兒苗(Lycopus lucidus Turcz.var.hirtus Regel.)根莖為原料，正己烷回流提取，回收溶劑，得正己烷部位(RLE-H)；殘渣用乙醇回流提取，回收溶劑，得到浸膏(RLE)；2)浸膏用水分散，依次經過石油醚、乙酸乙酯，正丁醇萃取，得到乙酸乙酯部位(RLE-E)、正丁醇部位(RLE-B)和水部位(RLE-W)。
4.如權利要求3所述的方法，其特征是步驟1)中用正己烷回流提取兩次，第一次提取2小時，第二次提取1小時；步驟1)中乙醇濃度分別為70％和50％，回流提取兩次，第一次提取2小時，第二次提取1.5小時。
5.權利要求1所述活性部位作為有效成分與藥學上可接受的載體組成的藥物組合物。
6.權利要求5所述藥物組合物的制劑形式可以是片劑、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、緩釋片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、緩釋膠囊劑、口服液、合劑、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、溶液劑、注射劑、粉針劑、凍干粉針劑、栓劑、軟膏劑、硬膏劑、霜劑、噴霧劑、滴劑、滴丸劑和貼劑。
7.權利要求1所述活性部位在制備抗氧化和抗腫瘤藥物中的應用。
8.權利要求5所述組合物在制備抗氧化和抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及中藥地筍有效部位及其制備方法，以所說部位作為有效成分的藥物組合物以及有效部位在制備抗氧化和抗腫瘤藥物中的應用，所說地筍提取物有效部位選自用正己烷提取地筍得到的正己烷部位、用乙酸乙酯和正丁醇萃取得到的乙酸乙酯部位和正丁醇部位之一及其組合，其中，乙酸乙酯部位和正丁醇部位具有明顯的體外清除超氧陰離子自由基能力、還原Fe
文檔編號A61K125/00GK1907325SQ20061011168
公開日2007年2月7日 申請日期2006年8月22日 優先權日2006年8月22日
發明者肖培根, 聶波, 劉勇, 梁鑫淼, 杜冠華 申請人:肖培根