腎移植排斥反應抑制劑的制作方法

專利名稱：腎移植排斥反應抑制劑的制作方法
技術領域：
本發明涉及腎移植排斥反應抑制劑。特別是，本發明涉及抗C D80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段在制備腎臟移植排斥反應抑制劑中的應用。
背景技術：
器官移植是內科療法以及外科處置中，對那些無法選擇其他的方法進行治療的疾患所采取的療法。接受臟器移植的患者，為了抑制T細胞所導致的急性排斥反應，手術后必須每天投與非特異性免疫抑制劑。然而，像預防腎移植器官排斥反應的鈣調神經磷酸酶抑制劑(calcineurin repressor)以及類固醇等的免疫抑制劑，都有可能導致由于免疫力異常低下引起的感染，高血壓，高脂血癥，腎臟毒性以及癌癥的發生。
為了克服上述非特異性免疫抑制劑所存在的問題，最好是能夠有針對性地抑制具有同種異體反應性(alloreactivity)排斥反應的T細胞，誘導其產生對移植器官的免疫寬容。用于誘導免疫寬容的一個方法，就是對共同的刺激分子使用單克隆抗體(以下用[mAb]表示)，在短期內進行免疫寬容誘導處置。已經證明，只要阻斷嚙齒類動物體內CD28/B7或者是CD40/CD40L的反應途徑，就能夠延長同種心臟移植器官的存活時間(Lenschow，D.J.et al.(1992)Science.257789-791；Lenschow，D.J.et al.(1995) Transplantation. 601171-1178；Bashuda，H.et al.(1996)Transplant. Proc.281039-1041；Larsen，C.P.et al.(1996)Transplantation.614-9；Larsen，C.P.et al.(1996) Nature.381434-438)。然而也有報告稱，對于小鼠器官移植動物模型，實施阻斷共同的刺激分子的方法沒有奏效(Li，Y.et al.(1999)Nat.Med.51298-1302；Dharnidharka，V.R.，Schowengerdt，K.，and Skoda-Smith，S.(2000)Nat.Med.6115)。
使用mAb進行免疫寬容誘導處置的其他例子還有，通過對獼猴使用抗CD40L mAb以及CTL-associated antigen-4(CTLA-4)Ig(Kirk，A.D.et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.948789-8794)，或者使用抗CD40L mAb進行單獨免疫寬容誘導處置(Kirk，A.D.et al.(1999)Nat.Med.5686-693)，證明可以有效地延長同種腎移植的存活時間，并被認為有應用于臨床治療的前景。然而，這種試驗藥物的臨床試驗，近幾年卻由于意想不到的血栓栓塞性的合并癥而被中止了(Kawai，T.，Andrews，D.，Colvin，R.B.，Sachs，D.H.，and Cosimi，A.B.(2000)Nat.Med.6114；Boumpas，D.T.et al.(2003)Arthritis Rheum.48719-727)。對人類使用mAb抑制CD40的效果，不像對獼猴那么理想，(Pearson，T.C.et al.(2002)Transplantation.74933-940)。像這樣，對于大型動物模型，盡管采取了種種旨在減少使用同種移植免疫抑制劑的嘗試(Kirk，A.D.(2003)Immunol.Rev.196176-196)，但對于包括人類在內的靈長類來說，要達到對同種移植器官的免疫寬容仍然是非常困難的。
近年來通過在活體外和活體內的試驗，已經證實了無細胞免疫反應性T細胞，具有抑制因子活性的功能(Lombardi，G.，Sidhu，S.，Batchelor，R.，and Lechler，R.(1994)Science.2641587-1589；Chai，J.G.et al.(1999)Eur.J.Immunol.29686-692；Luo，Z.J.et al.(2000)Transplantation.692144-2148)。無細胞免疫反應性T細胞被應用于移植器官對于宿主的風險相對較低的，人的組織不適應性骨髓移植上(Guinan，E.C.et al.(1999)N.Engl.J.Med.3401704-1714)。

發明內容本發明的目的在于對接受腎移植的患者，即便不投與以前的非特異性免疫抑制劑，也可以有效地抑制腎移植的排斥反應。即提供一種新型的腎移植排斥反應抑制劑。
經過本專利發明者的潛心研究，在抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段存在的情況下，通過使用腎臟供體的同種抗原(alloantigen)，刺激從腎臟移植受體上采取的T細胞，并通過將這些接受過腎臟供體同種抗原刺激的T細胞，輸送回腎臟移植受體體內的方法，達到誘導腎臟移植受體產生對供體腎臟的免疫寬容，從而抑制腎臟移植后的排斥反應。這就是本專利發明所要達到的，即使不使用長期以來所使用的免疫抑制劑，也能夠達到防止排斥反應的效果。
本發明提供了一種腎移植排斥反應抑制劑，其通過以下方式制備在所述抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段存在下，通過使用來自腎臟供體外周血的同種抗原刺激從腎臟移植受體上采取的T細胞，其中經刺激的受體T細胞為腎臟移植排斥反應抑制劑的有效成分。
本發明提供了抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段在制備腎臟移植排斥反應抑制劑中的應用，其中，所述腎臟移植排斥反應抑制劑在所述抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段存在下，通過使用腎臟供體同種抗原刺激從腎臟移植受體上采取的T細胞得到，其中，所述受體T細胞為腎臟移植排斥反應抑制劑的有效成分。
即本發明所提供的是一種通過使用腎臟供體的同種抗原，在抗CD80抗體或者其抗原親和性片段以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段存在的情況下，刺激從腎臟移植受體上采取的T細胞所取得的，將上述受體T細胞作為有效成分的腎移植排斥反應抑制劑。
本發明使接受腎移植的患者，不必再長期接受免疫抑制劑，也能夠有效地抑制腎移植后的排斥反應。在解除了接受腎移植的患者長期接受免疫抑制劑的煩惱的同時，還可以避免由于接受免疫抑制劑而可能伴隨的免疫力異常低下而引起的感染，高血壓，高脂血癥，腎臟中毒以及癌癥發生的危險。
附圖簡要說明

圖1表示使用本發明的腎移植排斥反應抑制劑進行治療的實例概略圖，在有星狀記號的日期表示進行了CsA(8mg/kg/d)的肌肉內投與。在術后第6，7，8天進行了CP(30mg/kg)的肌肉內投與。在手術期間，供體以及受體都作了脾臟摘除。來自受體的脾臟T細胞，在有抗CD80/CD86 mAb存在的情況下，同經過13天放射線處理的供體脾細胞進行了共同培養，然后注射到受體體內，其后未進行任何其他的免疫抑制劑的投與。
圖2通過進行腎移植后的A群(n＝6)的血清肌酸酐濃度指標，反映移植腎的腎臟功能的一個圖表。涂黑的箭頭表示沒有發生排斥反應的生存狀態。
圖3表示受體(A群)CsA的全血中濃度(ng/ml)的一個圖表。從腎移植手術的當天到第7天以及第9，11，13天都進行了CsA(8mg/kg)的肌肉內注射。實線表示生存1年以上的動物(n＝3)；虛線表示1年以內死亡了的動物(n＝3)。
具體實施方式本發明是一種通過使用腎臟供體同種抗原(alloantigen)，在抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段存在的情況下，刺激從腎臟移植受體上采取的T細胞所取得的，將上述來自受體的T細胞作為有效成分的腎移植排斥反應抑制劑。通過給上述腎臟移植受體投與本發明的腎移植排斥反應抑制劑，能夠誘導受體產生對來自供體的腎臟的免疫寬容，從而達到抑制腎移植后排斥反應的目的。
在制作本發明的腎臟移植排斥反應抑制劑有效成分時，為了能在阻斷CD80以及CD86反應途徑的狀態下，使用供體的同種抗原刺激受體的T細胞，需要使用CD80以及CD86各自的抗體或抗原親合性片段(以下稱為″抗體等″)。抗體可以是多克隆抗體，也可以是單克隆抗體。所謂的抗原親和性片段是指和抗原有親和性的抗體片段，包括像Fab片段以及F(ab′)2片段那樣的抗體片段，抗體的輕鏈(light chain)和抗體的重鏈(heavy chain)，以及他們各自的可變域(Variable region)所組成的包括像ScFVs(single chain fragment of variable region)那樣的人工直鏈抗體。上述的抗體或抗原親和性片段，在制作本發明的腎移植排斥反應抑制劑有效成分時，最好是使用單克隆抗體。
來自受體的T細胞一般是從脾臟，或者是從末梢血中采取。
供體的異種抗原刺激最好是將來自受體的T細胞，和發現異種抗原的供體細胞進行共同培養后再實施，作為供體異種抗原來源的供體細胞，最好是從供體的脾細胞或者是從供體的末梢血，采取抗原提呈細胞(antigen presenting cell)。
來自受體的T細胞，最好是在抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段存在的情況下，和上述來自供體的細胞一起進行共同培養。共同培養最好放在液體培養基中進行浮游培養。開始培養時培養液中的來自受體T細胞的細胞密度，雖然沒有特殊的規定，一般為4×105個/mL～4×107個/mL左右、能控制在2×106個/mL～8×106個/Ml左右更好。來自受體的T細胞和來自供體細胞的混合比率雖然沒有特殊的規定，一般受體T細胞數和供體細胞數的比率為1∶0.5～1∶2左右、如果能控制在1∶0.7～1∶1.3左右更好、最好能達到1∶1左右。另外，供體細胞最好是經過放射線處理，使其喪失增殖能力后再進行培養。再有，添加在培養液中的抗CD80抗體以及抗CD86抗體等的濃度、雖然沒有特殊的規定，一般各自應控制在1μg/mL～100μg/mL左右、如果能控制在5μg/mL～20μg/mL更好。共同培養的時間、雖然沒有特殊的規定，一般應為6～24天左右、最好是在8～16天左右。
培養基可以使用過去培養T細胞所使用的培養基，例如，可以用市售的AIM-V培養基(Invitrogen Corp.)。培養基中最好添加受體的血清，濃度要求雖然沒有特殊的規定，一般來說培養基的最終濃度為0.5～2重量％左右、最好是控制在0.7～1.5重量％左右。培養條件最好在培養人的細胞所常用的加濕5％CO2，37℃的環境下進行。但也不必拘泥于這個條件。另外，共同培養分為2次進行，將經過第一次共同培養生存的T細胞回收后，最好是將該回收的T細胞和新鮮的來自供體的T細胞混合在一起，進行第二次共同培養。每次的共同培養都需要在抗CD80的抗體或者是抗原親和性片段，以及抗CD86的抗體或者是抗原親和性片段存在的情況下進行、每回共同培養的時間最好在3～12天左右。第一次和第二次共同培養需要的條件如上所述。通過上述的共同培養，受體T細胞對于供體細胞的敏感性將會消失，也就是說會成為無細胞免疫反應性的T細胞。
本發明的腎移植排斥反應抑制劑是，經過上述共同培養后即可成為將來自受體的T細胞，作為有效成分的制劑。從培養基中回收經過上述共同培養后的T細胞，最好是讓其浮遊在像生理鹽水等，適合輸送回受體體內的等浸透壓液體中，成為本發明的腎移植排斥反應抑制劑。此時不必將受體的T細胞和供體的細胞進行分離，即使含有供體的細胞也沒有關系。因為此時供體的細胞經過放射線處理已經喪失了增殖的能力，所以在共同培養中它不能增殖且數量較少，即使輸送到受體體內也不能分裂，不久會自行消亡。另外，投與用的浮游液中的受體T細胞的細胞密度，雖然沒有特殊的規定，一般控制在1×106個/mL～1×107個/mL左右。再者，進行共同培養所用的抗CD80抗體以及抗CD86抗體等，最好不要將其混入腎移植排斥反應抑制劑中，所以進行上述的共同培養以后，使用不含有這些抗體的培養基培養0.5-2天，然后進行清洗。在上述的浮游液中，可以含有1種或者是2種以上的添加劑，但是這些添加劑，是以不影響適合輸送回受體體內，而且具有等浸透壓等的生理學特性，并且不妨礙其有效成分的上述T細胞的效果為前提的。
本發明的腎移植排斥反應抑制劑，是非經口投與到受體體內的。作為非經口投與的方法有靜脈內，動脈內，肌肉內，腹腔內以及皮下投與等各種方法，最好的方法是通過靜脈內給腎移植受體投與。另外，投與量要根據受體的狀態，體重，年齡等條件進行適當的選擇。一般來說，受體T細胞的投與量一般每次為107個～109個左右，最好是能控制在5×107個～5×108個左右。作為本發明的腎移植排斥反應抑制劑，雖說可以分為多次進行投與，但只進行一次的投與也可以收到預期的效果。投與的時間一般在接受腎移植后的6-20天進行，最好是在10-16天后至少投與一次。另外，從腎移植后到投與本發明的腎移植排斥反應抑制劑這段時間內，最好是通過三甲基環己醇A等的免疫抑制劑的投與來防止排斥反應。
為了充分地發揮本發明的腎移植排斥反應抑制劑的效果，在投與腎移植排斥反應抑制劑前，通過cychlophosphamide(CP)等的投與，使受體體內的淋巴細胞減少，這一點是很重要的。減少淋巴細胞的處置，最好是在投與本發明腎移植排斥反應抑制劑前的3-9天進行。然后進行2-4天cychlophosphamide(CP)的連續投與。投與本發明的腎移植排斥反應抑制劑時，從抑制腎移植排斥反應的角度來看，此時受體血液中的淋巴細胞能應控制在1600個/mm3以下、最好是能控制在200～800個/mm3左右。
以下通過實驗例和比較例對本發明進行具體地說明，但絕不是說本發明僅局限于下列的實施例和比較例。(1)動物，MHC標記以及供體和受體的選擇從Hamri公司購入了一些對猴免疫不全病毒以及乙型肝炎病毒呈血清陰性反應的，非近親交配的年輕雄性獼猴Macaca mulatta(年齡2～3歲、體重3～4kg)，這些獼猴的外科處置以及手術后的處理，都是遵照非人靈長類實驗的基本原則(日本靈長類學會制定)，并得到了順天堂大學動物研究專門委員會的承認，有關供體和受體的組合以及第三者群的個體，選擇了MHC1組和2組遺傳基因排列不同的兩組。1組的不一致性正如Knechtle，S.J.et al.(1997)Transplantation 631-6中所記載的那樣、在作血清學的判斷以后又進行了1維等電聚焦電泳的鑒別。通過試管MLR測定了受體T細胞對于供體的敏感性。為了證實各種動物所具有的移植排斥性，對所有可能做為供體的動物進行了檢查。有關遺傳基因排列的不一致性正如Knapp，L.A.，et al.(1997)Immunogenetics 45171-179中所記載的那樣，通過變性劑濃度曲線凝膠電泳以及DRB の第二外顯子的直接順序進行了驗證。
(2)抗體從eBioscience Inc.(加利福尼亞州San Diego)獲取了針對人CD80及CD86的mAb抗體(分別為2D10和IT2.2)。又從BD Bioscience的Pharmingen購入了獼猴CD3-FITC(SP34)，獼猴CD4-PE(L200)，人CD20-PE(2H7)以及獼猴CD14-PE(M5E2)抗體。還有從eBioscience Inc獲取了CD25-FITC(M-A25 1)以及CD152-PE(14D3)抗體。
(3)腎移植排斥反應抑制劑的調制采用無菌操作取出脾臟，用機械方法將其切成碎末，放進含有自身的血清(來自受體本身)的AIM-V培養基(Invitrogen Corp.)中制成懸濁液，然后用尼龍篩網進行過濾，用同性質的溶液進行處理清除紅血球。來自受體的T細胞則是通過nylon column法過濾取得的。為了獲得無細胞免疫反應性細胞，我們將添加了受體血清的AIM-V培養基50ml的一個大的帶蓋玻璃細菌培養器(標號430599；Coming Inc.)中，在抗CD80/CD86 mAb(各10μg/ml)存在的情況下、對2×108個受體脾臟T細胞和經過30 Gy放射線照射過的供體脾細胞2×108個進行了共同培養。在加濕5％CO237℃的條件下培養了6天后，再對生存細胞進行了收集和計數。然后使用相同數量的經過放射線照射過的供體脾細胞，對這些脾細胞在抗CD80/CD86 mAb存在的情況下，進行了6天的再刺激。經過3次清洗后，再放在沒有mAb抗體的培養基中培養1天，對生存細胞進行收集后，用50ml的生理鹽水制成懸濁液，做好進行受體靜脈內投與的準備。
(4)混合淋巴細胞培養反應(MLR)從獼猴身上取得的末梢血，通過Separate-L(Muto Pure ChemicalsCo.，Ltd.)的離心后制取PBMC(末梢血単核細胞)。CD4+T細胞是通過非標記CD4+8T細胞的Untouched CD4+T cell Isolation Kit(MiltenyiBiotec)陰極板提純方式制取的。CD4+T細胞或者經過上述培養獲得的無細胞免疫反應性T細胞(105個)，是在圓形96孔板(標號3799；ComingInc.)中、在使用或者不使用10μg/ml的抗CD80/CD86 mAb，或者10單位的替換IL-2(鹽野義制藥公司產品)的情況下、進行了與經過30Gy放射線處理過的相同數量的供體脾細胞的共同培養。該細胞的培養大約需要3-7天，在培養的最后的18小時使用10μCi的[3H]胸腺嘧啶脫氧核苷進行了脈沖刺激。所取得的放射能量是通過1450 MicroBetacounter(PerkinElmer)進行測定的。
(5)腎移植腎移植在上述通過MHC以及MLR的分析，被判定為組織不適應性的一對供體和受體之間進行。供體和受體的動物的麻醉是通過按1mg/kg肌肉內注射氯胺酮(三共公司產品)，以及按1mg/kg注射XYLAZINE.(Bayer AG公司產品)進行的。供體和受體在手術過程中都進行了脾臟摘除。在摘取移植腎時，對供體進行了肝素處理(100U/kg)。在進行同種腎移植時，為了有利于供體的腎動脈同受體的遠端大動脈之間的縫合，以及供體的腎靜脈同受體的大靜脈之間的縫合，采用了標準的顯微血管技術。接著實施了一次尿管新膀胱的縫合。在腹腔縫合以前進行兩側未處置腎的摘除。對于這些動物，在它們恢復進食以前提供了48小時的靜脈營養。作為外科手術后的抗菌預防措施，實施了3天頭孢美唑(三共公司產品)的投與。
(6)腎移植后的處置從手術當天到術后第7天以及術后的第9，11，13天時，都要對腎移植受體進行脂溶性三甲基環己醇A(CsA)8mg/kg(Sandimmune；Novartis Pharma AG)的肌肉內投與，為了在乙醇抽出后，使用放射性分析測定CsA的濃度，每周抽取了2次EDTA血樣，為了減少受體的白血球，腎移植后的第6天到第8天，每天都要進行30mg/kg的cychlophosphamide(CP)的肌肉內投與(鹽野義制藥公司產品)。術后第13天進行無細胞免疫反應性細胞的靜脈內接種，以后再沒有進行任何免疫抑制劑的投與(A群、n＝6、図1)。對血清肌酸酐，血中尿素氮，全蛋白質以及血紅蛋白濃度，紅細胞壓積，白血球數，血小板數等，移植后3個月內要每周測定2次，以后要每2周測定1次。
(7)統計學的解析數據用平均值±SD來表示，將2種處置群所獲得的數值用StatView 4.5 for Macintosh(SAS Institute Inc.)統計軟件進行處理、并通過非參數的(non-parametric)Mann-Whitney U檢測進行比較，以有意概率P＜0.05作為判斷基準。
(8)移植腎沒有成活的個體的判斷和處置依據美國實驗動物管理認定協會(American Association forAccreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC))的標準，當血清的肌酸酐不斷上升導致發生了腎功能不全，或者是確認體重同移植前比較下降了15％的時候，可以對進行實驗的獼猴實施安樂死。
(9)組織像的觀察方法為了進行組織學的評價，使用有20種規格針孔的裝置(Biopsy-Cut；Bard)，從一部分動物實驗個體上獲取了腎臟活檢的試料。對于那些死亡的獼猴進行了全面徹底的分析，以及組織病理學的解析。為了對腎臟活檢以及剖檢的樣品進行光學顯微鏡檢查，在稀釋的10％的甲醛溶液中將組織固定，并用石蠟包埋。為了做組織學的檢查，進行了H&E和PAS的染色。使用Movat pentachrome進行彈性纖維染色，確認了血管中的變化。
(10)A群個體腎移植后情況的觀察在A群中有3只(獼猴)的生存時間很長(實驗結束后生存了410天-880天)。正如后面敘述的那樣，有1只獼猴由于患急性腎功能不全在手術后75天死亡(見表1)。為了進行組織學性狀的解析所做的腎活檢的1只獼猴，由于腎活檢后的出血無法控制，在手術后81天死亡。而在手術后212天死亡的1只獼猴，雖然死亡前曾出現過血清肌酸酐濃度上升的現象，但死亡的原因并不是典型的急性或者是慢性的排斥反應，而被推測為死于尿路狹窄引起的腎積水。A群移植腎的平均生存天數為416±365天。生存期較長的3只獼猴，雖然手術后14天以內血清肌酸酐的濃度略有上升，但是，在進行無細胞免疫反應性細胞接種以后，再沒有出現過移植腎的腎功能異常的情況(見圖2)，血清CsA的濃度接種時為92～142ng/ml，以后數值逐漸降低，最后一次投與約經過45～60天以后，已經無法測出血清CsA的濃度(見圖3)。至實驗結束時為止，這些獼猴都沒有發生感染和惡性疾患。
(11)關于無細胞免疫反應性細胞的數量和腎移植排斥反應抑制劑的效果投與了含有6×107個以上的無細胞免疫反應性細胞的腎移植排斥反應抑制劑的個體、血清肌酸酐濃度在手術后第7天達到1.2±0.4mg/dl、其后逐漸降低。但是，投與了含有4×106個無細胞免疫反應性細胞的腎移植排斥反應抑制劑的個體、血清肌酸酐濃度在手術后第67天開始逐漸上升，在手術后第75天死于因細胞性排斥反應引起的急性腎功能不全(見表1)。由此可見如果不含有足夠的無細胞免疫反應性細胞的話，恐怕無法達到腎移植排斥反應抑制劑所預期的效果。
表1
表2
表中的數值是平均值±SD。對所有的受體都進行了脾臟摘除。[生存]欄的數值是表示本群各動物的相關數值。分別為A急性腎功能不全引起的死亡；B4×106個細胞接種；C腎活檢查后因失血而引起的死亡；D因尿管狹窄導致腎積水而引起的死亡等。
(12)A群個體移植腎的組織像對術后75天，810天以及尸檢個體的移植腎上獲取部分腎臟組織進行了檢查。結果發現，在A群獼猴中，移植腎的構造保持良好，移植腎中沒有發現腎小管炎以及腎小球炎的跡象，血管中也沒有內膜的過度形成或者是肥厚的現象，在生存期較長的動物的細胞壁里，也沒有偶發性炎癥細胞的出現。上述在術后81天和212天死亡的2只獼猴中，也沒有發現腎小管浸潤和腎小球的損傷，以及軟組織壞死等的跡象。
比較例1B群(n＝5)在腎移植后除了沒有投與本發明的腎移植排斥反應抑制劑以外，其他的條件均與A群相同，觀察的結果，5只獼猴在手術后15-28天以內，全部死于急性排斥性反應(見表1)，移植腎的平均生存天數為22±6.5日；n＝5；P＜0.005、顯示出了同A群的明顯的差異。
比較例2對于個體群C群(n＝5)使用的腎移植排斥反應抑制劑，不是用來自供體的T細胞而是用來自第三者群采集的細胞進行共同培養而制成的，對于除此之外其他的條件均與A群相同，術后觀察的結果，5只獼猴全部死于急性排斥性反應(見表1)。移植腎的平均存活天數為47.0±19.0日；n＝5；P＜0.005、顯示出了同A群的明顯的差異。
參考例對除了在腎移植手術后不進行CP的投與外，其他的條件均與A群相同的個體群D群(n＝2)術后觀察的結果，A群的個體、在投與本發明腎移植排斥反應抑制劑時的淋巴細胞數為200～800個/mm3、嗜中細胞以及血小板數分別為1,540±470個/mm3，37.4×104±4.0×104個/mm3、相比之下、D群的淋巴細胞數為3,920±120個/mm3。對于D群的獼猴，盡管投與了含有9×107±0.5×107個無細胞免疫性細胞的腎移植排斥反應抑制劑，但是，在術后27天和28天，死于急性排斥反應。由此可見，在投與本發明的腎移植排斥反應抑制劑時，受體體內的淋巴細胞的數量在沒有降低到適當的程度時，恐怕無法達到腎移植排斥反應抑制劑所預期的效果。
比較例3對來自供體的T細胞和來自受體的T細胞進行共同培養時，除了使用在培養基中只添加抗CD86 mAb來制作腎移植排斥反應抑制劑以外，其他的條件均與A群相同的個體群E群(n＝4)，以及除了使用在培養基中只添加抗CD80 mAb來制作腎移植排斥反應抑制劑以外，其他的條件均與A群相同的個體群F群(n＝1)進行術后觀察的結果，發現這些個體只是移植腎的生存時間延長了43-111天，效果并不十分理想。這些個體死亡前5-7天血清肌酸酐的濃度有所上升。在對E群出現排斥反應的所有移植腎的組織學檢查中，發現了有并發腎小管炎、腎小管損傷以及腎小球的損害、間質中的単核細胞導致的散在性的浸潤，以及由于小動脈的內膜增厚而引起的嚴重的內皮炎、由此可以證明了發生過急性細胞性排斥反應。
比較例4由于從供體的脾臟取得供體T細胞的方法大大限制了本發明在實踐中的應用，發明者在上述其他條件相同的情況下，采用從供體外周血中采取T細胞的方法進行了試驗。所用抗CD80/CD86抗體的濃度分別為1、5、10ug/ml。結果參見表2。在抗體濃度為5和10ug/ml時，采用從外周血取得的T細胞處理的方法同樣使得生存時間得到了顯著性的延長。
參考文獻非專利文獻1Lenschow，D.J.et al.(1992)Science.257789-79非專利文獻2Lenschow，D.J.et al.(1995)Transplantation.601171-1178非專利文獻3Bashuda，H.et al.(1996)Transplant.Proc.281039-10非專利文獻4Larsen，C.P.et al.(1996)Transplantation.614-9非專利文獻5Larsen，C.P.et al.(1996)Nature.381434-438非專利文獻6Li，Y.et al.(1999)Nat.Med 51298-130非專利文獻7Dharnidharka，V.R.，Schowengerdt，K.，andSkoda-Smith，S.(2000)Nat.Med 611非專利文獻8Kirk，A.D.et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.948789-879非專利文獻9Kirk，A.D.et al.(1999)Nat.Med.5686-69非專利文獻10Kawai，T.，Andrews，D.，Colvin，R.B.，Sachs，D.H.，and Cosimi，A.B.(2000)Nat.Med.611非專利文獻11Boumpas，D.T.et al.(2003)Arthritis Rheum.48719-72非專利文獻12Pearson，T.C.et al.(2002)Transplantation.74933-940非專利文獻13Kirk，A.D.(2003)Immunol.Rev.196176-19非專利文獻14Lombardi，G，Sidhu，S.，Batchelor，R.，andLechler，R.(1994)Science.2641587-1589非專利文獻15Chai，J.G.et al.(1999)Eur.J.Immunol.29686-69非專利文獻16Luo，Z.J.et al.(2000)Transplantation.692144-2148非專利文獻17Guinan，E.C.et al.(1999)N.Engl.J.Med.3401704-171非專利文獻18Alexander，J.W.et al.(1984)Transplantation.37467-470非專利文獻19Knechtle，S.J.et al.(1997)Transplantation631-非專利文獻20Knapp，L.A.，et al.(1997)Immunogenetics45171-179
權利要求
1.一種腎移植排斥反應抑制劑，其通過以下方式制備在所述抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段存在下，通過使用來自腎臟供體外周血的同種抗原刺激從腎臟移植受體上采取的T細胞，其中經刺激的受體T細胞為腎臟移植排斥反應抑制劑的有效成分。
2.根據權利要求1的腎移植排斥反應抑制劑，其中所述同種抗原刺激，是在所述受體T細胞和發現了同種抗原的供體細胞共同培養的條件下進行的。
3.根據權利要求2所述的腎移植排斥反應抑制劑，其中抗CD80抗體以及抗CD86抗體是單克隆抗體。
4.根據權利要求2任一項所述的腎移植排斥反應抑制劑，其中所述供體細胞是已經喪失了增殖能力的細胞。
5.根據權利要求4的腎移植排斥反應抑制劑，其中供體細胞是經過放射線處理喪失了增殖能力的細胞。
6.根據權利要求2的腎移植排斥反應抑制劑，其中共同培養需要6-24天的時間。
7.根據權利要求6的腎移植排斥反應抑制劑，其中共同培養需要經過8-16天的時間。
8.根據權利要求2的腎移植排斥反應抑制劑，其中共同培養分為兩次進行，將第一次共同培養中存活的T細胞，提供給第二次共同培養使用。
9.根據權利要求8的腎移植排斥反應抑制劑，其中第一次和第二次的共同培養各需要經過3-12天的時間。
10.根據權利要求1-9任一項的腎移植排斥反應抑制劑，其中所述的抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段的濃度是5μg/ml。
11.根據權利要求2的腎移植排斥反應抑制劑，其中受體T細胞數和供體細胞數的比率為1∶0.5～1∶2。
12.根據權利要求2的腎移植排斥反應抑制劑，其中受體T細胞數和供體細胞數的比率為1∶1。
13.抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段在制備腎臟移植排斥反應抑制劑中的應用，其中，所述腎臟移植排斥反應抑制劑在所述抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段存在下，通過使用來自腎臟供體外周血的同種抗原刺激從腎臟移植受體上采取的T細胞得到，其中，所述受體T細胞為腎臟移植排斥反應抑制劑的有效成分。
14.根據權利要求13的應用，其中所述同種抗原刺激，是在所述受體T細胞和發現了同種抗原的供體細胞共同培養的條件下進行的。
15.根據權利要求14所述的應用，其中抗CD80抗體以及抗CD86抗體是單克隆抗體。
16.根據權利要求14任一項所述的應用，其中所述供體細胞是已經喪失了增殖能力的細胞。
17.根據權利要求16的應用，其中供體細胞是經過放射線處理喪失了增殖能力的細胞。
18.根據權利要求14的應用，其中共同培養需要6-24天的時間。
19.根據權利要求18的應用，其中共同培養需要經過8-16天的時間。
20.根據權利要求14的應用，其中共同培養分為兩次進行，將第一次共同培養中存活的T細胞，提供給第二次共同培養使用。
21.根據權利要求20的應用，其中第一次和第二次的共同培養各需要經過3-12天的時間。
22.根據權利要求13-21任一項的應用，其中所述的抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段的濃度是5μg/ml。
23.根據權利要求14的應用，其中受體T細胞數和供體細胞數的比率為1∶0.5～1∶2。
24.根據權利要求14的應用，其中受體T細胞數和供體細胞數的比率為1∶1。
全文摘要
本發明提供了一種腎移植排斥反應抑制劑。本發明的腎臟移植排斥反應抑制劑在抗CD80抗體或者其抗原親和性片段，以及抗CD86抗體或者其抗原親和性片段存在下，通過使用腎臟供體同種抗原刺激從腎臟移植受體上采取的T細胞得到，其中，所述受體T細胞為腎臟移植排斥反應抑制劑的有效成分。
文檔編號A61P37/06GK1969883SQ200610146509
公開日2007年5月30日 申請日期2006年11月14日 優先權日2005年11月14日
發明者奧村康, 場集田壽, 陳建君 申請人:科羅斯生物技術株式會社