硬化素與Wnt信號通路和骨形成的抑制的制作方法

專利名稱：硬化素與Wnt信號通路和骨形成的抑制的制作方法
技術領域：
本發明涉及蛋白質硬化素(sclerostin)，該蛋白質是Wnt蛋白質的拮抗劑和/或 抑制劑。當硬化素結合LRP5受體或LRP6受體(LRP5/6)時，抑制Wnt信號并因此抑制骨形 成。本發明涉及硬化素在治療骨折、骨疾病、骨損傷、骨異常、腫瘤或生長方面的治療方法、 組合物和應用領域。更具體地，組合物和方法指向阻斷硬化素的化合物，從而允許骨形成發 生。通過多種篩選方法和測定從美國國立癌癥研究所(NCI)的數據庫確定化合物。這些化 合物還可以被修飾來以創建在NCI數據庫中或自然界中沒有的但也具有有效功能的衍生 物或類似物。在本申請中引用的或指明的所有專利、專利申請、專利公開、科學文獻等，都被整 體引入此處作為參考，來更全面的揭示發明所屬領域的技術水平。
背景技術：
分泌性糖蛋白中的Wnt家族是發育中重要信號分子的主要家族之一，在胚胎誘 導、產生細胞極性和規范細胞命運中扮演重要角色。遺傳和生化研究都表明frizzled(Fz) 和LRP5/6是傳導經典Wnt (canonical ffnt)信號的共受體，最終導致β -連環蛋白 (β-catenin)穩定化并通過轉錄調控子調控基因轉錄，所述轉錄調控子包括淋巴增強 因子-I(LEF-I)和T細胞因子(TCF)。Wnt信號還受到一些天然產生的拮抗劑，包括 Dickkopf(Dkk)分子的調控。最初，第一個Dkk(Xen0pusDkk-l)最初被發現作為Wnt拮抗 劑在頭部形成中扮演重要角色。到目前為止，在哺乳動物中已經確定了 4個Dkk成員。不 過只有前兩個成員(Dkkl和Dkk2)作為經典Wnt信號拮抗劑的功能被研究比較透徹。Dkkl 和Dkk2通過同時結合LRP5/6和一個被稱為Kremen的單獨跨膜蛋白來拮抗經典Wnt信號。 進一步研究發現Dkkl和Dkk2的第二個(不是第一個)富含半胱氨酸結構域抑制經典Wnt 信號。許多證據表明增強LRP5/6介導的經典Wnt信號導致骨量增加。LRP5中發生失去 功能性突變引起人骨質疏松假神經膠質瘤綜合征(0PPG，是一種常染色體隱性遺傳疾病)， 據推測獲得功能突變(包括谷氨酸171-纈氨酸替換)和人高骨量(HBM)表型相關。此外， 通過基因打靶使LRP5基因失活的小鼠顯示出和OPPG患者相似的表型，并且在小鼠中轉基 因表達LRP5emv導致HBM。并且，小鼠原代成骨細胞在缺乏LRP5時顯示出降低的對Wnt的應 答性和低水平的增殖指數。并且，在類成骨細胞中，經典Wnt或激活的β-連環蛋白刺激經 典Wnt信號活性并誘導產生一種成骨細胞標志物-堿性磷酸酯酶(AP)。Wnt拮抗劑sFRPl失活增強小梁骨增長的發現進一步支持了經典Wnt信號增強骨形成的觀點。Dkkl在分化的 成骨細胞和骨細胞中表達，并且LRP5中的G171V突變有可能通過衰減Dkkl對經典Wnt信 號的拮抗效果引起HBM表型。Itasaki等人揭示了一個新的Wnt拮抗劑，被稱為WISE。WISE有可能是一種環境 依賴的(context-d印endenOWnt信號調節子；它在非洲蟾蜍中的不同檢測中可以抑制或 刺激Wnt信號。WISE還顯示出結合LRP6的活性，并且和Wnt8競爭結合LRP6。WISE和SOST 的基因產物硬化素具有38%的氨基酸一致性。SOST的失去功能性突變導致常染色體隱性 遺傳硬化素骨病。以前的實驗顯示，硬化素在骨細胞中高表達，有可能是骨形態發生蛋白 (BMP)拮抗劑，不過另外的研究認為硬化素可能不是有功能的BMP拮抗劑，并且推測它可能 調節Wnt信號。在本報告中，我們現在清楚的證明硬化素能結合LRP5和LRP6，并且是Wnt 拮抗劑。因為成骨分化中硬化素表達發生在Wnt7b表達高峰之后，降低硬化素介導的Wnt 信號拮抗作用有助于增加SOST相關的骨量。發明概述本發明針對于解決與骨重建相關的一些問題的方法和組合物，例如骨質疏松和其 它骨疾病。本發明還提供了組合物在幫助治愈骨折或其它骨損傷或異常方面的應用。特別 的，發明提供了在哺乳動物受試者中促進骨形成的方法，包括向受試者給予有效量防止硬 化素的結合的化合物。本發明進一步提供了用于以骨形成不足為特征的臨床病癥的基因治療方法，該方 法包括給予有效量的防止硬化素的結合的化合物或者通過引起硬化素表達降低。在本發明的其它方面，硬化素或相關蛋白的基因表達、檢測和定量可用作多種骨 疾病的潛在診斷方法。本發明還指向解決腫瘤或其它骨生長的方法和組合物。本發明已經鑒定了化合物，當將所述化合物提供給細胞時，能結合、相互作用或裝 配到(fitinto)參與刺激、增強、抑制或調節骨形成或骨重建的共受體的結構域中發現的 位點或空腔中。這些受體包括LRP5受體、LRP6受體、frizzled受體或任何其它的和LRP5 或LRP6 (LRP5/6)受體系統有關的受體。使用專利申請10/849，067所述的篩選方法鑒定化合物。發現這些化合物破壞硬 化素和LRP5/6的相互作用。其它化合物通過抑制Wnt結合LRP5/6來抑制Wnt信號。本發 明的化合物是非天然的或是細胞中不存在的但來自于外界來源的外源性化合物。具體而 言，發現鑒定的化合物IIIC3 (NCI8642)和IIC8 (NCI366218)能破壞硬化素和LRP5/6的相互作 用。如圖5所示，加入111C3或11C8后，硬化素-AP(硬化素和堿性磷酸酯酶的融合蛋白) 和LRP5的結合下降。化合物結合于LRP5/6，并且因此防止硬化素的結合，阻斷了 Wnt并有 可能抑制骨形成。發明詳述因為WISE和硬化素具有同源性，進行實驗來確定硬化素是否能對經典Wnt信號產 生效果。使用基于LEF-I的報告基因檢測法在人胚腎(HEK)細胞中測定了含有小鼠硬化素 的調整后的培養基(CM)對Wnt3a誘導的經典Wnt信號激活的效果。含有硬化素的CM顯示 出顯著的劑量依賴方式的Wnt3a活性抑制(圖1A)。因為對照CM在50微升下開始顯示顯著 的抑制作用，所以沒有檢測更高的劑量。為了進一步證實硬化素的這種效果，在HEK細胞中共表達硬化素和其它經典Wnt (Wntl)，且硬化素對共表達的Wnt-I的活性顯示出高達60% 的抑制作用(圖1B，柱2&4)。有趣的是，LRP5的共表達能消除硬化素對Wnt信號的拮抗效 果，并且在存在共表達的LRP5情況下還觀察到硬化素輕微刺激Wntl信號(圖1B，柱6&8)。 還在成骨細胞系MC3T3中檢測了硬化素對Wnt信號的效果。在MC3T3細胞中表達硬化素還 顯示出對Wnt-I激活的報告基因活性高達70%的抑制效果(圖1C，柱2&4)。再一次，LRP5 的表達逆轉該抑制(圖1C，柱6&8)。不過，當使硬化素和LRP5與Wnt —起表達時，Wntl的 活性在MC3T3細胞中沒有增加(圖1C)。然而，所有這些結果清楚地表明，當LRP5以內源水 平表達時硬化素具有拮抗被經典Wnt激活的經典Wnt活性。為了了解硬化素如何拮抗經典信號，進行實驗來確定硬化素是否直接結合到 LRP5/6上。采用Dkkl-AP中使用的相同方法測定了硬化素-堿性磷酸酶(AP)融合蛋白對 表達外源LRP5或LRP6的細胞的結合。如圖2A所示，硬化素-AP顯示出和Dkkl-AP相似的 LRP6結合曲線，提示硬化素-AP具有和Dkkl-AP相當的對LRP6的親和力，對DKK-IAP的親和 力已經在以前測定為亞納摩爾級。硬化素-AP和Dkkl-AP結合到表達LRP5的細胞上表明硬 化素-AP和Dkkl-AP也具有相似的對LRP5的親和力(圖2B)。為了描繪LRP5的哪個結構域 用于結合硬化素-AP，我們檢測了硬化素-AP結合分別缺乏第一個或最后一個雙YWTD-EGF 重復結構域的兩種LRP5突變體。這些突變體分別被命名為LRP5R12或LRP5R34(圖2E)。 Dkkl-AP能結合兩種LRP5突變體(圖2D)，硬化素-AP只能結合LRP5R12，而不能結合 LRP5R34 (圖 2C)。我們以前已經發現LRP5R12還能轉導Wnt信號，表明這種LRP5突變體仍然保留有 Wnt結合序列。為了確定硬化素和Wnt是否互相競爭結合LRP5R12，在存在或不存在Wnt3aCM 的條件下測定硬化素-AP和表達LRP5R12的細胞之間的結合。Wnt3a的存在不影響硬化 素-AP和LRP5R12的結合(圖3A)。相反，Dkkl的存在能完全阻斷硬化素-AP和LRP5R12 的結合(圖3B)。為了嘗試進一步描繪LRP5上的硬化素結合序列，構建了另外兩個LRP5 突變體，它們分別缺乏第二個到第四個YWTD-EGF重復結構域，和缺乏第一個、第三個和第 四個YWTD-EGF重復結構域。不過，這兩個LRP5突變體既不能結合硬化素-AP也不能結合 Dkkl-ΑΡ,并且不能轉導Wnt信號。這些結果暗示，硬化素結合于LRP5或者結合于錯誤折疊 的這些LRP5突變體需要第一、第二 YWTD-EGF重復結構域。已經發現一些第一 YWTD-EGF重復結構域的LRP5突變體和HBM相關。我們以前已 經表征了這些突變體中的一個(G171V)并且發現這個突變體干擾LRP5和它的伴侶Mesd的 相互作用，導致LRP5很少運輸到細胞表面。因為該LRP5突變體還能夠在細胞內傳導用于 自分泌Wnts的信號，所以人們認為這種突變體可以通過保護細胞內LRP5受體免受細胞外 拮抗劑例如Dkkl的影響來增強Wnt信號，因為Dkkl在骨細胞中高表達。已知在骨和骨細 胞中表達的硬化素作為新型Wnt拮抗劑的發現可以為G171V突變的效果提供另一種解釋， 所述突變位于第一個YWTD-EGF重復結構域并位于硬化素結合區域內部。這些解釋中的一 個可能是G171V突變體直接干擾LRP5和硬化素的結合。為了檢測這個可能性，我們測定并 比較了硬化素-AP、LRP5G171V之間的結合和Dkkl-ΑΡ、LRP5G171V之間的結合。如我們以 前所示，因為突變對伴侶功能的干擾，表達LRP5GV的細胞和Dkkl-AP的表觀結合比表達野 生型LRP5的細胞低5倍(圖3C)。相似的，表達LRP5GV的細胞也顯示出相同程度的硬化 素-AP結合下降(圖3B)。和G171V突變不直接干擾LRP5和Dkkl的相互作用一樣，該突變也不太可能干擾LRP5和硬化素的相互作用。LRP5GV在和野生型LRP5相同的劑量范圍內還 可以逆轉硬化素介導的抑制Wnt活性作用(圖1B、C)，這一觀察進一步支持了 G171V突變 不干擾LRP5或LRP6和Dkkl的相互作用的觀點。以前已經顯示硬化素主要在骨細胞中表達。我們在原代顱蓋成骨細胞分化過程中 檢測了硬化素表達和Wnt7B表達的相關性。我們以前已經鑒定Wnt7b(—種能穩定β-連 環蛋白的經典Wnt)是唯一一個在原代骨髓成骨細胞分化中表達水平顯示劇烈變化的Wnt。 相似地，在顱蓋成骨細胞分化過程中Wnt7b的表達水平顯示劇烈變化；第8天時Wnt7b表 達達到峰值，隨后降低到低水平，在成骨標志物骨鈣素和另一個Wnt拮抗劑Dkkl的表達之 前(圖4A)。主要在小鼠long骨早期未分化成骨細胞中檢測出Wnt7b mRNA(圖4B)的原位 雜交，進一步證實了對于Wnt7b表達的結論。硬化素的表達顯示出一種和骨鈣素相似的時 間曲線，并且僅發生在分化后期階段，推測此時礦化基質中的骨細胞正在形成(圖4A)。硬 化素的這種表達模式和以前在體內觀察到的硬化素在埋在骨基質中的骨細胞中表達是相 一致的，并且可能在機械負荷(mechanical loading)中起到一定作用。以硬化素和Wnt7b 的表達模式為基礎，我們提出假說，認為硬化素促成G171V相關的HBM表型，縱使硬化素不 能直接干擾Wnt的結合或者突變不能影響硬化素結合到LRP5上。根據我們的假說，G171V 突變可以在不減小突變受體對自分泌Wnt的信號能力的情況下讓受體回避旁分泌拮抗劑， 只由分化良好的成骨細胞或骨細胞產生的硬化素有可能是被認為是和野生型LRP5相比結 合LRP5G171V更差的這種旁分泌拮抗劑中的一種。因此，G171V突變不僅可以通過Dkkl，還 可以通過硬化素和骨中潛在的其它旁分泌Wnt拮抗劑減弱經典Wnt信號的拮抗作用來增強 Wnt活性。在以前的實驗中，硬化素顯示出充當BMP拮抗劑的角色。令人信服的表明硬化素 對BMP6和BMP7有合理的高親和性。不過，只能通過在成骨細胞中加入配體后3_6天檢測 BMP誘導的堿性磷酸酶(AP)活性來測定硬化素對BMP的生物學效果。這種AP活性信息顯 示對于BMP活性不是特異性的。事實上，在這些類型的細胞中經典Wnt也能刺激AP活性。 相反，我們的Wnt報告基因檢測對于經典Wnt是特異性的，并且在HEK細胞中不能被BMP激 活(數據沒有顯示)。此外，在檢測中使用CM，我們測定了 6小時硬化素的效果(圖1A)。 鑒于最近觀察到硬化素不能抑制BMP引發的早期應答，我們相信更有可能情況的是硬化素 是生物學上的一種經典Wnt拮抗劑，并且它對骨量的效果可能主要是其對經典Wnt信號拮 抗效果的結果。如圖2所示，硬化素結合到LRP5的第一個雙YWTD-EGF重復結構域，這也是傳導 Wnt信號所需要的。不過，我們的證據暗示，硬化素的拮抗效果不可能是因為和Wnt直接競 爭LRP結合，因為l)Wnt3a不能抑制硬化素-AP結合LRP5 ；2)LRP5能逆轉硬化素對經典Wnt 信號的抑制效果。后面的現象暗示Dkkl對Wnt信號的效果(Wnt信號的Dkkl抑制)也能 被外源表達的LRP5/6所逆轉。LRP5/6分子具有逆轉Dkk效果的能力是因為Dkk介導的拮 抗作用需要另一種蛋白Kremen。當Kremen和LRP5/6共表達時，Dkk介導的抑制作用能被 恢復。雖然Kremen對硬化素介導的拮抗作用沒有效果，不過我們猜測硬化素使用了相似的 機制來抑制Wnt信號。換句話說，有可能需要象Kremen這樣的輔助蛋白來讓硬化素發揮有 效的拮抗劑功能。最近，已經發現noggin直接和硬化素相互作用，并且抑制noggin的能力 來抑制BMP信號。因此，一旦noggin結合硬化素就有可能抑制硬化素的能力，來調節Wnt信號。此外，硬化素顯示出在存在外源LRP5或LRP5GV情況下能輕微刺激LEF-I報告基因 的活性，這暗示硬化素在特定環境下甚至在哺乳動物系統中可能是部分激動劑。本發明提供了促進或調節骨形成或骨重建的方法，包括給予至少一種非天然化合 物、非天然化合物片段或它們的任何組合。非天然化合物的定義是在哺乳動物受試者中尤 其是在人體中非天然存在的一種化合物。非天然化合物還可以包括和在人體中天然存在的 化合物相同的人工制造化合物。當非天然化合物結合到涉及骨形成或骨重建的受體或共受 體上時，硬化素的結合被阻止，因此允許骨形成。兩個或更多個非天然化合物可以通過交聯直接連接在一起，例如，或通過連接臂 非直接地連接。每個這些連接的化合物可以被對接(dock)到相同的結合位點、蛋白質或受 體中的不同位置上。每個這些連接的化合物還可以被對接到不同的結合位點、蛋白質或受 體中的不同位置上。化合物或化合物的片段可以是小分子、蛋白質、肽、多肽、環狀分子、雜環有機分 子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化學藥物。化 合物或片段還可以是激動劑、拮抗劑、部分激動劑或上述的任何組合；化合物可以通過吸入、口服、靜脈內、腹膜內、肌肉內、腸胃外、透皮、陰道內、鼻內、 粘膜的、舌下、局部的、直腸的或皮下給藥。本發明還提供了一種鑒定化合物或候選藥物的方法，所述化合物或候選藥物將能 夠結合到參與蛋白-蛋白相互作用的信號肽或蛋白上抑制或促進后續事件的發生。特別 是，化合物或候選藥物將結合到受體蛋白上來抑制或促進骨形成或骨重建。第一步包括通 過使用多種方法例如氨基酸測序、X射線衍射晶體分析、核磁共振、受體蛋白的類似物或衍 生物或者上述方法的任何組合來確定受體蛋白的實際或計算結構。在一個優選的實施例 中，蛋白是不溶的或膜結合的。下一步驟包括通過使用基于生物功能的實驗，包括突變分析、化學修飾(例如對 氨基酸)、共結晶、核磁共振或上述方法的任何組合來確定受體蛋白中的特定的結合腔位點 或結構域。使用這些實驗獲得的結果(例如突變和化學修飾)確定化合物或候選藥物將結 合的結合腔中的特定結合位點或結構域。整個結合腔或腔內特定結合位點可被用于篩選適 合(fit)并結合的化合物。使用UNITY 程序進行篩選。通過使用Flexx 程序使化合物對 接到腔內。隨后使用Cscore 程序選擇具有最高結合親和力或最低結合能的化合物。最終 的目標是選擇一種最適的化合物或候選藥物。本發明的一個優選的實施方案是通過給予硬化素來防止或阻斷哺乳動物受試者 中骨形成的方法。本發明的另一個優選的實施方案是治療異常骨生長的方法，包括給予硬化素抗 體、或者給予任何其它的降低或清除硬化素的、或者降低或消除硬化素和參與骨形成或骨 重建的受體或共受體之間的親和力的化合物或化合物片段。材料與方法細胞培養、轉染、制備CM和熒光素酶檢測如前所述地維持和轉染人胚腎細胞系(HEK)A293T和小鼠成骨細胞系MC3T3。為 了進行熒光素酶檢測，以5X IO4細胞/孔將細胞接種到24孔板中并使用Lipofectamine Plusdnvitrogen, CA)按照產品說明書以0. 5 μ g DNA/孔進行轉染。通常使用LacZ質粒，使每個轉染的DNA濃度相等。轉染24小時后收集細胞提取物。如前所述進行熒光素酶檢 測。根據GFP的熒光強度標準化發光強度。為了制備含有DKKl-AP和硬化素-AP的CMJf HEK細胞以4X IO5細胞/孔接種到6孔板中并以1 μ g DNA/孔轉染。轉染后48小時收集 CM。表達質粒的構建和誘變通過使用高保真耐熱DNA聚合酶Pfu Ultra (Stratagene，CA)進行PCR制備人 LRP5、LRP6、小鼠Wnt 1、DKKl、硬化素和DKK-2野生型和突變形式。通過DNA測序驗證核苷 酸序列。在全長和突變分子的C末端引入HA或Flag表位標簽。通過CMV啟動子驅動這些 分子的表達。Dr. Grosschedl提供了 LEF-I報告基因構建體。DKKl-AP和硬化素-AP結合檢測用LRP5及其突變體轉染24孔板中的HEK細胞。1天后，用冷的清洗緩沖液(含有 BSA和NaN3的HBBS)清洗細胞并在冰上和小鼠DKKl-AP或硬化素-AP CM孵育2小時。隨 后，用清洗緩沖液清洗細胞3次并裂解。裂解產物在65°C加熱10分鐘，并用Tropix發光 AP檢測試劑盒測定它的AP活性。基本上如前所述進行免疫沉淀檢測。原代顱蓋成骨細胞培養如前所述地制備來自于5天齡小鼠的小鼠顱蓋成骨細胞培養物，并在存在SmM β -磷酸甘油和50ug/ml抗壞血酸的條件下誘導發生成骨分化。每2天更換培養基。定量PCR分析使用TRIzoI試劑(Invitrogen)根據產品說明書分離總RNA。為了進行QPCR分析， 使用用于RT-PCR的superscript 第一鏈合成系統(Invitrogen)對RNA進行逆轉錄。使 用 QuantiTect SYBR Green PCR 試劑盒(Qiagen)在 DNA Engine OPT I CON (MJ Research 公司制)儀器設備上進行QPCR。每個樣品都使用肌動蛋白作為內部參照。使用以前所 述的公式，根據β -肌動蛋白mRNA水平標準化mRNA水平的相對變化。原位雜交使用Wnt7b的全長編碼區合成反義和正義探針。使用RNALabeling試劑盒(Roche， Indianapolis, IN,USA)用Digoxigenin標記探針。來自于3周齡小鼠的脛骨切片脫蠟，再 水合并用4%多聚甲醛再次固定。用2%甘氨酸和蛋白酶K處理切片并用乙酸酐/TEA溶 液乙酰化，隨后和digoxygenin標記的探針雜交。用50%甲酰胺、5XSSC、5% SDS在70°C 清洗切片兩次，每次30分鐘，隨后用50 %甲酰胺、2XSSC在65 °C下清洗，隨后切片和抗 digoxigenin堿性磷酸酶抗體孵育，隨后和Nitro Blue etrazolium/4-溴-5-氯吲哚磷酸 鹽孵育來產生藍紫色。切片還用甲基綠(核)和橙黃G(細胞質)復染。


圖1.硬化素拮抗經典Wnt信號。A)硬化素CM對Wnt3a CM的效果。Wnt3a CM(25ul)和不同數量的硬化素CM(SCM) 或對照CM(CCM)混合并加入到用LEF-I報告基因轉染的HEK細胞中。6小時后，裂解細胞， 測定熒光素酶活性。將沒有SCM條件下的活性定為100%。Wnt3a CM使報告基因活性增 加5倍。通過抗Flag抗體(插入)檢測帶有Flag標簽的硬化素的表達。B，C)在HEK (B) 和MC3T3(C)細胞中共表達的硬化素對Wntl信號的效果。用如圖所示的編碼Wntl、硬化素(Scl)、野生型LRP5 (Wt)或G171VLRP5 (GV)的cDNA和LEF-I受體基因以及GFP表達質粒轉 染細胞。1天后，裂解細胞，測定GFP水平和熒光素酶活性并根據GFP水平標準化。圖2.硬化素-AP結合LRP5及其突變體A, B) Dkkl-AP和硬化素-AP結合全長的LRP6、LRP5或LacZ。用全長LRP6 (A)或 LRP5 (B)轉染HEK細胞。如方法中所述測定Dkkl-AP或硬化素-AP (Scl)的結合。和轉染 有對照質粒LacZ的細胞的結合作為非特異性結合被減去。特異性結合列于表中。B，C) Dkkl-AP和硬化素-AP結合LRP5突變體。如所示用LacZ或LRP5突變體轉染HEK細胞。測 定硬化素-AP (C)和Dkkl-AP (D)的結合。(E)LRP5突變體的圖示。圖3. Wnt3a、Dkkl和LRP5突變體對硬化素結合的效果。A)用LRP5轉染HEK細胞。測定在存在對照CM(CCM)或Wnt3a CM(WCM, IOOul)的 情況下硬化素-AP (5ul)的結合。B)用LRP5R12轉染HEK細胞。測定在存在緩沖液或重組 Dkkl (IOnM)的情況下硬化素_AP(50ul)的結合。C)用LRP5 (黑色條柱)或者LRP5G171V(白 色條柱)轉染的HEK細胞。測定Dkkl-AP (Dkk)或硬化素-AP (Scl)的結合。在所有這些結 合檢測中，轉染有對照質粒LacZ的細胞的結合都作為非特異性結合被減去。特異性結合列 于表中。圖4. Wnt7b、硬化素、Dkkl和骨鈣素的表達。A)由5天齡小鼠建立原代顱蓋成骨細胞培養物。在第5天加入分化誘導劑。如 方法中所述通過QRT-PCR測定Wnt7b、硬化素(scl)、骨鈣素(OC)和Dkkl的相對表達水平。 B)使用原位雜交測定Wnt7b在小鼠long中的表達。Wnt7b (黑色染色)主要在成骨細胞中 檢測到。核被復染為綠色。圖5. IIIC3和IIC8對硬化素-AP結合LRP5的效果。A)骨形成的抑制和IIIC3存在的量呈負相關。加入的IIIC3越多，骨形成抑制百 分比越低。B)加入IIC8越多，骨形成抑制百分比越低。
權利要求
促進骨形成或骨重建的方法，包括給予防止硬化素與參與骨形成或骨重建的受體或共受體結合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
2.促進骨形成或骨重建的方法，包括給予防止硬化素與LRP5或LRP6受體結合的至少 一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
3.促進骨形成或骨重建的方法，包括給予防止硬化素與LRP5或LRP6受體的同系物結 合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
4.促進骨形成或骨重建的方法，包括給予防止硬化素與LRP5或LRP6受體的至少一個 結構域結合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
5.促進骨形成或骨重建的方法，包括給予防止硬化素與LRP5或LRP6受體的第一個或 第二個結構域結合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組I=I ο
6.權利要求1到5的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或IIC8。
7.權利要求1到5的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3、IIC8或它 們的任意衍生物或類似物。
8.權利要求6或7的方法，其中所述兩種或更多種化合物或所述化合物片段通過交聯 直接地連接在一起，或通過連接臂間接地連接在一起。
9.權利要求8的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到相 同結合位點、受體或蛋白質上的第一個位置和第二個位置。
10.權利要求8的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 不同結合位點、受體或蛋白質上的第一個位置和第二個位置。
11.權利要求1到5的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通過連接臂或交聯連接 到一起。
12.權利要求1到11的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白質、 肽、多肽、環狀分子、雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖蛋 白、糖脂、脂蛋白、化學藥品、或包括雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性 脂質、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化學藥品的化合物的片段。
13.權利要求1到5的方法，其中所述給藥步驟包括通過吸入、口服、靜脈內、腹膜內、肌 肉內、腸胃外、透皮、陰道內、鼻內、粘膜的、舌下、局部的、直腸的或皮下給藥或它們的任何 組合進行給藥。
14.權利要求1到12的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一種激動劑、 拮抗劑、部分激動劑或它們的任何組合。
15.權利要求1到14的方法，其中所述化合物用下述方法鑒定，該方法包括a.使用UNITY 程序篩選適合進入受體上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序將所述化合物對接進入腔；和c.使用Cscore 程序獲得具有最高結合親和力的化合物。
16.治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常的方法，包括給予防止硬化素 與參與骨形成或骨重建的受體或共受體結合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化 合物片段或它們的任何組合。
17.治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常的方法，包括給予防止硬化素與LRP5或LRP6受體結合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
18.治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常的方法，包括給予防止硬化素 與LRP5或LRP6受體的同系物結合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段， 或它們的任何組合。
19.權利要求16到18的方法，其中所述化合物包括IIIC3或IIC8。
20.權利要求16到18的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或IIC8。
21.權利要求19或20的方法，其中所述兩種或更多種化合物或所述化合物片段通過交 聯直接地連接在一起，或通過連接臂間接地連接在一起。
22.權利要求21的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 相同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
23.權利要求21的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 不同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
24.權利要求16到18的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通過連接臂或交聯連 接到一起。
25.權利要求16到24的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白質、 肽、多肽、環狀分子、雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖蛋 白、糖脂、脂蛋白、化學藥品、或包括雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性 脂質、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化學藥品的化合物的片段。
26.權利要求16到18的方法，其中所述給藥步驟包括通過吸入、口服、靜脈內、腹膜內、 肌肉內、腸胃外、透皮、陰道內、鼻內、粘膜的、舌下、局部的、直腸的或皮下給藥或它們的任 意組合進行給藥。
27.權利要求16到25的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一種激動 劑、拮抗劑、部分激動劑或它們的任何組合。
28.權利要求16到27的方法，其中所述化合物用下述方法鑒定，所述方法包括a.使用UNITY 程序篩選適合進入受體上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序將所述化合物對接進入腔；和c.使用Cscore 程序獲得具有最高結合親和力的化合物。
29.治療組合物，用于治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常，包括防止硬 化素與骨形成或骨重建中的受體或共受體結合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然 化合物片段，或它們的任何組合。
30.治療組合物，用于治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常，包括防止硬 化素與LRP5或LRP6受體結合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它 們的任何組合。
31.治療組合物，用于治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常，包括防止硬 化素與LRP5或LRP6受體的同系物結合的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物 片段或它們的任何組合。
32.權利要求29到30的組合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或 IIC8。
33.權利要求29到31的組合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3、IIC8 或它們的任意衍生物或類似物。
34.權利要求32或33的組合物，其中所述兩種或更多種化合物或化合物片段通過交聯 直接地連接在一起，或通過連接臂間接地連接在一起。
35.權利要求34的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 相同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
36.權利要求34的組合物，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接 到不同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
37.權利要求29到31的組合物，其中所述化合物或所述化合物片段通過連接臂或交聯 連接到一起。
38.權利要求29到37的組合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白 質、肽、多肽、環狀分子、雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖 蛋白、糖脂、脂蛋白、化學藥品、或包括雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極 性脂質、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化學藥品的化合物的片段。
39.權利要求29到31的組合物，其中所述給藥步驟包括通過吸入、口服、靜脈內、腹膜 內、肌肉內、腸胃外、透皮、陰道內、鼻內、粘膜的、舌下、局部的、直腸的或皮下給藥或它們的 任意組合進行給藥。
40.權利要求29到38的組合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一種激動 劑、拮抗劑、部分激動劑或它們的任何組合。
41.權利要求29到40的組合物，其中所述非天然化合物用下述方法鑒定，所述方法包括a.使用UNITY 程序篩選適合進入受體上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序將所述化合物對接進入腔；和c.使用Cscore 程序獲得具有最高結合親和力的化合物。
42.權利要求29到41的組合物，其中所述組合物進一步包括藥學上可接受的載體。
43.權利要求29到41的組合物，其中所述組合物被配制為片劑、丸劑、錠劑、液體、凝 膠、膠囊、糖漿、膏劑或懸浮液。
44.調節骨形成或骨重建的方法，包括給予破壞硬化素和參與骨形成或骨重建的受體 或共受體之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的 任何組合。
45.調節骨形成或骨重建的方法，包括給予破壞硬化素和LRP5或LRP6受體之間的相互 作用的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
46.調節骨形成或骨重建的方法，包括給予破壞硬化素和LRP5或LRP6受體的同系物之 間的相互作用至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
47.調節骨形成或骨重建的方法，包括給予破壞硬化素和LRP5或LRP6受體的至少一個 結構域之間的相互作用至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段，或它們的任 何組合。
48.調節骨形成或骨重建的方法，包括給予破壞硬化素和LRP5或LRP6受體的第一個或 第二個結構域之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段，或它們的任何組合。
49.權利要求44到48的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或IIC8。
50.權利要求44到48的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3、或IIC8 或它們的任意衍生物或類似物。
51.權利要求49或50的方法，其中所述兩種或更多種化合物或所述化合物片段通過交 聯直接地連接在一起，或通過連接臂間接地連接在一起。
52.權利要求51的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 相同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
53.權利要求51的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 不同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
54.權利要求44到48的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通過連接臂或交聯連 接到一起。
55.權利要求44到54的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白質、 肽、多肽、環狀分子、雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖蛋 白、糖脂、脂蛋白、化學藥品、或包括雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性 脂質、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化學藥品的化合物的片段。
56.權利要求44到48的方法，其中所述給藥步驟包括通過吸入、口服、靜脈內、腹膜內、 肌肉內、腸胃外、透皮、陰道內、鼻內、粘膜的、舌下、局部的、直腸的或皮下給藥或它們的任 意組合進行給藥。
57.權利要求44到55的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一種激動 劑、拮抗劑、部分激動劑或它們的任何組合。
58.權利要求44到57的方法，其中所述化合物用下述方法鑒定，所述方法包括a.使用UNITY 程序篩選適合進入受體上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序將所述化合物對接進入腔；和c.使用Cscore 程序獲得具有最高結合親和力的化合物。
59.治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常的方法，包括給予破壞硬化素 和參與骨形成或骨重建的受體或共受體之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至少一 種非天然化合物片段或它們的任何組合。
60.治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常的方法，包括給予破壞硬化素 和LRP5或LRP6受體之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片 段或它們的任何組合。
61.治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常的方法，包括給予破壞硬化素 和LRP5或LRP6受體的同系物之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至少一種非天然 化合物片段或它們的任何組合。
62.治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常的方法，包括給予破壞硬化素 和LRP5或LRP6受體的至少一個結構域之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至少一 種非天然化合物片段或它們的任何組合。
63.治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常的方法，包括給予破壞硬化素 和LRP5或LRP6受體的第一個或第二個結構域之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
64.權利要求59到63的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3或IIC8。
65.權利要求59到63的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括IIIC3、IIC8或 它們的任意衍生物或類似物。
66.權利要求64或65的方法，其中所述兩種或更多種化合物或所述化合物片段通過交 聯直接地連接在一起，或通過連接臂間接地連接在一起。
67.權利要求66的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 相同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
68.權利要求66的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 不同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
69.權利要求59到63的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通過連接臂或交聯連 接到一起。
70.權利要求59到69的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白質、 肽、多肽、環狀分子、雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖蛋 白、糖脂、脂蛋白、化學藥品、或包括雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性 脂質、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化學藥品的化合物的片段。
71.權利要求59到63的方法，其中所述給藥步驟包括通過吸入、口服、靜脈內、腹膜內、 肌肉內、腸胃外、透皮、陰道內、鼻內、粘膜的、舌下、局部的、直腸的或皮下給藥或它們的任 意組合進行給藥。
72.權利要求59到69的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括至少一種激動 劑、拮抗劑、部分激動劑或它們的任何組合。
73.權利要求59到72的方法，其中所述非天然化合物用下述方法鑒定，所述方法包括a.使用UNITY 程序篩選適合進入受體上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序將所述化合物對接進入腔；和c.使用Cscore 程序獲得具有最高結合親和力的化合物。
74.治療組合物，用于治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常，包括破壞硬 化素和參與骨形成或骨重建的受體或共受體之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至 少一種化合物的片段或它們的任何組合。
75.治療組合物，用于治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常，包括破壞硬 化素和LRP5或LRP6受體之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至少一種化合物片段 或它們的任何組合。
76.治療組合物，用于治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常，包括破壞硬 化素和LRP5或LRP6受體的同系物之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至少一種化 合物片段或它們的任何組合。
77.治療組合物，用于治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常，包括破壞硬 化素和LRP5或LRP6受體的至少一個結構域之間的相互作用的至少一種非天然化合物、至 少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
78.治療組合物，用于治療哺乳動物受試者骨折、骨疾病、骨損傷或骨異常，包括破壞硬化素和LRP5或LRP6受體的第一個或第二個結構域之間的相互作用的至少一種非天然化合 物、至少一種非天然化合物片段或它們的任何組合。
79.權利要求74到78的組合物，其中所述化合物包括IIIC3或IIC8。
80.權利要求74到78的組合物，其中所述化合物包括IIIC3、IIC8或它們的任意衍生 物或類似物。
81.權利要求79或80的組合物，其中所述兩種或更多種化合物或所述化合物片段通過 交聯直接地連接在一起，或通過連接臂間接地連接在一起。
82.權利要求81的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 相同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
83.權利要求81的方法，其中所述化合物、所述化合物片段或它們的任何組合，對接到 不同結合位點、受體或蛋白質的第一個位置和第二個位置。
84.權利要求74到78的方法，其中所述化合物或所述化合物片段通過連接臂或交聯連 接到一起。
85.權利要求74到84的組合物，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白 質、肽、多肽、環狀分子、雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖 蛋白、糖脂、脂蛋白、化學藥品、或包括雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極 性脂質、糖、糖蛋白、糖脂、脂蛋白或化學藥品的化合物的片段。
86.權利要求74到78的組合物，其中所述給藥步驟包括通過吸入、口服、靜脈內、腹膜 內、肌肉內、腸胃外、透皮、陰道內、鼻內、粘膜的、舌下、局部的、直腸的或皮下給藥或它們的 任意組合進行給藥。
87.權利要求74到86的組合物，其中所述非天然化合物用下述方法鑒定，所述方法包括a.使用UNITY 程序篩選適合進入受體上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序將所述化合物對接進入腔；和c.使用Cscore 程序獲得具有最高結合親和力的化合物。
88.權利要求74到87的組合物，其中所述組合物進一步包括藥學上可接受的載體。
89.權利要求74到87的組合物，其中所述組合物被配制為片劑、丸劑、錠劑、液體、凝 膠、膠囊、糖漿、膏劑或懸浮液。
90.通過給予硬化素防止或阻斷哺乳動物受試者中骨形成的方法。
91.治療哺乳動物受試者中異常骨生長的方法，包括給予硬化素的抗體或任意的減少 或清除硬化素的其他非天然化合物或化合物片段。
92.權利要求91的方法，其中所述化合物或所述化合物片段包括小分子、蛋白質、肽、 多肽、環狀分子、雜環有機分子、核酸、脂質、帶電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖蛋白、 糖脂、脂蛋白或化學藥品。
93.權利要求91或92的方法，其中所述給藥步驟包括通過吸入、口服、靜脈內、腹膜內、 肌肉內、腸胃外、透皮、陰道內、鼻內、粘膜的、舌下、局部的、直腸的或皮下給藥或它們的任 意組合進行給藥。
94.權利要求90到92的方法，其中所述硬化素包括相關蛋白、帶有類似功能的不相關 蛋白或者硬化素的任意同系物或衍生物。
95.治療組合物，包含用于防止或阻斷哺乳動物受試者中的骨形成的硬化素。
96.防止或阻斷哺乳動物受試者中骨形成的治療組合物，包含硬化素抗體或任意的減 少或清除硬化素的其它非天然化合物或化合物片段。
97.權利要求91到96的方法或組合物，其中所述非天然化合物用下述方法鑒定，所述 方法包括a.使用UNITY 程序篩選適合進入受體上的腔中的化合物；b.使用Flexx 程序將所述化合物對接進入腔；和c.使用Cscore 程序獲得具有最高結合親和力的化合物。
98.鑒定促進或抑制蛋白_蛋白相互作用的候選藥物或化合物的方法，包括a.確定受體蛋白的實際結構；b.鑒定所述受體蛋白中的特定結合腔；c.鑒定所述結合腔中的特異性位點；和d.篩選適合進入所述特異性位點的化合物。
99.權利要求98的方法，進一步包括使用Cscore 程序鑒定具有最高結合親和力的化 合物的步驟。
100.權利要求98的方法，其中所述鑒定特定的結合腔的步驟包括根據化合物的生物 功能進行實驗。
101.權利要求100的方法，其中所述實驗包括突變分析。
102.權利要求98的方法，其中所述受體蛋白是不溶性的或膜結合的。
103.鑒定促進或抑制蛋白_蛋白相互作用的候選藥物或化合物的方法，包括a.確定受體蛋白的實際結構；b.鑒定所述受體蛋白中的特定結合腔；c.鑒定所述結合腔中的特異性位點；和d.使用UNITY 程序篩選適合進入所述特異性位點的化合物；e.使用Flexx 程序所述將化合物對接進入腔內；和f.使用Cscore 程序獲得具有最高結合親和力的化合物。
104.權利要求103的方法，其中所述鑒定特定的結合腔的步驟包括根據化合物的生物 功能進行實驗。
105.權利要求104的方法，其中所述實驗包括突變分析。
106.權利要求103的方法，其中所述受體蛋白是不溶性的或膜結合的。
107.鑒定與參與骨形成或骨重建的受體蛋白結合的候選藥物化合物的方法，包括a.確定不可溶受體蛋白的實際或計算結構，包括使用氨基酸測序、X射線衍射晶體分 析、核磁共振、所述受體蛋白的類似物或衍生物或者它們的任何組合；b.使用基于生物功能的實驗，包括突變分析、氨基酸化學修飾、共結晶、核磁共振或它 們的任何組合來鑒定所述受體蛋白中的特定結合腔；c.根據突變或化學修飾鑒定所述結合腔中的特異性的結合位點；d.使用UNITY 程序篩選適合進入所述特異性位點的化合物；和e.使用Cscore 程序鑒定具有最高結合親和力或最低能量的化合物來找到最造化合物。
108.鑒定與參與骨形成或骨重建的受體蛋白結合的候選藥物化合物的方法，包括a.確定信號肽的實際或計算結構，包括使用氨基酸測序、X射線衍射晶體分析、核磁共 振、所述信號肽的類似物或衍生物或者它們的任何組合；b.使用基于生物功能的實驗，包括突變分析、化學修飾、共結晶、核磁共振或它們的任 何組合來鑒定所述受體蛋白中的特定結合腔；c.根據所述實驗獲得的結果鑒定所述結合腔中的特異性的結合位點；d.使用UNITY 程序篩選適合進入所述結合腔或所述結合腔中的所述特異性位點的化 合物；e.使用Flexx 程序將所述化合物對接進入到所述結合腔或所述結合腔中的所述特異 性位點中；和f.使用Cscore 程序鑒定具有最高結合親和力或最低能量的化合物。
109.鑒定與參與信號轉導系統的蛋白相結合的候選藥物或化合物的方法，包括a.提供或確定所述蛋白的實際或計算結構，包括使用氨基酸測序、X射線衍射晶體分 析、核磁共振、所述受體蛋白的類似物或衍生物或者它們的任何組合；b.使用多種實驗，包括突變分析、氨基酸化學修飾、共結晶、核磁共振或它們的任何組 合來鑒定所述蛋白中的特定結合腔、位點或結構域；c.根據所述實驗的結果鑒定所述結合腔、位點或結構域中的特異性的結合位點；和d.篩選候選藥物化合物庫來鑒定最適合于所述特異性結合位點或所述結合腔、位點或 結構域的候選藥物或化合物。
110.鑒定與參與信號轉導系統的不可溶蛋白或膜結合蛋白相結合的候選藥物或化合 物的方法，包括a.提供或確定所述蛋白的實際或計算結構，包括使用氨基酸測序、X射線衍射晶體分 析、核磁共振、所述受體蛋白的類似物或衍生物或者它們的任何組合；b.使用多種實驗，包括突變分析、氨基酸化學修飾、共結晶、核磁共振或它們的任何組 合來鑒定所述蛋白的特定結合腔、位點或結構域；c.根據所述實驗的結果鑒定所述結合腔、位點或結構域中的特異性的結合位點；和d.篩選候選藥物化合物庫來鑒定最適合于所述特異性結合位點或所述結合腔、位點或 結構域的候選藥物或化合物。
111.鑒定與參與Wnt信號傳導途徑的蛋白相結合的候選藥物或化合物的方法，包括a.提供或確定所述蛋白的實際或計算結構，包括使用氨基酸測序、X射線衍射晶體分 析、核磁共振、所述受體蛋白的類似物或衍生物或者它們的任何組合；b.使用多種實驗，包括突變分析、氨基酸化學修飾、共結晶、核磁共振或它們的任何組 合來鑒定所述蛋白的特定結合腔、位點或結構域；c.根據所述實驗的結果鑒定所述結合腔、位點或結構域中的特異性的結合位點；和d.篩選候選藥物化合物庫來鑒定最適合于所述特異性結合位點或所述結合腔、位點或 結構域的候選藥物或化合物。
112.鑒定與參與信號轉導系統的蛋白相結合的候選藥物或化合物以用于促進或抑制 骨生長的方法，包括a.提供或確定所述蛋白的實際或計算結構，包括使用氨基酸測序、X射線衍射晶體分析、核磁共振、所述受體蛋白的類似物或衍生物或者它們的任何組合；b.使用多種實驗，包括突變分析、氨基酸化學修飾、共結晶、核磁共振或它們的任何組 合來鑒定所述蛋白的特定結合腔、位點或結構域；C.根據所述實驗的結果鑒定所述結合腔、位點或結構域中的特異性的結合位點；和 d.篩選候選藥物化合物庫來鑒定最適合于所述特異性結合位點或所述結合腔、位點或 結構域的候選藥物或化合物。
113.用于調節骨形成或骨重建的方法，包括給予減少或消除硬化素對參與骨形成或骨 重建的受體或共受體的親和力的至少一種非天然化合物、至少一種非天然化合物片段或它 們的任何組合。
全文摘要
SOST基因產物硬化素丟失會導致特征為高骨量(HBM)的硬化性骨化病。在這個報告中，我們發現硬化素能拮抗人胚腎A293細胞系和小鼠成骨細胞MC3T3中的經典Wnt信號通路。這種硬化素介導的拮抗作用可以被過量表達Wnt共受體LRP5所逆轉。另外，我們發現硬化素能與LRP5和LRP6結合，并且識別用于結合的LRP5的第一個雙YWTD-EGF重復結構域。雖然誘導經典Wnt信號需要這兩個重復結構域，不過經典Wnt沒有顯示出和硬化素競爭結合LRP5。在初期顱蓋成骨細胞分化中檢測硬化素和Wnt7b(自分泌經典的Wnt)的表達，發現硬化素在成骨細胞分化后期表達，和成骨標志物骨鈣素的表達同時發生，并尾隨在Wnt7b表達之后。因為大量的證據表明經典Wnt信號刺激成骨作用，所以我們認為與硬化素缺失相關的HBM表型有可能至少部分歸因于硬化素介導的Wnt拮抗作用降低所導致的經典Wnt信號增強。
文檔編號A61K38/17GK101888849SQ200680012943
公開日2010年11月17日 申請日期2006年3月17日 優先權日2005年3月18日
發明者D·D·吳, X·李 申請人:康涅狄格州大學