一種含有肉桂皮提取物用于改善正常菌群及增強免疫應答的組合物的制作方法

專利名稱：：一種含有肉桂皮提取物用于改善正常菌群及增強免疫應答的組合物的制作方法一種含有肉桂皮提取物用于改善正常菌群及增強免疫應答的組合物
技術領域：
：本發明涉及一種含有以肉桂皮提取物作為有效組分用于改善正常菌群及增強免疫應答的組合物，更確切地說，一種含有肉桂皮提取物的藥物組合物，所述提取物具有促進長雙歧桿菌(及y^foz^ctehw附/o"gwm)、乳酸菌(丄aco/o6ac/〃i^sp.)和嗜酸乳酸菌(丄a"oZ)ac/〃M"c^o/7/n7w)生長，促進免疫細胞如全身淋巴細胞增殖，激活腸道免疫系統免疫細胞的作用。
背景技術：
：從出生起，人體就成為腸道微生物的棲居地，且一旦微生物處于平衡狀態，它們就形成穩定的腸道細菌菌群。腸道細菌菌群受宿主狀態，包括生理狀況、食物、藥物和壓力等的影響。形成正常菌群的微生物的數量和活性可通過外源因素和自體自身因素來調整(YazawaT.,LettersinappliedMicrobiology10:229-232，19卯)。外源因素源于宿主環境及宿主飲食；而自身因素來自菌群內部的微生物。在強厭氧環境，腸蠕動和持續排泄等條件下，正常菌群通過對棲居地和營養的競爭達到平衡。此外，有報道稱正常菌群的平衡也可以通過諸如pH值，氧化還原電位，膽汁酸，桿菌素，脂肪酸和硫化氫等因素進行調節(YazawaK.和TamuraZ，BifidobacteriaMicroflora1(1):39-44,1982)。組成腸道菌群的各種微生物對宿主有益或有害取決于其生產和分解的能力，例如，腸道菌群作為整體，參與提供維生素，防止感染和協助腸原生作用(蠕動和吸收)。因此，菌群的組分與便秘及其它腸相關疾病密切相關(MistuokaT.BifidobacteriaMicroflora,1(1):3,1982)。在老年人群和腸胃虛弱人群中，可觀察到異常的腸道菌群(MitsuokaT，JournalofIndustrialMicrobiology,6:263,1990)。通常，菌群內的細菌數量在小腸道快速增長，特別是雙歧桿菌(益生菌)減少或消失，而諸如產氣莢膜芽孢梭菌(C.pw/nV/g^O的梭菌快速增長。因此，對長壽健康的人生來說，重要的是降低諸如產氣莢膜芽孢梭菌(Cper/n>ige^)的有害微生物，增加諸如雙歧桿菌的有益微生物，從而使腸道菌群盡可能地平衡(MitusokaT.,Ecologyandroleofintestinalflora.,JapanScientificSocietyPress,Tokyo,p.l，1989)。肉桂皮是一種月桂科常綠喬木的外皮，主要分布在中國南方和越南。肉桂皮是指外皮，肉桂樹干是指樹枝，厚樹皮，樹的干燥老皮和厚外皮。肉桂皮含有1~3.4%精油(苯乙烯醛75-90%,苯丙烯醛等)，2~3%單寧酸、粘膠和碳水化合物。在56年生樹皮中可觀測到更高含量的精油。肉桂皮長期用作發汗劑，退燒藥，止痛藥和調味品。據報道，肉桂皮在腸道具有促進蠕動，抑制異常發酵的作用。但是，此作用的機制還未見解釋。在亞洲民間傳統醫藥中，肉桂皮還用作體質虛弱和氣血(體力和血)虛弱的人的處方藥物以提高他們的免疫反應。但是，提高免疫反應的確切機制還未被了解。因此，本發明人猜想通過觀察肉桂皮提取物對參與免疫反應過程的粒細胞(淋巴細胞，漿細胞，吞噬細胞和粒性白細胞)和淋巴器官的影響，可以導出肉桂皮關于增強免疫應答的確切機制的解釋。特別是，腸道免疫系統是由各種食物抗原和正常菌群一起存在而引發的免疫耐受性的絕佳示例。更確切地說，對無害抗原如食物和正常菌群，腸道免疫系統無反應，而對有害抗原如病毒和致病菌，免疫系統有選擇地作出反應(免疫自穩機制)。腸道的免疫自穩機制通常由對無害抗原的口腔免疫耐受性和對有害抗原的免疫反應維持。但是，一旦腸道免疫機制使免疫耐受性失效，免疫系統就會對包括食物和正常菌群，甚至腸壁本身的抗原作出反應，引起腸炎，從而引發腸消化和腸排泄功能失調。腸道免疫存在于腸相關淋巴網狀組織中，淋巴網狀組織是三個粘液淋巴器官之一，至少占據活體淋巴組織的1/3;屬于兩種淋巴組織中的第二淋巴組織；并且可在腸道等器官中由IgA引發的自防御系統起重要作用的腸道粘膜中觀察到(Bienestock,J.et.al.,Immunol.,41,249-270(1980))。腸道免疫的關鍵作用是通過胞飲和吞噬作用吞噬可溶抗原、病毒和細菌，然后將其運到淋巴細胞來激活細胞(Trier,J"Gastroenterol.Clin.NorthAm"20,531-547(1991))。一些專利文獻描述了含有肉桂皮提取物的組合物。例如，含有肉桂皮提取物的防治動脈硬化的藥物組合物(KoreanPatentNo.10-1998-0021474),含有肉桂皮提取物的化妝品組合物(KoreanPatentNo.10-1999-0034707),以及含有納米肉桂皮提取物的口腔衛生組合物(KoreanPatentNo.10-2002-0074210)。但是，還沒有關于肉桂皮改善腸道菌群，提高免疫力的說明。因此，本發明人研究了肉桂皮提取物，證實以肉桂皮提取物為有效組分的組合物可以增加長雙歧桿菌(5折^6a"m'wm/o"gwm)、乳酸菌(丄acotoZ)(3cz7/wssp.)和嗜酸乳酸菌(丄actoZ^c/〃Mac/dop/n7ws)這些益生菌的數量，有助于免疫細胞如淋巴細胞在脾臟和腸道的增殖。由此，本發明人基于通過證實本發明的組合物能用作治療便秘和其它腸相關疾病的藥劑及免疫增強劑，特別是腸道免疫增強劑的發現，進一步完成了此發明。
發明內容技術問題本發明的一個目的是提供一種含有肉桂皮提取物作為有效組分用于改善腸道菌群的組合物。本發明的另一個目的是提供一種含有肉桂皮提取物作為有效組分用于增強免疫應答的組合物。本發明的進一步的目的是提供一種含有肉桂皮提取物作為有效組分用于提高腸道免疫的組合物。本發明的更進一步的目的是提供一種含有肉桂皮提取物作為有效組分用于增強免疫應答的保健食品。技術方案為達到上述目的，本發明提供一種含有肉桂皮提取物用于改善腸道菌群的組合物。本發明也提供了一種含有肉桂皮提取物用于增強免疫應答的組合物。本發明還提供了一種含有肉桂皮提取物用于提高腸道免疫力的組合物。本發明還提供一種改善腸道菌群的方法，包括施用有效劑量的肉桂皮提取物的步驟，以改善腸道菌群。本發明還提供一種提高免疫的方法，包括為需增強免疫力的病人施用有效劑量的肉桂皮提取物的步驟。本發明還提供一種治療腸相關疾病的方法，包括為有需求的病人施用藥學上有效劑量的肉桂皮提取物的步驟。最后，本發明還提供了含有肉桂皮提取物作為有效組分用于增強免疫力的保健食品。下文中，將詳述本發明。本發明提供一種含有肉桂皮提取物，改善腸道菌群的組合物。肉桂皮是一種月桂科常綠喬木的外皮，主要分布在中國南方和越南，肉桂皮長期用作發汗劑，退燒藥，止痛藥和調味品。據報道，肉桂皮在腸道具有促進蠕動、抑制異常發酵的作用。但是，還沒有對此行為的機制的解釋。一旦達到平衡，棲居在腸道的微生物便開始生長并形成腸道菌群。組成腸道菌群的各種微生物都與提供維生素，防止感染及其它腸道機能有關，表明這些微生物與便秘和其它腸相關疾病密切關聯的(MistuokaT.BifidobacteriaMicroflora,1(1):3，1982)。本申請發明人研究了肉桂皮提取物的活性，得知其對腸道機能、對腸道益生菌有促進作用。首先，得到干燥的肉桂皮(來自HwajinDistributionCo.)然后在熱水提取器中提取3個小時，提取物用濾紙過濾后用真空蒸發器濃縮，然后冷凍干燥得到粉末。當實驗需用時，將粉末提取物以適當濃度懸浮分散在滅菌蒸餾水中并過濾。本發明涉及的肉桂皮提取物是釆用選自包括水、單一或混合醚、乙醇、甲醇及乙酸乙酯中的一種或多種來提取，然后減壓蒸餾濃縮提取物。所述溶劑優選水，提取方法可以是熱水提取、浸漬、回流或超聲提取之一，優選熱水提取。各種腸道菌群中，長雙歧桿菌(5zy^o&c^7^m/o"gwm)(ATCC15707)、乳酸菌(丄腳幽d〃wsp.)(KCTC3930)和嗜酸乳酸菌Ua"o^d〃Mac^o;Mw)(ATCC4356)被用作益生菌的指標。可在BBLGasPak(BectonDickinsonandCompany)設定37。C的厭氧條件下，利用強化梭狀芽孢桿菌培養基(RCM)培養這些菌株。本發明人研究了肉桂皮提取物對促進長雙歧桿菌(說y^o6acten'i/m/owgwm)、享L酸菌(丄acotoZ)acz'〃1^sp.)和嗜酸乳酸菌(i^ctoZ^cz7/wac^/o;/n7ws)生長的影響。為進行此實驗，粉末提取物以不同濃度加入要接種長雙歧桿菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌的預培養溶液的介質中，測量吸光度(O.D)來研究這些菌株的生長情況，當肉桂皮提取物的量增加時，菌株的生長也增加，吸光度更高，生長活性比(實驗組吸光度/對照組吸光度)也增加(見圖1)。將不同濃度的肉桂皮提取物置于直徑6mm的圓濾紙上，然后應用在固體培養基上。菌株培養完成后，測量生長活性區域的大小。如表1所示，應用肉桂皮提取物10mg/片的固體培養基上培養的促進長雙歧桿菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌菌株顯示大的生長活性區域，表明本發明涉及的肉桂皮提取物具有促進腸道益生菌生長的作用(見表1)。將肉桂皮提取物口服施用于小鼠并研究小鼠的血液成分，特別是，以500mg/kg/天的肉桂皮提取物的量施用于小鼠15天，然后檢測。結果為小鼠的血液成分與對照小鼠的血液成分基本無差別(見表2)。本發明還提供了一種含有肉桂皮提取物用于增強免疫應答的組合物。本發明人進一步研究常被用作亞洲民間補充氣血(能量和血液)的藥物的肉桂皮提取物，除了已被證實的能促進腸道益生菌的生長的作用，是否還有促進免疫細胞增殖的作用。為進行此項研究，自施用肉桂皮提取物的小鼠的脾臟內分離淋巴細胞，并研究其細胞分裂能力，結果證明其具有高度細胞分裂能力(見圖9)。本發明也提供一種含有肉桂皮提取物用于提高腸道免疫力的組合物。腸道免疫和體液免疫的機制和作用區域有很大的差別，因此，即使一種物質具有提高體液免疫力的作用，這種物質也不是必然具有促進腸道免疫的作用。為研究肉桂提取物對腸道免疫和全身免疫的作用，本發明人將提取物經口服施用于小鼠，然后測量腸道免疫細胞(腸系膜淋巴結T細胞和B細胞，粘膜固有層單核細胞)的細胞因子表達，這些免疫細胞是腸道免疫反應的指標。結果發現，當提取物施用于腸道，它可以通過調節參與增強或減弱免疫力的細胞因子表達，顯著調節腸道免疫活性(見圖2~圖8,圖10)。本發明用于改善腸道菌群與增強免疫應答的藥物組合物含有作為有效成分的肉桂皮提取物。肉桂皮提取物可以口服或注射施用，可釆用藥物制劑的所有形式。可口服施用的固體制劑形式是片劑、軟或硬膠囊、溶液和懸浮液，這些藥物制劑可將提取物與常用填充劑、膨脹劑、黏合劑、濕潤劑、崩解劑、諸如表面活性劑的稀釋劑或輔料混合制備。肉桂皮提取物的有效劑量根據體重，年齡，性別，健康狀況，食譜，施用頻度，施用方法，排泄狀況和疾病的嚴重程度確定。肉桂皮提取物的劑量范圍是每天0.1mg~10g/kg，優選每天10mg~lg/kg。單次劑量最好含有活性組合物的有效量，可以一次施用，通常以全部日劑量的1/2,1/3或1/4分次施用。施用頻度為一天1~6次。但是，當長期施用以提高健康狀況時，提取物的含量可以低于上述分量。但由于本發明的提取物非常安全，有效劑量可含有高于上述分量的量。作為本發明提取物原料的肉桂皮，經證明是一種安全的物質。將肉桂皮口服施用于大鼠，以檢測其毒性。結果發現，因肉桂皮對大鼠的半數致死劑量(LDso)遠遠大于10g/kg,肉桂皮被評定為安全物質。本發明也提供了含有以肉桂皮提取物作為有效組分用于改善腸道菌群與增強免疫反應的保健食品。保健食品可以含有本發明涉及的肉桂皮提取物，此時，根據常規方法，肉桂皮提取物可在與其它食物和組分混合時或混合后添加。有效組分的混合比例取決于用途(預防，保健或治療)。制作含有肉桂皮提取物食物或飲料時，根據原材料，加入提取物優選4070wt。/。，更優選為50~60wt%。但是，當長期施用以提高健康狀況時，提取物可以低于上述的含量。但由于本發明的提取物非常安全，有效劑量可含有高于上述的含量。適用的食物沒有限制，肉類，香腸，面包，巧克力，糖果，點心、餅干、比薩、拉面、面條、包括冰激凌的奶制品、湯、飲料、茶、飲品、酒精飲料及維生素合成物等，以及實際上包括通常制作的每一種保健食品，都可以作為例子說明。參考下列附圖，將有助于理解本發明最佳實施例的應用，其中圖1為說明益生菌在含有肉桂皮提取物的液態介質中的生長活性的柱狀圖；圖2為說明根據肉桂皮提取物的口服劑量，以分離于小鼠腸系膜淋巴結T細胞表示的TNF-a表達水平的柱狀圖；圖3為說明根據肉桂皮提取物的口服劑量，以分離于小鼠腸系膜淋巴結T細胞表示的IFN-y表達水平的柱狀圖；圖4~圖7為說明根據肉桂皮提取物的口服劑量，以分離于小鼠腸系膜淋巴結B細胞誘發的細胞因子表達水平，圖4，5，6和7分別說明IL-4，IL-10，IFN-y和TNF-a的表達水平的柱狀圖；圖8為說明根據肉桂皮提取物的口服劑量，以分離于粘膜固有層的單核細胞表示的IFN-y水平的柱狀圖；圖9為說明根據肉桂皮提取物的口服劑量，分離于脾臟和腸系膜淋巴結的CD4+T-細胞中抗-CD3抗體和抗-CD28抗體激活的T-細胞增殖的柱狀圖；圖10為說明利用流式細胞測定儀檢測TNF-a和IFN-y細胞內水平的結果的曲線圖。口服施用肉桂皮提取物后，將CD"T-細胞和B-細胞從脾臟和腸系膜淋巴結分離，利用PMA和伊屋諾霉素激活6小時，然后用流式細胞測定法測量TNF-a和IFN-y水平。圖11為通過PMA和伊屋諾霉素與肉桂皮提取物的聯合用藥的組圖，其表明，肉桂皮提取物依賴于由TNF-a報道載體表達的小鼠淋巴T-細胞、EL4細胞的報道基因的表達水平與報道基因的表達水平。具體實施方式本發明的實用的和優選的實施方案將通過下述的實施例來說明。但是，本領域技術人員應能理解，考慮本發明的內容，可在本發明精神和范圍內進行一些修改和改進。實施例1材料<1-1>肉桂皮提取物的制備將購買于HwajinDistributionCo.公司的干燥肉桂皮粉碎，然后用熱水提取器熱水提取3小時，肉桂皮提取物用濾紙過濾后，上清液用旋轉蒸發儀濃縮，然后將提取物用凍干機(Ilshin)冷凍干燥得到粉末。粉末提取物懸浮在蒸餾水中以配置適當濃度的溶液，過濾后使用。<1-2>腸道細菌的制備長雙歧桿菌(ATCC15707)、乳酸菌(KCTC3930)和嗜酸乳酸菌(ATCC4356)被用作腸道益生菌的指標。厭氧條件下，將BBLGasPak(BectonDickinsonandCompany)設定37°C，在強化梭狀芽孢桿菌培養基(RCM，Difco,USA)上培養這些菌株。實施例2肉桂皮提取物對腸道益生菌的生長的影響為研究肉桂皮提取物對腸道益生菌(長雙歧桿菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌)的生長的影響，進行以下實驗。每個實驗重復三次，實驗結果以提取物處理的實驗組和只用水處理的對照組的吸光度的比值表示。<2-1〉通過懸浮培養測定生長活性為研究肉桂皮提取物對腸道益生菌的生長的影響，以100ug、1mg和10mg/ml的濃度加入肉桂皮提取物來制備改性EG(EggerthGagnon)介質(牛肉浸膏2g，朊蛋白胨No.310g，酵母提取物5g,Na2HP044g，可溶淀粉0.5g,葡萄糖1.5g，L-半胱氨酸0.4g，硅消泡劑0.25ml，吐溫800.5g,D.W1000ml)。將在厭氧條件下激活的長雙歧桿菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌的預培養溶液接種到此介質，然后在厭氧條件、37'C下，進一步培養18小時，測定OD6。。來評價菌株的生長。實驗結果以提取物處理的實驗組的吸光度與只用水處理的對照組的吸光度的比值表示。通過測定腸道益生菌在含有肉桂皮提取物的液態介質中的生長(見圖1)，結果表明，菌株的生長隨著肉桂皮提取物的增加而增強，顯示為吸光度的增加。例如，加入10mg/ml的肉桂皮提取物，乳酸菌的生長與對照組相比，增加了2.4倍。同時，長雙歧桿菌和嗜酸乳酸菌的生長也隨著肉桂皮提取物的增加而增強。<2-2>利用瓊脂擴散法測定生長活性將EG瓊脂介質滅菌，在50。C冷卻，并分到三個含有23%菌株的平板中。培養基在室溫硬化，將不同濃度的肉桂皮提取物，0.1mg、1mg和10mg，置于直徑6醒的圓濾纟氏(WhatmanpaperNo.41)上，然后以固定間距分布在固體培養基上，培養基在厭氧條件下，37°C培養48小時，測定生長活性圈的大小。如表1所示，在含有lOmg/盤的肉桂皮提取物的固體培養基上，長雙歧桿菌顯示+生長活性圏，乳酸菌也有同樣表現，而嗜酸乳酸菌顯示+++的生長活性圈。結果顯示肉桂皮提取物具有優良的生長促進活性。表l肉桂皮提取物改善腸道菌群的活性表1菌株劑量(mg/disc)0.1110長雙歧桿菌iin+產氣莢膜芽孢梭菌n--乳酸菌n++嗜酸乳酸菌++++++n:無效果；+:直徑10-14mm;++:直徑15-19mm;+++:直徑20-24mm;-:抑制區，直徑10-14mm實施例3經口服施用于小鼠，研究肉桂皮提取物對血液成分的影響本發明人將肉桂皮提取物口服施用于小鼠，研究血液成分。將六周大雄性鼠分為兩組對照組和實驗組(3只/組)，實驗組以500mg/kg/天的量，口服肉桂皮提取物15天。利用庫爾特粒度儀(COLUTERJT)研究血液成分，結果見表2。表2實驗術語對照組實驗組Weight體重38.49士2.356b)36.61±3.192職C白細胞2.77±0.8312.5±1.127<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>如表2所示，施用提取物的實驗組的血液成分與對照組的血液成分沒有顯著差別。實施例4肉桂皮提取物對小鼠腸道免疫的影響<4-1>腸道免疫細胞的分離為研究根據肉桂皮提取物口服施用量，其對宿主免疫系統的影響，分離小鼠脾臟，淋巴結，腸系膜淋巴結和粘膜固有層細胞。特別是，小鼠口服肉桂皮提取物后被處死，取出脾臟，腸系膜淋巴結和腸，釆用磁選法(magneticmethod)從取出的脾臟和腸系膜淋巴結中分離T-細胞和B-細胞。磁選法表明T-細胞和B-細胞特定磁性小珠吸附在T-細胞和B-細胞上，將其置于強磁場中使磁珠緊緊吸附在磁場中的T-細胞和B-細胞上，以除去非特定細胞，然后去除磁場得到目標T-細胞和B-細胞。為從腸中分離粘膜固有層細胞，首先取出腸，用1%膠原蛋白酶(TypeI,Sigma，USA)處理三小時去除肌肉組織，在肌組織下的粘膜固有層細胞被處置成單個細胞，最后，通過Fercoll密度梯度法得到粘膜固有層細胞。<4-2>小鼠腸系膜淋巴結的T細胞分泌的細胞因子表達水平將細胞用PMA(Sigma，USA)和伊屋諾霉素(Kalbiochem,Switzerland)激活，為提供活體環境，采用用于活體T細胞評價的CD3和CD28抗體(BDbioscience,USA),激活細胞48小時，觀測T-細胞的變化。結果，觀察到T-細胞的蛋白質(免疫誘導物)變化。首先，與對照組相比，不論是否激活，腫瘤壞死因子(TNF-a)的mRNA水平增加，與腸系膜淋巴結B-細胞的增加一致。但是，被認為是肉桂皮提取物誘發的干擾素的表達形式隨激活變化，實際上，表達式隨著肉桂皮提取物增加(見圖2和圖3)。<4-3>小鼠腸系膜淋巴結的B-細胞分泌的細胞因子表達水平小鼠以500mg/kg/天，5000mg/kg/天口服肉桂皮提取物10天。處死小鼠，利用磁選法從腸系膜淋巴結中分離T-細胞和B-細胞。分離的細胞用PMA和伊屋諾霉素激活，為達到活體類似環境，釆用常用于激活活體B-細胞的LPS(lipopolyssacaride)激活B-細胞4小時，然后觀察每組B-細胞的變化。實驗結果在實驗組觀察到分子的顯著變化。首先，對照組的腫瘤壞死因子(TNF-a)的表達水平低到難以發現，而不論是否激活，月艮用500mg/kg/天，5000mg/kg/天的兩個實驗組的腫瘤壞死因子(TNF-a)都過度表達(見圖4)。白細胞間素-4的表達形式與TNF-a的一致(見圖5)。用或不用PMA和伊屋諾霉素激活，白細胞間素-10的表達形式有微小增加，但釆用LPS(lipopolyssacaride)激活，其顯著增加，比對照組至少約增加100倍(見圖6),無論是否激活，？干擾素(interferon-gamma)的表達也依賴提取物劑量而增加(見圖7)。<4-4>粘膜固有單核細胞分泌的細胞因子表達粘膜固有單核細胞是研究腸道免疫系統的最重要的關鍵細胞，這些免疫細胞可以在腸表皮細胞下找到，參與腸道免疫的調節。但是，這些細胞難于得到以致于很多研究者未能在實驗中成功應用這些細胞。本發明人以前建立了一種獲得粘膜固有單核細胞的方法，過程如前所述。因此，發明人可測定依賴于經上述同樣激活(PMA/伊屋諾霉素，LPS和抗-CD3/抗-CD28抗體)細胞的mRNA表達的肉桂皮提取物。實驗結果與對照組相比，施用肉桂皮提取物的粘膜固有單核細胞的干擾素表達顯著增加(見圖8)。實施例5肉桂皮提取物對小鼠脾臟和腸系膜淋巴結的影響<5-1>將T-輔助細胞從小鼠脾臟分離為從小鼠脾臟中分離CD"T輔助細胞，將小鼠處死取出脾臟，然后將脾臟組織物理粉碎，流動通過濾膜(40pm尼龍篩；Falcon)，制備單細胞。然后，采用磁選法分離CD"T細胞，加入CD4-特定結合金屬小珠(MiltenyiBiotec，USA)使小珠吸附在CD4+T細胞表面。將細胞置于強磁場中以除去未被金屬小珠吸附的細胞，然后去除磁場得到CD4+T細胞。<5-2〉口服肉桂皮提取物對小鼠脾臟和腸系膜淋巴結中T細胞分裂能力的影響參考亞洲民間傳統醫藥，本發明人研究口服肉桂皮提取物對宿主T細胞分裂能力的影響。實驗前，將肉桂皮提取物口服施用于小鼠8~20周(500mg/kg/次)。口服施用完成后，處死小鼠，取出小鼠脾臟和腸系膜淋巴結，以上述相同方式從取出的組織中分離CD"T輔助細胞。為評價分離的T細胞的分裂能力，釆用抗-CD3抗體(1ug/ml)和抗-CD28抗體(lug/ml)激活相同數量的細胞，將激發后的細胞培養三天使細胞有足夠時間反應和分化，加入放射同位素([3司-脫氧胸腺嘧啶)吸附在細胞內DNA上。通過測定其中反射性同位素的放射性，檢測細胞的增加水平來評價分裂能力。實驗結果在脾臟和腸系膜淋巴結中，可觀察到經肉桂皮提取物處理的T細胞比經PBS處理的T細胞具有更強的分裂能力(見圖9)。<5-3〉通過口服肉桂皮提取物，在小鼠脾臟和腸系膜淋巴結T細胞中表達干擾素和TNF-a上述實驗已經證實口服肉桂皮提取物可提高，最具代表性的參與免疫的細胞因子，INF-y和TNF-a的mRNA水平，說明提取物具有通過T細胞增強免疫應答的作用。基于此結果，此實施例將在蛋白質層面評價上述兩個細胞因子的表達。從口服肉桂皮提取物實驗小鼠和僅經PBS處理的對照小鼠的脾臟和腸系膜淋巴結中，分離T細胞和B細胞，為使以上分離的T細胞和B細胞分泌細胞因子，釆用PMA和伊屋諾霉素細胞激活一段時間。為防止分泌的細胞因子外泄，釆用布雷菲德菌素A(Epicentrebiocompany;B901MG，USA)處理激活細胞，以達到防止紅細胞(ER)中分泌的蛋白質移動的結果。為阻斷紅細胞(ER)中的蛋白質移動，用透化緩沖液(permeabilizationbuffer(0.5%皂素，r/。BSA的葡萄糖水溶液))在細胞膜上制作孔洞，向有孔的細胞內加入有放射標志的INF-y和TNF-a,然后用流式細胞測定儀測定細胞中分泌的細胞因子水平。實驗結果根據肉桂皮提取物的口服量，小鼠脾臟T細胞中TNF-a表達輕度增加，腸系膜淋巴結的T細胞顯著增加。但INF-y表達沒有增加。還測定了B細胞，對照組和實驗組沒有顯著差別(見圖10)。實施例6肉桂皮提取物在體外報道測定系統中的免疫增強活性<6-1>用于評價肉桂皮提取物對細胞因子表達的影響的體外篩選在活體實驗前，以間接方式研究肉桂皮提取物對宿主免疫系統的影響，更確切地說，釆用熒光酶素指針測定系統(TaKaRa，Japan)，對細胞因子進行篩分。通過克隆構造重組體載體，其中，定位在上游的細胞因子啟動因子調節熒光酶素的活性，將IL2，IL4，IL10,IL24和TNF-a的啟動子區(Promoterregions)插入含有熒光酶素基因(pXPGvector,Plasmid44，173-182，2000)的載體的上游。特別是，表達熒光酶素的載體上游隨XhoI和KpnI消化。為準備插入，從取出的小鼠脾臟和基因組DNA中分離T細胞，釆用兩末端含有Xhol和Kpnl限制性內切酶區域、上游含有起譯密碼子的啟動因子特定引發劑，利用PCR放大啟動子區。放大的啟動因子由上述限制性內切酶消化并純化。用連接酶(NewEnglandBiolabs)將準備好的插入片段和載體連接起來。上述重組體載體釆用lipoplex(Invitrogen;Lipofectamine2000)將一種小鼠T細胞系的EL4細胞(ATCC;TIB-39)轉染。僅采用肉桂皮提取物激發或還聯合使用PMA和伊屋諾霉素激發細胞一段時間，用熒光酶素測定試劑盒(Dualluciferaseassaysystem,Promega，USA)測定熒光酶素，此實驗應用的啟動因子是IL2，IL4,ILIO，IL24和TNF-a，但重復實驗證實只有TNF-a可以被肉桂皮提取物激發，即當利用肉桂皮提取物激發細胞時，細胞因子活性增加，特別是，當施用1%肉桂皮提取物激發時，熒光酶素活性約增加5~6倍，當施用肉桂皮提取物，并聯合使用濃度分別為0.1%和0.3%的？]\4八+伊屋諾霉素激發時，活性高于只施用PMA+伊屋諾霉素的活性(見圖11)。實施例7經口服施用于大鼠測定急性毒性利用6周齡無特殊病原體(SPF)SD系大鼠進行急性毒性實驗。將實施例1制備的肉桂皮提取物懸浮在0.5%的甲基纖維素溶液中，分別以1g/kg，5g/kg和10g/kg的劑量一次口服施用于每組的5只大鼠，觀察大鼠的死亡、臨床癥狀和體重變化，進行血液實驗和血液生化實驗，在尸檢時，肉眼檢查胸腹部胃腸組織的任何異常現象。結果顯示實驗化合物未引起任何特定的臨床癥狀、體重變化或死亡，血液實驗，血液生化實驗和尸檢也沒有變化。因此，由于直至10g/kg的劑量不會引發大鼠的任何中毒變化，判斷其半數致死量遠遠大于10g/kg，本發明涉及的肉桂皮提取物被評定為安全物質。制備實施例l軟膠囊的制備每個軟膠囊含有100mg實施例1制備的肉桂皮提取物，175.0mg大豆油，45.0mg黃蜂蠟，127.5mg棕櫚硬化油，21.0mg大豆卵磷月旨，212.0mg明膠，50.0mg甘油(比重1.24),76.0mgD-山梨醇，0.54mg對氧甲基安息香酸(paraoxymethylbenzoicacid)，0.90mg對氧丙基安息香酸(paraoxypropylbenzoicacid)，0.56mg甲基香莢蘭醛和適量食用黃色素203,根據韓國藥典軟膠囊的生產流程制造。制備實施例2片劑的制備將lOO.Omg實施例1制備的肉桂皮提取物，90.0mg玉米淀粉，175mg乳糖，15.0mgL-羥丙基纖維素，5.0mg聚乙烯吡咯烷和適量乙醇均勻混合，用濕淀粉法(wet-granulizingmethod)淀粉化。再加入1.8mg硬脂酸鎂，制備每片含有400mg混合物的藥片。制備實施例3膠囊的制備將lOO.Omg實施例1制備的肉桂皮提取物，83.2mg玉米淀粉，175.0mg乳糖和1.8mg硬脂酸鎂均勻混合，然后制備每粒含有360mg混合物的膠囊。制備實施例4粉劑的制備肉桂皮提取物2g乳糖lg混合上述組分，裝入氣密性包裝中制得粉劑。制備實施例5口香糖的制備口香糖以以下組分制備肉桂皮提取物0.24-0.64%,口香糖膠基20%，糖76.36-76.76%,水果風味劑1%，水2%。制備實施例6飲料的制備飲料以以下組分制備肉桂皮提取物0.48~1.28mg，蜂蜜522mg，二硫化苯酰5mg，煙酰胺5mg,核黃素氯化鈉(sodiumriboflavinhydrochloricacid)3mg，維生素B62mg，纖維醇30mg，正酸(orthoacid)50mg，水200ml。制備實施例7香腸的制備香腸以以下組分制備肉桂皮提取物0.24-0.64%,豬肉63.6%，雞肉27.5%，淀粉3.5%,大豆蛋白1.7%,食鹽1.62%,葡萄糖0.5%，其它添加劑(甘油)0.94-1.34%。工業實用性如前所述，含有肉桂皮提取物，改善腸道菌群、增強免疫應答的組合物顯示出對長雙歧桿菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌，還有免疫細胞，特別是全身免疫系統和腸道免疫系統的淋巴細胞的生長促進活性，因此，本發明的組合物可以發展成腸相關疾病如便秘和便積的治療藥劑，免疫促進劑和保健食品，例如酸奶或其它奶制品，促進老年人或病人消化的肉桂飲料，助消化中草藥等。本領域技術人員可以理解前述說明書揭露的概念和特定實施方案，可輕易將其作為修改或設計其它實施例的基礎，來實現與本發明同樣的目的。本領域技術人員也可以理解不偏離如附加權利要求所述的本發明精神和范圍的同等實施方案。權利要求1、一種含有肉桂皮提取物作為有效組分用于改善腸道菌群的組合物。2、根據權利要求1的改善腸道菌群的組合物，其中的肉桂皮提取物是用選自水、單一或混合醚、乙醇、甲醇及乙酸乙酯的溶劑來提取的。3、根據權利要求1的改善腸道菌群的組合物，其中腸道菌群包括一種或多種選自長雙歧桿菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌的菌株。4、一種含有肉桂皮提取物作為有效組分用于增強免疫應答的組合物。5、根據權利要求4的增強免疫應答的組合物，其中所述的免疫增強作用表現為誘導免疫細胞增殖的活性。6、根據權利要求5的增強免疫應答的組合物，其中所述的免疫細胞是T-淋巴細胞和B-淋巴細胞。7、一種含有肉桂皮提取物作為有效組分用于改善腸道菌群和增強免疫力的保健食品。8、根據權利要求7的改善腸道菌群和增強免疫力的保健食品，其中所述的食品可以為片劑，膠囊，粉劑，顆粒劑，溶液或丸劑。9、一種含有肉桂皮提取物作為有效組分用于提高腸道免疫力的組合物。10、根據權利要求9的提高腸道免疫力的組合物，其中所述的免疫提高作用通過加速免疫細胞增殖或增加腸系膜淋巴結T-細胞的細胞因子分泌來獲得。全文摘要本發明涉及一種含有以肉桂皮提取物作為有效組分用于改善正常菌群與增強免疫應答的組合物，更確切地說，涉及一種含有以肉桂皮提取物作為有效組分，具有促進諸如長雙歧桿菌、乳酸菌和嗜酸乳酸菌的益生菌生長，促進免疫細胞諸如全身免疫系統淋巴細胞增殖，以及提高腸道免疫細胞活性的作用的組合物。由于具有通過促進免疫細胞增殖提高免疫力特別是腸道免疫力的活性，本發明的組合物可有效用作治療便秘或其它腸相關疾病的藥物和免疫增強劑。文檔編號A61P37/04GK101277712SQ200680036238公開日2008年10月1日申請日期2006年10月25日優先權日2005年10月26日發明者任申赫,全園璟,權大泳,權好根,高柄燮,黃智仙申請人:韓國韓醫學研究院;韓國食品研究院