治療心腦血管疾病的中藥注射劑及其制法和質量控制方法

專利名稱：：治療心腦血管疾病的中藥注射劑及其制法和質量控制方法
技術領域：
：本發明涉及一種中藥制劑，特別是一種用于治療心腦血管疾病的中藥注射劑及其制法和質量控制方法。
背景技術：
：心腦血管疾病，具有發病急、病情重、變化快、可多次發病及病死率高等特點，嚴重危害著人類身體健康特別是老年人的身體健康，給社會、家庭及患者個人均帶來極為沉重的負擔。2006年9月20日中國專利公報公開了由本申請人申報的名稱為"用于治療心腦血管疾病的中藥制劑及其制備方法"、公開號為1569150的專利申請，可由紅景天和燈盞花素制備成中藥注射劑。但是在實際應用過程中我們發現制備方法比較粗糙，效果不夠理想。在近兩年的時間里，我們在原來的基礎上，通過大量的實驗摸索，找到了最佳的制備工藝，科學地進行質量控制，臨床藥效學實驗效果顯著。
發明內容本發明的目的在于提供一種療效顯著的治療心腦血管疾病的中藥注射劑及其制法和質量控制方法。本發明是這樣實現的一、處方紅景天(最粗粉)1000g，燈盞花素(按燈盞花乙素計)40g，制成5000ml(1000支)注射液。二、制法取處方量紅景天最粗粉，加適量65%乙醇浸潤后，置滲漉器中，再加65%乙醇適量浸泡過夜，用65%乙醇以每公斤藥材每分鐘15ml流速滲漉，收集藥材12倍量的漉液，回收乙醇，濃縮至相對密度約1.2(6(TC)左右，加6倍量水攪勻，煮沸溶解，冷藏過夜，濾過，濾液濃縮至相對密度1.1(60°C)，冷至室溫，用水飽和的等體積仲丁醇萃取3次，合并仲丁醇，減壓回收仲丁醇，濃縮至相對密度1.2(6(TC)，加200g聚酰胺拌勻，干燥，裝于層析柱(柱徑與柱高比1:68)，用65%乙醇以每公斤藥材每分鐘15ml的流速洗脫，收集藥材3倍量的洗脫液，回收乙醇，濃縮至相對密度1.1(6(TC)，加5倍量水攪勻，煮沸，冷藏過夜，濾過，濾液濃縮至每lml相當于藥材10g的濃清膏，冷藏備用。取紅景天苷提取物，加處方量20%的注射用水煮沸溶解，冷藏過夜，取上清液，用0.85um微膜過濾澄明。調節pH至6.5左右。取燈盞花素，加處方量20%的注射用水攪勻，用10%氫氧化鈉溶液調節pH至約7.0，冷藏過夜，用0.85um微膜過濾，與上述含紅景天提取物溶液混合，加熱至8(TC左右，加0.1M(W/V)活性炭攪勻，吸附約15min，期間攪拌23次，用0.85um微膜過濾，加水至全量，調節pH至6.5左右，濾過，灌封，滅菌即得。三、性狀本品為本品為棕紅色澄明液體。四、鑒別(1)取本品5ral加水稀釋至10ml，用水飽和的仲丁醇提取3次，每次20ml，合并仲丁醇液，于水浴蒸干，殘渣加5ml水溶解，上D101大孔吸附樹脂柱，以70ml水洗脫，棄去洗脫液，再用70%乙醇50ml洗脫，收集洗脫液，于水浴蒸干，殘渣加甲醇4ml溶解，即得供試品溶液。另取紅景天苷對照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VIB)試驗，吸取上述兩種溶液各10y1，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-甲醇-水(13:7:1.5)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵-1%鐵氰化鉀(1:1)的溶液至顯色，置日光下觀察，在與對照品色譜相應的位置上，應顯相同顏色的斑點。(2)在紅景天苷含量測定的色譜圖中，供試品峰的保留時間應與對照品峰的保留時間一致。(3)取本品2ml，拌入適量硅藻土，置水浴上蒸干，加甲醇20ml，超聲處理10分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為供試品溶液。另取野黃芩苷(燈盞花乙素)對照品，加甲醇制成每lml含2mg的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VIB)試驗，吸取供試品溶液5wl、對照品溶液3lil，分別點于同一硅膠G薄層板上，以醋酸乙酯-甲酸-水(16:l:2)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液,在105'C加熱數分鐘，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點。(4)在燈盞花素含量測定項下的色譜圖中，供試品峰的保留時間應與對照品峰的保留時間一致。五、檢查pH值應為5.57.5(中國藥典2000年版一部附錄WG)。溶液顏色取本品lml，置于25ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，取10ml置于納氏比色管中，依法檢查(中國藥典2000年版一部附錄XI第一法)，與黃色8號標準比色液比較，不得更深。蛋白質取本品5ml，加水稀釋至100ml，取lml加鞣酸試液3滴，不得出現渾濁。鞣質取本品5ml，加水至100ml，取lml加入稀醋酸1滴，再加明膠氯化鈉溶液5滴，不得出現渾濁或沉淀。樹脂取本品5ml，加水至100ml，取5ml于分液漏斗中，加稀鹽酸3滴，放置10min，用10ml乙醚萃取，乙醚層用水(pH7)洗滌3次，每次10ml，乙醚層于水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇5ml溶解，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞試管中，加水3ml，混勻，放置30分鐘，應無絮狀物析出。草酸鹽取本品5ml，加水至100ml，取5ml，用稀鹽酸調節pH值至12，放置30min濾過，濾液調節pH值為56，放置10min過濾，濾液加3%氯化鈣溶液3滴，放置10分鐘，不得出現渾濁或沉淀。鉀離子取本品5ml，加水至100ml，取2ml，依法測定(中國藥典2000年版一部附錄IXS)，應符合規定。熱原取本品5ml加5%葡萄糖注射液稀釋至50ml，照熱原檢驗法(中國藥典2000年版一部附錄XIIIA),劑量按家兔體重每lkg注射6ml，應符合規定。熾灼殘渣精密吸取本品2ml，依法檢查(中國藥典2000年版一部附錄IXJ)，熾灼殘渣不得過1.0%(g/ml)。重金屬取熾灼殘渣項下遺留的殘渣，依法檢查(中國藥典2000年版一部附錄KE第二法)，含重金屬不得過百萬分之十。總固體精密量取注射液10ml，置于恒重的蒸發皿中，于水浴上蒸干后，在105"C干燥3小時，移置干燥器中冷卻30分鐘，迅速稱定重量。計算出注射劑中含總固體的量(mg/ml)，應符合規定。本品含總固體不得過30.00mg/ml。指標成分總含量為總固體量的百分率用指標成分總含量+總固體量X10(^加以計算，應不得少于25%。其他應符合注射劑項下有關的各項規定(中國藥典2000年版一部附錄IU)。六、含量測定紅景天苷照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適用性試驗用十八垸基硅烷鍵合硅膠為填充劑；甲醇-水-磷酸(20:80:0.2)為流動相；檢測波長為223nm。理論板數按紅景天苷峰計算應不低于1500。對照品溶液的制備取紅景天苷對照品適量，精密稱定，加流動相制成每lml約含0.15mg的溶液，即得。供試品溶液的制備精密量取本品2ml，加流動相稀釋至10ml，搖勻，濾過，取續濾液，即得。測定法分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20ul,注入液相色譜儀，測定，即得。本品每5ml含紅景天苷(C14H2007)應不少于2.5mg。燈盞花素照高效液相色譜法(中國藥典2000年版一部附錄VID)測定。色譜條件與系統適用性試驗用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；乙腈_0.5%冰醋酸溶液(30:70)為流動相；檢測波長為335nm，理論板數按野黃苳苷峰計算應不低于1000。對照品溶液的制備取野黃芩苷(燈盞花乙素)對照品，用甲醇配制成約0.15mg/ml的溶液作為對照品溶液。供試品溶液的制備精密量取本品lml，加甲醇稀釋至50ml，濾過，溶液作為供試品溶液。領l淀法分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20u1，注入液相色譜儀，測定，即得。本品含燈盞花素按燈盞花乙素(C21H18012)計，應為標示量的95.0105.0%。七、功能與主治補氣溫陽，活血化瘀，通絡止痛，用于缺血性腦中風和中風后遺癥以及胸痹心痛證(冠心病心絞痛)。八、用法用量一次5ml10ml，一日1次；或遵醫囑。臨用前加入100200ml5%葡萄糖注射液或10%葡萄糖注射液中靜脈滴注。主要藥效學試驗為了進一步比較公開號為1569150的專利申請技術與本發明技術之間的療效差別，進行了下述的比較實驗研究。將公開號為1569150的專利申請簡稱為原發明。實驗一本發明治療腦缺血性中風后遺癥藥效學試驗(1)犬大腦中動脈結扎所致腦缺血模型試驗1實驗方法草犬30只，隨機分成5組，每組6只，雌雄兼用，腹腔注射3%戊巴比妥鈉L0ml/kg(30mg/kg)麻醉，仰位固定于犬手術臺上,然后在犬右外眼角與右耳根部1/2處(中點)，用電刀切開皮膚，分離肌肉，用手術專用顱骨鉆鉆開顱骨，以咬骨鉗擴大顱骨孔，切開硬腦膜，找到大腦中動脈。先用多譜勒超聲血流探測儀測定大腦中動脈血流速度，然后股靜脈滴注給藥，給藥劑量及分組見表l。給藥15min后，再次同前法測定大腦中動脈血流速度，隨后立即將大腦中動脈結扎造成腦缺血。大腦中動脈結扎6小時后，分離雙側頸總動脈并夾閉之，即刻從右側頸總動脈夾閉處的遠心端灌注20ml龍膽紫飽和溶液對腦組織進行染色，然后處死動物，開顱取出腦組織，稱全腦重，遂切下未染色的腦組織(即缺血區腦組織)稱重，求出其占全腦重量的百分率，并進行病理組織學檢查(按常規取腦組織，10%甲醛固定1周，H.E染色，石臘包埋切片，光學顯微鏡下觀察)，以判斷其是否屬于腦缺血性損傷，結果見表12。2實驗結果表l紅燈注射液對實驗性犬腦缺血的影響(x士SD)組另lj劑量x次數(mg/kgXc)犬數(只)全腦重(g)腦缺血區重(g)缺血區重/全腦重對照組原發明組5%葡萄糖y1注射液X1346.7X16663.65±5.4060.35±5.0318.90±4.8214.00±2.53*29.50±6.3223.17±3.54*本發明大劑量組346.7X1657.82±4.279.70±3.07**A16.98±6,07**A本發明中劑量組173.4X1660.13±4.2012,03±4.74*19.80±7.54'本發明小劑量組86.7X1660.47±4.4415.87±3.5526.51±7.06注各給藥組與對照組比較*P<0.05林P<0.01，與原發明組比較，△P<0.05。表1結果顯示，本發明大、中劑量組均能明顯減少犬大腦中動脈結扎后的腦組織缺血區重量和缺血腦組織百分率(P〈0.01和P〈0.05)。與原發明組比較，本發明大劑量組療效更為顯著(P<0.05)，中、小劑量組療效相當。表2本發明對犬大腦中動脈血流速度的影響組別劑量x次數犬數-(mg/kgXc)(只).血流速度(cm/s，x土SD)給藥前給藥后15min峰值流速平均流速峰值流速平均流速對照組5%葡萄糖注射液620.58±4.819.70±1.0221.38±5.019.70±3.01原發明組346.7X1621.45±6.9410.43±5.0527.02±8.517.38**±5.13本發明大劑量組346.7X1622.47±5.479.43±5.1033.05*±7.3520.27"±6.20本發明中劑量組173.4X1621.57±10.0510.72±6.4431.824±16.4614.98*±9,37本發明小劑量組86.7X1617.95±9.429.83±4.6720.87±12.4711.75±6.43注各給藥組與對照組比較^P〈0.05，**P<0.01。表2結果顯示，本發明大、小劑量組與原發明組均能明顯增加血流速度(P<0.01或P〈0.05)，其中本發明大、中劑量組作用更為顯著。(2)大鼠頸內動脈注射血栓局部腦缺血模型試驗1實驗方法取SD種大鼠50只，雌雄各半，體重200250g，隨機分為5組，每組10只，按表6所示藥物和劑量尾靜脈注射給藥，l次/日，連續3天。于末次給藥后30min，左側頸內動脈注射血凝塊直徑小于0.lmm的血栓混懸液0.4ml造模，此后于第2，6,12和24h采用0-3級評分標準(見表3)評定每只大鼠的意識和運動能力。在處死前，又以0-3級標準(見表4)進行神經行為學的評分。隨后頸總動脈注射龍膽紫染色，處死動物，開顱取出腦組織，稱全腦重，遂切下未染色的腦組織(即缺血區腦組織)稱重，求出其占全腦重量的百分率，并將其進行病理組織學檢查(按常規取腦組織，10%甲醛固定1周，H.E染色，石臘包埋切片，光學顯微鏡下觀察)，判斷其是否屬于腦缺血性損傷，結果見表37。表3大鼠的意識和運動能力評分標準評分標準0分l分2分3分正常活動自發活動+/-觸覺刺激不能喚醒疼痛刺激不能喚醒，無自發活動表4大鼠神經行為學的評分標準<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>血大鼠的神經行為學癥狀(P<0.01)，兩者療效相當。表7本發明減少大鼠腦缺血百分率作用(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注各給藥組與模型組比較*P<0.05，**P<0.01;與原發明組比較，厶P〈0.05。表7結果顯示，693.4173.4mg/kg本發明與原發明組均能顯著降低局灶性腦缺血大鼠缺血區重量和腦缺血百分比(P<0.01)，其中本發明大劑量組與原發明組比較具有更好療效(P〈0.05)。實驗二全腦缺血模型試驗(1)沙土鼠頸動脈結扎法所致腦缺血模型試驗1實驗方法選取體重4555g的沙土鼠60只，雌雄各半，按體重隨機分為6組。按表8所示藥物和劑量于手術前尾靜脈注射連續給藥10天，于第10天末次給藥后30min開始手術。各組動物均在乙醚麻醉下分離雙側頸總動脈，除假手術組外各組用血管夾夾閉雙側頸總動脈，40min后開夾使血流再通，60min后斷頭取腦，稱重。將腦均分為2份。一份取大腦皮層測定水含量，并做病理切片觀察海馬CA1區錐體神經元，以2個視野下的存活錐體神經元數總和來表示海馬損傷的程度。另一份用0.5mol/L、P^7.8的磷酸鹽緩沖水溶液冰浴下制備10%腦組織勻漿，按試劑盒操作步驟測定勻漿中MDA、GSH-PX及LDH的含量，試驗結果見表811。2實驗結果表8本發明對夾閉再灌注腦損傷沙土鼠腦組織GSH-PX和LDH活力的影響(X土SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注①模型組與假手術組比較△△P<0.01,△△△P〈0.001;②各給藥組與模型組比較***P<0.001,**P<0.01，*P<0.05。表8結果顯示，693.4mg/kg本發明有極顯著升高腦缺血再灌注沙土鼠的GSH-PX和LDH活力的作用(P〈0.01和P<0.001)，346.7mg/kg本發明也能顯著升高模型動物的LDH活力(P<0.01)，與原發明組比較療效相當。表9本發明夾閉再灌注腦損傷沙土鼠腦組織MM含量和大腦皮層含水量影響(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>注①模型組與假手術組比較AP〈0.05②各給藥組與模型組比較*P〈0.05表9結果顯示，693.4mg/kg本發明有明顯降低腦缺血再灌注沙土鼠的大腦皮層含水量(P〈0.05)，，療效與原發明組相當。表10本發明對沙土鼠腦缺血再灌注后海馬CA,區神經元密度的影響(X±SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表11結果顯示，693.4和346.7mg/kg本發明分別有顯著和明顯增加斷頭小鼠張口喘氣次數的作用(p〈0.01和p〈0.05)，效果與原發明組相當。實驗三對戊巴比妥鈉所致小鼠記憶獲得障礙的改善作用(跳臺法)1實驗方法給藥取健康昆明種小鼠60只，雌雄各半，鼠齡8周，體重1822g,，按體重隨機分為6組，每組10只，按表16所示藥物和劑量連續給藥10天。訓練給藥1小時后開始訓練，訓練前10分鐘各組小鼠分別腹腔注射戊巴比妥鈉20mg/kg。每批實驗各組分別有一只小鼠給藥，平行操作，十分種后第2批小鼠給藥，以此類推。訓練時將第一批小鼠放入跳臺儀的格子內，先適應環境3分鐘，然后通電，小鼠遭電擊后，多數跳上跳臺，逃避電擊。此后小鼠也會再次跳下時觸電，視為錯誤反應，訓練5分鐘，并記錄5分鐘內觸電次數，24小時后重新測試。測試24小時后，先將小鼠放在跳臺上，同時開動秒表，記錄小鼠5分鐘內跳下次數(即錯誤次數)，作為記憶指標。統計分析采用T檢驗法，分別將各組記憶指標與模型組進行比較，試驗結果見表12。2實驗結果表12本發明對戊巴比妥鈉所致小鼠記憶獲得障礙的影響(x土SD)劑量x天鼠數組另lj錯誤反應次數(mg/kgXd)(只)正常對照組—101.44±0.49'模型組—103.63±0.663AA原發明組693.6X10101.52±0.50**本發明大劑量組693.6X10100.70±0.64,本發明中劑量組346.7X10102,10±1,22**本發明小劑量組173.4X10101,40±1.36**注①模型組與對照組比較AAP<0.01@各給藥組與模型組比較林*P<0.001,**P〈0.01;與原發明組比較，ttP<0.05。表12結果顯示，模型組與空白組比較，模型組5分鐘內錯誤次數顯著增多(P〈0.01)，說明戊巴比妥鈉腹腔注射已造成記憶獲得障礙。693.6和346.7mg/kg本發明和原發明組均能顯著減少該模型動物5分鐘內錯誤次數(P<0.01)，其中本發明與原發明組比較具有顯著性差異(P〈0.05)，其它劑量與原發明組療效相當。實驗四冠心病藥效學試驗(1)抗心肌缺血試驗1.1犬冠狀動脈前降支結扎法所致心肌梗塞模型試驗1實驗方法，健康犬30只，雌雄兼用，用戊巴比妥納30mg/kg靜脈麻醉后氣管插管(備作開胸時人工呼吸用)，分離左側頸總動脈，插入適當口徑的聚乙稀管(內充滿肝素生理鹽水)，連接壓力換能器測定外周血壓(AP)，股靜脈插管接輸液管以備給藥，同時測定心電圖(ECGII)。從胸骨左緣沿第四或第五肋間開胸，切開一根肋骨并用撐開器撐開使全心充分暴露。剪開心包作心包吊籃，插入適當口徑的聚乙稀管(內充滿肝素生理鹽水)，連接壓力換能器測定左室內壓(LVP)，左心室舒'張未期壓(LVEDP)及左心室內壓最大上升速率(LV+dp/dt)和最大下降速率(LV-dp/dt);分離深主動脈根部，用多譜勒超聲血流探測儀測定主動脈血流速度(用于折算心輸出量CO)。除直接測取上述參數外，按公式1[1]計算，間接測定左心室心肌耗氧量。以上指標均同步記錄于泰盟BL-420型生物機能信號系統上，等各項指標穩定后，按表12所示藥物和劑量經靜脈恒速滴注，注射容量均為2ml/kg，注射前、注射后15min兩個時間點，均記錄上述各項參數一次。然后于左冠狀動脈前降支(LADl/3處，供應心室前壁及心尖部的第一級血管分支起始部)雙重結扎，結扎后5、10、15、30、60和120分鐘分別開機記錄上述各項參數。并在結扎LAD前和結扎后3小時，取靜脈血測定乳酸脫氫酶(LDH)和磷酸肌酸激酶:公式2計算)用配對T檢驗對模型組給藥前后差異進行顯著性比較，用組間T檢驗對各試驗組間結扎LAD增減比率(按公式3計算)進行顯著性比較，結果見表13。公式1:左心室心肌耗氧量<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>，BPs:收縮壓(mmHh),BPd-舒張壓(mmHh)，服=心率(bats/min)，SV二每搏輸出量(ml/beat)，BW^體重(kg)公式2:心室梗死范圍(CPK)含量；然后迅速放血摘取心臟，NBT染色法稱重并計算心室梗塞范圍(按么、心室梗死范圍=一公式3:結扎LAD增減比率結扎LAD增減比率=t、室梗死區重量-X100%全心重給藥后數值-給藥前數值給藥前數值2實驗結果2.1本發明對心肌缺血酶學指標及左室梗塞范圍的影響表13對麻醉犬結扎LAD心肌缺血酶學指標及左心室梗塞范圍的影響(X土SD,N=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注各給藥組與5%葡萄糖組比較*P<0.05**P〈0.01;與原發明組比較，#P<0.05。由表13可見，本發明大、中劑量組靜脈給藥后，可使左心室梗塞范圍分別顯著和明顯縮小(P<0.01)、可顯著降低模型動物的LDH和CPK(P〈0.01)。與原發明組比較，本發明大劑量組具有更為顯著降低模型動物的LDH和CPK(P〈0.01)的療效(P<0.05)。200710019163.4轉溢也被13/21到1.2本發明對對麻醉犬結扎LAD心肌缺血模型心臟功能的影響表14對麻醉犬結扎LAD心肌缺血模型的心外膜電圖的影響(X土SD，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>表16本發明對麻醉犬結扎LAD心肌缺血LV-dp/dt的影響(X士SD，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注各給藥組與5%葡萄糖組比較*P〈0.05表17本發明對麻醉犬結扎LAD心肌缺血模型LVP的影響(X土SD，n=6)劑量對照結扎LAD后增減比率指標組別(mg/kg)藥前藥后15min5minlOmin15min30min60min120min5%葡萄60.3057.18-0.06-0.18-0.20-0.23-0.24-0.27糖組±15.50±13.35±0.16±0.13±0.13±0.14土O.20±0.13原發明346.770.90±16.1468.00±14.55-0,19±0.22-0.20±0.19-O.30±0.17-0.30±0,21-O.34±0.16-O.35±0.13LVP本發明346.767.3060.83-0,05-0.03-0.04-0.03±0.07*柳-O.05-0.15(minHg)大劑量組±12.52±7.17±0.18±0.l廣±0.09鄉±0.14*柳±0.24s本發明173.463,6061.93-0.02-0.12-0.11-0.16-O.14-0.12中劑量組±13,41±15.72±0,28±0.29±0.27s±0.24±0.258±0.15M本發明86.755.4049.90-0.05-0.05-0,06-0.07-0.09-0.10小劑量組±17.65±13.77±0.36±0.30"±0.30s±0.26"±0.31*s±0.22*s注各給藥組與5%葡萄糖組比較*P<0.05，**P〈0.01;與原發明組比較，#P<0.05，tt#P<0.01200710019163.4溢步被17/21M表18本發明對麻醉犬結扎LAD心肌缺血模型LVEDP的影響(X士SD，n=6)<table>complextableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>注各給藥組與5%葡萄糖組比較*P〈0.05，**P<0.01，***P〈0.001;與原發明組比較，#P<0.05，P<0.01。表1518結果顯示，本發明各劑量組對結扎冠狀動脈前降支后心肌收縮能力(LVP和LV+dp/dt)的下降有明顯或顯著的改善作用(P〈0.05或P〈0.01)，可持續30min;對缺血心肌的舒張能力(LVEDP和LV-dp/dt)的下降也有明顯或顯著的改善作用(P〈0.05或P〈O.OD。本發明多項考察指標與原發明組比較具有不同程度的顯著性差異，具有更好的療效。表19本發明對麻醉犬結扎LAD心肌缺血耗氧指數的影響(X士SD，n=6)對照結扎LAD后增減比率指標組別藥前藥后15min5minlOmin15min30min60min120min12,6413.29-O.03-0.01-0.10-0.14-0.18-0.26±4.65±4,62±0.07±0.13±0.10±0.14±0.25±0.2215.3113,96-0,11-0.14-0.21-0.25-0.31-0.35±4.51±2.85±0.16±0.13*±0.16*±0.12*±0.12*±0.1017.4315.09-0.22-0.21-0.22-0.26-0.32-O.37±2,85±2.14±0.16*8±0.16樹±0.24*±0.23*±0.28*±0.2118.8517.59-0.14-0.20±-O.20-0.25-O.33-0.36±2.29±2.17±0.120.09*w±0.09*±0.10*±0.14*±0.1317.2915.81-0.09-0.17-O.16-O.26-0.28-0.34±3.22±3.04±0.07±0.03**±0.04±0.05*±0.08*±0.125%葡萄糖組—原發明組346.MV02(ml02/miri/100g)本發明大劑量組本發明中劑量組本發明小劑量組346.173.486.7注與5%葡萄糖組比較，*P〈0.05**P〈0.01;與原發明組比較，SP<0.05。表19結果可見本發明大、中劑量組對缺血心肌耗氧量有明顯或顯著的降低作用(P〈0.05或P〈0.01)，可持續30min。表明本品有降低心肌耗氧量的作用。與原發明組比較，在lOmin內有顯著性差異，具有更好療效。(2)藥物法所致心肌缺血模型試驗1實驗方法健康草犬50只，體重8.513.5kg，雌雄兼用，分為5組，每組10只。經用戊巴比妥納30mg/kg靜脈麻醉，背位固定后用泰盟BL-420型生物機能信號系統記錄一段正常II導聯ECG，然后iv垂體后葉素lu/kg，在給藥后15s、30s、lmin、2min、3min、4min、5min、10min、15min、20min分別記錄II導聯ECG，并以其中任何一時間的T波或ST段升高0.lmv或下降0.05mv作為心肌缺血陽性動物數，試驗結果用Fisher精確檢驗進行組間顯著性差異比較，結果見表20。2實驗結果表20本發明對犬由垂體后葉素誘發急性心肌缺血的影響藥物劑量(mg/kg/d)動物數.(只)心肌缺血動物數組別陽性數陰性數P模型組5%葡萄糖XI10100原發明組346.7X1103<0.01本發明大劑量組346.7X11046<0,.01本發明中劑量組173.4X11055<0,.05本發明低劑量組86.7X11073>0.,05表20結果顯示，本發明大、中劑量組能顯著和明顯對抗垂體后葉素誘發的急性心肌缺血(P〈0.01和P〈0.05)，且346.786.7mg/kg本發明有明顯的量效關系。與原發明組比較，相同劑量下療效相當。(3)抗低糖低氧對培養心肌細胞損傷的保護作用1實驗方法選用Wistar大鼠乳鼠，在無菌操作下取心室肌剪碎至lmm:'，Hanks液沖洗后用胰蛋白酶多次消化、離心、沉淀后，用15%小牛血清懸浮、計數，調整濃度為3X107培養瓶(25ml)，37。C5。/。C02孵箱培養46天，鋪滿呈單層細胞后備用。試驗分為六組，每組10瓶①正常對照組(用有糖有氧的DMEM培養液培養)；②模型對照組(用不含葡萄糖的DMEM培養液培養)；③心得安注射液組；分別為紅燈注射液高、中、低三個劑量實驗組。除①外，其余各組每一個細胞培養瓶內加3ml充氮藥液并充氮30秒(流量lL/分)，旋緊瓶蓋。封閉培養6小時后，取上清液按照LDH、AST和CK測試盒說明進行樣品處理，用BeckmanDU640型紫外可見分光光度計，分別在440歷、565nm和660ntn下測定光密度，計算心肌細胞損傷后釋放至培養基中的LDH、AST和CK含量。并用T檢驗比較組間差異，結果見表21。表21本發明對缺氧缺糖條件下心肌細胞LDH、AST和CK的影響(n=:10，X士SD)<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>注①模型組與對照組比較AAAP〈0.001②各給藥組與模型組比較承P<0.05，**P<0.01，***P〈0.001③與原發明組比較，ttP<0.05。表21結果顯示，缺氧缺糖模型組LDH、AST和CK較正常對照組均極顯著升高(P<0.001)，說明缺氧缺糖模型組心肌細胞己經受到損傷。與模型組比較，20.80.208mg/ml本發明的LDH和CK均有不同程度的顯著性降低，其中與原發明組比較本發明的大、中劑量組具有顯著性差異(P<0.05)，具有更好的療效；本發明的大、中劑量組對AST分別亦有顯著降低(P<0.05)，與原發明組比較，也有顯著性差異，具有更好的效果。20.80.208mg/ml本發明有明顯量效關系(P<0.05)，20.8mg/ml本發明的AST和CK已恢復至正常。表明本發明20.80.208mg/ml劑量對體外培養心肌細胞缺氧缺糖性損傷有直接的保護作用。藥理對比實驗總結通過上述的治療腦中風后遺癥和抗冠心病兩大藥效學試驗的結果可以看出，本發明和原發明在相同劑量給藥的情況，在多項實驗指標上均具有明顯的優越性，達到了顯著性差異，還有小部分的實驗指標療效相當，甚至本發明的劑量比原發明小一個等級的情況，也存在多項實驗指標具有明顯療效的情況，由此可以看出，本發明的藥效綜合起來比較，比原發明具有突出的優越性，比原發明有著意想不到的效果。權利要求1、一種用于治療心腦血管疾病的中藥注射劑，其特征在于它是由以下方法制備而成取1000g紅景天最粗粉，加適量65％乙醇浸潤后，置滲漉器中，再加65％乙醇適量浸泡過夜，用65％乙醇以每公斤藥材每分鐘15ml流速滲漉，收集藥材12倍量的漉液，回收乙醇，濃縮至60℃相對密度約1.2左右，加6倍量水攪勻，煮沸溶解，冷藏過夜，濾過，濾液濃縮至60℃相對密度1.1，冷至室溫，用水飽和的等體積仲丁醇萃取3次，合并仲丁醇，減壓回收仲丁醇，濃縮至60℃相對密度1.2，加200g聚酰胺拌勻，干燥，裝于柱徑與柱高比為1∶6～8的層析柱，用65％乙醇以每公斤藥材每分鐘15ml的流速洗脫，收集藥材3倍量的洗脫液，回收乙醇，濃縮至60℃相對密度1.1，加5倍量水攪勻，煮沸，冷藏過夜，濾過，濾液濃縮至每1ml相當于藥材10g的濃清膏，得紅景天提取物，冷藏備用；取紅景天提取物，加1000ml的注射用水煮沸溶解，冷藏過夜，取上清液，用0.85μm微膜過濾澄明。調節pH至6.5左右，得紅景天提取物溶液，備用；按燈盞花乙素計，取40g燈盞花素，加1000ml的注射用水攪勻，用10％氫氧化鈉溶液調節pH至約7.0，冷藏過夜，用0.85μm微膜過濾，與上述含紅景天提取物溶液混合，加熱至80℃左右，加W/V為0.1％的活性炭攪勻，吸附約15min，期間攪拌2～3次，用0.85μm微膜過濾，加水至5000ml，調節pH至6.5左右，濾過，灌封1000支，滅菌，即得。2、如權利要求1所述的治療心腦血管疾病的中藥注射劑的制法，其特征在于取1000g紅景天最粗粉，加適量65%乙醇浸潤后，置滲漉器中，再加65%乙醇適量浸泡過夜，用65%乙醇以每公斤藥材每分鐘15ml流速滲漉，收集藥材12倍量的漉液，回收乙醇，濃縮至60"C相對密度約1.2左右，加6倍量水攪勻，煮沸溶解，冷藏過夜,濾過，濾液濃縮至6(TC相對密度l.l，冷至室溫，用水飽和的等體積仲丁醇萃取3次，合并仲丁醇，減壓回收仲丁醇，濃縮至60'C相對密度1.2，加200g聚酰胺拌勻，干燥，裝于柱徑與柱高比為1:68的層析柱，用65%乙醇以每公斤藥材每分鐘15ml的流速洗脫，收集藥材3倍量的洗脫液，回收乙醇，濃縮至60。C相對密度1.1，加5倍量水攪勻，煮沸，冷藏過夜，濾過，濾液濃縮至每lml相當于藥材10g的濃清膏，得紅景天提取物，冷藏備用；取紅景天提取物，加1000ml的注射用水煮沸溶解，冷藏過夜，取上清液，用0.85um微膜過濾澄明。調節pH至6.5左右，得紅景天提取物溶液，備用；按燈盞花乙素計，取40g燈盞花素，加1000ml的注射用水攪勻，用10%氫氧化鈉溶液調節pH至約7.0，冷藏過夜,用0.85um微膜過濾，與上述含紅景天提取物溶液混合，加熱至80'C左右，加W/V為0.1%的活性炭攪勻，吸附約15min，期間攪拌23次，用0.85ixm微膜過濾，加水至5000ml，調節pH至6.5左右，濾過，灌封1000支，滅菌，即得。3、如權利要求1所述的治療心腦血管疾病的中藥注射劑的檢査方法，其特征在于該方法中包括如下方法中的一種或幾種的組合(1)pH值按中國藥典2000年版一部附錄V1IG方法，應為5.57.5;(2)溶液顏色取本發明lml，置于25ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，取10ml置于納氏比色管中，依中國藥典2000年版一部附錄XI第一法檢査，與黃色8號標準比色液比較，不得更深。(3)蛋白質取本發明5ml，加水稀釋至100ml，取lml加鞣酸試液3滴，不得出現渾濁；(4)鞣質取本發明5ml，加水至100ml，取lml加入稀醋酸1滴，再加明膠氯化鈉溶液5滴，不得出現渾濁或沉淀。(5)樹脂取本發明5ml，加水至100ml，取5ml于分液漏斗中，加稀鹽酸3滴，放置10min，用10ml乙醚萃取，乙醚層用pH7的水洗滌3次，每次10ml，乙醚層于水浴上蒸干，殘渣加無水乙醇5ml溶解，過濾，濾液水浴蒸干，殘渣加冰醋酸2ml使溶解，置具塞試管中，加水3ml，混勻，放置30分鐘，應無絮狀物析出；(6)草酸鹽取本發明5ml，加水至100ml，取5ml，用稀鹽酸調節pH值至12,放置30min濾過，濾液調節pH值為56，放置10min過濾，濾液加3%氯化鈣溶液3滴，放置10分鐘，不得出現渾濁或沉淀；(7)鉀離子取本發明5ml，加水至100ml，取2ml，依中國藥典2000年版一部附錄IXS法測定，應符合規定；(8)熱原取本發明5ml加5%葡萄糖注射液稀釋至50ml，照中國藥典2000年版一部附錄XIIIA熱原檢驗法，劑量按家兔體重每lkg注射6ml，應符合規定；(9)熾灼殘渣精密吸取本發明2ml，依中國藥典2000年版一部附錄IXJ法檢査，熾灼殘渣g/ml不得過1.0%;(10)重金屬取熾灼殘渣項下遺留的殘渣，依中國藥典2000年版一部附錄KE第二法檢査，含重金屬不得過百萬分之十；(11)總固體精密量取注射液10ml,置于恒重的蒸發皿中，于水浴上蒸干后，在105'C干燥3小時，移置干燥器中冷卻30分鐘，迅速稱定重量，計算出注射劑中含總固體的量，應不得過30.00mg/ml;指標成分總含量為總固體量的百分率，應不得少于25%。(12)其他應符合中國藥典2000年版一部附錄IU注射劑項下有關的各項規定。4、如權利要求1所述的治療心腦血管疾病的中藥注射劑的含量測定方法，其特征在于該方法中包括如下方法中的一種或幾種的組合(1)紅景天苷的含量測定用十八垸基硅烷鍵合硅膠為填充劑，20:80:0.2的甲醇-水-磷酸為流動相，檢測波長為223nm，理論板數按紅景天苷峰計算應不低于1500;取紅景天苷對照品適量，精密稱定，加流動相制成每lml約含0.15mg的溶液，即得對照品溶液；精密量取本發明2ml，加流動相稀釋至10ml，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各20ul，注入液相色譜儀，照中國藥典2000年版一部附錄VID高效液相色譜法測定，本發明每5ml含分子式為CMH2,A的紅景天苷應不少于2.5mg;(2)燈盞花素的含量測定用十八烷基硅垸鍵合硅膠為填充劑，30:70的乙腈-0.5%冰醋酸溶液為流動相，檢測波長為335nm，理論板數按野黃芩苷峰計算應不低于1000;取野黃芩苷，即燈盞花乙素對照品，用甲醇配制成約O.15mg/ml的溶液作為對照品溶液；精密量取本發明lml，加甲醇稀釋至50ml，濾過，溶液作為供試品溶液；分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各20y1，注入液相色譜儀，照中國藥典2000年版一部附錄VID高效液相色譜法測定，本發明含燈盞花素按分子式為C2,H,sO,2的燈盞花乙素計，應為標示量的95.0105.00/0。5、如權利要求1所述的治療心腦血管疾病的中藥注射劑的鑒別方法，其特征在于該方法中包括如下方法中的一種或幾種的組合(1)紅景天苷的薄層鑒別取本發明5ml加水稀釋至10ml，用水飽和的仲丁醇提取3次，每次20ml，合并仲丁醇液，于水浴蒸干，殘渣加5ml水溶解，上D皿大孔吸附樹脂柱，以70ml水洗脫，棄去洗脫液，再用70%乙醇50ml洗脫，收集洗脫液,于水浴蒸干，殘渣加甲醇4ml溶解，即得供試品溶液；另取紅景天苷對照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典2000年版一部附錄VIB薄層色譜法試驗,吸取上述兩種溶液各10iU,分別點于同一硅膠G薄層板上，以13:7:1.5的氯仿-甲醇-水為展開劑，展開，取出，晾干，噴以h1的1%三氯化鐵_1%鐵氰化鉀溶液至顯色，置日光下觀察，在與對照品色譜相應的位置上，應顯相同顏色的斑點；(2)紅景天苷的HPLC鑒別在紅景天苷含量測定的色譜圖中，供試品峰的保留時間應與對照品峰的保留時間一致；(3)燈盞花素的薄層鑒別取本發明2ml，拌入適量硅藻土，置水浴上蒸干，加甲醇20ml，超聲處理10分鐘，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇lml使溶解，作為供試品溶液；另取燈盞花乙素對照品，加甲醇制成每lml含2mg的溶液，作為對照品溶液；照中國藥典2000年版一部附錄VIB薄層色譜法試驗，吸取供試品溶液5ul、對照品溶液3ul，分別點于同一硅膠G薄層板上，以16:1:2醋酸乙酯-甲酸-水的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，在105'C加熱數分鐘，置365nm紫外光燈下檢視；供試品色譜中，在與對照品色譜相應的位置上，顯相同顏色的熒光斑點；(4)燈盞花素的HPLC鑒別在燈盞花素含量測定項下的色譜圖中，供試品峰的保留時間應與對照品峰的保留時間一致。全文摘要本發明涉及一種用于治療心腦血管疾病的中藥注射劑及其制法和質量控制方法；該中藥注射劑由紅景天和燈盞花素制成；該中藥注射劑的質量控制方法包括紅景天苷和燈盞花素的鑒別，pH值、溶液顏色、蛋白質、鞣質、樹脂、草酸鹽、鉀離子、熱原、熾灼殘渣、重金、總固體、指標成分總含量為總固體量的百分率等檢查，紅景天苷和燈盞花素的含量測定。文檔編號A61K36/41GK101181333SQ20071001916公開日2008年5月21日申請日期2007年11月22日優先權日2007年11月22日發明者濤趙申請人:咸陽步長醫藥科技發展有限公司