丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途的制作方法

專利名稱：：丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發明涉及一種丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途。技術背景肺纖維化(pulmonaryfibrosis,PF)是一種原因不明，以彌漫性肺泡炎和肺泡結構紊亂，導致肺泡、肺間質纖維化，最終可引起呼吸衰竭的疾病。發病率約為5/10萬，近年來有增高趨勢。PF確診后平均存活期為2-4年，5年生存率為50-70%，現有的治療手段并沒有使患者的生存率有所改善。致肺纖維化的始動因素目前還不清楚，有人認為可能與遺傳易感性、病毒感染、免疫功能有關。目前比較公認的理論涉及細胞、細胞因子和信號轉導機制以及脂質過氧化作用等方面。根據肺纖維化的病理特點，其病理過程大致分為三個階段，第一階段是致病因子對肺泡上皮細胞和血管內皮細胞的彌漫性損害，啟動炎癥免疫反應；第二階段是多種炎性細胞參與，釋放各種細胞因子和炎性介質擴大組織損傷并引起間質增生；第三階段是成纖維細胞、內皮細胞遷移、增殖以及膠原和其它細胞外基質(Extracellularmatrix,ECM)的代謝紊亂以反饋方式使炎性損傷和增生反應加重，最終導致正常功能組織被取代和改建。在此過程中，肺炎癥細胞(主要為單核巨噬細胞)、肺上皮細胞、肥大細胞、內皮細胞和肺間質細胞(如成纖維細胞、肌成纖維細胞)通過分泌細胞因子、炎性介質等生物活性物質，發揮直接或間接作用。實際上這三個過程同時存在、互相促進，不代表時間上的分隔和疾病本身的發展順序。在參與肺纖維化的細胞因子網絡中，轉化生長因子e(TransforminggrowthfactorP，TGFe)是研究最深入、最重要的細胞因子。肺纖維化動物模型以及人類特發性肺纖維化(Idiopathicpulmonaryfibrosis,IPF)中，TGFP水平都是升高的，TGFe抗體及TGFP受體拮抗劑都能減弱博萊霉素所致的肺內膠原沉積。在肺纖維化發展中，肺巨噬細胞和上皮細胞可能是TGFe的主要來源。轉化生長因子e1(Transforminggrowthfactore1，TGF01)在肺纖維化發生發展過程中起著重要作用，其具有多種生物學效應，對成纖維細胞具有趨化作用，并能刺激未成熟成纖維細胞的生長，損傷部位出現的TGFel能夠從周圍組織中募集成纖維細胞并能刺激未成熟成纖維細胞增生和分化，促進膠原蛋白、纖維連接蛋白、透明質酸、蛋白聚糖等在ECM中沉積，減少細胞外基質的降解。膠原纖維(collagenousfiber)是細胞外基質的重要組成部分，其生化成分是膠原蛋白(collagen,簡稱膠原)，目前已發現至少有ll種不同的膠原蛋白。I型和III型膠原稱為間質膠原，分布廣泛，也是肺內主要的間質型膠原。羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)是機體膠原蛋白的主要成分之一，約占其氨基酸總量的13.4%，其他除彈性蛋白含有少量HYP(約1%)夕卜，均不含HYP。因此組織中HYP含量可作為膠原組織代謝的重要指標。近年來脂質過氧化成為肺纖維化的研究熱點之一。研究發現，接觸二氧化硅和石棉的工人，其巨噬細胞有脂質過氧化損傷，從而被激活釋放致纖維化因子，導致肺纖維化。超氧化物歧化酶(superoxidedismutase，SOD)對機體的氧化與抗氧化平衡起著至關重要的作用，此酶能清除超氧陰離子自由基保護細胞免受損傷。機體通過酶系統與非酶系統產生氧自由基，后者能攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacid，PUFA)，引發脂質過氧化作用，并形成脂質過氧化物。如醛基(丙二醛，malondialdehyde,MDA)、酮基、羥基、羰基以及新的自由基等。因此MDA的量可反映機體內脂質過氧化的程度，間接反映出細胞損傷的程度。MDA的測定常常與SOD的測定相互配合，SOD活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，而MDA的高低又間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。在肺纖維化的治療上，目前公認療效確切的糖皮質激素，早期應用效果好，能夠抑制炎癥及免疫過程。中晚期則療效不佳，且長期應用副作用大，嚴重影響機體免疫功能，增加繼發感染和呼吸衰竭的可能性。臨床資料顯示僅有30%以下的患者激素治療有效。因此國內學者多用中醫中藥來治療肺纖維化，而且已經取得一定的進展，但實驗研究中，復方多限于幾味活血化瘀藥，且藥味過多也不利于藥理機制的研究，目前發現對肺纖維化有一定治療效果的中藥研究主要集中于(l)抗自由基損傷；(2)抑制炎性因子的釋放，發揮抗炎性損傷作用；(3)影響膠原代謝過程，從而減少纖維蛋白的形成；(4)影響機體免疫系統功能，降低應激反應的強度。隨著中藥單體活性成分的提取分離技術研究的進一步深入，從天然產物中尋找藥理作用明確的活性單體，進一步闡明不同單體或有效部位的作用機理，針對肺纖維化發病的多層面特點進行治療，發揮中藥的多靶位治療優勢，已成為目前治療肺纖維化的一個發展方向。丹參總酚酸(salvianolicacids，Sals)是從唇形科植物丹參(SalviamiltiorrhizaBuiige)中分離得到的水溶性部位，是一類多酚羥基化合物，含有丹參酚酸A，丹參酚酸B和迷迭香酸等成分。現代實驗研究及臨床應用均表明，丹參在抗肺纖維化中作用確切、效果顯著，其防治肺纖維化的作用機制與氧自由基清除有關。研究發現治療組動物肺系數，羥脯氨酸(HYP)、表面活性物質含量，成纖維細胞生長因子(fibroblastgrowthfactor,FGF)活性均明顯低于模型組，認為其作用機制與抗氧化性損傷、維持細胞內鈣穩定及抑制成纖維細胞向膠原纖維的轉化有關。文獻中，關于丹參對肺纖維化影響的研究，采用的是丹參水煎液、丹參注射液(丹參酮)及丹參脂質體。丹參總酚酸具有活血化瘀、抗氧化、降血脂及抗肝纖維化形成等多種作用。但是，丹參總酚酸作為丹參的有效部位，是否具有抗肺纖維化的作用，至今未見報導。博萊霉素(bleomycin,BLM)是臨床上一種常用的腫瘤化療藥物，對多種類型的腫瘤均具有較好的治療效果，但是絕大多數病人會在使用過程中產生劑量依賴性的肺纖維化，因為在科研中BLM廣泛用于肺纖維化動物模型的制備。向嚙齒類動物氣管內注入BLM，可導致肺泡上皮受損，炎性細胞滲出、成纖維細胞增生及膠原沉積，BLM所致早期肺損傷無論是在病理組織學上還是生理學上均與人類纖維化肺部疾病相似。
發明內容本發明目的是提供一種丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途。本發明的技術方案是本發明通過博萊霉素復制小鼠、大鼠肺纖維化動物模型，首次選用丹參總酚酸作為治療藥物，研究肺纖維化動物肺組織的病理學改變，觀察丹參總酚酸對肺纖維化動物模型的治療作用，從而為丹參總酚酸治療肺纖維化提供實驗依據。圖1丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠肺系數的影響(X土S，n=10);圖2丹參總酚酸對小鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(；±s，n=10);圖3丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠TGFP1陽性細胞數的影響(x±s，n=10);圖4丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠TGFe1IOD的影響(；土s,n=10);圖5丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIIOD的影響(；±s,n=10);圖6丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIIIIOD的影響(；±s,n=10);圖7丹參總酚酸對肺纖維化小鼠肺組織HYP含量的影響(；±s，n=10);圖8丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺系數的影響(S±s，n=6);圖9丹參總酚酸對大鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(；土s，n=6);圖10丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFe1陽性細胞數的影響(x±s，n=6);圖11丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFe1IOD的影響(；土S,11=6);圖12丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenIIOD的影響(x±s，n=6);圖13丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenIIIIOD的影響(x±s，n=6);圖14丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清SOD的影響(^士s，11=6);圖15丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清MDA的影響(；±s,n=6);圖16s，n=6);丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織MDA的影響(；士丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織SOD的影響(.圖17s，n=6);圖18n=6);丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織HYP的影響P土s，圖19第圖20第圖21第圖22第100;圖23X100;圖24構X8000;圖25第28天大鼠肺組織病理改變—丹參總酚酸小劑量組28天HE第28天大鼠肺組織超微結構改變一正常對照組28天超微結第28天大鼠肺組織超微結構改變一模型組28天超微結構X5000;圖26第28天大鼠肺組織超微結構改變一醋酸潑尼松組28天超微結構X10000;圖27第28天大鼠肺組織超微結構改變一丹參總酚酸大劑量組28天超微結構X8000;圖28第7天大鼠肺組織TGFP1的表達一模型組7天TGFP1的表達SABCX200;圖29第7天大鼠肺組織TGF01的表達一丹參總酚酸小劑量組7天TGFP1的表達SABCX200;圖30第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達一模型組28天CollagenI的表達SABCX200;圖31第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達一丹參總酚酸大劑量組28天CollagenI的表達SABCX200;圖32第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達一模型組28天CollagenIII的表達SABCX200;圖33第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達一丹參總酚酸大劑量組28天CollagenIII的表達SABCX200。實施例第一部分博萊霉素致肺纖維化小鼠病理觀察及丹參總酚酸干預作用研究材料與方法材料1、實驗動物昆明種小鼠，180只，雌雄各半，體重18-22g，清潔級，由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號XCYK(蘇)2002-0008,實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2002-0037.2、藥物與試劑2.1藥物博萊霉素A5(BLM),日本化藥株式會社，產品批號640110,藥品進口注冊證號H20040205;4%水合氯醛；丹參總酚酸，蘇州中藥研究所植化室提供；醋酸潑尼松片，江蘇徐州平光制藥有限責任公司，產品批號32022681;注射用青霉素鈉，華北制藥股份有限公司，國藥準字H13020657.2.2試劑羥脯氨酸含量測定試劑，南京建成生物制劑公司購買。兔多克隆抗體TGF01、CollagenI、CollagenIII，即用型SABC試劑盒，DAB顯色劑，均由武漢博士德生物工程有限公司生產。3、儀器光學顯微鏡，OLYMPUSCX31;分光光度計722型，上海精密科學儀器有限公司生產，出廠編號7070309047;離心機，80-2型，上海手術器械廠。一、方法1、分組及造模昆明種小鼠，180只，稱重，編號，隨機分為正常對照組，模型組，醋酸潑尼松組(6.67mg.kg-l.d-l)，丹參總酚酸(160mg'kg-l'd-l)大劑量組，丹參總酚酸(80mg*kg-l'd-l)中劑量組，丹參總酚酸(40mg'kg-l'd-l)小劑量組，每組30只。實驗小鼠用4%水合氯醛(0.01ml/g)腹腔注射麻醉后，取仰臥固定位，常規消毒，行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，模型組、醋酸潑尼松組、丹參總酚酸大劑量組、丹參總酚酸中劑量組和丹參總酚酸小劑量組于氣管軟骨環間隙穿刺緩緩注入BLM(5mg/kg)，正常對照組注入等體積生理鹽水。注藥后縫合皮膚，立即將小鼠直立旋轉3-5min,使藥液均勻分布于兩側肺內，手術前一日及術后三天連續肌肉注射青霉素(0.8萬U-只-1-天-1)4天。各治療組造模后次日開始灌服給藥，正常對照組與模型組灌服蒸餾水。2、肺系數(pulmonaryindex)各組動物分別于實驗第7、14、28天經頸椎"脫舊"法處死10只，分離出雙肺，稱重，根據公式肺重(mg)/體重(g)[18，計算肺系數。3、組織病理學觀察取右肺，4%中性福爾馬林固定，按常規病理學方法包埋、切片。將病理切片進行HE染色，然后根據Szaopiel等19方法將肺泡炎和肺纖維化的程度分為四級0級，無明顯改變；1級，輕度改變，病變范圍小于全肺的20%;2級，中度改變，病變范圍占全肺的20%-50%;3級，重度改變，病變范圍占全肺的50%以上。4、免疫組織化學技術免疫組織化學染色步驟主要參照試劑公司試劑盒說明書進行，對切片行高溫高壓處理代替胰酶消化，促進抗原暴露。4.1抗體工作濃度TGFP1為1:100,CollagenI為1:200，CollagenIII為1:100。4.2工作流程①3jim厚石蠟切片，貼附于涂有多聚賴氨酸的載玻片上，60'C烤片2hr;②切片常規脫蠟至水；③0.05M(PH7.2)PBS洗3次，每次2min;④抗原修復于高壓鍋內加入PH6.0檸檬酸鹽緩沖液1500ml并加熱至沸騰，將置于不銹鋼架上的切片放入緩沖液內，繼續加熱至噴氣后2min,冷卻至室溫，取出玻片，蒸餾水沖洗2次，PBS(PH7.2)沖洗3次，每次2min;⑤滴加5XBSA封閉液，室溫20min。甩去多余液體，不洗；⑥滴加適當稀釋的一抗，37'C1hr左右。PBS(PH7.2)洗3次，每次2min;⑦滴加生物素化二抗，37°C20min。PBS(PH7.2)洗3次，每次2min;⑧滴加SABC試劑(鏈酶親和素一生物素一過氧化物酶復合物)；37'C孵育20min，PBS(PH7.2)洗3次，每次2min;⑨滴加新鮮配置DAB顯色劑(取3ml蒸餾水，加A、B、C試劑各3滴，混勻)，室溫顯色，鏡下控制反應時間，充分水洗；0⑩蘇木素輕度復染。脫水，透明，封片。顯微鏡觀察。4.3圖像分析及處理采用PAS9000病理圖像分析系統(Ver9.2.1)，用積分光密度(Integralopticaldensity,IOD)來衡量肺組織中TGF-P1、CollagenI、III的含量。細胞的密度參數是利用攝像機輸入細胞圖像信息的光電轉換原理，將細胞在同一光源下吸收或透過光的數值作為光密度(也稱吸光度)。測量目標顏色越深，透過的光線越少，光密度越大。因此，光密度值可用于衡量組織或細胞中某種成分的含量。積分光密度是整個視野內每一點光密度的疊加。是對免疫組化染色結果分析的一個較為準確的方法。每次取圖前均預熱20分鐘以上，并保持光源、電壓、對比度、敏感度等穩定。①TGFei:每張切片選取5個高倍視野(X400)，以巨噬細胞胞漿染為棕色、棕黃色、褐色為陽性，計數陽性細胞數/高倍視野[23]。同時采用PAS9000病理圖像分析系統(Ver9.2.1),進行定量分析，根據免疫組化陽性著色的深淺計算每個視野的IOD[241，求平均值。②CollagenI、CollagenIII:采用PAS9000病理圖像分析系統(Ver9.2.1)，進行定量分析，每張切片選取5個僅含肺間質的高倍視野(X400)，根據免疫組化陽性著色的深淺計算每個視野的IOD24，求平均值。5、肺組織羥脯氨酸(hydroxyproline，HYP)含量測定按羥脯氨酸含量測定試劑盒說明書采用樣本堿水解法進行HYP含量測定稱取小塊肺組織(約30mg)放入試管內，準確加水解液0.1ml，混勻，加蓋后沸水浴水解20min，之后將各試管液體PH值調至6.0-6.8,加適量活性炭，混勻，3500r/min離心10min，取上清0.6ml,依次加入三種試劑后，混勻，60°C7jC浴15min,3500r/min離心10min,取上清在550腿，0.5cm光徑下測定各管的吸光度，之后按照說明書公式計算肺組織中HYP含量。6、統計方法將等級資料轉化為計量資料，采用SPSS11.0軟件進行分析，實驗數據以^士s表示，比較組間差異性，進行t檢驗。結果1、丹參總酚酸對小鼠肺系數的影響造模后各時間點模型組小鼠肺系數均高于正常對照組(p<0.01)，28天實測數值增高最顯著；丹參總酚酸及醋酸潑尼松組小鼠肺系數均比同期模型組顯著降低(P<0.01,P<0.05)。(見表l-l，圖1)。表1-1丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠肺系數的影響(x土s，n=io)組別齊慢(mg/kg)7天14天28天正常對照組7.318±0.4126.481±0.5625.775±0.473模型組10.266±1.552##10.030土1.751湘10.655±5.213##醋酸潑尼松組6.677.705±1.278**8.109±1.279*6.391±0.926*大劑量組跳07.635±1.157**7.187±1.434**6.351±1.037*丹參總酚酸中劑量組80.07.328±1.288**7.630±1細**6.661±1.412*小劑量組40.08扁±1.165**8.464±1.425*6.343±1.148*注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比。圖1丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠肺系數的影響(；±s,11=10)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，"p<0.01，與模型組相比。)2、丹參總酚酸對小鼠肺病理形態的影響組小鼠第7天雙肺呈暗紅色，體積較大，彈性差；第14、28天時雙肺蒼白，體積縮小，硬度增加。其余各治療組均輕于模型組。2.2光鏡觀察正常對照組肺組織結構清晰，肺泡壁未見增厚，肺泡上皮細胞結構完整。模型組7天時肺泡炎明顯，肺泡腔見大量巨噬細胞、中性粒細胞、漿細胞滲出，肺泡間隔增寬，可見少量成纖維細胞及其基質增生；14天時肺泡炎減輕，肺泡間隔見成纖維細胞及基質大量增多；28天時肺泡炎輕微，肺泡間隔顯著增寬，可見大量成纖維細胞及膠原纖維增生，少量巨噬細胞、淋巴細胞和漿細胞浸潤。丹參總酚酸及醋酸潑尼松治療組小鼠肺泡間隔增寬較各時間點模型組明顯減輕，巨噬細胞、淋巴細胞和槳細胞浸潤較輕，肺泡結構基本正常，與模型組相比纖維化程度均有不同程度減輕(見表1-2，圖2)。表l-2丹參總酚酸對小鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(x±s，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>。圖2丹參總酚酸對小鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(x士s,n=10)(#P<0.05,##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，"p<0.01，與模型組相比)3、丹參總酚酸對小鼠肺組織TGF01蛋白表達的影響TGF61表達在胞漿，表達的細胞有支氣管粘膜上皮細胞、肺泡巨噬細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞。正常對照組小鼠的少數細支氣管粘膜上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞的胞漿有少量陽性表達；模型組小鼠細支氣管粘膜上皮細胞肺泡上皮細胞、血管內皮細胞TGFP1表達更明顯和范圍更廣；其余各治療組小鼠細支氣管粘膜上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞TGF01表達減少。與正常對照組相比模型組小鼠在7天肺泡腔和間質中出現大量的TGFPI陽性的肺泡巨噬細胞(P<0.01),以單個或成群肺泡巨噬細胞出現，14天和28天時在肺泡腔和間質中TGFe1陽性的肺泡巨噬細胞數目減少，與正常對照組相比仍有顯著性差異(P^.01):醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組7天、"天、28天陽性細胞數比模型組相應時間點陽性細胞數減少，7天和14天有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)，28天無顯著性差異。(見表1-3，圖3)模型組各時間點IOD均明顯高于正常對照組(P<0.01)，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組7天、14天IOD比模型組明顯降低(P<0.01，P<0.05)，28天與正常對照組相比無顯著性差異。(見表1-4，圖4)表1-3丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠TGFP1陽性細胞數的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>組別劑量(mg/kg)7天14大28天正常對照組277.23±22.87260.97±10.52268.09±23.48模型組416.94土81.87賴391.34±85.65##316.18士50.69糾醋酸潑尼松組6.67338.34±48.35*310.34±44.14*293.99±53.20人劑量組跳0323.85±42.18**298.51土47.94林304.40±42.49丹參總酚酸中劑量組80.0313.94±39.50**310.24±36.73*307.68±21.95小劑量組40.0313.80±40.70**305.79±40.21*305.17±36.50注#P<0.05，##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.0]，與模型組相比。(x±s,n,圖4丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠TGFe1IOD的影響(x士s，n=10)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，"p<0.01，與模型組相比)4、丹參總酚酸對小鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達的影響CollagenI、CollagenIII經免疫組化染色后呈現棕色、棕黃色或棕褐色。正常對照組小鼠肺組織中血管壁、支氣管、細支氣管壁有Collagenl、CollagenIII的表達，肺間質內有散在性的表達；模型組小鼠肺間質內可見CollagenI、CollagenIII呈局灶性、斑片狀、條索狀分布。兩者IOD皆于第7天開始增多，并逐步增加。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組各時間點IOD與模型組相比，都有顯著性降低(P<0.01，P<0.05)。(見表1-5，圖5,表1-6,圖6)表l-S丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenI積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組189.03±8.01190.13±16.84181.47±17.95模型組302.71土21.90絲326.30±31.06##361.42士47.99糊醋酸潑尼松組6.67280.43±23.13*287.88±28.56*311.65±28.32*大劑量組跳O274.92±24.32*294.05±20.23*314.27±35.38*丹參總酚酸中劑量組80.0281.37±22.40*287.47±19.98**302.44±24.59"小劑量組40.0272.88±34.16*2%.18±14.8*312.47±32.9*注#P<0.05,##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01,與模型組相比。Cx±S,"=/0」圖5丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIIOD的影響("±s,n=10)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01,與模型組相比)表1-6丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIII積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組288.75±22.78278.28±2U2290.43±6.65模型組388.89±23.11##409.32±31.71##457.42±40.11##醋酸潑尼松組6.67355.79±36.61*379.17±20.39*416.89±44.62*大劑量組160.0365.30±15.57*378.14±19.06*406.25±24.49**丹參總酚酸中劑量組80.0359.02±12.73**370.10±11.23**401.18±24.22**小劑量組40.0359.87±26.67*373.07±15.38**417.37土25.83*注#P<0.05,##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。Cx±S,"=/C()圖6丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化小鼠CollagenIIIIOD的影響(x±s，n=10)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比)5、丹參總酚酸對小鼠肺組織HYP含量的影響模型組小鼠肺HYP含量和正常對照組相比于14天開始升高，28天最顯著；丹參總酚酸大劑量治療后各時間點HYP含量均比模型組明顯降低(P<0.05,P<0.01);中、小劑量小鼠治療后7天、28天肺HYP含量顯著降低(P4.01)。給藥14天時小鼠肺HYP含量有下降趨勢；醋酸潑尼松治療后雖可見HYP含量比模型組降低，但無顯著差異。(見表1-7，圖7)表1-7丹參總酚酸對肺纖維化小鼠肺組織HYP含量(Wg/mg)的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>注#P<0.05,##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。d±s,=7W圖7丹參總酚酸對肺纖維化小鼠肺組織HYP含量的影響(x±s，n=10)(#P<0.05，p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)小結1、丹參總酚酸給藥7、14、28天后均可明顯降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠的肺系數；2、丹參總酚酸早期可減輕博萊霉素致肺纖維化小鼠肺部的炎癥反應，晚期可抑制肺組織膠原沉積和纖維化形成；3、丹參總酚酸早期能降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠肺組織TGFPl的表達；4、丹參總酚酸能降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠肺間質中I型、III型膠原的沉積；5、丹參總酚酸可降低博萊霉素所致肺纖維化小鼠的肺羥脯氨酸的含量。第二部分博萊霉素致肺纖維化大鼠病理觀察及丹參總酚酸干預作用研究材料與方法一、材料1、實驗動物SD大鼠，108只，雌雄各半，體重180-220g，清潔級，由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供。實驗動物生產許可證號XCYK(蘇)2002-0008，實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2002-0037.2、藥物與試劑2.1藥物同第一部分。2.2試劑SOD活力測定試劑、MDA含量測定試劑，南京建成生物制劑公司購買。其它試劑同第一部分。3、儀器內切式組織勻漿機，ZS88-1型，浙西機械廠；臺式低溫離心機，5180R型，美國Effendorf公司；日立H-600透射電鏡；其它儀器同第一部分。二、方法1、分組及造模[16、17SD大鼠，108只，稱重，編號，隨機分為正常對照組，模型組，醋酸潑尼松組(3.33mg*kg-l*d-l)，丹參總酚酸(80mg'kg-l'd-l)大劑量組，丹參總酚酸(40mg'kg-l'd-l)中劑量組，丹參總酚酸(20mg'kg-l'd-l)小劑量組，每組18只。實驗大鼠用4%水合氯醛(lml/g)腹腔注射麻醉后，取仰臥固定位，常規消毒，行頸正中切口，鈍性分離暴露氣管，模型組、醋酸潑尼松組、丹參總酚酸大劑量組、丹參總酚酸中劑量組和丹參總酚酸小劑量組于氣管軟骨環間隙穿刺緩緩注入BLM(5mg/kg)，正常對照組注入等體積生理鹽水。注藥后縫合皮膚，立即將大鼠直立旋轉3-5min，使藥液均勻分布于兩側肺內，手術前一日及術后三天連續肌肉注射青霉素(8萬1>只-1-天-1)4天。各治療組造模后次日開始灌服給藥，正常對照組與模型組灌服蒸餾水。2、肺系數各組動物分別于實驗第7、14、28天經頸椎離斷法處死6只，分離出雙肺，稱重，根據公式肺重(mg)/體重(g)，計算肺系數。3、組織病理學觀察方法同第一部分。4、透射電鏡觀察取28天大鼠肺組織經4%戊二醛固定液固定后，再用鋨酸后固定，丙酮梯度脫水，618環氧樹脂包埋，LKB超薄切片機切片，日立H—600透射電鏡觀察。5、免疫組織化學技術5.1抗體工作濃度TGFP1為1:150，CollagenI為1:200,CollagenIII為1:100。5.2工作流程同第一部分。5.3圖像分析及處理同第一部分。6、血清SOD、MDA的測定取血清5jil按SOD測定試劑盒說明書采用黃嘌呤氧化酶法進行SOD活力測定；取血清0.1ml按MDA測定試劑盒說明書采用硫代巴比妥酸(TBA)法進行MDA含量測定。7、肺組織SOD、MDA指標測定7.1組織勻漿的制備稱取肺組織塊(約150mg)，除去血液，用濾紙拭干，加入冷生理鹽水，體積為肺組織塊重量的9倍，用內切式組織勻漿機制成10%肺組織勻漿。7.2SOD、MDA測定取10%肺組織勻漿用臺式低溫離心機10000r/min離心4min，留上清，取O.lml按MDA測定試劑盒說明書采用硫代巴比妥酸(TBA)法進行MDA含量測定；另取0.1ml加0.9ml生理鹽水制成1%肺組織勻漿，取30fU按SOD測定試劑盒說明書采用黃嘌呤氧化酶法進行SOD活力測定。8、肺組織HYP含量測定方法同第一部分。9、統計方法將等級資料轉化為計量資料，采用SPSS11.0軟件進行分析，實驗數據以；士s表示，比較組間差異性，進行t檢驗。結果1、丹參總酚酸對大鼠肺系數的影響造模后各時間點模型組大鼠肺系數均顯著高于正常對照組(p<0.01);丹參總酚酸及醋酸潑尼松組大鼠肺系數均比同期模型組顯著降低(P<0.01,P<0.05)。(見表2-1，圖8)。表2-l丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺系數的影響(；±s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>2、丹參總酚酸對大鼠肺組織病理形態的影響-2.1大體觀察正常對照組雙肺呈粉紅色，表面光滑，彈性較好。模型組大鼠第7天雙肺呈暗紅色，體積較大，彈性差；第14、28天時雙肺蒼白，體積縮小，硬度增加。其余各治療組均輕于模型組。2.2光鏡觀察正常對照組肺組織結構清晰，肺泡壁未見增厚，肺泡上皮細胞結構完整。模型組7天時肺泡炎明顯，肺泡腔見大量巨噬細胞、中性粒細胞、漿細胞滲出，肺泡間隔增寬，可見少量成纖維細胞及其基質增生；14天時肺泡炎減輕，肺泡間隔見成纖維細胞及基質大量增多；28天時肺泡炎輕微，肺泡間隔顯著增寬，可見大量成纖維細胞及膠原纖維增生，少量巨噬細胞、淋巴細胞和漿細胞浸潤。丹參總酚酸及醋酸潑尼松治療組小鼠肺泡間隔增寬較各時間點模型組明顯減輕，巨噬細胞、淋巴細胞和漿細胞浸潤較輕，肺泡結構基本正常，與模型組相比纖維化程度均有不同程度減輕(見表2-2，圖9)。(第28天大鼠肺組織病理改變見附圖19、20、21、22、23)表2-2丹參總酚酸對大鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(；土s，n=6)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>注#P<0.05,##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。圖9丹參總酚酸對大鼠肺組織肺泡炎/肺纖維化程度的影響(x土s,n=6)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比)2.3超微結構觀察28天時，正常對照組I、II型肺泡上皮細胞結構完整，細胞間連接正常，血管內皮細胞及基膜完好。模型組部分I、II型肺泡上皮細胞內質網及線粒體腫脹，其嵴稀疏，胞核固縮，胞質內可見壞死自溶改變；II型肺泡上皮細胞數量減少，胞質內板層小體增多，有排空現象；血管內皮細胞核變形，基膜增厚。肺泡腔萎縮，其中可見壞死游離的II型上皮細胞；肺泡間隔增寬尤為明顯，可見成纖維細胞增多，其間有大量不規則、排列紊亂的膠原纖維沉積，間質輕度水腫，并有單核細胞中性粒細胞浸潤。醋酸潑尼松組及丹參總酚酸組I、II型肺泡上皮細胞仍可見內質網、線粒體輕度腫脹偶見少量炎細胞浸潤；間質中膠原纖維的沉積較模型組有不同程度的減輕。(第28天大鼠肺組織超微結構改變見附圖24、25、26、27)3、丹參總酚酸對大鼠肺組織TGFP1蛋白表達的影響TGF01定位于胞漿，支氣管粘膜上皮細胞、肺泡巨噬細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞均可表達。正常對照組大鼠的少數細支氣管粘膜上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞的胞漿有少量陽性表達；模型組大鼠細支氣管粘膜上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞則TGFP1表達更明顯和范圍更廣；其余各治療組大鼠細支氣管粘膜上皮細胞、肺泡上皮細胞、血管內皮細胞TGFe1表達減少。與正常對照組相比模型組大鼠在7天肺泡腔和間質中出現大量的TGFPI陽性的肺泡巨噬細胞(P<0.01)，以單個或成群肺泡巨噬細胞出現，14天和28天時在肺泡腔和間質中TGFP1陽性的肺泡巨噬細胞數目減少，與正常對照組相比仍有顯著性差異(P^.01);醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組7天、14天、28天陽性細胞數比模型組相應時間點陽性細胞數減少，7天和14天有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)，28天無顯著性差異。(見表2-3，圖10)表2-3丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFel陽性細胞數的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比;*P<0.05,**pO.Ol，與模型組相比。"±s，《=》圖10丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFP1陽性細胞數的影響(x±s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01,與模型組相比)模型組各時間點IOD均明顯髙于正常對照組(P<0.01)，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組7天、14天IOD比模型組明顯降低(P<0.01,P<0.05),28天與正常對照組相比無顯著性差異。(見表2-4，圖11)，(第7天大鼠肺組織TGFP1的表達見附圖28、29)表2-4丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFel積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組211.90±20.3422U7±36.14226.82±27.29模型組312.81士21.79絲299.88±23.55##276.25±5.固醋酸潑尼松組3.33269.11±20.85**268.19±21.68*255.37±21.20大劑量組肌0276.50±35.22*263.95±12.16**260.12±13.47丹參總酚酸中劑量組40.0273.25±16.17**266.61±15.08*264,11±24.69小劑量組20.0275.48±19.15*268.85±14.95*263.53±12.37注#P<0.05，絲pO.Ol，與正常對照組相比;*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。(X±S,M=6)圖11丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠TGFP1IOD的影響(x±s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比)4、丹參總酚酸對大鼠肺組織CollagenI、Collagenin的表達的影響CollagenI、CoHagenIH經免疫組化染色后呈現棕色、棕黃色或褐色。正常對照組大鼠肺組織中血管壁、支氣管、細支氣管壁有CollagenI、CollagenIII的表達，肺間質內有散在性的表達；模型組大鼠肺間質內可見CollagenI、CollagenIII呈局灶性、斑片狀、條索狀分布。兩者IOD皆于第7天開始增多，并逐步增加。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組各時間點IOD與模型組相比，都有顯著性降低(P<0.01，P<0.05)。(見表2-5，圖12，表2-6，圖13)，(第28天大鼠肺組織CollagenI、CollagenIII的表達見附圖30、31、32、33)表2-5丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenI積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組238.13±31.73242.39±15.08248.53±23.17模型組329.30±17.93##352.82±9.51##394.27±17.05##醋酸潑尼松組3.33300.84±10.03**328.49±35.15**340.72士16.50**大劑量組80.0300.78±9.96**311.42±28.21**330.35±14.48**丹參總酚酸中劑量組御299.95±13.39*323.55±22.72*332.71±23.73**小劑量組20.0302.23±11.13*323.86±21.25*335.61±13.78**注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比。Cjc士s，"=<5,圖12丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenIIOD的影響(x±s，ii=6)(#P<0.05,##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)表2-6丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠Collagenin積分光密度(IOD)的影響組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組24U3±20.53251.65±12.71253.09±19.86模型組332.73±13.55##371.95±12.41##380.64±11.74##醋酸潑尼松組3.33290.77±6.56**348.65±15.37*347.80±9.73**大劑量組80.0305.81±9.71**349.30±5.73**354.34±5.65**丹參總酚酸中劑量組40.0308.30土8.薩350.13±16.11*363.52±9.65*小劑量組20.0312.51±8.37*348.54±21.93*358.07±9.49**注#P<0.05，胖pO.Ol，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。(JC±S,圖13丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠CollagenfflIOD的影響(x±s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05,"p<0.01,與模型組相比)5、丹參總酚酸對大鼠血清SOD、MDA的影響5.1SOD的變化模型組SOD數值逐漸增高，與正常對照組相比，第7、14天SOD活力有顯著性降低(P<0.01,P<0.05),第28天與正常對照組接近，無顯著差異。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組在第7、14天SOD活力均高于模型組，低于正常對照組，第28天逐漸恢復正常。與模型組相比，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸大、小劑量組在第7天有顯著性差異(P<0.05);丹參總酚酸中劑量組第7、14天均有顯著性差異(P<0.01,P<0.05)。(見表2-7,圖14)表2-7丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清SOD的影響(U/mgprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。「S±S,"=6」圖14丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清SOD的影響(S±s,n=6)(#P<0.05，p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)5.2MDA的變化模型組MDA數值逐漸降低，與正常對照組相比，第7、14天MDA含量均有顯著性升高(P<0.01)，第28天無顯著性差異。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組在第7、14天MDA含量低于模型組，高于正常對照組，第28天逐漸恢復正常。與模型組相比，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸大、小劑量組第7、14天有顯著性降低(P<0.01,P<0.05),丹參總酚酸中劑量組第7天有顯著性降低(P<0.01)。(見表2-8，圖15)表2-8丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清MDA的影響(nmol/mgprot)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>注#P<0.05，絲pO.Ol，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比。「JC土S,w=6J圖15丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠血清MDA的影響(；±s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)6、丹參總酚酸對大鼠肺組織SOD、MDA的影響6.1SOD的變化模型組SOD數值逐漸增高，與正常對照組相比，第7、14天SOD活力有顯著性降低(P<0.05)，第28天與正常對照組接近，無顯著差異。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組在第7、14天SOD活力均高于模型組，低于正常對照組，第28天逐漸恢復正常。與模型組相比，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸小劑量組在第7天有顯著性差異(P<0.05);丹參總酚酸大、中劑量組第7、14天均有顯著性差異(P<0.01，P<0.05)。(見表2-9，圖16)表2-9丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織SOD的影響(U/mgprot)組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組33.46±3.4234.60±5.7032.93±2.66模型組27.87±1.51#28.50±1.62#30.44±1.94醋酸潑尼松組33330.76±2.40*27.32±6.6927.08±4.10大劑量組訓31.06±2.49*34.01±2.05**33.77±6.32丹參總酚酸中劑量組40.029.56±0.88*32.91±2.58**33.51±4.06小劑量組20.030.27±1.29*32.22±3.7630.09±3.03注#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01,與模型組相比。"is,圖16丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織SOD的影響。土s，n=6)(#P<0.05,##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01，與模型組相比)6.2MDA的變化模型組MDA數值逐漸降低，與正常對照組相比，第7、14天MDA含量均有顯著性升高(P<0.01)，第28天無顯著性差異。醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組在第7、14天MDA含量低于模型組，高于正常對照組，第28天逐漸恢復正常。與模型組相比，醋酸潑尼松組和丹參總酚酸大、小劑量組第7、14天有顯著性降低(P<0.01,P<0.05)，丹參總酚酸中劑量組第7天有顯著性降低(P<0.01)。(見表2-10，圖17)表2-10丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織MDA的影響(nmol/mgprot)組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組3.556±.2153.528±1.043.447±0.925模型組6.094±2.126##6.268±0.880##5.026±1.041醋酸潑尼松組3.334.441±0.956*5.129±0.483*4.219±0.889大劑量組訓4.610±0.472*5.113±0.389*4.380±1.989丹參總酚酸中劑量組40.04.453±0.699*4.667±2.3234.677±0.551小劑量組20.04.374±0.392*3.732±0.753**4.866±1.956注#P<0.05,##p<0.01,與正常對照組相比；*P<0.05,**p<0.01,與模型組相比。f^f±S,"=0圖17丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織MDA的影響(x士s，n=6)(#P<0.05，##p<0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p<0.01，與模型組相比)7、丹參總酚酸對大鼠肺組織HYP含量的影響.-模型組大鼠肺HYP含量與正常對照組相比于14天開始升高，28天最顯著(P4.01);醋酸潑尼松組各時間點與模型組相比HYP雖有所下降，但都無顯著差異。丹參總酚酸治療后各時間點HYP含量均比模型組降低，第28天有顯著差異(P<0.05，P<0.01)。(見表2-11，圖18)表2-11丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織HYP的影響(iig/mg)組別劑量(mg/kg)7天14天28天正常對照組0.63±0.0530.71±0.0520.87±0.096模型組0.62±0.1070.81±0.1311.35±0.104##醋酸潑尼松組3.330.55±0.0570.80±0.1221.26±0.222大劑量組80.00.46±0.0680.77±0.0691.18±0.134*丹參總酚酸中劑量組40.00.46±0.0760.8±0.0701.01±0.139**小劑量組20.00.43±0.0190.79±0.1190.96±0.249**注#P<0.05，湖pO.Ol，與正常對照組相比；*P<0.05，**pO.Ol，與模型組相比。「；±s,"=6」圖18丹參總酚酸對博萊霉素肺纖維化大鼠肺組織HYP的影響。士s，n=6)(#P<0.05,##p《0.01，與正常對照組相比；*P<0.05，**p《0.01，與模型組相比)小結1、丹參總酚酸給藥7、14、28天后可明顯降低博萊霉素所致肺纖維化大鼠的肺系數；2、丹參總酚酸給藥7天后可減輕博萊霉素致肺纖維化大鼠肺泡炎，給藥14、28天后可減輕肺纖維化程度；3、丹參總酚酸給藥7、14天能降低博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺組織TGFP1的表達；4、丹參總酚酸可明顯增強博萊霉素所致肺纖維化大鼠早期肺組織、血清SOD活力，明顯降低MDA含量；5、丹參總酚酸能減少博萊霉素所致肺纖維化大鼠肺間質中i型、m型膠原的沉積。6、丹參總酚酸給藥28天可降低博萊霉素所致肺纖維化大鼠的肺組織羥脯氨酸含量。討論在本發明實施條件下，造模第7天時，模型組動物肺泡炎明顯(P4.01)，第28天肺組織中羥脯氨酸含量較正常組明顯增高(P<0.01)光鏡、免疫組化及電鏡觀察顯示肺纖維程度明顯升高，成纖維細胞和膠原纖維大量增生，纖維化已成為主要病變，說明BLM所致肺纖維化動物模型復制成功。在用BLM制備肺纖維化動物模型的基礎上，本文實驗結果表明，給予丹參總酚酸治療后，動物肺纖維化明顯減輕。現將博萊霉素致肺纖維化動物模型的評價及丹參總酚酸對博萊霉素致肺纖維化動物模型的療效機制，討論如下一、博萊霉素致肺纖維化動物模型的評價肺纖維化的病因目前尚不清楚，其發病機制亦未完全闡明。一般認為粉塵吸入、感染、吸入某些氣體以及使用某些藥物均可引起肺纖維化。為了初步探討丹參總酚酸對肺纖維化的治療作用及機制，首先必須復制穩定的肺纖維化動物模型；而實驗動物模型選擇正確、復制穩定是本實驗順利進行的根本保證。在査閱相關文獻的基礎上，本課題選擇了博萊霉素致肺纖維化的實驗動物模型。目前國內外常用石英、博萊霉素致肺纖維化動物模型來研究肺纖維化形成的原因和機制。博來霉素(BLM)是從鏈霉菌屬中一個產抗生素的菌株中提取出的一組糖肽類，是一種癌癥化療制劑。肺纖維化是BLM常見的并發癥，常用于制作動物肺纖維化模型。BLM致纖維化機制尚不明確。比較公認的觀點是BLM能和亞鐵離子形成Blemydn-Fe++復合物，在02存在下，這一復合物能為氧分子提供電子，形成過氧化物和游離羥基等中間體產物，使DNA的脫氧核糖產生自由基。大量的自由基對肺組織產生脂質過氧化損傷，促進成纖維細胞等增生、增殖，使肺泡間質發生纖維化。由于BLM分子量大，性質穩定，在室溫中2年不降低效價，進入組織后被細胞緩慢攝取，所以BLM對組織的損傷具有持續性。經氣管注入博萊霉素造成動物肺纖維化，其病理過程與人類特發性肺間質纖維化相似，作為肺纖維化的經典動物模型而被廣泛應用。本實驗應用博萊霉素復制小鼠、大鼠肺纖維化模型，觀察發現模型組病理學改變7天肺泡炎明顯，14天、28天形成纖維化，主要病變與指標都與文獻報道一致，同時肺組織超微結構的改變顯示大鼠不僅有肺間質的病變，還有明顯的肺實質包括肺泡上皮細胞、血管內皮細胞及基底膜的損傷，與文獻報道一致，說明動物模型復制成功。二、丹參總酚酸抑制肺損傷及炎癥反應肺纖維化過程起始于肺泡，肺泡上皮損傷、肺泡炎以及巨噬細胞數量增多可能是肺纖維化發生的早期事件。在本實驗中，通過氣管內注入博萊霉素可使肺泡上皮細胞和血管內皮細胞受損，受損肺組織產生的化學趨化物質最初可使大量炎癥細胞游走到肺間質及肺泡腔中，之后炎癥細胞可進一步釋放多種細胞因子和炎性介質，例如IL-1、TGF-e、TNF-a、IFN-Y、PDGF、MMPs等，這些因子對肺纖維化形成均具有重要作用。此外，BLM所致肺損傷可使肺泡上皮細胞和血管內皮細胞通透性增加，血漿蛋白外滲，最終導致ECM沉積于肺泡腔和肺間質中。由此可見，肺組織受損、炎癥細胞聚集可促進纖維化形成，而保護肺泡上皮細胞、減輕炎癥反應、減少炎癥細胞滲出則可改善肺功能。目前針對肺纖維化的傳統治療藥物如糖皮質激素和其他免疫抑制藥物其出發點就是抑制炎癥反應，從而減輕肺纖維化的程度。在本實驗中，經丹參總酚酸治療后，可以顯著減輕BLM誘導的小鼠、大鼠肺部早期急性期炎癥反應，降低肺系數，病理形態學檢查及電鏡觀察顯示肺部炎癥細胞滲出明顯減少、肺泡上皮細胞結構基本正常，故推測抑制肺損傷及炎癥反應是治療肺纖維化的主要機制之一。三、丹參總酚酸抑制肺纖維化模型氧自由基損傷自由基損傷在肺纖維化發生發展過程起著重要作用，是目前已知的重要機制之一。Murrel等報道氧自由基可刺激成纖維細胞增生。成纖維細胞是分泌膠原蛋白的主要細胞，其合成與分泌膠原能力的增強或成纖維細胞的大量增殖，都可能導致膠原總量的增加。本實驗表明注入博萊霉素后l-7天內，病變以肺泡炎為主，第7天時肺泡炎達高峰，并開始出現肺泡間隔增厚，成纖維細胞及毛細血管增生，第28天時形成穩定的纖維化，與文獻報道一致。因此博萊霉素致肺纖維化病理過程分兩期即早期為肺泡炎，晚期為肺纖維化。肺泡炎階段，博萊霉素刺激大量炎性細胞產生氧自由基、細胞因子和酶參與了肺損傷，隨后氧自由基刺激成纖維細胞分泌膠原蛋白形成肺纖維化。在生理條件下，氧自由基引發的組織損傷可被內源性抗氧化物質所抑制。然而，當這些抗氧化物不足以對抗大量的氧化物即氧化-抗氧化系統失衡時，組織就會發生不可逆性損傷。博萊霉素在氧分子和Fe2+存在下可產生氧自由基，氧自由基可破壞生物大分子如DNA、蛋白質和脂質，損傷DNA及信號轉導蛋白，最終引發細胞膜脂質過氧化反應，生物膜功能喪失，從而使肺泡上皮遭到不可逆的破壞，導致肺損傷；另一方面，肺泡上皮細胞損傷可引起大量炎癥細胞浸潤到間質或肺泡腔中，炎癥細胞的聚集和活化也可產生過量的氧自由基，除了進一步加重脂質過氧化和肺組織的損傷外，還可通過激活NF-kB上調致纖維化細胞因子的產生，間接促進肺纖維化的形成。因此，過氧化物和自由基反應中間產物的過量產生在BLM誘導的炎癥和纖維化中起重要作用。SOD是體內重要的清除氧自由基的酶，它的活性增加可阻止氧自由基的連鎖反應，清除氧自由基及其氧化產物，保護肺組織細胞，減輕肺損傷。其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力。MDA是脂質過氧化的產物，它的髙低間接反映了機體細胞受自由基攻擊的嚴重程度。因此兩者同時測定具有更好的評判價值。丹參的化學成分主要分為水溶性成分和脂溶性成分兩大部分。丹參酮是丹參主要的脂溶性有效成分，以往的研究表明丹參酮具有抗動脈粥樣硬化、降低心肌耗氧量、抑制血栓形成等心血管保護作用。丹參的水溶液性有效成分主要是酚酸類化合物，有研究結果顯示丹參總酚酸對于防治動脈粥樣硬化發揮重要作用。另有研究顯示，丹參總酚酸對11202氧化損傷的血管平滑肌有明顯的保護作用。本實驗結果表明，肺纖維化大鼠經丹參總酚酸和醋酸潑尼松治療后，早期肺組織、血清SOD活力明顯高于模型組；MDA含量明顯低于模型組。說明肺纖維化早期，丹參總酚酸有很好的抗氧自由基的作用。四、丹參總酚酸抑制TGF-e大量分泌TGF-e廣泛分布于體內，參與多種細胞的生理功能，如細胞的游走、分化和增殖。其在致纖維化作用方面表現尤為突出，涉及多個器官和多種原因所致的纖維化性病變。在參與肺纖維化的細胞因子網絡中，TGF-e是研究最深入、最重要的細胞因子。TGFP在哺乳類動物中共有三種異構體，即TGF-ei，TGF-e2，TGF-P3，其中TGF-e1分布最廣，研究得也最多。Aubert報道TGF-e1廣泛分布于正常大鼠肺內，包括肺泡巨噬細胞，肺內間質，支氣管上皮細胞，氣道和血管周圍的結締組織中。其中肺泡巨噬細胞被認為是分泌TGF-e1的主要細胞。TGF-e1是一種具有多種生物學效應的細胞因子，對成纖維細胞具有趨化作用，并能刺激未成熟成纖維細胞的生長，損傷部位出現的TGF-e1能夠從周圍組織中募集成纖維細胞并能刺激未成熟成纖維細胞增生和分化。體外研究表明，TGF-e1可刺激肺成纖維細胞合成大量膠原。以往研究顯示丹參可抑制肺纖維化小鼠肺組織TGF-P的表達，未見丹參總酚酸的相關報道。本實驗結果表明，模型組小鼠、大鼠肺組織TGF-ei積分光密度值明顯多于正常對照組，說明博萊霉素的可刺激肺組織中TGF-ei的產生，從而引起各種細胞外基質的合成和沉積；而醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組小鼠、大鼠早期肺組織TGF-ei積分光密度值明顯低于模型組，同時發現丹參總酚酸能降低TGF-ei在巨噬細胞的表達，說明肺纖維化早期，丹參總酚酸和醋酸潑尼松能抑制TGF-e1分泌，降低其在肺組織的表達。五、丹參總酚酸對肺纖維化模型膠原及HYP的影響膠原是細胞外基質的主要成分，膠原積聚是肺間質纖維化的一個重要特征。其合成的速度大于降解的速度，肺內膠原纖維顯著增多，最終導致膠原的逐漸積累。實驗還證實，在大鼠和人肺間質纖維化的肺組織有膠原代謝紊亂，表現為I型和III型膠原比例失調，膠原在肺間質中積聚。HYP是機體膠原蛋白的主要成分之一，約占其氨基酸總量的13.4%，其他除彈性蛋白含有少量HYP(約1%)夕卜，均不含HYP。因此組織中HYP含量可作為其膠原組織代謝的重要指標[9]。膠原合成的一個重要過程是脯氨酸經羥化酶作用轉化成羥脯氨酸，每個膠原分子中每條a肽鏈里至少要有近IOO個羥脯氨酸殘基才能使膠原的三螺旋結構穩定。羥脯氨酸與膠原分子中a肽鏈的這種穩定的比例關系，使羥脯氨酸含量的測定成為間接反映膠原含量的敏感指標而被廣泛應用于肺纖維化的研究。而通過羥脯氨酸測算膠原蛋白的含量，一方面可以直觀的反映膠原代謝的情況，判斷纖維化的程度，同時可以為篩選預防與治療的藥物提供依據。本實驗CollagenI、Collagenin免疫組化結果顯示小鼠、大鼠模型組I型和III型膠原積分光密度均在7天開始增加，而且直至28天，仍呈不斷增加趨勢，此時肺泡結構已破壞，纖維化明確可見，纖維組織呈條索樣，斑片狀分布。而醋酸潑尼松組和丹參總酚酸組小鼠、大鼠I、HI型膠原第7、14、28天積分光密度值明顯低于模型組。提示了丹參總酚酸能抑制I、III型膠原在肺間質的沉積。本實驗肺組織HYP結果表明，在造模后14、28天時，與正常組相比，模型組小鼠、大鼠肺組織HYP含量明顯升高；14天丹參總酚酸組小鼠、大鼠肺組織HYP含量與模型組相比，均有不同程度下降，但無顯著性差異；28天丹參總酚酸組小鼠、大鼠肺組織HYP含量與模型組相比均有顯著下降，間接反映了丹參總酚酸可降低肺組織膠原的含量，起到減輕肺纖維化的作用。14天、28天醋酸潑尼松組小鼠、大鼠肺組織HYP含量與模型組相比，均有不同程度下降，但無顯著性差異。提示醋酸潑尼松遠期治療效果不佳。綜上所述，PNS對BLM誘導的動物肺纖維化模型有明確的治療作用，為肺纖維化的藥物治療提供了一個新的選擇。PNS抗實驗性肺纖維化的機制為①抗損傷及抗炎效應病理形態學觀察顯示PNS可以保護肺泡上皮細胞，顯著減輕肺泡炎的程度和范圍。②抗氧化作用本實驗中PNS可以顯著提高大鼠肺組織勻漿和血清中SOD活力，降低MDA含量，提示PNS可通過抑制脂質過氧化反應而對肺損傷及纖維化起到一定的抑制作用。③調節細胞因子網絡免疫組化顯示PNS可以顯著減少肺組織中致纖維化因子TGF-3的陽性表達，從而使膠原等ECM沉積減少。④抑制成纖維細胞增生、活化經病理形態學和電鏡觀察發現，PNS可以抑制由成纖維細胞大量增生引起的膠原沉積。結論1、本實驗實施結果表明通過氣管內注入BLM，成功復制了小鼠、大鼠的肺纖維化模型；2、丹參總酚酸可明顯降低博萊霉素致肺纖維化小鼠、大鼠的肺系數；3、病理觀察顯示丹參總酚酸早期可減輕博萊霉素致肺纖維化小鼠、大鼠肺泡炎，晚期減輕纖維化程度；4、電鏡觀察顯示丹參總酚酸可減輕肺纖維化大鼠I、II型上皮細胞損傷的程度及間質中膠原的沉積；5、丹參總酚酸可明顯升高博萊霉素所致肺纖維化大鼠早期肺組織、血清SOD活力，明顯降低MDA含量；6、丹參總酚酸早期能降低博萊霉素致肺纖維化小鼠、大鼠肺組織TGF01的過高表達；7、丹參總酚酸能降低博萊霉素致肺纖維化小鼠、大鼠肺間質CollagenI、CollagenIII的表達；顯著降低肺組織HYP的含量。以上結果表明丹參總酚酸對博萊霉素所致動物肺纖維化具有明確的治療作用，該作用抑制與其抗損傷、抗炎癥反應，抗氧自由基損傷、抑制TGF-0大量分泌及成纖維細胞增生、治療有關。權利要求1.一種丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途。全文摘要本發明公開了丹參總酚酸在制備治療肺纖維化藥物中的用途，本發明在以博萊霉素復制小鼠和大鼠的肺纖維化模型的基礎上，用三種不同劑量的丹參總酚酸予以治療，通過丹參總酚酸、免疫組織化學分析、電鏡觀察及生化測定等方法來證明丹參總酚酸對博萊霉素所致肺纖維化的療效、病理變化及作用機制。實施結果表明丹參總酚酸對博萊霉素誘導的動物肺纖維化有明確的治療作用，為肺纖維化的藥物治療提供了一個新的選擇。文檔編號A61P11/00GK101120962SQ20071002405公開日2008年2月13日申請日期2007年7月12日優先權日2007年7月12日發明者馮一中,周文軒,軍林,郭次儀,顧振綸申請人:蘇州中藥研究所