專利名稱：結構類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及結構類似Combretastatin A4的化合物，具體的說，涉及結構類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應用。
背景技術：
血管阻斷劑(Vascular Disrupting Agents，VDA)是近年來出現的抗血管、抗腫瘤藥物領域的一支重要的生力軍。血管阻斷劑(VDA)從機理上源自于微管蛋白結合，屬于抗微管藥物。研究認為，微管蛋白分子結構中有三個較為明確的小分子結合部位，即秋水仙堿結合部位(Colchicine domain)、長春堿結合部位(Vinca domain)和紫杉烷結合部位(Taxane site)，前兩者定位于聚合前的微管蛋白，后者定位于聚合后的微管。與秋水仙堿及長春堿部位相結合的配體能干擾、阻斷微管的形成，而與紫杉烷部位結合的配體能穩定微管，最終都能阻斷有絲分裂，導致細胞死亡。
早期發現的具有抑制微管蛋白作用的化合物應屬秋水仙堿(Colchicine)，但由于秋水仙堿的產生毒副作用的劑量與治療劑量相差無幾，臨床應用受到極大的限制。目前，已在歐美進入臨床研究、具有代表性的VDA類藥物主要有CA4P、CA1P(即Oxi-4503)、
AVE-8062(即AC-7700)、ZD-6126、DMXAA(即AS-1404)及TZT-1027等等。為更有利于血液給藥及提高靶向性，這些化合物大都被設計成為水溶性前體藥物，當其進入體內后，經相應的磷酸酯酶或氨基肽酶水解而釋放出原藥，發揮抗血管、抗腫瘤作用。
在VDA中具有開創意義和領先水平的化合物當屬CA4P(Combretastatin A4 Prodrug)。CA4P是第一個進入臨床研究的VDA，它是從非洲灌木Combretum Caffrum的樹皮中分離得到的一種多取代二苯乙烯類化合物、高活性抗腫瘤天然產物——CA4(Combretastatin A4)的磷酸酯化前體藥物。研究證實CA4是強效的微管蛋白結合劑，能與微管蛋白β亞基結合、干擾微管及紡錘體形成、阻斷有絲分裂過程，CA4能區分腫瘤細胞和正常細胞在增殖特性、細胞脆性、蛋白水平等方面的差異，選擇性的作用于腫瘤血管內皮細胞，導致其變形、膨脹、從基底膜上脫落、使腫瘤血管堵塞、關閉，最終導致腫瘤細胞繼發性死亡。同時，對正常內皮細胞及其他非異常增殖的細胞影響很小。但CA4的水溶性極差，難以通過血管給藥。1995年，Pettit等人設計合成了CA4的磷酸酯化二鈉鹽前體藥物CA4P，極大的改善了其水溶性和藥代動力學性質，利用磷酸酯酶在增殖的血管內皮細胞中的濃度高于正常細胞中的特點，使CA4P在腫瘤血管中被選擇性激活，靶向的釋放出CA4并發揮抗血管、抗腫瘤作用。
近年來的研究認為，由于VDA類藥物作用于腫瘤血管并使其關閉，其對深部腫瘤細胞的作用較強，而對可從正常組織獲取養分的外周腫瘤細胞的殺傷作用較弱，體內試驗發現單獨給予VDA類藥物，腫瘤邊緣部位細胞仍能保持活力并繼續生長。但VDA類藥物的作用機理及特點正好與傳統的放化療互補(傳統放化療對供氧充足的外周腫瘤細胞殺傷作用較強，而對深部腫瘤效果較差)，因此，VDA類藥物適合與其他治療方式聯合應用，目前正在進行的臨床研究也反應了這一點。如有關CA4P的9項臨床研究中，除退行性甲狀腺癌(ATC)、近視性黃斑病變(MMD)和老年性黃斑病變(AMD)以外，其用于卵巢癌(Ovarian Cancer)、乳腺癌(Breast Cancer)、肺癌(Lung Cancer，包括晚期非小細胞肺癌NSCL)、頭頸癌(Head & Neck Cancer)、前列腺癌(Prostate Cancer)、結腸癌(Colorectal Cancer)、晚期復發性宮頸癌(Cervical Cancer)等的治療均與放化療聯合應用。另外，由于CA1P作為更新一代的VDA，除保持優良的抗血管活性外，其直接作用于腫瘤細胞的細胞毒性明顯提高，CA1P單獨用藥的療效明顯優于其他VDA。因此，需要進一步開發兼有良好抗血管作用及直接抗腫瘤作用的新型VDA藥物。
發明內容
本發明的目的在于針對現有技術存在的不足，提供結構類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應用。
本發明的結構類似Combretastatin A4的化合物的結構如通式(I)所示
其中，R為-OH或-OPO(ONa)2。
當R＝-OH時，名稱為(Z)-3，4′，5-三甲氧基-3′-羥基二苯乙烯，簡稱為M286，分子式為C17H18O4，分子量為286.32，為棕色液體；其結構式如(II)所示 當R＝-OPO(ONa)2時，名稱為(Z)-3，4′，5-三甲氧基二苯乙烯-3′-O-磷酸酯二鈉鹽，簡稱為M410，分子式為C17H17Na2O7P，分子量為410.27，為白色固體；其結構式如(III)所示
與現有技術相比，本發明具有如下有益效果本發明發現結構類似Combretastatin A4的化合物能用于制備抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤的藥物，應用前景廣闊。
圖1為M410對微管蛋白聚合的抑制作用圖；圖2為M410對人結腸癌(LoVo)在裸鼠體內生長的抑制作用圖；圖3為M410單用及聯合5-Fu對人肝癌(HepG2)在裸鼠體內生長的抑制作用圖。
具體實施例方式
實施例1Combretastatin A4類似物的體外抗腫瘤細胞增殖實驗所選的細胞株包括人口腔上皮癌KB-3-1，人胃腺癌MGC803，宮頸癌HeLa，乳腺癌MCF-7，肝癌HepG2，結腸癌LoVo和白血病HL-60細胞株等。取對數生長期腫瘤細胞制成一定濃度的細胞懸液接種于96孔板中，每孔加入一定濃度的待測藥物，對照孔不加藥物，每個濃度設4個平行孔。培養68小時加入MTT 100μg/孔，繼續培養4小時，棄去培養液，加入200μL二甲基亞砜，震蕩15分鐘完全溶解后，用酶標儀測定570/630nm雙波長吸光光度值，用Logit法計算抑制50％細胞生長時的藥物濃度(IC50)。實驗重復3次，結果見表1。
表1的體外藥理實驗表明，化合物M286和M410對多種腫瘤細胞株，包括人口腔上皮癌KB-3-1，人胃腺癌MGC803，宮頸癌HeLa，乳腺癌MCF-7，肝癌HepG2，結腸癌LoVo和白血病HL-60細胞株等，具有明顯的生長抑制作用。
表1
*CA4，VCR為陽性對照，IC50為半數抑制濃度(IC50，nM)實施例2Combretastatin A4類似物M410體外抑制微管蛋白聚合活性實驗微管蛋白溶液在0～4℃是無色透明溶液，在37℃保溫時，微管蛋白聚合成微管，溶液在340nm的吸光度(OD值)上升，并在一定時間內達到坪值。根據測得的OD值對保溫時間作圖，可以繪制出特征性的“S”型聚合曲線。干擾微管聚合的藥物可以使曲線形態發生改變，曲線坪值也隨之發生改變。
用General Tubulin Buffer將純化的牛腦微管蛋白粉末溶解為10mg/mL的儲備液并置冰浴；用General Tubulin Buffer稀釋微管蛋白儲備液至2mg/mL，加入GTP至1mM，加入甘油至10％，將此混合液迅速加入冰上預冷的比色杯中，在紫外分光光度計340nm下調定零點；將比色杯用37℃恒溫水浴保溫，每6min測定一次OD值，連續測定60min，直到OD值無明顯上升為止；以時間(min)為橫坐標，OD值(OD340nm)為縱坐標，繪制微管蛋白聚合曲線，即對照組曲線；配制相同的含1mM GTP和10％甘油的微管蛋白溶液，分別加入待檢測化合物(M410至8μM，Taxol至8μM，Colchicine至8μM)，重復上述測定過程；分別繪制聚合曲線，實驗重復3次，結果見圖1。這說明化合物M410對微管蛋白聚合有明顯抑制作用。
實施例3Combretastatin A4類似物M410在裸鼠體內抑制人結腸癌(LoVo)生長實驗取對數生長期的LoVo細胞1×107/mL接種于裸鼠右腋下，每只小鼠0.2mL。一旦腫瘤長成200～300mm3，根據腫瘤大小將小鼠隨機分成5組。第1組為生理鹽水對照組，第2組為CA4P組(25mg/kg)，第3組為DDP組(1mg/kg)，第4組為M410組(25mg/kg)，第5組為DDP(1mg/kg)與M410(25mg/kg)聯合應用組(M410用于DDP之后1小時)。每3～4天腹腔給藥1次，共4次。每3～4天用游標尺測量腫瘤大小及稱小鼠體重，腫瘤體積(Tumor Volume，mm3)按照(L×S×S)/2計算，其中L(mm)代表腫瘤長徑，S(mm)代表腫瘤短徑。給藥后第20天處死小鼠，取腫瘤稱重，計算腫瘤抑制率IR(IR＝1-T/C)，其中T，C分別代表用藥組和對照組腫瘤平均重量。實驗結果采用t檢驗分析，P＜0.05認為有顯著性差異。結果見圖2，表2。表明化合物M410體內能抑制結腸癌的生長，25mg/kg的腫瘤抑制率為44.3％(P＜0.01)。
表2
實施例4Combretastatin A4類似物M410在裸鼠體內抑制人肝癌(HepG2)生長實驗取對數生長期的HepG2細胞1×107/mL接種于裸鼠右腋下，每只小鼠0.2mL。一旦腫瘤長成100～200mm3，根據腫瘤大小將小鼠隨機分成5組。第1組為生理鹽水對照組，第2組為CA4P組(25mg/kg)，第3組為M410組(50mg/kg)，第4組為5-Fu組(25mg/kg)，第5組為5-Fu(25mg/kg)與M410(50mg/kg)聯合應用組(M410用于5-Fu之后1小時)。每3～4天瘤內注射給藥1次，共7次。每3～4天用游標尺測量腫瘤大小及稱小鼠體重，腫瘤體積(Tumor Volume，mm3)按照(L×S×S)/2計算，其中L(mm)代表腫瘤長徑，S(mm)代表腫瘤短徑。給藥后第24天處死小鼠，取腫瘤稱重，計算腫瘤抑制率IR(IR＝1-T/C)，其中T，C分別代表用藥組和對照組腫瘤平均重量。實驗結果采用t檢驗分析，P＜0.05認為有顯著性差異。結果見圖3，表3。表明化合物M410體內能抑制肝癌的生長，50mg/kg的腫瘤抑制率為61.9％(P＜0.01)；5-Fu與M410聯合應用組的腫瘤抑制率為61.9％，與單用5-Fu組(27.6％)相比有統計學差異(P＜0.01)。
表3
權利要求
1.結構類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應用，所述結構類似Combretastatin A4的化合物的結構如通式(I)所示 其中，R為-OH或-OPO(ONa)2。
全文摘要
本發明公開了結構類似Combretastatin A4的化合物在制備用于抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤藥物中的應用。本發明發現結構類似Combretastatin A4的化合物能用于制備抑制微管蛋白聚合或抗腫瘤的藥物，應用前景廣闊。
文檔編號A61K31/661GK101073561SQ20071002874
公開日2007年11月21日 申請日期2007年6月22日 優先權日2007年6月22日
發明者冼勵堅, 鄒永, 蔡于琛, 王志新 申請人:中山大學