專利名稱：：急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
：本發明屬于血液腫瘤免疫治療
技術領域：
，特別涉及一種急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARa384-ML-2(即pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2質粒)及其制備方法和應用。
背景技術：
：免疫療法治療腫瘤與白血病是目前的一個趨勢，DNA疫苗具備諸多傳統疫苗所不能比擬的優勢，能夠誘導特異性體液免疫與細胞免疫。急性早幼粒細胞白血病(Acutepromyelocyticleukemia,APL)是目前治療效果最好的一種白血病，但腫瘤的微小殘留病變(minimalresidualdisease,MRD)卻很難被現行治療方案根除，尋找一種能夠根除APL的MRD的治療方案迫在眉睫。盡管針對急性早幼粒細胞白血病(Acutepromyelocyticleukemia,APL)的聯合化療方案已經取得很大進展，患者的預后也有了較大改善，但腫瘤的微小殘留病變(minimalresidualdisease,MRD)卻很難被現行治療方案徹底消滅。由于許多白血病患者體內都存在由于染色體易位所形成的融合基因，利用融合基因作為誘導產生特異性抗白血病治療的靶點已經成為眾多研究人員追求的目標。由于體外表達的蛋白不一定具有與體內蛋白一致的天然構象，而且外源蛋白進入體內后以誘導體液免疫反應為主，而DNA疫苗則能夠有效地克服這些缺陷，同時誘導體液免疫和細胞免疫。利用PML-RARa[早幼粒白血病基因(PML)與維甲酸受體a(RARa)基因]融合基因制備DNA疫苗是有希望根除急性APL的MRD的方法之一。目前對于APL的治療主要有傳統化療和誘導分化治療，雖然現有的治療方法已經能夠在很大程度上提高患者的生存質量，患者的預后也有了較大改善，但腫瘤的MRD卻很難被現行治療方案徹底消滅。骨髓移植雖然能夠根除MRD，但骨髓來源少，配型成功率低，高昂的移植費用以及嚴重的移植相關并發癥限制了該療法的推廣。在化療結束后輔以APL特異的DNA疫苗治療是有希望根除MRD的方法之一。大約有70%APL患者體內存PML-RARa融合基因，該融合基因是APL發病以及應用全反式維甲酸治療有效的分子基礎，是一個特異的白血病抗原。表達PML-RARa的細胞可誘導T細胞克隆性增殖，提示該細胞內的融合蛋白可以被MHC分子加工和提呈到細胞表面，因此可以利用PML-RARa融合蛋白或融合基因誘導機體產生特異性免疫應答，或者誘導機體產生針對PML-RARa的特異性CTL，達到免疫治療的目的。Padua等研究發現利用跨越PML-RARa融合基因的融合點的基因片段構建的DNA疫苗能夠在小鼠體內誘導產生特異性免疫保護作用。目前對于制備PML-RARa基因疫苗特異性目的基因的選擇尚無定論，如何篩選出具有最佳免疫原性的PML-RARa基因片段仍是此類研究所面臨的核心問題。目前尚未有融合基因pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2(人白細胞介素2)的構建。
發明內容針對上述現有技術存在的不足之處，本發明的首要目的在于提供一種急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARa384-ML-2(即pIRES-PML-RARa(384bp)-1111^2重組質粒)。該融合基因pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2是能夠在真核細胞內同時表達PML-RARa和hIL-2蛋白的質粒。本發明利用基因克隆和重組技術構建了急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARa(384bp)-1111^2重組質粒)，并研究了通過體外細胞轉導后基因和蛋白表達；小鼠體內注射免疫后不同時期的基因和蛋白表達、抗體產生和特異性CTL效應等的效應。本發明的另一目的在于提供上述急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗的制備方法。本發明的再一目的在于提供上述急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗的應用。所述急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗是一種能夠在真核細胞中同時表達PML-RARa蛋白和ML-2蛋白的DNA疫苗，它能夠誘導APL患者機體產生針對APL細胞的特異性CTL從而清除患者體內的微小殘留病變，達到治愈APL的目的。本發明的目的通過下述技術方案來實現一種急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARa384-hIL-2，所述DNA疫苗PML-RARa384-ML-2(即pIRES-PML-RARa(384bp)-ML-2重組質粒)由pIRES質粒、PML-RARa基因和h!L-2基因組成，所述PML-RARa基因(大小為384bp)序列如下CAAJGCTAGCAGC[^gtctccaatacaacgacagcccagaagaggaagtgcagccagacccagtgccccaggaaggtcatcaagatggagtctgaggaggggaaggaggcaaggttggctcggagctccccggagcagcccaggcccagcacctccaaggcagtctcaccaccccacctggatggaccgcctagccccaggagccccgtcataggaagtgaggtcttcctgcccaacagcaaccacgtggccagtggcgccggggaggcagccattgagacccagagcagcagttctgaagagatagtgcccagccctccctcgccaccccctctaccccgcatctacaagccttgctttgtctgtcaggac^^ACGCGTCGC;所述PML-RARa基因片段是384bp,實際上有效片段是360bp,ATG為啟始密碼子，TGA為終止密碼子；前后的序列為酶切位點等。所述h!L-2基因(大小為487bp)序列如下GGCACGTCGACACAATGTACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCA所述hlL-2基因片段是487bp，ATG為啟始密碼子，TGA為終止密碼子；前后的序列為酶切位點等。上述急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARa384-hlL-2的制備方法，包括如下步驟(1)首先提取NB4細胞的RNA通過逆轉錄合成cDNA，然后利用引物PP3和PP4通過PCR擴增出PML-RARa基因；擴增的PCR產物標記為PML-RARa，其大小為384bp;將擴增的基因PML-RARa利用T4DNA連接酶與pIRES質粒進行連接，插入到pIRES質粒的多克隆位點A中構建出pIRES-PML-RARa;所述的PP3:5，CA^GC7MG(^GCATGGTCTCCAATACAACGA3，，其中，方框內GCTAGC為7WzeI酶切位點；所述的PP4:5，GCGUCGCG7tTCAGTCCTGACAGACAAAG3，，其中方框內ACGCGT為MmI酶切位點。(2)然后通過PCR從Jurkat細胞的cDNA中擴增出hlL-2基因用引物PD、PI4(外側引物)和PIl、PI2(內側引物)進行巢式PCR，擴增ML-2基因，擴增的PCR產物大小為487bp。所述的PI1:5，GGCACG7Y:a4CACAATGTACAGGATGCAACTCC3，；方框內GTCGAC為酶切位點；所述的PI2:5，TAllG"a7GCCGC^CAAGTCAGTGTTGAGATGATG3，；方框內GCGGCCGC為ATwl酶切位點。所述的PI3:5，TTGTTCAAGAGTTCCCTATC3，；所述的PI4:5，TGAAACCATTTTAGAGCC3,;(3)將上述擴增得到的WL-2基因利用T4DNA連接酶與pIRES質粒進行連接，插入到pIRES-PML-RARa的多克隆位點B中，經過測序正確后，構建了pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2質粒即DNA疫苗PML-RARa384-hIL-2。所述步驟(1)擴增反應條件為預變性94'Clmin，退火60°Clmin;延伸72°Clmin，共進行40個循環；首次預變性為94°C3min，末次延伸為72°C10min。所述步驟(2)擴增反應條件為首先94'C預變性3min，然后94'Clmin，56°C1min，72°C1min循環30次，最后72°C總延伸6min。上述急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARa384-ML-2(即pIRES-PML-RARa-hlL-2質粒)可應用于制備治療急性早幼粒細胞白血病的藥物。本發明與現有技術的相比，具有如下優點和有益效果1、該DNA疫苗是一個能夠在真核細胞內同時表達PML-RARa和hIL-2蛋白的質粒，將該DNA疫苗注射到急性早幼粒細胞白血病(APL)患者體內能夠激發機體產生針對APL細胞的特異性免疫效應，從而達到根除患者體內的微小殘留病變的目的。可應用于制備治療急性早幼粒細胞白血病的藥物。2、本發明利用PML-RARa融合基因構建DNA疫苗用于根除APL的MRD，本發明提供了一個可以誘導產生特異性抗APL免疫效應的PML-RARa(384bp-ML-2雙基因DNA疫苗，為治療APL的DNA疫苗的研發提供重要的數據和資料。3、本發明利用腫瘤相關抗原或腫瘤特異抗原與細胞因子基因共同構建DNA疫苗)還可以為其他治療性腫瘤DNA疫苗的研究所借鑒。4、本發明的DNA疫苗能清除APL患者體內的微小殘留病變，最終達到治愈APL的目的。圖1為PIRES-PML-RARa-hIL-2雙表達質粒構建流程圖。圖2為PCR擴增獲得的PML-RARa基因片段圖。其中，Lane2:PML-RARa(384bp)的PCR產物384bp。圖3為pIRES-PML-RARa(384bp)重組質粒等雙酶切鑒定圖。其中，Lane3:pIRES-PML誦RARa(384bp)/7W^I+MwI。圖4為PCR擴增獲得的hIL-2基因的電泳檢測圖。圖5為pIRES-PML-RARa-hlL2和pIRES-hIL-2重組質粒用1進行單鑒定圖。其中，Lane2:pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2+7Vofl;Lane3:pIRES-hIL-2/1+7VoH。圖6為pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2重組質粒中PML-RARa測序比對結果圖。圖7為pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2重組質粒中hIL-2測序比對結果圖。圖8為pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2重組質粒轉染后A549細胞后cDNAPCR產物電泳圖。其中，Lanel:轉染了pIRES-PML-RARaG84bp)的A549細胞cDNA作為模板，PP3,PP4作為引物；Lane2:轉染了pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2的A549細胞cDNA作為模板，PP3，PP4作為引物；Lane3:轉染了pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2的A549細胞cDNA作為模板，PIl，PI2作為引物；Lane4:轉染了pIRES-hIL-2的A549細胞cDNA作為模板，PP3，PP4作為引物。圖9為點雜交結果圖。其中，1:陽性對照；2:轉染了pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2的A549細胞培養上清液；3:轉染了pIRES-hlL-2的A549細胞培養上清液；4:轉染了pIRES的A549細胞培養上清液。圖IO為ELISA實驗結果圖。其中，由左至右標本加樣順序依次如下管l:轉染了pIRES-PML-RARa(384bp)的A549細胞上清液；管2:轉染了pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2的A549細胞上清液；管3:轉染了pIRES-hIL-2的A549細胞上清液；管4:轉染了pIRES的A549細胞上清液；管5:未轉染任何質粒的A549細胞上清液。圖11為HE染色觀察注射部位肌肉組織細胞聚集情況圖。其中，A:PML-RARa-IL2-pIRES質粒組；B:IL2-pIRES質粒組；C:PML-RARa-pIRES質粒組；D:pIRES質粒組。圖12為小鼠脾臟細胞針對NB4細胞的殺傷性圖。具體實施方式下面結合實施例和附圖對本發明作進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限于此。實施例1急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗(pIRES-PML-RARa(384bp)-hlL-2重組質粒)的構建構建流程圖如圖l所示，利用RT-PCR擴增PML-RARa基因，將該基因插入到pIRES質粒的多克隆位點A中構建出pIRES-PML-RARa(384bp)，然后通過PCR從Jurkat細胞cDNA中擴增出hIL-2基因，將該基因插入到pIRES-PML-RARa(384bp)的多克隆位點B中構建pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2，經過測序正確后，成功構建了PML-RARa384-hlL-2即pIRES-PML-RARa(384bp)-hlL-2質粒。具體步驟如下1pIRES-PML-RARa重組質粒的構建1.1PML-RARa基因的擴增從NB4細胞株中提取RNA逆轉錄合成cDNA作為模板(NB4細胞的RNA提取和cDNA合成均按常規方法進行)，用上游引物PP3、下游引物PP4進行PCR擴增PML-RARa基因，總反應體積為20^iL，其中含2^LcDNA和1U聚合酶其余各試劑的終濃度為引物0.5nmol/L，dNTP0.1mmol/L，MgCl21.5mmol/L，lxBuffer緩沖液。反應在PCR擴增儀中進行，共進行40個循環，94°Clmin(首次為3min);退火60°Clmin;延伸72。Clmin(末次為10min)，擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠在100伏電壓下電泳。電泳結果如圖3所示，產物片段大小與預期結果相符。擴增的PCR產物標記為PML-RARaG84bp)(見圖2)，其大小為384bp。PP3:5'CAAGCX4(CAGCATGGTCTCCAATACAACGA3，；方框內為7W^I酶切位點；PP4:5，GCg4aCG7lrCAGTCCTGACAGACAAAG3，;方框內為M&I酶切位點。1.2酶切E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化PML-RARaG84bp)基因PCR產物，將純化后的PCR產物和pIRES質粒用MzeI和MmI進行雙酶切處理，具體反應體系見表2。反應體系旋渦振蕩混勻后置于PCR儀中，37°C反應5小時。表2PML-RARa基因片段PCR產物和pIRES質粒雙酶切反應體系<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>純化上述酶切反應產物，酶切后的PML-RARa基因片段與經過同樣酶切處理的pIRES質粒利用T4DNA連接酶進行連接反應。體系配好混勻后16。C過夜，連接產物4'C保存，盡量24h內進行轉化。連接反應體系共25^iL，包括2.5mL10xBuffer，5pLPCR產物，3pL載體，1^LT4DNA連接酶和13.5^iL滅菌水。經過上述步驟將擴增的基因PML-RARa(384bp)插入到pIRES質粒的多克隆位點A中構建出pIRES-PML-RARa(384bp)重組質粒。1.4轉化、篩選鑒定陽性克隆將構建好的pIRES-PML-RARa(384bp)重組質粒常規轉化大腸桿菌后，16小時左右長出菌落。每個培養皿隨機挑選數個單菌落，分別置于100pLLB培養液(Amp100pg/mL)中，旋渦震蕩混勻。取溶解單菌落的培養液1pL作為模板分別配以相應的引物PP3，PP4進行PCR(擴增體系和方法同1.1)。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠在100伏特電壓下進行電泳。1.5提取質粒及酶切鑒定收集擴增的大腸桿菌利用質粒提取試劑盒提取pIRES-PML-RARaG84bp)重組質粒；將提取的重組質粒分別用NheI和MluI進行雙酶切鑒定，酶切反應體系共20iaL，包括2jxL10xBuffer，l(iLNheI，1^iLMluI，10fxLDNA和6jiL滅菌水。體系配好后旋渦振蕩混勻，然后置于PCR儀中37'C反應12小時，酶切產物100伏電壓下用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結果如圖3所示，從pIRES-PML-RARa(384bp)中切下來的PML-RARa基因片段，大小為384bp，與預期結果相符。1.6重組質粒序列分析鑒定構建的pIRES-PML-RARa(384bp)重組質粒經過雙酶切鑒定正確后，還需要進行測序以驗證插入多克隆位點A(MCSA)序列的正確性，從插入片段的上游開始延順時針方向采用雙脫氧鏈末端終止法進行單向測序，引物序列為"GGCACCTATTGGTCTTACTG"標記為PC1。測序結果與Genbank中PML-RARa融合基因序列比對結果如圖6所示，由該圖可以看出重組質粒中的插入的PML-RARa(384bp)基因序列完全正確。2pIRES-PML-RARa-ML-2重組質粒的構建2.1PCR擴增hlL-2基因取經過傳代培養的Jurkat細胞，向細胞培養液中加入PHA使其終濃度為10mg/L，經過24小時培養后，hlL-2mRNA能夠在Jurkat細胞中高效表達,。常規方法提取總RNA，逆轉錄合成cDNA作為模板。用引物PI3、PI4(外側引物)和PIl、PI2(內側引物)進行巢式PCR，擴增h!L-2基因，擴增的PCR產物大小為487bp。總反應體積為20^L，其中含2^LcDNA和1U聚合酶其余各試劑的終濃度為引物0.5pmol/L,dNTP0.1mmol/L，MgCl21.5mmol/L，lxBuffer緩沖液。反應在PCR擴增儀中進行。反應條件首先94"C預變性3min，然后94。Clmin，56°C1min，72°C1min循環30次，最后72°C總延伸6min。擴增產物在100伏特電壓下，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(結果見圖4)。PI1:5，GGCACl^Ca4C]ACAATGTACAGGATGCAACTCC3，；方框內為Sa/I酶切位點；PI2:5，TATlGCGGQ7(7CtrCAAGTCAGTGTTGAGATGATG3，；方框內為A^I酶切位點；PI3:5，TTGTTCAAGAGTTCCCTATC3';PI4:5，TGAAACCATTTTAGAGCC3'。2.2酶切E.Z.N.A.凝膠回收試劑盒純化WL-2基因PCR產物，將純化后的PCR產物和pIRES-PML-RARa重組質粒以及pIRES質粒用XbalI和SalI進行雙酶切處理，酶切反應體系共40(iL，包括8(iL10xTangoBuffer，2pLXbal，2pLSal1，10(iLDNA和18pL滅菌水。反應體系旋渦振蕩混勻后置于PCR儀中，37°C反應5小時。2.3連接純化上述酶切反應產物。酶切后的hIL-2PCR產物與經過同樣酶切處理的pIRES-PML-RARa重組質粒利用T4DNA連接酶行連接反應。體系配好混勻后16i:過夜，連接產物4"C保存，盡量24h內進行轉化。連接反應體系共10^L，包括l)iL10xBuffer，lpLPCR產物，2pL載體，l^iLT4DNA連接酶和5^L滅菌水。經過上述步驟將擴增的ML-2基因插入到pIRES質粒的多克隆位點B中構建出pIRES-hlL-2和pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2重組質粒。2.4轉化及篩選鑒定陽性克隆取溶解單菌落的培養液1作為模板用PI1、PI2作為引物進行菌落PCR擴增體系和方法同2.1。2.5常規提取質粒及酶切鑒定將提取的pIRES-hlL-2和pIRES-PML-RARa-hlL-2重組質粒用1和MfI分別進行單酶切鑒定，酶切反應體系共20pL，包括4pL10xTangoBuffer，1.5pLXbal，L5^iLSa11，6(iLDNA和7pL滅菌水。體系配好后旋渦振蕩混勻，然后置于PCR儀中37°C反應12小時，酶切產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定。電泳結果如圖5所示，從各重組質粒中切下來的hlL-2基因片段大小均為458bp，與預期結果相符。2.6重組質粒測序鑒定從插入片段的下游開始延逆時針方向進行單向測序，測序引物序列為"CGTCCATTCGCCATTCAG"標記為PC2，測序比對結果(見圖7)顯示插入到pIRES-PML-RARa(384bp)重組質粒多克隆位點B(MCSB)中的hlL-2序列，與Genebank中的hlL-2序列是完全一致的。實施例2研究構建的急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗(即pIRES-PML-RARaG84bp)-11正-2重組質粒)轉染真核細胞后基因和蛋白表達1篩選合適的待轉染細胞，由于懸浮細胞的轉染效率較低，為了進一步提高轉染效率我們采用了貼壁細胞用于轉染。禾U用LipofectamineTM2000Kit轉染A549細胞，經巢式PCR證明A549細胞總RNA中不含有ML-2基因及PML-RARa基因，因此可以將插構建的pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2重組質粒轉染A549細胞株。利用Lipofectamine2000Kit轉染A549細胞，將培養板放入5。/。C02培養箱中(37°C)培養，46小時后將培養基更換為含有胎牛血清和抗生素的培養基，48小時后收集上清液和細胞。2RT-PCR檢測收集轉染后培養48小時的A549細胞提取總RNA，逆轉錄合成cDNA作為模板，分別用引物PP3，PP4(用于擴增PML-RARa基因，384bp)和PIl，PI2(用于擴增WL-2基因，458bp)進行PCR擴增，PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠在100伏特電壓下電泳。確定PML-RARa/hlL-2基因轉錄情況。3翻譯水平(點雜交)檢測外源質粒在真核細胞中的表達由于細胞因子蛋白帶有信號肽，可以分泌到細胞外，在細胞培養上清液中濃度較高，因此收集轉染后培養48小時的A549細胞上清液(含WL-2蛋白)，冷凍濃縮干燥后作為樣品，用于點雜交實驗檢測hlL-2蛋白在A549細胞中的表達情況，結果見圖9。由該圖可以看出轉染了pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2和pIRES-hlL-2的A549細胞培養上清液點雜交結果均為陽性，說明pIRES-PML-RARa(384bp)-WL-2和pIRES-hlL-2重組質粒能夠在A549細胞中表達hlL-2蛋白，并且該蛋白能夠與ML-2抗體發生特異結合。4取轉染后的A549細胞裂解液(含PML-RARa蛋白)通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測PML-RARa蛋白表達情況(考馬斯亮蘭染色)。5ELISA按說明書要求配好ELISA試劑盒各種試劑，配制的標準品濃度分別為500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8、3.9、0pg/mL。分別將標本和不同濃度標準品(100uL/孔)加入相應反應孔中，用封板膠封住反應孔，37t:孵育90分鐘。洗板4次。除空白孔外，加入生物素化抗體工作液(100uL/孔)，用封板膠封住反應孔，37"C孵育60分鐘。洗板4次。除空白孔外，加入酶結合物工作液(100uL/孔)，用封板膠封住反應孔，37。C孵育30分鐘。洗板4次。加入顯色劑(100uL/孔)，避光37。C孵育1520分鐘。加入終止液(100uL/孔)，混勻后立刻測量OD45o值。加入轉染了pIRES-PML-RARa(384)-hIL-2的A549細胞上清液(標本2)和轉染了pIRES-hlL-2的A549細胞上清液(標本3)的孔在加入顯色劑孵育15分鐘后呈現出明顯的肉眼可見的藍色，說明這兩種上清液中含有重組質粒表達的hlL-2;其余標本孔均未出現顯色反應，說明這些標本中不含有hlL-2，這與預期結果是一致的，說明重組質粒已經成功的轉染了A549細胞，并且能夠在細胞中正常地表達目的蛋白。以僅加入顯色劑和終止液的孔作為空白孔，根據標準品OD^值繪制的ML-2標準曲線，由該曲線可以査出標本2和標本3中ML-2的濃度分別約為130pg/ml和60pg/ml。ELISA實驗照相結果見圖10。表lIL-2檢測標準品及i際本的OD^值標準品濃度(pg/ml)OD45。值標本編號OD45。值500.002.26910.101250.001.54920.887125.000.82030.32862.500.37940.08931.250.18350.07315.630.0897.800.0523.900.047其中，標本l:轉染了pIRES-PML-RARa(384bp)的A549細胞上清液;標本2:轉染了pIRES-PML-RARa(384bp)-hIL-2的A549細胞上清液；標本3:轉染了pIRES-ML-2的A549細胞上清液；標本4:轉染了pIRES的A549細胞上清液；標本5:未轉染任何質粒的A549細胞上清液。實施例3研究小鼠體內注射免疫急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗(pIRES-PML-RARa(384bp)-ML-2重組質粒)后不同時期的基因和蛋白表達、抗體產生和特異性CTL效應等30只68周的健康純系雄性BALB/c小鼠隨機均分為5組(每組6只)，各小鼠分別于第l周、2周、4周各免疫1次，共3次。A組每次于雙側股四頭肌肌內分別注射pIRES200嗎；B組每次于雙側股四頭肌肌內分別注射PML-RARa-pIRES200嗎；C組每次于雙側股四頭肌肌內分別注射PML-RARa-hIL-2-pIRES200嗎；D組每次于雙側股四頭肌肌內分別注射WL-2-plRES200嗎；E組每次于雙惻股四頭肌肌內分別注射生理鹽水200嗎。于2次免疫和末次免疫接種后第7d將每組小鼠隨機選3只處死，分離出脛前肌。用反轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)及免疫組織化學染色法檢測目的基因在小鼠骨骼肌中的轉錄和表達；ELISA法檢測小鼠血清中INF-y含量；LDH釋放法檢測小鼠脾細胞特異性CTL活性。結果(1)在小鼠注射部位肌肉組織的常規石蠟切片(HE染色)可見在各組肌肉間隙中發現有不同程度的淋巴細胞浸潤，呈散在或不連續性的簇狀分布(圖11)。小鼠肌肉組織提取的RNA中可檢測(RT-PCR和實時定量PCR)到PML-RARa基因及hIL-2基因的表達。(2)利用間接免疫熒光法檢測小鼠血清中抗PML-RARa蛋白的抗體(熒光顯微鏡和流式細胞儀檢測標記NB4細胞)結果發現在初次免疫后7周四組小鼠血清中存在特異性抗體，而對照組為陰性(圖8)。(3)在初次免疫小鼠第7周時，疫苗免疫組小鼠脾細胞(體外培養7天后)，效應細胞靶細胞為10:1，經LDH檢測顯示其對NB4細胞具有特異性細胞毒性作用，對NB4細胞的殺傷率明顯高明顯高于Molt4細胞對照組(圖12)。上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護范圍之內。SEQUENCELISTING<110>暨南大學<120>急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARa384-hlL-2及其制備方法和應用<130>38<160>2<170>Patentlnversion3.2<210>1<211>384<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>PML-RARa基因<400>1caagctagcagcatggtctccaatacaacgacagcccagaagaggaagtgcagccagacc60cagtgccccaggaaggtcatcaagatggagtctgaggaggggaaggaggcaaggttggct120cggagctccccggagcagcccaggcccagcacctccadggcagtctcaccaccccacctg180gatggaccgcctagccccaggagccccgtcataggaagtgaggtcttcctgcccaacagc240aaccacgtggccagtggcgcc路ggaggcagccattgagacccagagcagcagttctgaa300gagatagtgcccagccctccctcgccaccccctctaccccgcatctacaagecttgcttt360沐tgtcaggactgaacgcgtogc384<210>2<211>487<212>DNA<213>Artificialsequence<220><223>ML-2基因<400>2ggcacgtcgacacaatgtacaggatgcaactcctgtcttgcattgcactaagtcttgcac60ttgtcacaaacagtgcacctacttcaagttctacaaagaaaacacagctacaactggagc120atttactgctggatttacatgagaatggaattaataattacaagaatcccaaac180tcaccaggatgctcacatttaagttttacatgcccaagaaggccacagaactgaaacatc240ttcagtgtctagaagaagaactcaaacctctggaggaagtgctaaatttagctcaaagca300aaaactttcacttaagacccagggacttaatcagcaatatcaacgtaatagttctggaac360taaagggatctgaaacaacattcatgtaatatgctgatgagacagcaaccattgtag420aatttctgaacagatggattaccgtcaaagcatcatctcaacactgacttgagcgg480ccgcata48權利要求1、一種急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2，其特征在于，所述DNA疫苗由pIRES質粒、PML-RARα基因和hIL-2F基因組成，所述PML-RARα基因序列如下CAAAGCGTCTCCAATACAACGACAGCCCAGAAGAGGAAGTGCAGCCAGACCCAGTGCCCCAGGAAGGTCATCAAGATGGAGTCTGAGGAGGGGAAGGAGGCAAGGTTGGCTCGGAGCTCCCCGGAGCAGCCCAGGCCCAGCACCTCCAAGGCAGTCTCACCACCCCACCTGGATGGACCGCCTAGCCCCAGGAGCCCCGTCATAGGAAGTGAGGTCTTCCTGCCCAACAGCAACCACGTGGCCAGTGGCGCCGGGGAGGCAGCCATTGAGACCCAGAGCAGCAGTTCTGAAGAGATAGTGCCCAGCCCTCCCTCGCCACCCCCTCTACCCCGCATCTACAAGCCTTGCTTTGTCTGTCAGGACCGC；所述hIL-2基因序列如下GGCACACATACAGGATGCAACTCCTGTCTTGCATTGCACTAAGTCTTGCACTTGTCACAAACAGTGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTATA。2、權利要求1所述的一種急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARa384-ML-2的制備方法，其特征在于包括如下步驟(1)首先提取NB4細胞的RNA通過逆轉錄合成cDNA，然后利用引物PP3和PP4通過PCR擴增出PML-RARa基因；擴增的PCR產物標記為PML-RARa，其大小為384bp;將擴增的基因PML-RARa利用T4DNA連接酶與pIRES質粒進行連接，插入到pIRES質粒的多克隆位點A中構建出pIRES-PML-RARa;所述的PP3:5，CAAlGC7M^gAGCATGGTCTCCAATACAACGA3，，其中，方框內GCTAGC為I酶切位點；所述的PP4:5，GCGUCGCG7tTCAGTCCTGACAGACAAAG3,，其中方框內ACGCGT為MwI酶切位點；(2)然后通過PCR從Jurkat細胞的cDNA中擴增出hlL-2基因用引物PB、PI4和PI1、PI2進行巢式PCR，擴增hlL-2基因，擴增的PCR產物大小為487bp;所述的PI1:5，GGCAC|G7ra4C|ACAATGTACAGGATGCAACTCC3';方框內GTCGAC為酶切位點；所述的PI2:5，TAIJGCGGa:GCtrCAAGTCAGTGTTGAGATGATG3，；方框內GCGGCCGC為酶切位點；所述的PI3:5，TTGTTCAAGAGTTCCCTATC3';所述的PI4:5，TGAAACCATTTTAGAGCC3，；(3)將上述擴增得到的hlL-2基因利用T4DNA連接酶與pIRES質粒進行連接，插入到pIRES-PML-RARa的多克隆位點B中，經過測序正確后，構建了pIRES-PML-RARa-WL-2重組質粒即DNA疫苗PML-RARa384-hIL-2。3、根據權利要求2所述的一種急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARa384-hlL-2的制備方法，其特征在于所述步驟(1)擴增反應條件為預變性94。Clmin，退火60°Clmin;延伸72°Clmin，共進行40個循環；首次預變性為94°C3min，末次延伸為72°C10min。4、根據權利要求2所述的一種急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARd384-hIL-2的制備方法，其特征在于所述步驟(2)擴增反應條件為首先94。C預變性3min，然后94°C1min，56°C1min，72°C1min循環30次，te后72。C總延伸6min。5、權利要求1所述的急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARa384-tlIL-2在制備治療急性早幼粒細胞白血病的藥物中的應用。全文摘要本發明公開了一種急性早幼粒細胞白血病DNA疫苗PML-RARα384-hIL-2，即融合基因pIRES-PML-RARα-hIL-2。本發明還公開了上述DNA疫苗可應用于制備治療急性早幼粒細胞白血病的藥物。本發明利用PML-RARα融合基因構建DNA疫苗用于根除APL的MRD，本發明提供了一個可以誘導產生特異性抗APL免疫效應的PML-RARα-hIL-2雙基因DNA疫苗，為治療APL的DNA疫苗的研發提供重要的數據和資料。本發明方法還可以為其他治療性腫瘤DNA疫苗的研究所借鑒。本發明的DNA疫苗能清除APL患者體內的微小殘留病變，最終達到治愈APL的目的。文檔編號A61K48/00GK101224307SQ20071003281公開日2008年7月23日申請日期2007年12月26日優先權日2007年12月26日發明者周羽竝,岑東芝,李揚秋,楊力建,剛胡,陳少華申請人:暨南大學