抗pml蛋白核定位信號抗體的制備及其在apl診斷中的應用的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種抗PML蛋白核定位信號（NLS）抗體的制備及其在APL診斷中的應用。該抗體以SEQ?ID?NO：1所示的氨基酸序列，即NLS多肽作為免疫原制備得到。該抗體可用于區分PML蛋白和缺失核定位信號的PML蛋白，以及應用于急性早幼粒細胞白血病診斷劑的制備中。另外，本發明還提供一種PML蛋白的定位方法。由此，為進一步研究PML在基因轉錄層面誘導細胞凋亡從而抑制腫瘤生長奠定了基礎；同時，區別檢測了野生型PML蛋白和PML(NLS-)蛋白，為APL臨床診斷以及深入研究APL的發病機制，提供了新的依據。
【專利說明】抗PML蛋白核定位信號抗體的制備及其在APL診斷中的應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫藥【技術領域】，特別涉及一種抗PML蛋白核定位信號(NLS)抗體的制備及其在APL診斷中的應用。
【背景技術】
[0002]急性早幼粒細胞白血病(APL)的發生與染色體易位密切相關，95%以上的APL為特征性的染色體t(15，17)易位，形成并表達PML-RARa融合蛋白。研究發現，PML-RARa融合蛋白可以被中性白細胞彈性蛋白酶(Neutrophil Elastase，NE)切割成約52KDa和61KDa大小的兩種變異蛋白。由于NE酶的這一特異性的切割作用，產生了一種缺失核定位信號(nuclear localizat1n signal, NLS)的突變型PML蛋白即PML(NLS-)蛋白和帶上核定位信號的NLS-RARa蛋白。
[0003]PML蛋白作為一種腫瘤生長抑制因子，對不同組織起源腫瘤的發生發展具有一定抑制作用，PML基因的失活能夠明顯促進白血病的發生，同時PML蛋白參與多條凋亡途徑以及DNA損傷修復。由于PML參 與形成PML-RAR α融合蛋白在APL的發生發展中扮演著重要的角色，對PML與腫瘤形成方面的研究越來越激烈。在正常細胞中，PML蛋白主要分布于細胞核內呈斑點狀，屬于核體(nuclear bodies, NBs)亞核區域的成分。只有個別PML蛋白如PMLVI b、PML Vll b，因缺乏NLS而定位于胞漿。PML蛋白具有內在的抗病毒活性，具有抑制腫瘤的生長、參與造血祖細胞分化、調芐基因轉錄、誘導細胞凋亡等多種生物學功能，所有這些功能的發揮與PML蛋白NBs內定位息息相關。而PML蛋白定位于NBs有賴于其自身的NLS序列，通過NLS介導PML蛋白入核，從而參與NBs的形成發揮其正常生物學功能。
[0004]所有PML蛋白的亞型均含有相同N-末端區域，即RBCC (ring finger, B-box,coiled-coil domain,總稱RBCC)結構域，PML(NLS-)蛋白也含有RBCC結構域。目前，國際上普遍采用合成PML蛋白N-末端或者RBCC結構域部分多肽作為免疫原，免疫家兔或小鼠來制備特異性抗體，這樣獲得的抗體不僅能特異性檢測野生型PML蛋白，同時也能檢測PML(NLS-)蛋白，不能對二者進行區分。
[0005]因此，選擇合適的特異性序列多肽作為免疫原，制備能有效區分野生型PML蛋白與PML(NLS-)蛋白的抗體異常重要，可為APL臨床診斷提供新的依據。
【發明內容】
[0006]有鑒于此，本發明提供一種能有效區分野生型PML蛋白與PML (NLS-)蛋白的抗體。
[0007]為實現上述目的，發明人經反復研究，創造性的發現以SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，即NLS多肽作為免疫原可制備得到抗PML蛋白核定位信號抗體，能區分野生型PML蛋白與PML(NLS-)蛋白。具體地，本發明要求保護:
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作為免疫原在制備抗PML蛋白核定位信號抗體中的應用。
[0008]SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列與KLH的偶聯復合體作為免疫原在制備抗PML蛋白核定位信號抗體中的應用。
[0009]上述制備得到的抗體在區分PML蛋白(野生型PML蛋白)和缺失核定位信號的PML蛋白(PML(NLS-)蛋白)中的應用。
[0010]一種PML蛋白特異性抗體，所述抗體為抗PML蛋白核定位信號抗體，由SEQ ID NO:I所示的氨基酸序列作為免疫原制備得到。
[0011]本發明還提供一種PML蛋白特異性抗體的制備方法，該抗體可區分野生型PML蛋白與PML (NLS-)蛋白，可廣泛用于APL研究和臨床診斷中。
[0012]為實現上述目的，本發明的技術方案為:
一種PML蛋白特異性抗體的制備方法，包括以下步驟:
(O制備多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(2)制備多肽偶聯復合體:采用戊二醛連接法，將純化后的多肽與KLH交聯；
(3 )制備抗體血清:以多肽偶聯復合體作抗原，免疫家兔或小鼠制備抗體血清，分離，即得PML蛋白特異性抗體。
[0013]進一步，所述步 驟(3 )的免疫由首次免疫和加強免疫組成，首次免疫輔助采用完全福式佐劑，加強免疫輔助采用不完全福式佐劑。
[0014]上述制備的PML蛋白特異性抗體可應用于急性早幼粒細胞白血病診斷劑的制備中。
[0015]此外，本發明還提供一種PML蛋白的定位方法，該方法可定位PML蛋白的胞內位置，為PML蛋白的相關研究開辟新的途徑。
[0016]為實現上述目的，本發明的技術方案為:
一種PML蛋白的定位方法，包括以下步驟:
(O制備多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
(2)制備多肽偶聯復合體:采用戊二醛連接法，將純化后的多肽與KLH交聯；
(3 )制備抗體血清:以多肽偶聯復合體作抗原，免疫家兔或小鼠制備抗體血清，分離，即得PML蛋白特異性抗體；
(4 ) PML蛋白定位:用上述制備的抗體血清，采用間接免疫熒光檢測PML蛋白在胞內定位。
[0017]進一步，所述步驟(4)中，間接免疫熒光檢測包括以下步驟:取靶細胞，轉染前12h，將細胞按1x10 5/孔鋪于24孔板中，轉染48h后，棄去培養基，用PBS洗三次，用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS漂洗三次，再用0.1% Triton透膜處理1min ;然后，用10%山羊血清室溫封閉30min，加上抗體血清，4 °C過夜，PBS洗3次，加羅丹明標記的山羊抗鼠熒光二抗，37°C孵育Ih ;再PBS洗3次，加入核染色液DAPI 5 min, PBS漂洗3次，用70%甘油封固，熒光顯微鏡下觀察拍照。
[0018]進一步，所述抗體血清和山羊抗鼠熒光二抗均為1:200倍體積稀釋。
[0019]本發明的有益技術效果是:
本發明通過分析PML蛋白NLS序列免疫原性，合成NLS多肽，以此多肽作為免疫原，制備了抗PML蛋白抗體，為進一步研究PML在基因轉錄層面誘導細胞凋亡從而抑制腫瘤生長奠定了基礎；同時，區別檢測了野生型PML蛋白和PML(NLS-)蛋白，為APL臨床診斷以及深入研究APL的發病機制，提供了新的依據。【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為NLS-RARa在宿主菌BL21中表達的檢測結果；
圖2為ELISA檢測抗體效價(初次免疫)結果；
圖3為ELISA檢測抗體效價(加強免疫)結果；
圖4為Western blot驗證抗體特異性結果；
圖5為間接免疫熒光驗證抗體特異性——過表達PML蛋白免疫熒光結果；
圖6為間接免疫熒光驗證抗體特異性——正常人與M3型病人中性粒細胞免疫熒光結
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【具體實施方式】
[0021]以下參照附圖對本發明的優選實施例進行詳細描述。優選實施例中未注明具體條件的實驗方法，按照常規條件進行。
[0022]材料 1.1質粒、菌株和動物
E.coli BL21菌由重慶醫科大學臨床診斷實驗室保存。
[0023]原核表達質粒PET-His-NLS-RARa 的構建:以 PCMV-HA-NLS-RARa 質粒為模板，分別以 Dl:5’ -TTA GGATCC ACAGTCAGTGCCCGGGC-3’ p2:5? -GCC AAGCTTTCACGGGGAGTGGGTGGC-3 ’為上下游引物，PCR擴增NLS-RAR α基因并在其兩端分別弓丨入BamH和Hind酶切位點(下劃線部分)，將其插入原核表達載體pET-his中，構建原核表達質粒pET-his-NLS-RARa，經酶切和測序驗證其構建正確。真核表達質粒PCMV-HA-PML的構建參照文獻《人聯苯樣水解酶(BPHL)在急性早幼粒細胞白血病發生中的分子機制研究》(初晨，重慶醫科大學碩士學位論文，2012年5月)。PCMV-HA-PML(NLS-)的構建參照文獻《RANBP9在急性早幼粒細胞白血病發生中的作用研究》(黎亮，重慶醫科大學碩士學位論文，2012年5月)。PCMV-HA-NLS-RARa的構建參照文獻《帶核定位信號的維甲酸受體與Ubiquilinl蛋白相互作用的驗證》(朱丹等，中南大學學報(醫學版)，2010年07期)。
[0024]清潔級健康雄性BLAB/ c小鼠,6~8周齡,體重18~22 g,購自重慶醫科大學實驗動物中心。
[0025]1.2主要試劑
匙孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin, KLH)和牛血清白蛋白(albumin bovineserum albumin, BSA)完全福氏佐劑及不完全福氏佐劑、辣根酶標記山羊抗大鼠IgG均購自北京鼎國生物公司；N1-NTA spin kits蛋白純化試劑盒購自Qiagen公司。蛋白Marker購自美國Fermentas公司；紅細胞裂解液、人外周血中性粒細胞分離液購自天津灝洋生物；RIPA細胞裂解液、核染料DAPI，均購自碧云天生物技術研究所；HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠的IgG、異硫氰酸熒光素(FITC)和標記的羊抗兔IgG和羅丹明(TRITC)標記的羊抗鼠IgG均購自北京中山金橋生物技術有限公司。其它所用的試驗材料，如無特殊說明，均為市售購買產品。
[0026]1.3標本來源
急性早幼粒細胞白血病病人血(初診)及正常人血皆由重慶醫科大學附屬第一醫院提供，病人為18-35歲女性。正常人血來源于24歲男性。
[0027]實驗步驟及結果
2.1原核表達NLS-RARa蛋白制備
蛋白的誘導表達與純化:將原核表達質粒PET-His-NLS-RAR α轉化宿主菌BL21 (DE3)，誘導溫度為37°C，誘導時間4 h，IPTG I mmol/L，超聲裂解，離心后分別取沉淀和上清電泳。純化時采用鎳柱親和層析法進行非變性條件下純化:溶菌酶+超聲裂解法裂解細菌，Smmol /I,咪唑濃度掛柱純化，10mmol /I,和 20mmol/L 洗漆，250mmol/L 和 300mmo1 /I,洗脫。
[0028]Western blot鑒定蛋白:200 ng/孔純化蛋白，12.5%的分離膠SDS-PAGE電泳，電泳后轉至PVDF膜，封閉液封閉I h (5%脫脂奶粉的TBST液)，Ant1-His抗體按1:1 000稀釋4 1:孵育過夜，二抗山羊鼠IgG按1:2000稀釋，室溫孵育I h，最后應用ECL化學發光法顯色。
[0029]檢測及結果:米用I?春紅膜染色和Western blot對外源蛋白NLS-RARa進行檢測，在37 °C誘導條件下，轉化PET-Hi s-NLS-RAR α質粒的菌株內檢測到有外源蛋白NLS-RARα的表達,蛋白分子量大小61KDa,與預期分子量大小相符，而未經誘導組則檢測不到相應蛋白的表達。檢測結果見圖1，圖中代號為:A:麗春紅染色；B:ffestern blot ；M:蛋白marker ；1:未誘導上清；2:未誘導沉淀；3:誘導組上清；4:誘導組沉淀；5:陰性對照組；6:陽性對照組。 [0030]2.2 NLS序列分析及免疫原的制備
NLS多肽制備:從Gene Bank中獲取PML蛋白全長560個氨基酸，其中NLS序列位于476到490之間，其序列為CKRKCSQTQCPRKVIK。采用Fmoc固相合成法，在AB1-431A多肽合成儀上進行合成，使用HPLC進行純化。
[0031]分析:采用DNAstar軟件對NLS序列進行分析,其中易形成二硫鍵,因此合成兩條多肽，多肽信息見表1。
[0032]表1合成NLS多肽信息
【權利要求】
1.一種PML蛋白特異性抗體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟: (O制備多肽:合成SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列； (2)制備多肽偶聯復合體:采用戊二醛連接法，將純化后的多肽與KLH交聯； (3 )制備抗體血清:以多肽偶聯復合體作抗原，免疫家兔或小鼠制備抗體血清，分離，即得PML蛋白特異性抗體。
2.根據權利要求1所述的PML蛋白特異性抗體的制備方法，其特征在于:所述步驟(3)的免疫由首次免疫和加強免疫組成，首次免疫輔助采用完全福式佐劑，加強免疫輔助采用不完全福式佐劑。
3.權利要求1或2制備的PML蛋白特異性抗體在制備急性早幼粒細胞白血病診斷劑中的應用。
4.一種PML蛋白的定位方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)制備多肽:合成SEQID NO:1所示的氨基酸序列； (2)制備多肽偶聯復合體:采用戊二醛連接法，將純化后的多肽與KLH交聯； (3 )制備抗體血清:以多肽偶聯復合體作抗原，免疫家兔或小鼠制備抗體血清，分離，即得PML蛋白特異性抗體； (4 ) PML蛋白定位:用上述制備的抗體血清，采用間接免疫熒光檢測PML蛋白在胞內定位。
5.根據權利要求4所述的PML蛋白的定位方法，其特征在于，所述步驟(4)中，間接免疫熒光檢測包括以下步驟:取靶細胞，轉染前12h，將細胞按MO 5/孔鋪于24孔板中，轉染48h后，棄去培養基，用PBS洗三次，用4%的多聚甲醛固定20 min后，PBS漂洗三次，再用0.1% Triton透膜處理10 min ;然后，用10%山羊血清室溫封閉30min，加上抗體血清，4°C過夜，PBS洗3次，加羅丹明標記的山羊抗鼠熒光二抗，37°C孵育Ih ;再PBS洗3次，加入核染色液DAPI 5 min, PBS漂洗3次，用70%甘油封固，熒光顯微鏡下觀察拍照。
6.根據權利要求5所述的PML蛋白的定位方法，其特征在于:所述抗體血清和山羊抗鼠熒光二抗均為1:200倍體積稀釋。
7.SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作為免疫原在制備抗PML蛋白核定位信號抗體中的應用。
8.SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列與KLH的偶聯復合體作為免疫原在制備抗PML蛋白核定位信號抗體中的應用。
9.權利要求7或8所述的抗體在區分PML蛋白和缺失核定位信號的PML蛋白中的應用。
10.一種PML蛋白特異性抗體，其特征在于:所述抗體為抗PML蛋白核定位信號抗體，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列作為免疫原制備得到。
【文檔編號】G01N33/574GK104031149SQ201410267344
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月16日 優先權日:2014年6月16日
【發明者】劉北忠, 陽小群, 蔣開玲, 鐘梁 申請人:重慶醫科大學附屬永川醫院