燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用的制作方法

專利名稱：：燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及燈盞花甲醇提取物應用
技術領域：
，更具體地說，是涉及燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用。
背景技術：
：人的膚色是由皮膚內的黑色素密度和分步來決定的，同時又受環境或生理因素的影響，比如太陽光中的紫外線、疲勞、壓力和遺傳因素。現有化妝品中廣為使用的美白方式，其美白機理主要有兩種一種是黑色素還原機理，如以維生素C美白，但美白效果不是很明顯；另一種重要的機理是通過抑制酪氨酸酶活性而達到美白效果，如以氫醌、曲酸、桑葚提取物及熊果苷(arbutin，氫醌的天然形式)等美白。但以熊果苷、曲酸等化學物祛斑美白的臨床效果不是特別明顯。近些年研究發現，一些傳統的增白祛斑褪色劑，如對苯二酚、皮質類固醇、汞的化合物等，可能會引起一系列健康問題，如不可逆的皮膚損害、黃褐斑等，因而也被禁止使用。可以說目前只有氫醌可用于皮膚的美白，但研究發現其可表現出諸如使黑素退化或致突變、細胞功能破壞等副作用，因此目前在一些國家氫醌被禁止在化妝品中使用。此外，一種氫醌的糖衍生物熊果苷已被開發成美白商品，但認為其增白效果很小，而抗壞血酸、曲酸等雖活性較高，但穩定性較差，以致使其應用范圍受到限制。黑色素代謝的一般過程是，黑素細胞中酪氨酸在酪氨酸酶的作用下轉化為多巴、多巴醌和多巴色素等，最終轉變為色素顆粒，并從黑素細胞分泌到鄰近的角質形成細胞中去，體現出皮膚的顏色。部分色素沉著性皮膚病，如黃褐斑、雀斑等，就是由于過量水平的黑色素在表皮沉積形成。酪氨酸酶(tyrosinase,TYR)，分類號為EC1.14.18.1和EC1.10.3.l是一種含銅的酶，兼有加氧酶和氧化酶雙重功能，為黑色素合成的限速酶，其表達和活性決定黑素合成的速度和產量。在黑素生成過程中，酪氨酸酶有3個特征性的催化活性，即酪氨酸羥化酶活性、多巴氧化酶活性和5，6—二羥基吲哚氧化酶活性，分別催化酪氨酸羥化為多巴(Dopa)，多巴(Dopa)氧化為多巴醌(DQ)和5，6—二羥基B引哚(DHI)氧化為5,6—吲哚醌(IQ)。這些反應導致所在部位的黑色素沉著，如黑斑、雀斑和痣。因此，可以選擇應用酪氨酸酶抑制劑，通過抑制酪氨酸酶的活性，阻斷黑色素的合成反應鏈，減少其在皮膚內的生成從而達到祛斑增白的效果。大部分的酪氨酸酶抑制劑是酚類或鄰苯二酚的衍生物，其結構類似于酪氨酸或多巴，作為一種錯配底物，從而抑制酶的活性。酪氨酸酶抑制劑在醫藥和化妝品行業正越來越受關注，它可以通過抑制酶的氧化而防治黑色素沉著。已報道了很多天然產物來源的酪氨酸酶抑制劑，大部分含有酚類結構或能夠螯合酪氨酸酶的銅離子。但這些酪氨酸酶抑制劑都有這樣那樣的缺點，如活性低、毒性高，穿透能力弱等。其他一些活性較強的化學物，如曲酸和熊果苷，還沒有被證實具有臨床效果；氫醌，一種廣泛應用的祛斑美白藥物，研究發現對黑色素細胞具有細胞毒性，是潛在的有絲分裂物。克服這些缺點的一個可能的方向是應用從天然物中提取的混合物，利用混合物中的各種成分的不同作用機制以抑制酪氨酸酶和過氧化物酶等，以聯合的方式起到抑制黑色素生成的作用。因此，從天然產物中提取化合物已成為化妝品的研究熱點，以滿足人們對祛斑美白產品的巨大需求。
發明內容針對現有技術的美白祛斑活性成分存在的不足，本發明的目的旨在提供一種更為有效與安全的美白祛斑活性成分一燈盞花甲醇提取物，以制備皮膚美白或祛斑化妝品、抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的藥物組合物和抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的食品。為了解決本發明所要解決的上述技術問題，本發明的發明者進行了深入研究和反復實驗，發現燈盞花甲醇提取物具有抑制酪氨酸酶活性和黑素生成的作用，從而完成了本發明。燈盞花，又名燈盞細辛，為菊科植物短葶飛蓬(ErigeronBreviscapus(Vant.)Hand—Mass)的全草，是主要產于中國西南地區的一種中草藥，具有祛風除濕、活血化瘀、消炎止痛等功效，臨床上用于治療血栓形成等多種心腦血管疾病。但至今為止，還沒有發現任何有關燈盞花甲醇提取物具有皮膚美白功效的報道。本發明所述的燈盞花甲醇提取物具有抑制酪氨酸酶活性和黑素生成作用，因此，本發明的燈盞花甲醇提取物可用于與皮膚美白祛斑有關癥狀的預防和治療，具體來說，可用于制備皮膚美白或/和祛斑化妝品、制備抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的醫藥品，以及制備抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的食品等。就燈盞花而言，其作為原料使用的部位不受特殊限制，可以是莖、葉、花、果實等，而且可以釆集后立即提取，也可以干燥后再提取，優選將莖干燥后提取。作為本發明中燈盞花的甲醇提取法，不受特殊限制，通過使溶劑與燈盞花接觸來實施。提取可以在常溫下進行，也可以在加溫下進行。提取溫度不受特殊限制，操作上優選小于或等于溶劑的沸點，提取所需時間根據溫度條件、提取方法的不同而不同，通常大于等于l小時。本發明的提取物可制成經口用(內服)和非經口用(外用)的兩種制品形式。經口用時，可把本發明提取物配成醫藥品或食品等形式。非經口用時，可配成化妝品、醫藥外用品、皮膚外用劑等形式。本發明用途之一的化妝品可以是包括軟膏劑、溶液、乳霜、乳液、化妝水、洗劑、凝膠、美容液、粉底霜、填塞物、面膜、口紅、粘粘劑、淋浴液等各種皮膚外用劑在內的任何一種形式的化妝品。本發明的提取物可以制備成目前流通的任何一種化妝品劑型。例如能制成溶液、懸浮劑、乳化劑、膏狀、凝膠、奶液、粉、香皂、含表面活性劑的清潔劑、油、干粉、粉底乳液、濕粉、噴劑等各種劑型。本發明的用途之二的醫藥品，可制成任何給藥方式的醫藥制品，為各種醫藥制劑形式。醫藥品制劑包括溶液劑、糖漿劑、注射劑、吸入劑、乳劑等液體制劑和片劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、吸入劑等固體劑，以及軟膏皮膚外用劑和栓劑等外用制劑。本發明的用途之三的食品是指保健食品，包括餅干點心、飲料、蔬菜或果品加工品、畜肉制品和調味品等。其形式有粉末、固形制品、溶液等。根據其目的和制品形式，可適當調整食品中燈盞花甲醇提取物的配比量。在不影響本發明效果的條件下，以本發明的燈盞花甲醇提取物制備的化妝品、醫藥品、食品等制品中，還可添加燈盞花甲醇提取物之外的常用于化妝品、醫藥品和食品的其他成分。對于化妝品，可添加油性成分、粉末、表面活性劑、保濕劑、增粘劑、低級醇、皮膜劑、多價鰲合劑、有機胺、pH調節劑、藥效成分、糖類、防腐劑、維生素類、其他美白劑、防氧化劑、香料和水等。所述油性成分包括液體石蠟、大顆粒蠟、三十碳烷基等碳氫化合物；硬脂酸等高級脂肪酸類；十六烷醇、硬脂醇等高級醇；辛酸三甘油酯、十四烷酸異丙醇、蘋果酸二異硬脂酸酯、二一2—庚基十一垸酸甘油酮、三一2—乙基己酸三羥甲基丙烷等。根據化妝品的性狀和劑型，可適當選擇調整化妝品中的油性成分含有量。所述粉末成分包括滑石粉、云母、高嶺土、二氧化硅、氧化鋅、云母鈦、氧化鈦、氧化鐵、尼龍粉末等。所述表面活性劑包括聚氧乙烯垸基醚、聚氧乙烯脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯硬化蓖麻油、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯等非離子表面活性劑；十六烷酸鈉等陰離子表面活性劑；氧化硬脂酸三甲基銨等陽離子表面活性劑；磺基三甲銨乙內酯型兩性表面活性劑。所述保濕劑包括甘油、1，3—丁二醇、聚乙二醇等。所述增粘劑包括羧基乙烯基聚合物、羧甲基纖維素、聚乙烯醇等水溶性高分子，膨潤土等粘土礦物。所述多價螯合劑包括EDTA.4Na、檸檬酸等。低級醇包括乙醇等。所述有機胺類包括乙醇胺和三乙醇胺等。所述pH調節劑包括；乳酸一乳酸鈉、檸檬酸一檸檬酸鈉等緩沖液。所述藥效成分包括；泛酸醇乙醚和甘草酸鹽等。所述糖類包括蔗糖、葡萄糖、果糖、透明質酸等。所述防腐劑包括氨基乙基苯酸、對氨基丁基苯酸、安息香酸鈉等。所述維生素類包括維生素B類、維生素C及其衍生物、維生素E及其衍生物。所述美白劑包括抗壞血酸及其衍生物、曲酸及其衍生物、甘草提取物、氛醌衍生物、谷胱甘肽等。所述防氧化劑包括生育酚類、二丁基羥基甲苯、沒食子酸丙酯等。對于醫藥品，可添加賦形劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、吸收促進劑、pH調節劑、表面活性劑、稀釋劑、載體等添加成分。這些添加成分可以是淀粉、乳糖等糖類；硫酸鎂、滑石粉、明膠、羥丙基纖維素等纖維素衍生物；大豆油、芝麻油、動物油或合成油等油類；橡膠；生理鹽水等水分；乙醇、1，3—丁二醇、聚二烯醇等醇類。另外，還可在上述配制化妝品的成分中選擇添加成分。對于食品，可添加甜味劑、酸味劑、保存劑、香料、著色劑、賦形劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、吸收促進劑、pH調節劑、表面活性劑、稀釋劑、載體等添加成分。這些添加成分包括蘑菇提取液、人參提取液、生姜提取液、蜂蜜等各種食品提取液、液狀食品。作為糖類可以是環狀低聚糖、還原麥芽糖、海藻糖、乳糖、蔗糖脂肪酸酯等糖類。另外，還可在上述配制化妝品和醫藥品的成分中選擇添加成分。燈盞花甲醇提取物臨床上被批準用于治療腦血栓形成的多種心腦血管疾病已有多年，已證明安全無毒。本發明的發明人在研究中發現并通過實驗證明燈盞花甲醇提取物能有效地抑制酪氨酸酶活性和黑素生成，即有效地抑制皮膚的色素沉積，藥理作用強，對皮膚沒有副作用，可美白紫外線照射后曬黑的皮膚，預防、改善和治療因日曬引發的老人斑、雀斑、紅斑等皮膚色素沉積癥狀，為燈盞花甲醇提取物發掘了一個全新的醫療用途，開拓了一個新應用領域，預示著燈盞花甲醇提取物有更好的藥用前景。作為燈盞花甲醇提取物生產原料的燈盞花，其莖、葉、花、果實等都可作為原料，而且可以采集后立即用于提取，也可以干燥后再進行提取，來源豐富，價格低廉。燈盞花甲醇提取物的提取制備工藝成熟，操作易于掌握。具體實施方式以下通過實施例對本發明作進一步說明，闡述燈盞花甲醇提取物在美白祛斑防治中的有益效果。實施例1——燈盞花甲醇提取物提取制備燈盞花甲醇提取物可通過以下方法制備干燥的燈盞花全枝莖500g,用甲醇在室溫下浸泡12小時左右，浸泡提取結束后，經過濾、減壓濃縮、干燥成粉末即為燈盞花甲醇提取物。實施例2——燈盞花甲醇提取物對純化蘑菇酪氨酸酶的抑制作用試驗方法將蘑菇酪氨酸酶(Sigma，E.C丄14.18.1)用于研究試驗例1制備的粉末燈盞花提取物的抑制活性。將酪氨酸酶溶解于1A5M的磷酸緩沖液(PH6.8)，使酶溶液的濃度為368U/ml。作為底物，在1/15M的磷酸緩沖液(PH6.8)中溶解L一3，4—二羥基苯丙氨酸(L一DOPA)，使L一DOPA濃度為5mM/ml。燈盞花甲醇提取物用蒸餾水配制成0，125,250，500，1000,2000嗎/ml5個濃度。以上溶液均為現用現配。在25。C,依次向試管中加入5mM的左旋多巴(L-DOPA)0.8ml、1/15M的PBS(PH6.8)1.2ml以及0.1ml的受試物，陰性對照組加入等量蒸餾水，37'C孵育5min，再加入368U/ml的蘑燕酪氨酸酶0.3ml，調節紫外分光光度計的波長為A475，測定反應0.5min和2min后的光吸收值，用L-DOPA的自身氧化作參比。使用曲酸作為陽性對照。實驗重復3次。根據以下公式計算酶抑制率-[(A-B)-(C-D)]/(A-B)其中A:陰性對照組2分鐘時475nm處吸光度；B:陰性對照組0.5分鐘時475nm處吸光度；C:受試物組2分鐘時475nm處吸光度；D:受試物組0.5分鐘時475nm處吸光度。實驗數據經統計后顯示125~1000pg/ml的燈盞花甲醇提取物對酪氨酸酶活性具有抑制作用，抑制率為9.49%~73.33%，且隨濃度增加，抑制作用也逐漸增加，并呈劑量依賴性(P<0.05)。表1燈盞花提取物對蘑菇酪氨酸酶的抑制作用(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>)受試物濃度(ug/ml)酶抑制率(％)陰性對照00燈盞花甲醇提取物1259.43±1.4725029.10±2.6250047.47±4.69100073.14±2.16200096.05±1.64曲酸(陽性對照)6.2520.558±3.6212.532.68±2.952550.39±2.565076.74±1.37100103.5±8.51實施例3—J燈盞花甲醇提取物對B16小鼠黑色素瘤細胞內酪氨酸酶活性的抑制作用試驗方法B16小鼠黑色素瘤細胞(四川大學衛生部移植工程與移植免疫重點實驗室提供)，將培養的細胞消化配置成單個細胞懸液后，以lxl()S/rnl細胞密度接種于6孔板，將6孔板放入C02孵箱，在37'C、5%<:02及飽和濕度條件下，培養24小時后添加含受試物的培養液2ml，72h后消化并收集細胞。用離心機以1000r/min頻率離心5min，用PBS洗2次，加入PBS制成細胞懸液。計數細胞密度后，調整細胞密度為lxlO"ml。取lml細胞懸液離心后棄去上清液，加入l%TritonX-100(用PH7.4的磷酸緩沖液S配制)lml,迅速放入-8(TC冰箱冷凍，30min后取出在37'C溶解，加入5mM的L-DOPA2ml。調節紫外分光光度計的波長為A475，測定即時反應的光吸收值；再置于37'C條件下30min后測定光吸收值。均用L-DOPA的自身氧化作為參比。以曲酸作為陽性對照。實驗重復3次。根據以下公式計算酶抑制率=[(A-B)-(C-D)]/(A-B)其中A:陰性對照組37'C孵育30分鐘后475nm處吸光度；B:陰性對照組37'C孵育前475nm處吸光度；C:受試物組37'C孵育30分鐘后475nm處吸光度；D:受試物組37'C孵育前475nm處吸光度；實驗數據經統計后顯示31.25~25(Hig/ml燈盞花甲醇提取物對活體B16細胞的酪氨酸酶的活性和細胞內黑素含量有抑制作用，酶抑制率為9.95%~80.36%,且隨著濃度的增加其對活體細胞酪氨酸酶活性的抑制作用越強，并呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。表2燈盞花甲醇提取物對B16細胞酪氨酸酶活性的影響(4s)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>實施例4一燈盞花甲醇提取物對B16小鼠黑色素瘤細胞內黑素生成的抑制作用試驗方法U)黑素標準曲線的制作用含10%DMSO的Imol/lNaOH溶液配制6個黑素(Sigma)溶液濃度，分別為0、40、80、120、160、20(Hig/ml，各濃度終體積均為3ml。將配置好的黑素系列液置于80'C水浴中30分鐘后，調節紫外分光光度計的波長為475nm,測定黑素系列液的吸光度值。以吸光度值為縱坐標，濃度為橫坐標繪制黑素標準曲線。(2)蛋白含量標準曲線的制作及細胞懸液蛋白濃度的測定按照蛋白分析試劑盒(Bio—Rad)進行。(3)B16小鼠黑色素瘤細胞將培養的細胞消化配置成單個細胞懸液后，以lxl05/ml細胞密度接種于6孔板，將6孔板放入C02孵箱，在37'C、5%C02及飽和濕度條件下，培養24小時后添加含受試物的培養液2ml，72h后消化并收集細胞。用離心機以1000r/min頻率離心5min，用PBS洗2次，加入PBS制成細胞懸液。計數細胞密度后，調整細胞密度為lxl06/ml。取上述細胞懸液lml離心去上清液，加入3ml含10%DMSO的1mol/lNaOH溶液，80。C水浴30min,測定A475。根據黑素標準曲線計算黑素含量，用蛋白含量進行校正。按公式(i)黑素含量=黑素濃度/蛋白含量、公式(ii)黑素生成抑制率=(對照黑素含量-藥物黑素含量)/對照黑素含量，求出黑素生成抑制率。實驗數據經統計后顯示31.25~25(Hig/ml燈盞花甲醇提取物對活體B16細胞的酪氨酸酶的活性和細胞內黑素含量有抑制作用，黑素生成抑制率為4.33%69.22%，且隨著濃度的增加其對活體細胞黑素生成的抑制作用越強，并呈劑量依賴性(P<0.05)。見表3。表3燈盞花甲醇提取物對B16細胞黑素含量的影響(4s)<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>實施例5—燈盞花甲醇提取物毒理學評價(第一階段和致突變評價)(1)第一階段評價試驗所用動物均由由四川省醫科院實驗動物研究所提供，合格證號:SCXK(川)2004-16號。實驗前檢疫一周，整個實驗過程中，動物飼養于屏障級動物房(許可證號四川省實驗動物管理委員會第Oll號)，動物自由攝食和飲水，動物房溫度20'C24'C，相對濕度60%~75%。a)大鼠急性經口毒性試驗采用最大限量法。設5000mg/kg—個劑量組，20只SD大鼠，雌雄各半。以lml/100g.bw于動物空腹下一次性灌胃染毒。灌胃后觀察其中毒癥狀、體征，連續觀察二周，判定毒性分類。燈盞花甲醇提取物5g/kg.bw劑量經口染毒后，兩周內未見動物死亡，亦無明顯的中毒癥狀或不良反應，結果見表4。兩周實驗結束后剖殺全部動物，內臟器官未見明顯異常改變。即燈盞花甲醇提取物對雌、雄性SD大鼠的急性經口MTD大于5g/kg.bw，屬實際無毒類。表4燈盞花甲醇提取物對SD大鼠的急性經口毒性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b)大鼠急性經皮毒性試驗采用最大限量法。設5000mg/kg—個劑量組，20只SD大鼠，雌雄各半。備皮:剪去大鼠脊柱兩側的被毛，去毛面積為4X5cm2。24h后確認無皮膚損傷，以1m1/100g.bw將該劑量組溶液滴于6層紗布上，貼敷于己去毛的皮膚上，覆蓋稱量紙，膠布固定。4h后，取下紗布，洗去殘留物，觀察其中毒癥狀、體征，連續觀察二周，判定其毒性分類。燈盞花甲醇提取物5g/kg.bw劑量經皮染毒后，兩周內未見動物死亡，亦無明顯的中毒癥狀或不良反應，結果見表5。兩周實驗結束后剖殺全部動物，內臟器官未見明顯異常改變。即燈盞花甲醇提取物對雌、雄性SD大鼠的急性經皮MTD大于5g/kg.bw，屬實際無毒類。表5燈盞花甲醇提取物對SD大鼠的急性經皮毒性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>c)皮膚刺激性試驗家兔急性皮膚刺激試驗白色家兔4只，剪去脊柱兩側的被毛，去毛面積兩側各為2x3cm2，24h后確認無皮膚損傷，將0.5mg燈盞花甲醇提取物原粉涂布在已去毛的兔背右側皮膚上，左側用蒸餾水作對照，覆蓋2層紗布和稱量紙，膠布固定。持續4h后，取下紗布，洗去殘留物，觀察去除受試物后的l、24、48及72h的皮膚刺激反應和恢復情況，計算刺激反應的平均分值，作出評價。多次皮膚刺激性試驗白色家兔4只，剪去脊柱兩側的被毛，去毛面積兩側各為2x3cm2，24h后確認無皮膚損傷，將0.5mg燈盞花甲醇提取物原粉涂布在已去毛的兔背右側皮膚上，左側用蒸餾水作對照，每天涂抹1次，連續涂抹14d。從第二天開始，每次涂抹前應剪毛，用水清除殘留受試物。一小時后觀察結果，計算刺激反應的平均分值，作出評價。燈盞花甲醇提取物對四只家兔急性皮膚刺激反應和多次皮膚刺激反應的紅斑、水腫形成評分之和的均值最高為0，見表6,7。根據評判標準，表明燈盞花甲醇提取物對家兔皮膚無刺激性。表6燈盞花甲醇提取物對家兔皮膚刺激試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表7燈盞花甲醇提取物對家兔多次皮膚刺激性試驗結果<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>d)家兔眼刺激試驗白色家兔4只，確認無眼疾病后，在一側眼結膜囊中滴入O.lmg的燈盞花甲醇提取物原粉，另一側眼作空白對照。觀察滴眼后l、24、48、72h及4、7d的眼結膜、虹膜、角膜的刺激反應和恢復情況，計算眼刺激積分指數，作出評價。燈盞花甲醇提取物對四只家兔眼睛急性刺激反應的最高刺激指數均值為0.25，見表8，24h后為0，根據評判標準，表明燈盞花甲醇提取物對家兔眼睛無刺激性。_表8燈盞花甲醇提取物對家兔眼睛刺激性試驗結果_<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>e)豚鼠皮膚致敏試驗60只成年豚鼠，隨機分為3個組，即受試物組、陰性對照組和陽性對照組。每組20只，雌雄各半。經預試，燈盞花甲醇提取物對皮膚無明顯刺激，正式試驗采用原粉。陽性藥物用2%的2,4-二硝基氯苯。試驗方法如下致敏接觸。試驗前24h剪去豚鼠背部左側的被毛，面積為3x3cm2。24h后確認無皮膚損傷，分別將涂有0.2mg的燈盞花甲醇提取物或0.2ml的2%的2，4-二硝基氯苯的濾紙貼敷于豚鼠已去毛區，封閉固定，持續6h后，去除斑貼，洗去殘留物。第7天和第14天以同樣方法各重復誘導一次。陰性對照組不經致敏誘導。激發接觸于末次致敏后15d，用上述方法在另一側己去毛皮膚進行激發接觸試驗；陰性對照組僅用受試物進行激發接觸。激發接觸后24h和48h觀察皮膚反應，進行評分,判定受試物的致敏強度。陰性對照組動物均未出現皮膚變態反應，陽性對照組豚鼠經三次誘導和一次激發后，所有動物均出現不同程度紅斑、水腫，致敏率達100%，提示本試驗系統是可靠的。而經燈盞花甲醇提取物三次誘導、二次激發試驗組動物均未出現紅斑和水腫，致敏率為0%，見表9。試驗結果表明燈盞花甲醇提取物對豚鼠皮膚屬弱致敏物。表9燈盞花甲醇提取物對豚鼠皮膚變態反應試驗結果注在皮膚反應強度欄為當皮膚反應積分為O、1、2、3...時，發生反應的動物數占受試動物數的比例(2)致突變試驗a)Ames試驗釆用經鑒定符合要求的TA97、TA98、TA100和TA102菌株,進行加與不加大鼠肝S9的標準平皿摻入法試驗(S9mix用量為0.5ml/皿)。設四個燈盞花甲醇提取物劑量組40、200、1000和5000pg/皿(準確稱取受試物1.0g，加蒸餾水至20ml得最高工作濃度50mg/ml，取該液100pl加入平皿為最高終濃度5000^g/皿。其它濃度以最高工作濃度為基礎，依次用蒸餾水5倍往下稀釋)，同時設自發對照、溶劑對照(蒸餾水100W皿)和陽性對照。不加S9試驗的陽性對照為2，4，7-TNFone(0.2pg/皿，適用菌株TA97、TA98);4-NQNO(0.5ng/皿，適用菌株TA100)、MMC(0.5pg/皿，適用菌株TA102);力[]S9試驗的陽性對照為2-AF(10.0ng/皿，適用菌株TA97、TA98、TAIOO)、1，8-二羥基蒽醌(Dan)(50.0pg/皿，適用菌株TA102)。每個試驗劑量作三個平行皿，重復試驗一次。本試驗結果表明，無論加與不加S9的試驗，自發對照組的每皿平均回變菌落數均在正常值范圍內，而陽性對照組誘發的每皿平均回變菌落數均為自發對照組二倍以上，呈明顯陽性反應。燈盞花甲醇提取物各劑量組的平均回變菌落數均未超過溶劑對照組的一倍，呈陰性反應，即燈盞花甲醇提取物無誘導試驗菌株回復突變的作用。b)體外哺乳動物細胞染色體畸變試驗以CHL細胞(中國倉鼠肺成纖維細胞系，由上海細胞生物學研究所提供)進行加與不加S9的染色體畸變試驗。用MTT法檢測燈盞花甲醇提取物對CHL細胞的半數生長抑制濃度(ICso)，得燈盞花甲醇提取物(24h)ICso為5.92mg/ml。正式試驗設5.92，2.96，1.48mg/ml三個劑量組，同時設立陰性對照(不含血清MEM培養基)和陽性對照，加S9試驗增設S9對照。不加S9試驗的陽性對照為MMC(0.5yg/ml，作用24小時)，加S9試驗的陽性對照為CP(20ug/ml，作用6小時)，陽性對照均釆用1%體積皮膚反應強度^—:i的動-物數(％)123401232000.2mg200.2mg0.2mg200.2ml0.2ml2410000048100000241000004810000024001545480010300100000010000001000000100000400203050600102565察間w觀時&發量激劑導量誘齊動物數且經性照試組性照陰対受物陽對比加至5ml的MEM培養基中。每個試驗劑量作兩個平行樣，重復試驗一次。按510X10"個/ml的密度接種細胞，24小時貼壁后進行實驗。不加S9時，每個25ml培養瓶內加入5mlMEM受試物浸提液，處理6小時或24小時。結束后，吸去含受試物的培養液，用Hanks液洗細胞3次，加入含10%新生小牛血清的培養液5ml，放回培養箱，于24h內收獲細胞；加S9時，每個25ml的培養瓶內加入4.5mlMEM受試物浸提液，0.5mlS9混合液，處理6小時或24小時后，棄培養液，用Hanks液洗細胞3次，加入含10%新生小牛血清的培養液5ml，放回培養箱，于24h內收獲細胞。于收獲前4h,加入終濃度為0.2ug/ml秋水仙堿，培養4小時后收獲細胞，低滲、固定后常規制片染色，每個劑量組油鏡下觀察分裂中期相細胞100個，記錄畸變類型，計算細胞染色體畸變率(％)。試驗結果表明，無論是培養6小時或24小時兩個時間段，加S9與不加S9，陽性對照組的染色體畸形率顯著高于空白對照組(尸O.Ol)，畸變類型以斷裂、缺失和交換為主；燈盞花甲醇提取物各劑量組和S9對照組的染色體畸形率均<5%，且與空白對照組比較均無顯著性差異(尸〉0.05),即燈盞花甲醇提取物在CHL細胞染色體畸變試驗中為陰性結果。權利要求1、燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用。2、如權利要求l所述燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用，其特征是燈盞花甲醇提取物在制備皮膚美白或/和祛斑化妝品中的應用。3、如權利要求l所述燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用，其特征是燈盞花甲醇提取物在制備抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成藥物中的應用。4、如權利要求l所述燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用，其特征是燈盞花甲醇提取物在制備抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成食品中的應用。5、如權利要求2所述的燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用，其特征是所述化妝品為軟膏劑、溶液、乳霜、乳液、化妝水、洗劑、凝膠、美容液、粉底霜、填塞物、面膜、口紅、粘粘劑和淋浴液中的一種形式。6、如權利要求2或5所述的燈盞花甲醇提取物在在皮膚美白祛斑防治中的應用，其特征在于所述化妝品中添加有油性成分、粉末、表面活性劑、保濕劑、增粘劑、低級醇、皮膜劑、多價鰲合劑、有機胺、pH調節劑、藥效成分、糖類、防腐劑、維生素類、其他美白劑、防氧化劑、香料和水中的至少一種。7、如權利要求3所述的燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用，其特征在于所述藥物中添加有賦形劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、吸收促進劑、pH調節劑、表面活性劑、稀釋劑和載體中的至少一種。8、如權利要求4所述的燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用，其特征在于所述食品中添加有可添加甜味劑、酸味劑、保存劑、香料、著色劑、賦形劑、穩定劑、濕潤劑、乳化劑、吸收促進劑、pH調節劑、表面活性劑、稀釋劑和載體中的至少一種。全文摘要本發明公開了燈盞花甲醇提取物在皮膚美白祛斑防治中的應用，即以燈盞花提取物為活性成分制備皮膚美白或/和祛斑化妝品、抑制酪氨酸酶活性或/和黑色素生物合成的醫藥品和食品。實驗證明，燈盞花甲醇提取物能有效地抑制酪氨酸酶活性和黑素生成，且對皮膚沒有副作用，可美白紫外線照射后曬黑的皮膚，預防、改善和治療因日曬引發的老人斑、雀斑、紅斑等皮膚色素沉積癥狀。本發明發掘了燈盞花甲醇提取物的一個全新用途，有極好的應用前景。文檔編號A61K133/00GK101125155SQ20071004976公開日2008年2月20日申請日期2007年8月15日優先權日2007年8月15日發明者徐培渝,熊靜芳,黃毅娜申請人:四川大學