專利名稱：：蛋白酶抑制劑的腎細胞保護功能及應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑(rhKD/APP)，特別是涉及rhKD/APP的腎細胞保護功能，及其在生產用于預防和治療腎的再灌注損傷性疾病的藥物中的應用。
背景技術：
：BPTI作為堿性絲蛋白酶抑制劑，具用廣譜的蛋白酶抑制活性。在臨床上主要用于減少手術后的大出血和炎癥反應。但BPTI是一種異源蛋白，具有一定的免疫原性，大量或長期反復使用會產生過敏反應。所以需要尋找一個人源的、分子量較小且具有強抑制活性的BPTI。研究發現，(3淀粉樣蛋白前體(APP)包含一段Kunitz型結構域(Kunitzdomain,KD),APP含有57個氨基酸殘基，與Kunitz型蛋白酶抑制劑(KPI)有同源性。X-Ray衍射分析，氨基酸序列與Kunitz型蛋白酶抑制劑家族的BPTI有43%同源性。除了第39~41位點的氨基酸殘基不同，其主鏈骨架的氨基酸與BPTI幾乎相同。作為一種由61個氨基酸組成的多肽，KD/APP分子量相對較小且結構穩定。KD/APP對絲氨酸蛋白酶家族有廣泛的抑制作用，可被抑制的蛋白酶包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽釋放酶、纖溶酶、彈性蛋白酶和凝血因子VIIaIXaXaXIaXIIa等(例如參見美國專利6，613，890)。作為一種絲氨酸蛋白酶抑制劑和活性藥物成分，KD/APP的基本作用在于將病理性升高的蛋白水解酶活性降低到正常水平，緩解與絲氨酸蛋白酶活性升高有關的臨床癥狀，在臨床廣泛用于手術后的止血及術后并發的炎癥反應。由于KD/APP對因子XIa、XIIa抑制作用可以直接抑制外源性的凝血系統。KD/APP的變異體可以抑制多種絲氨酸蛋白酶，通過活性中心及活性中性附近氨基酸的改變可以抑制廣譜的蛋白酶如因子VII、X、彈性蛋白酶，3組織蛋白酶G、尿激酶、組織纖溶酶原激活劑、腸激酶等。可用于預防和治療某些與絲氨酸蛋白酶升高相關的疾病。然而，迄今為止尚未見有關重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑(rhKD/APP)對腎臟急性再灌注損傷的保護及其在治療腎臟再灌注損傷相關疾病中的應用的報道。
發明內容本發明的一個目的是提供KD/APP在生產用于預防和治療腎再灌注損傷性疾病的藥物中的應用。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的KD/APP是以DNA重組技術制備的。根據本發明的一個優選實施方案,其中所說的KD/APP是人源的。根據本發明的一個優選實施方案,其中所說的腎臟損傷性疾病選自腎再灌注損傷性疾病和腎再灌注性損傷。本發明的另一個目的是提供一種由KD/APP或其類似物以及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物，及其在生產用于保護腎細胞、預防和治療腎再灌注損傷性疾病的藥物中的應用。本發明涉及Kunitz型蛋白酶抑制劑(KD/APP)，特別是涉及KD/APP的腎保護功能，及其在生產用于預防和治療病理性腎損傷相關疾病的藥物中的應用。本發明進一步涉及由作為基本活性成分的KD/APP及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。所謂缺血再灌注(I/R)損傷是指機體器官缺血一定時間后再恢復血液灌注，組織損傷反而進行性加重。這種損傷不具有器官特異性，即任何組織器官均可能在缺血后發生再灌注損傷。早期I/R損傷是一個可逆性的損傷，隨著時間的推進和損傷的加重，組織細胞發生不可逆的損傷，即細胞的壞死和凋亡。近年來，隨著溶栓治療的開展，血循環重建后再灌注性腎損傷的相關研究己取得了較大進展，當前研究從細胞、分子水平比較深入地闡明了腎缺血再灌注損傷機制。蛋白酶和它們的抑制劑普遍存在于自然界動、植物及微生物中，并且在許多重要的生理體系中起關鍵性的調控作用。目前已發現的蛋白酶抑制劑很多，其中以Kunitz屬的牛胰蛋白酶抑制劑一BPTI研究得最廣泛和深入，并已經成功應用于臨床治療急性胰腺炎、手術后器官功能衰竭以及再灌注損傷、早產、肺氣腫、腎水腫、腫瘤的浸潤和轉移等疾病。就rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷的保護而言，目前研究很少。BPTI抑制腎臟激肽釋放酶和緩激肽活性，自激肽產生的前列腺素樣物質減少。由于激肽釋放酶和PGE2、PGI2具有舒張腎臟血管，促進鈉排泄的作用，它們的減少可能造成腎血管收縮，加重腎臟的缺血損傷。因此有人推測靜脈應用BPTI可能損害腎功能。但最近大多數研究觀察到，BPTI治療，即使是大劑量，也不會影響腎血流動力學和功能。有報導發現心臟手術中應用BPTI可增加圍術期尿量，原因與BPTI排泄時增加腎小管內的滲透性和增加鈉排出有關。感染性休克或肝硬化患者應用大劑量BPTI可預防血壓和體循環阻力下降，維持血漿肌酐清除率和尿鈉排泄分數。我們的研究顯示，rhKD/APP對大鼠的腎臟缺血再灌注損傷具有保護作用，最主要體現在rhKD/APP可以降低腎臟缺血再灌注損傷后血肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)、尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的水平，血肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)是臨床上評價腎功能的常用指標，尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)是反應腎損傷較為靈敏的指標。檢測結果表明rhKD/APP在一定程度上有減輕腎臟缺血再灌注損傷、保護腎功能的作用。根據本發明的優選實施方案，其中所說的病理性腎損傷選自急性或慢性腎病和腎動脈硬化。我們的實驗從形態學上也證實了rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷有一定的保護作用，光鏡和透射電鏡下可見rhKD/APP組動物的腎臟組織結構的破壞明顯輕于對照組。這些結果明確顯示，rhKD/APP對大鼠的腎缺血再灌注損傷有良好的保護作用。小、中、大三個劑量的rhKD/APP在干預大鼠腎缺血再灌注損傷時，顯示出劑量和藥效相關性，這說明在我們選定的這個藥物濃度范圍內，rhKD/APP均可以發揮治療作用。可以利用常規的DNA重組和分子克隆技術制備重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑(rhKD/APP)。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的rhKD/APP可以是由原核、真核或酵母表達系統產生的。然而，為了本發明目的，優選的表達系統是巴斯德畢赤酵母表達系統。以下簡單地描述使用優化的發酵培養條件，在80L發酵罐中工業化大規模生產rhKD/APP的方法。(1)酵母表達載體的構建以人胎盤組織來源的基因組DNA為模板，使用合成的引物l:5'-CTCTgAATTCAggTCTgCAgTgAACAAgCC-3'(SEQIDNO:l)和引物2:5'-gAAgTCTAgATTAAATggCgCTgCCACACAC-3'(SEQIDNO:2)，經聚合酶鏈反應(PCR)擴增得到長度約200bp的產物。酶切后與用同種酶消化的pPICZa載體連接，得到重組質粒pPICZa/pre^w'。然后，分別合成一段寡核苷酸單鏈5'-TCgAgAAgAgAgAggTTgTTAgAgAggTCTgCA-3'(SEQIDNO:3)和5'-gACCTCTCTAACAACCTCTCTCTTC-3'(SEQIDNO:4)(其中包括編碼KPI氨基端四個氨基酸和a因子信號肽切割位點Lys-Arg的密碼子)。用Pstl和Xhol消化重組質粒pPICZa/preAp/并與退火后的寡核苷酸雙鏈連接，得到重組質粒pPICZa/Ap厶酶切分析和測序鑒定表明，pPICZa/A^'，重組質粒攜帶了預期的a因子信號肽和hKD/APP基因序列。(2)重組質粒的轉化、陽性克隆的篩選和表達采用電轉化法將pPICZa/^w'轉化到酵母菌株X-33中。在YPDzeocin陽性培養基中28。C培養36小時后，挑取單克隆菌落接種于BMGY培養基中，待細菌處于對數生長期(0D6。。=26)時，重懸于B醒Y培養基中繼續培養。每隔24小時補加甲醇至終濃度為0.5%，以誘導rhKD/APP的表達。誘導后，每隔24小時取上清，用胰蛋白酶和底物鹽酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基酰基苯胺進行活性測定，篩選相對高表達量的菌株。(3)大規模發酵工藝將高密度的(0D6。。=10)酵母工程菌接種于含甘油(5%，V/V)加痕量鹽(4.34mlPTMl/L)和生物素(0.08mg/L)的FM21培養基中，在溫度28°C、pH3.3、溶解氧濃度20%、攪拌速度600轉/分鐘,罐內壓力12psi條件下,在發酵罐罐內發酵培養30小時。當濕細胞重量達180220g/L時，以漸增的速度添加含1.2%PTM1的100%甲醇，誘導rhKD/APP的表達，其甲醇補加速率為3.6ml/h/L—7.3ml/h/L—10.9ral/h/L，直至發酵結束。(4)表達產物的純化:70L發酵液離心取上清，用Na0H(lmol/L)調pH4.0，添加NaAc-HAc緩沖液(終濃度為20誦ol/L)和去離子水稀釋后，通過預先用緩沖液A(20mmol/LNaAc-HAc，pH4.0)平衡過的S印haroseSP陽離子交換柱。然后連續加樣，檢測穿透液的活性，待樹脂飽和后用3倍于柱體積的緩沖液A洗柱。用緩沖液B(20國ol/LNaAc-HAc加1mol/LNaCl,PH4.0)洗脫。洗脫液用3000(3K)中空纖維柱除鹽和濃縮。(5)表達產物的活性測定以胰蛋白酶活性抑制方法測定表達產物的活性。將如上純化的rhKD/APP稀釋成不同濃度并與同濃度的胰蛋白酶反應，加入底物(鹽酸苯甲酰-精氨酸-4-硝基酰基苯胺)后測定殘余的胰蛋白酶量。結果可見，如上得到的rhKD/APP對胰蛋白酶有明顯的抑制作用。為了深入研究rhKD/APP對大鼠腎細胞缺血再灌注的保護作用，在本研究中，我們觀察了rhKD/APP對大鼠急性腎梗塞后再灌注動物模型的血清生化指標(血清尿素氮、肌酐和尿NAG的水平和活力)的影響，同時對各實驗組動物的腎組織進行了病理學觀察(光鏡和電鏡觀察)和統計學分析。在急性腎缺血再灌注動物模型的實驗中發現，與對照組相比，接受rhKD/APP治療的實驗組動物，rhKD/APP低、中、高劑量組與模型組比較，腎功能損傷均可見顯著改善(P0.01)，且隨著劑量的增加改善明顯。基于這些實驗結果，我們初步認定重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑(rhKD/APP)有可能作為一種新的腎細胞保護劑，用于預防和治療急性腎缺血后腎細胞損傷。因此，本發明的一個目的是提供Kunitz型蛋白酶抑制劑在生產用于預防和治療腎缺血后再灌注損傷的藥物中的應用。根據本發明的優選實施方案，其中所說的腎缺血后再灌注損傷性疾病選自急性或慢性腎缺血、腎出血、腎動脈硬化和再灌注損傷。根據本發明的優選實施方案，其中所說的Kunitz型蛋白酶抑制劑是人源化的，并且是以DNA重組技術制備的。本發明的另一個目的是提供一種具有腎細胞保護活性的基礎上由rhKD/APP及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。用于本發明的AKD/APP可以是具有天然野生序列的生物學活性多肽，但也可以是為改善產物的生物學活性，或為提高產物的產率或藥物動力學性質目的而在基因水平上進行了必要的修飾的rhKD/APP類似物或突變體。這里所說的修飾可以是內部或末端個別或部分氨基酸的加入、缺失或取代。本發明涉及的rhKD/APP可以單獨使用，也可以作為有各種不同劑型的藥物組合物的形式使用。可以使用制藥工業領域己知的方法(參見Remington'sPharmaceuticalSciences，MackPub.Co.,Easton,Pa.,1980)，以適于口服或非口服給藥的單位計量形式制備本發明的藥物組合物。例如，可將作為活性成分的有效量的rhKD/APP與醫藥上可接受的載體或賦形劑均勻地混合，制成溶液或懸浮液形式的適于靜脈內、肌肉內、器官腔內、皮內和皮下等胃腸道外途徑給藥的藥物組合物；或者也可以制成片劑、膠囊劑、粉末劑、乳劑、顆粒劑等形式的適于經胃腸道途徑給藥的藥物組合物。根據本發明的藥物組合物，其中所使用的醫藥上可接受的載體或賦形劑將依據所制備的本發明藥物組合物的劑型而有不同的選擇。適于胃腸道外給藥的制劑可含有無菌水或鹽水、聚乙二醇、油和氫化萘等常用的賦形劑。特別是，可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物、聚氧乙烯/聚氧丙烯共聚物作為賦形劑，以控制活性成分的緩慢釋放。在其他適于胃腸道外給藥的制劑中，還包括含有水楊酸的直腸給藥制劑和含有甘膽酸鹽的含服給藥制劑。具體地說，可以使用乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇和甲基纖維素等賦形劑，淀粉、海藻酸鈉、羧甲基纖維素鈣和結晶纖維素等崩解劑，硬脂酸鎂和滑石等潤滑劑，明膠、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素和羥丙基纖維素等黏結劑，和蔗糖脂肪酸酯、山梨醇脂肪酸酯等表面活性劑，以及著色劑、甜味劑、香料、分散劑等輔助成分，以常規方法制備片劑。可以使用乳糖和甘露醇等賦形劑，淀粉等崩解劑，明膠等黏結劑，以常規方法制備顆粒劑。或者，可以使用乳糖和蔗糖等賦形劑，以常規方法制備粉末劑。使用明膠、水、蔗糖、阿拉伯膠、山梨醇、甘油、結晶纖維素、硬脂酸鎂和滑石等，以常規方法制備膠囊劑。可以使用水、生理鹽水、植物油(如橄欖油和花生油)、油酸乙酯和丙二醇等溶劑，苯甲酸鈉，水楊酸鈉和氨基甲酸乙酯等增溶劑，氯化鈉和葡萄糖等等滲劑，青霉素和鏈霉素及其他抗真菌劑等抗生素，苯酚、甲酚、對位羥基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、度米酚和山梨酸等防腐劑，抗壞血酸和焦磷酸鈉等抗氧化劑，以常規方法制備注射劑。在任何情況下，所說的可注射制劑均應是無菌和可流動并適于通過注射器注射給藥的。另外，在生產、運輸和儲存條件下，所說的制劑還必須是穩定的，并且能夠對抗細菌和真菌等微生物的污染。另外，也可使用制藥工業中已知的方法和輔助成份，將本發明的藥物組合物制成微膠囊劑或脂質體包裹劑。本發明的藥物組合物除含有作為基本活性成分rhKD/APP或其類似物或突變體外，還可含有一種或多種合成的、天然的或重組來源的具有協同或輔助作用的其他活性成分。這些活性成分包括但不只限于具有免疫刺激或調節活性、病毒復制抑制活性、細胞修復活性的其他成分，例如可以是干擾素、白介素、胸腺素、肝細胞生長因子和成纖維細胞生長因子等。本發明的藥物組合物對功能性腎細胞具有良好的保護作用。雖然有關作用機理目前尚不明確，但我們推測可能與rhKD/APP或其類似物作用于腎臟細胞并抑制細胞內的絲氨酸蛋白酶類有關。基于以上的描述，本領域技術人員完全可以理解到，rhKD/APP除具有其固有的蛋白酶抑制活性并因此可用于治療絲氨酸活性升高相關疾病外，也可以用于預防和治療病理性腎臟細胞損傷及相關疾病。根據本發明的一個優選實施方案，其中所說的rhKD/APP或其類似物通過抑制腎臟細胞的絲氨酸蛋白酶提高腎臟細胞的存活性。一般說來，本發明藥物組合物的給藥劑量約為0.01-500mg/kg，較好為0.1-100mg/kg。可以以口服、皮下或肌肉注射、腹腔注射、靜脈內注射等多種途徑給藥。當然，本領域技術人員可以理解到，為有效地治療病人所需的確切的給藥劑量，應根據待治療的病癥或病理狀態的性質、嚴重程度、病人的年齡、體重和一般健康狀態，所用藥物的劑型、病人對所用藥物的敏感性和耐受性，以及所使用給藥途徑等因素，按照個體化的原則由臨床醫生確定。圖1顯示模型組腎組織HE染色，200倍光鏡下觀察結果，可見模型組腎小管上皮細胞變性壞死較嚴重，尤其以近曲小管上皮細胞為重，可見細胞明顯腫脹，胞漿疏松；上皮細胞內可見明顯的玻璃樣變性和空泡變性，并有大量蛋白管型形成；腎間質充血及出血明顯，伴有炎細胞浸潤。圖2顯示40000KIU'kg—rhKD/APP組腎組織HE染色，200倍光鏡下觀察結果，可見腎小管上皮細胞損傷較模型組明顯減輕，僅小部分細胞出現輕微腫脹，脫落及空泡變性，壞死細胞較少，腎小管形狀保持良好。圖3顯示模型組腎組織6k透射電鏡觀察結果，可見腎小管上皮細胞膜局部破損，細胞質空化，細胞器(線粒體等)明顯減少,細胞核內異染色質趨邊，可見大量大小不等溶酶體顆粒。圖4顯示模型組腎組織10k透射電鏡觀察結果，可見腎小管上皮細胞核發生固縮，可見較多髓樣小體，某些線粒體局部發生空化。圖5顯示40000KIU'kg"rhKD/APP組腎組織5k透射電鏡觀察結果，可見腎小管上皮細胞結構基本正常，可見部分溶酶體。圖6顯示40000KIl>kg"rhKD/APP組腎組織5k透射電鏡觀察結果，可見腎小球濾過膜與足細胞基本正常，足細胞內可見部分線粒體空化。圖7顯示模型組腎組織NF-KB免疫組化染色，200倍光鏡下觀察結果，可見較多陽性細胞。圖8顯示40000KIU'kg"rhKD/APP組腎組織NF-KB免疫組化染色，200倍光鏡下觀察結果，可見陽性細胞明顯少于模型組。圖9顯示模型組腎組織TUNEL免疫組化染色，200倍光鏡下觀察結果，可見較多TUNEL陽性細胞。圖10顯示40000KIU'kg"rhKD/APP組腎組織TUNEL免疫組化染色，200倍光鏡下觀察結果，可見TUNEL陽性細胞明顯少于模型組。具體實施例方式下列實施例旨在進一步舉例說明而不是限制本發明。本領域技術人員可以理解到，在不背離本發明的精神和原則的前提下，對本發明的任何平行改變和改動都將落入本發明的待批權利要求范圍內。實施例hrhKD/APP對大鼠腎臟急性缺血再灌注損傷的保護和治療作用1、腎缺血再灌注損傷動物(大鼠)模型的制備、分組和給藥平均體重250g-300g的雄性Wistar大鼠(吉林大學實驗動物部提供)禁食12小時后，腹腔內注射3%水合氯醛麻醉(0.2ml/50g)。將麻醉后的大鼠仰臥位固定后，打開動物腹腔并暴露雙腎、動靜脈和輸尿管。用無損傷血管夾阻斷雙側腎蒂，同時開始記時。阻斷雙側腎蒂45分鐘后，恢復腎臟供血，觀察到腎臟在短時內由暗紅色逐漸轉變為鮮紅色(提示腎臟恢復血供)。造成模型24小時后，分別將各組10只動物放入代謝籠中留取24小時尿液，以測定尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性。24小時后，再次用3%水合氯醛麻醉，切除腎臟，切除的部分腎臟在多聚甲醛液中固定備用；另取一部分腎臟放入戊二醛溶液中固定，置4'C冰箱備用。從腹腔腹主動脈處用無菌5ml注射器抽取3-4ml血進行腎功能測定。取Wistar大鼠60只，隨機分為6組，每組10只第1組為偽手術組；第2組為腎I/R損傷模型組(模型組)行大鼠雙側腎動靜脈夾閉，暫時阻斷手術，制備腎臟缺血再灌注損傷模型；第3組為rhKD/APP低劑量組腎I/R+尾靜脈注射rhKD/APP10000KIU'kg";第4組為rhKD/APP中劑量組腎I/R+尾靜脈注射rhKD/APP20000KIU'kg-1;第5組為rhKD/APP高劑量組腎I/R+尾靜脈注射rhKD/APP40000KIU'kg";第6組為依那普利組(對照組)腎I/R+尾靜脈注射對照藥物依那普利0.134mg'kg—1。第1~2組動物于造成模型前24小時、模型建立后即刻和模型建立后24小時尾靜脈注射生理鹽水；第35組大鼠于上述各時間點經尾靜脈注射各個劑量的rhKD/APP;第6組大鼠于上述各時間點經尾靜脈注射對照藥物依那普利。術中維持大鼠肛溫在37'C左右，用臺燈加熱保溫。入選的動物在取腎后如雙腎顏色未發生變化或于恢復腎動脈供血恢復后腎臟顏色未能由暗紅色轉變為鮮紅色則棄之不用。補充死亡例數、未入選例數、模型未成功例數，每組最終統計入組數經補充后『10。所有的實驗數據，包括計量資料和計數資料均值土標準差表示，各組所得的數據均采用單因素方差分析和DunnetT檢驗進行比較。2、觀察指標(1)腎功能檢測血清肌酐(SCR)，血清尿素氮(BUN):從腹主動脈處用無菌5m勝射器抽取3-4ml血液，去掉針頭，注入無菌非抗凝試管，靜置待血清析出后，以3000r/min，離心10min，取上清液以美國BACKMAN—SYNCHRONCX3型全自動生化分析儀測定血清肌酐(SCR)，血清尿素氮(BUN)(由吉林大學第一醫院二部檢驗科生化室協助完成)。肌酐采用Jaffer速率測定法測定，當樣品及標準液中的肌酐與堿性苦味酸試劑混和后，生成紅色復合物，在波長520nm及560nm處測定吸光度，復合物形成的速率與樣品中的肌酐濃度成正比。尿素氮通過BACKMAN—SYNCHRON—CX3型全自動生化分析系統通過操作BACKMAN導電電極測定酶的導電率增長速率，它與樣品中尿素氮的濃度成正比。(2)尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)活性的測定根據南京建成生物工程研究所提供的NAG測試盒說明書進行尿中NAG活性的測定和計算.原理底物在NAG作用下水解，釋放出游離的對硝基酚。加入堿性溶液停止反應，并使對硝基酚顯色。在400nrn處測吸光度，可計算酶活力單位。計算公式如下酶活力單位(U/L)=(測定管吸光度-對照管吸光度)+(標準管吸光度-空白管吸光度)x標準品濃度(0.6mmol/L)xi/i5><1000(3)腎臟組織病理切片光鏡觀察①將按規定取好的腎組織標本以多聚甲醛固定。②脫水酒精梯度(75%酒精、85%酒精、90%酒精、95%酒精、100%酒精、100%酒精)各級酒精，脫水時間2-4h。③透明二甲苯15min。共2次。④浸蠟將透明后組織塊浸入融化的石蠟中2-4h。⑤包埋修整蠟塊使切面平整。⑥切片切成厚約4-5Nm切片。⑦染色脫蠟至水，蘇木素5min，伊紅lmin。⑧脫水、透明、封片觀察。(4)腎臟組織病理切片電鏡觀察①初固定(或前固定)將腎組織標本用2.5%戊二醛固定。②漂洗用磷酸緩沖液(0.1mol/L，pH7.4，含2.5mmol/L氯化鈣)(C洗1小時(其間更換3次以上漂洗液)。(D二次固定(或后固定)1%四氧化鋨室溫或4"固定1小時。脫水50%丙酮(或乙醇)水溶液，4'C，10-15分鐘；70%丙酮(或乙醇)水溶液，4°C，10-15分鐘；95%丙酮(或乙醇)水溶液，4"C，10-15分鐘；100%丙酮(或乙醇)，4°C，10-15分鐘；100%丙酮(或乙醇)，室溫，10-15分鐘；100%丙酮(或乙醇)，室溫，10-15分鐘。⑤Epon812環氧樹脂包埋標本。⑥制備超薄切片。⑦染色醋酸鈾和擰檬酸鉛雙染色法染色。⑧電子顯微鏡觀察，攝片。3、實驗結果(1)rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷大鼠血清尿素氮和肌酐的影響各實驗組在腎缺血45min，再灌注48h后，與偽手術組相比較，模型組BUN和SCR，顯著升高(P〈0.001);與模型組比較，大劑量組血清的BUN和SCR顯著降低(p〈0.0D，中劑量組BUN和SCR明顯降低(P〈0.05);小劑量組BUN和Cr較模型組降低，但無顯著性差異(p〉0.05);中劑量組與大劑量組對腎臟急性缺血再灌注后大鼠血清BUN和SCR的影響與依那普利組相近，結果見表1。表1rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷大鼠血清尿素氮和肌酐的影響(3f±s，n=l0)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>與模型組比較*p〈0.05，**p〈0.01(2)rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷大鼠尿NAG的影響各實驗組在腎缺血45min，再灌注48h后，與偽手術組相比較，模型組尿NAG明顯升高(P<0.01);與模型組比較，中劑量及大劑量組尿NAG明顯降低(p<0.01)，小劑量組尿NAG較模型組降低，但無顯著性差異(p〉0.05);中劑量組與大劑量組對腎臟急性缺血再灌注后大鼠尿NAG的影響與依那普利組相近。結果見表2。表2rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷大鼠尿NAG的影響(i±S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>與模型組比較*p<0.05,**p<0.01(3)rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織形態學影響光鏡觀察偽手術組腎小管上皮細胞無腫脹及變性，形態正常。模型組可觀察到腎小管上皮細胞變性壞死較嚴重，尤其以近曲小管上皮細胞為重，可見細胞明顯腫脹，胞漿疏松；上皮細胞內可見明顯的玻璃樣變性和空泡變性，并有大量蛋白管型形成；腎間質充血及出血明顯，伴有炎細胞浸潤。小劑量治療組腎小管上皮細胞變性壞死嚴重，上皮細胞廣泛性脫落、壞死到管腔內，，可聚集形成細胞管型。壞死細胞的細胞核固縮，染色變深，部分細胞核碎裂、溶解消失。殘存上皮細胞水腫和玻璃樣變性較重，胞漿內可見大量玻璃滴狀物，同吋管腔內可見蛋白管型和壞死脫落細胞。腎間質可見大量紅細胞，充血及出血較重，伴有炎癥細胞浸潤。大劑量治療組可見腎小管上皮細胞損傷較模型組明顯減輕，僅小部分細胞出現輕微腫脹，脫落及空泡變性，壞死細胞較少，腎小管形狀保持良好。中劑量治療組較大劑量治療組病變略重，少部分管腔內可見蛋白管型，余病理變化與大劑量治療組相仿。陽性對照組中未發現明顯的形態學改變，僅個別近曲小管上皮細胞空泡變性及壞死，部分腎小管內可見管型及壞死細胞，其余組織形態未見異常。參見附圖1、圖2。(4)rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷大鼠腎臟組織超微結構的影響電鏡觀察偽手術組腎組織細胞形態，結構正常。模型組可觀察到腎小管上皮細胞內可見大量大小顆粒不等的溶酶體，細胞核內異染色質趨邊凝集，部分核發生固縮，細胞質內發生空化，細胞器減少。小劑量組腎小球結構未見明顯改變(無基底膜增厚，厚薄不均，足突融合)，可見部分腎小球血管內皮細胞增生；部分腎小管細胞細胞細胞核固縮，部分腎小管上皮細胞核內異染色質趨邊凝集，胞質內可見較多體積較大溶酶體，部分細胞質空化，線粒體中度減少。中劑量治療組腎小球未見明顯改變，腎小管上皮細胞質內可見大小不一的溶酶體，數量，體積與模型組相似，部分細胞，細胞質輕度空化。部分腎小管上皮細胞核固縮，胞質空化(中度)，細胞內可見少量溶酶體，但體積相對較大。大劑量治療組腎小管上皮細胞核形態基本正常，細胞質內仍可見溶酶體，但數目較模型組明顯減少，仍可見線粒體局部空化，部分細胞細胞質內可見輕度空化，髓樣小體少見。參見圖3、圖4、圖5、圖6。本研究顯示rhKD/APP對大鼠的腎臟缺血再灌注損傷確有一定的保護作用，主要體現在rhKD/APP可以降低腎臟缺血再灌注損傷后血清肌酐(SCR)、尿素氮(BUN)及尿B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)的水平。SCR、BUN是評價腎功能的常用指標。e-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(NAG)此酶為溶酶體中一種重要的酶，可作為腎損傷一個極為靈敏的指標。實驗結果顯示與模型組比較，大劑量組血清BUN、SCR及尿NAG顯著降低(p<0.01)，中劑量組血清BUN、SCR及尿NAG明顯降低(P〈0.05);與依那普利組比較，中劑量組對腎臟I/R后大鼠血清BUN、SCR及尿NAG的影響與陽性對照組相近，大劑量組對血清BUN、SCR及尿NAG的影響優于對照組。提示rhKD/APP在一定程度上有減輕腎臟缺血再灌注損傷、保護腎功能的作用。本研究從形態學上也證實了rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷有一定的保護作用，光鏡下的冊切片和透射電鏡顯示偽手術組腎臟組織無明顯病理學改變。對照組電鏡下可見線粒體明顯腫脹變形，形態不規則，排列不整齊，晴稀疏斷裂，排列紊亂，有斷裂、膜融合，近曲小管細胞微絨毛減少消失，細胞內空泡增多；光鏡下可見近曲小管上皮細胞空泡變性和壞死，腎小管腔擴張，內可見管型和壞死脫落細胞，可見明顯管周血管的擴張淤血。而rhKD/APP組(小、中、大三組)也可見部分腎臟組織結構的破壞，但明顯輕于對照組。提示rhKD/APP對大鼠的腎缺血再灌注損傷具有明顯的抑制作用，因而對腎功能及組織結構起到了明顯的保護作用。實施例2:rhKD/APP對腎缺血再灌注損傷大鼠自由基-抗自由基平衡中的保護作用近年來的研究表明急性腎缺血和缺血再灌注過程中，自由基介導的自由基連鎖反應具有病理損害作用。自由基引起細胞內DNA、RNA、蛋白質、氨基酸以及多糖高分子物質的氧化、交聯、變性和降解，并且使細胞膜上的不飽和脂肪酸形成過氧化脂質。自由基損傷膜性細胞器，導致膜對C^+通透性增加，而鈣超載又激活磷脂酶和脂質過氧化反應，這種惡性循環持續進行致使細胞發生不可逆損傷直至死亡。抗自由基治療可減輕急性腦缺血和再灌注損傷，保護神經細胞及其功能。丙二醛(MDA)是脂質過氧化過程中的代謝產物，機體缺血低氧時產生自由基的多少與MDA含量成正相關。SOD是一種金屬蛋白酶，是體內重要的自由基清除酶，其活性高低可反映機體清除自由基的能力。腎近曲小管細胞內含NO合酶(包括組成型和誘生型)，通過(^2+、鈣調蛋白依賴或獨立的途徑生成一氧化氮(NO),NO可很快與02結合，生成反應性更強的過氧化含氮化合物(ONOO-)。NO本身即是一自由基，具有細胞毒作用。再灌注時釋放的氧自由基是再灌注損傷的主要原因。谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的主要作用是清除氧自由基，防止人體內氧自由基對細胞和亞細胞系統的破壞。本實驗采用大鼠雙側腎蒂夾閉方法制備大鼠腎缺血再灌注模型，研究rhKD/APP對腎缺血再灌中MDA、NO含量及SOD、GSH-PX活性的影響，同時研究rhKD/APP干預治療對大鼠腎缺血再灌注損傷的保護作用。1、動物模型的制備和動物分組動物模型的制備參見實施例l。各組大鼠于造模48h后，在規定的時間點再次麻醉、從腹主動脈抽血3-4ml，靜置析出血清，以3000r/分，離心10分鐘取上清，用于檢測MDA、NO含量及SOD、GSH-PX、NAG活性。2、生化指標的測定(1)血清NO測定腹主動脈取血，離心(3000rpm)IO分鐘，取血清0.1ml。用南京建成生物工程研究所提供的一氧化氮測試盒測定一氧化氮含量。原理NO化學性質活潑，在體內代謝很快轉為N(y—和N03—，而NC^又進一歩轉化為N03—，本法利用硝酸還原酶特異性將N(y-還原為N02—，通過顯色深淺測定其濃度的高低。計算公式如下NO含量(pmol/L)=(測定管吸光度-測定空白管吸光度)+(標準管吸光度-標準空白管吸光度)x標準品濃度x樣品測試前稀釋倍數(2)血清丙二醛測定使用丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)測定MDA含量。過氧化脂質降解產物中的MDA可與硫代巴比妥酸(TBA)縮合，形成紅色產物，在532nm處有最大的吸收峰。血清MDA含量計算方法血清MDA含量二(測定管吸光度-測定空白管吸光度)+(標準管吸光度-標準空白管吸光度)x標準品濃度x樣品測試前稀釋倍數。(3)血清超氧化物歧化酶活性測定根據超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所提供)進行血清中SOD活性的測定和計算。通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應系統產生超氧陰離子自由基，后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度值低于對照管的的吸光度值，通過計算可求出被測樣品中的SOD活性。計算公式如下血清SOD二(對照管吸光度-測定管吸光度)+對照管吸光度+50%><稀釋倍數(4)谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性測定使用GSH-PX測試盒(南京建成生物工程研究所提供)進行血清中GSH—PX活性的測定和計算。GSH可促進過氧化氫與還原型谷胱甘肽反應生成水及氧化型谷胱甘肽(GSSG)，GSH-PX的活力可用其酶促反應的速度來表示，測定此酶促反應中還原型谷胱甘肽的消耗，則可求出酶活力。計算公式如下血清GSH-PX活力單位=(非酶管吸光度-酶管吸光度)-(標準管吸光度-空白管吸光度)x標準管濃度(20^mol/L)x稀釋倍數x樣本測試前稀釋倍數所有實驗數據均以均數土標準差表示(f±S)表示，各組所得的數據處理采用單因素方差分析和DimnetT檢驗進行比較。3、結果(1)rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷大鼠血清一氧化氮(NO)的影響各實驗組大鼠在腎缺血45min,再灌注48h后，與偽手術組比較，模型組大鼠血清NO含量顯著升高(p<0.01)。與模型組相比，大劑量組和中劑量組大鼠血清N0含量顯著降低(p<0.01或p〈0.05);小劑量組對血清NO含量影響無顯著性差異(p〉0.05)。陽性對照組大鼠血清NO含量明顯降低(p〈0.05)。大劑量組對腎缺血再灌注損傷后大鼠血清NO含量的影響優于依那普利組；中劑量組對腎缺血再灌注后大鼠血清NO含量的影響與依那普利組相近。(參見表3)。表3rhKD/APP對大鼠腎缺血再灌注損傷血清NO的影響(X±S，n=10)組別NO(,1/1)偽手術組35.63±8.45**模型組50.19±9.90rhKD/APP10000KIU/kg47.65±7.40rhKD/APP20000KIU/kg40.80±8.87*rhKD/APP40000KIU/kg37.78±12.2廣依那普利組42.61±7.36*與模型組比較*p<0,05，**p<0.01(2)rhKD/APP對腎臟缺血再灌注損傷大鼠血清丙二醛(MDA)的影響各實驗組大鼠在腎缺血45min，再灌注48h后，MDA含量與偽手術組比較，模型組大鼠血清MDA含量顯著升高(p〈0.0D。與模型組比較，大劑量和中劑量組大鼠血清MDA含量顯著降低(p<0.01或p〈0.05);小劑量組對血清MDA含量影響無顯著性差異(p〉0.05)。大劑量組對腎缺血再灌注后大鼠血清MM含量的的影響優于依那普利組；中劑量組對腎缺血再灌注后大鼠血清MM含量的影響與依那普利組相近。(參見表4)。表4rhKD/APP對腎缺血再灌注損傷大鼠血清MDA的影響(X±S,n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>與模型組比較*p<0.05，**p<0.01(2)rhKD/APP對大鼠腎臟缺血再灌注損傷血清SOD的影響各實驗組大鼠在腎缺血45min，再灌注48h后，與偽手術組比較，模型組大鼠血清SOD活性較顯著降低(pO.Ol)。與模型組比較，大劑量組和中劑量組大鼠血清SOD活性顯著升高(p<0.01或p0.05)。大劑量組對腎缺血再灌注后大鼠血清SOD活性的的影響優于依那普利組；中劑量組與小劑量組對腎缺血再灌注后大鼠血清SOD活性的影響與依那普利組相近。(參見表5)。表5rhKD/APP對腎缺血再灌注損傷大鼠SOD的影響(X±S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>與模型組比較*p<0.05，**p<0.01(4)rhKD/APP對大鼠腎臟缺血再灌注損傷后血清GSH-PX活性的影響各實驗組大鼠在腎缺血45min，再灌注48h后，與偽手術組比較，模型組大鼠血清GSH-PX活性顯著降低(p〈0.0D。與模型組比較，大劑量組和中劑量組大鼠血清GSH-PX活性顯著升高(p〈0.01或p〈0.05);小劑量組對血清GSH-PX活性影響與模型組比較無顯著性差異(p〉0.05)。大劑量組對腎缺血再灌注后大鼠血清GSH-PX含量的的影響優于依那普利組；中劑量組對腎缺血再灌注后大鼠血清GSH-PX含量的影響與依那普利組相近。(參見表6)。表6rhKD/APP對大鼠腎缺血再灌注損傷GSH-PX的影響(X±S，n=10)<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>我們的實驗結果顯示大劑量rhKD/APP組對于腎缺血再灌注損傷后大鼠血清MDA、NO含量活性下調及SOD、GSH-PX活性的上調優于傳統腎臟保護藥依那普利；中、小劑量組對于腎缺血再灌注損傷后大鼠血清MDA、NO含量及SOD、GSH-PX活性的上調與依那普利類似。(參見表3-6)。這說明rhKD/APP在大鼠腎缺血再灌注時發揮了自由基清除作用。體內活性氧自由基的大量釋放，對細胞膜和膜性細胞器的損傷顯著，尤其是溶酶體酶釋放，蛋白溶解酶激活，勢必要導致體內很多絲氨酸蛋白酶的活化反應，而其絲氨酸蛋白酶抑制劑消耗也相應增多。在這種病理狀態下，^l體原本維持的各種反饋和動態平衡被破壞，蛋白酶活化和激活占優勢，導致活性氧自由基釋放的激增和釋放。鈣超載和氧自由基爆發拉開了局部細胞損傷和凋亡的序幕。絲氨酸蛋白酶抑制劑能夠抑制ATP依賴的Na-K-ATPase水解活性，使ATPase水解酶的活性下調而ATP降解速度減慢，鈣超載延遲。絲氨酸蛋白酶抑制劑能夠拮抗激酶的活性，使次黃嘌呤脫氫酶轉化為黃嘌呤氧化酶的活性顯著降低，顯著對抗自由基爆發，因此，體外給予絲氨酸蛋白酶抑制劑，可以通過拮抗產生自由基網絡中的蛋白酶介導的分子生物學事件，發揮一定的代償和逆轉作用，最終結果是減輕了自由基級聯放大效應的損傷，從而保護瀕死的腎組織細胞。實施例3rMD/APP在腎缺血再灌注的炎癥-抗炎癥平衡中的治療作用大量證據表明，在腎臟缺血再灌注中存在著白細胞聚集和浸潤等病理現象。再灌注可促進局部炎癥反應，加重腎臟的缺血損害。再灌注時活化的白細胞在內皮細胞表面滾動、貼壁、最終滲入周圍組織，所以白細胞浸潤可加重缺血再灌注損害。缺血組織內白細胞的存在不僅是損傷的病理反應，而且更促進缺血損害。炎癥反應是加重腎缺血再灌注損傷的一個重要因素。髓過氧化物酶(MP0)主要存在于中性粒細胞，研究證明MPO可作為中性粒細胞的標記物，因此測定MPO活性己成為研究白細胞浸潤的常用方法。腎缺血再灌注炎癥反應過程中的一個重要部分是細胞因子，如腫瘤壞死因子-a(TNF-a)等。在腎缺血再灌注時，受損傷的內皮細胞及激活的白細胞可以產生和釋放大量的細胞因子，許多細胞因子又反過來可作為啟動因素，引起腎缺血后的炎癥反應，加重損傷。核因子NF-KB參與腎臟缺血，再灌注損傷的病理生理學過程。缺血刺激可誘導腎小管細胞內NF-kB的核內轉位和激活。此外，NF-kB還可介導缺血誘導的腎小管細胞凋亡。本研究采用大鼠雙腎動靜脈夾閉法制備腎缺血再灌注模型，預先給予rhKD/APP(10000，20000，40000KIUkg—0后，觀察其對大鼠腎缺血再灌注損傷過程中組織MPO、TNF-a和核因子的影響。1、模型制備、分組和給藥模型動物的制備及分組參見實施例1和2。2、生化檢測(1)MPO活性測定各組大鼠于缺血48h后，再次用3%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血后，取腎臟稱重并用生理鹽水漂洗。取100mg腎臟組織儲存于-7(TC，按腎重與試劑盒(上海森雄科技實業公司)中提供的勻漿介質混合制成5%組織勻漿液。按照試劑盒說明書檢測腦組織勻漿中的MPO活性。腎組織MPO活性的計算公式為MPO單位/克濕腎=(測定管OD值-對照管OD值)/11.3/樣品量(克)，為了消除水腫因素影響，通常以每克干腎組織中MPO活性來反映中性白細胞的浸潤程度，即MPO單位/克干腎二MPO單位/克濕腎x組織濕/干重比。(2)ELISA方法測定TNF-a腹主動脈采血，離心取血清O.lml。按照腫瘤壞死因子測定試劑盒(上海森雄科技實業公司)推薦的雙抗體夾心ABC-ELISA方法，檢測腫瘤壞死因子。簡單地說，用抗大鼠TNF-a單抗包被于酶標板上使標準品和樣品中的大鼠TNF-a與單抗結合，然后加入生物素化的抗大鼠TNF-a形成免疫復合物。連接在板上的免疫復合物與辣根過氧化物酶標記的抗生物素與生物素結合后，加入酶底物OPD即出現黃色，然后在492nm處測0D值。大鼠TNF-a濃度與OD值成正比，故可通過繪制標準曲線求出標本中大鼠TNF-a濃度。(3)免疫組化方法測定核因子NF-icB各組大鼠于缺血48h后，再次用3%水合氯醛麻醉后，腹主動脈取血后，取腎臟稱重后用生理鹽水漂洗。取100mg腎臟組織多聚甲醛液中固定，常規制備石蠟切片。將切片置于3。/。的HA中浸泡10分鐘，以滅活內源性過氧化物酶。抗原熱修復并用PBS洗滌后，加入一抗(兔抗TNF-a抗體和NF-kB抗體，1:150稀釋)4°C保溫過夜。然后滴加辣根過氧化物酶標記的二抗工作液，37C孵育20分鐘。PBS沖洗后，用DAB顯色5—20分鐘。然后進行蘇木精復染(5分鐘)。用PBS液替代一抗，作陰性對照。HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統，每張切片在鏡下(200x)隨機選取5個視野，計算陽性血管數，經觀察血管內皮細胞被染成棕色者為陽性血管。取均數進行統計。實驗數據以；±s表示，各組所得的數據處理采用單因素方差分析和DunnetT檢驗進行比較。3、實驗結果1)rhKD/APP對腎缺血再灌注損傷大鼠血清MPO的影響大鼠腎缺血45min再灌注48h后，各組MPO活性(見表l)。結果表明與偽手術組比較，模型組MPO活性顯著增高。與模型組比較，MPO活性，大劑量組顯著降低(P<0.01)，大劑量組對腎缺血再灌注大鼠血清MPO活性的影響優于依那普利組；中劑量和小劑量組血清MPO活性有明顯降低(P〈0.05)，與依那普利組相近。(參見表7)表7rhKD/APP對腎缺血再灌注大鼠血清MPO的影響(X±S，n=]0)組別MPO(U/L)偽手術組16.53±7.3"模型組34.12±15.8rhKD/APP10000KIU/kg29.63±16.7*,rhKD/APP20000KIU/kg28.82±15.8*rhKD/APP40000KIU/kg25.48±8.9"依那普利組28.57±15.3*與模型組比較*p〈0.05,**p<0.012)rhKD/APP對腎缺血再灌注損傷大鼠血清腫瘤壞死因子的影響大鼠腎缺血45min再灌注48h后，各組TNF-a含量(見表2)。結果表明與偽手術組比較，模型組血清TNF-a顯著增高(P<0.01)。與模型組比較，小劑量組、中劑量組、大劑量組血清腫瘤壞死因子均顯著降低(P〈0.05或P<0.01)。大劑量組對腎缺血再灌注后大鼠血清TNF-a的影響優于依那普利組；小劑量組、中劑量組與依那普利組相近。(參見表8)表8rhKD/APP對大鼠腎缺血再灌注血清腫瘤壞死因子的影響(X±S，n=10)組別TNF陽a(U/L)假手術組8.53±2.3"模型組41.72±17.8rhKD/APP10000KIU/kg24.67±8.9"rhKD/APP20000KIU/kg28.02±14.8'rhKD/APP40000KIU/kg35.73±15.7*依那普利組27.57±16.3*與模型組比較*p<0.05，**p<0.013)rhKD/APP對腎缺血再灌注損傷大鼠腎組織NF-kB表達的影響大鼠腎缺血45min再灌注48h后，各組NF-KB表達(見表9)。結果表明與偽手術組(圖31)比較，模型組(圖32)腎組織NF-KB表達顯著增多(P〈0.01)。與模型組比較，小劑量組(圖33)、中劑量組(圖34)、大劑量組(圖35)腎組織NF-kB表達均顯著下調(P〈0.01)，與依那普利組(圖36)相近。(參見表9和圖7、圖8)表9rhKD/APP對大鼠腎缺血再灌注腎組織核因子(NF-icB)的影響(X土S，n=0)<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>本實驗結果顯示，大鼠腎臟MPO、TNF-a活性均顯著降低，這說明rhKD/APP抑制了炎癥反應的中性粒細胞的活化及炎性因子的釋放。同時rhKD/APP各個劑量組的NF-kB的表達均明顯降低，說明rhKD/APP通過抑制NF-kB的過度表達發揮了抗炎作用。提示rhKD/APP可能是通過抑制中性粒細胞粘附、聚集、浸潤，降低細胞因子、粘附分子的表達、抑制NF-KB的過度表達，抑制或減輕了炎癥級聯放大效應，對腎缺血再灌注大鼠發揮腎臟保護作用。實施例4:rhKD/APP在腎缺血再灌注凋亡-抗凋亡平衡中的保護作用細胞死亡通常分為壞死和凋亡二類。壞死是一個被動的細胞死亡過程，物理性或化學性的損害因子及缺氧與營養不良等因素均可導致細胞壞死。細胞凋亡(apoptosis)是細胞接受某種信號后或受到某種因素刺激后一種主動的、由一些相關基因相互作用、以細胞DNA早期降解為特征的自殺過程，又稱程序化細胞死亡(programmedcelldeath,PCD)。凋亡是一個能量相關的過程，因此再灌注能夠通過恢復細胞內的能量而加重凋亡的發生。凋亡以細胞染色質致密、核間小體DNA片段形成、胞漿膜發泡、凋亡小體(被周圍健康細胞吞噬)出現，不伴炎癥反應為特征。缺血后再灌注越早，腎實質細胞壞死和凋亡越輕。另一方面再灌注損傷產生的氧自由基等可以導致氧化性DNA損傷，后者如不能及時修復，積累到一定程度，則可通過啟動凋亡程序，引起細胞凋亡。本研究采用大鼠雙腎腎蒂夾閉法制備腎缺血再灌注模型，預先給予rhKD/APP(10000，20000，40000KIUkg1)后，觀察其對大鼠腎缺血再灌注引起的細胞凋亡的保護作用。1、動物模型的制備、分組和給藥模型動物的制備參見實施例l。2、脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)法原位檢測細胞凋亡在細胞凋亡過程中，基因組DNA雙鏈斷裂或單鏈斷裂而產生大量的粘性3'-OH斷端，這些DNA鏈缺口，可以利用酶標法來識別。在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶(TdT)的作用下，可將標記有熒光素的dUTP轉移到DNA片段的3'-OH斷端，熒光素由結合有辣根過氧化物酶(POD)的Fab段抗體識別。加入底物DAB顯色后，即可用光鏡檢查被染色細胞，從而可進行凋亡細胞的檢測，這類方法稱為脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)。由于正常的或正在增殖的細胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。各組大鼠腎缺血45min再灌注48h后，取腎標本常規制備石蠟切片備用。依照試劑盒說明書進行TUNEL染色。陰性對照為核苷酸混合液代替TUNEL反應混合液。凋亡陽性細胞記數方法采用HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統，每張切片于高倍鏡下(200x)缺血側皮質區隨機采集5個視野，記數每個視野中的凋亡細胞個數，取高倍視野平均陽性細胞數進行統計。實驗數據以；±s表示，各組所得的數據處理采用單因素方差分析和DunnetT檢驗進行比較。3、結果鏡下可見，偽手術組大鼠腎小管上皮細胞可見較多的TUNEL陰性反應細胞，核著色淺藍，細胞疏散且界限較為不清，偶見陽性反應細胞。模型組大鼠腎小管上皮細胞可見大量TUNEL陽性反應細胞即凋亡細胞，胞核固縮濃染，呈深棕色，胞體縮小，形狀不規則，凋亡指數顯著高于偽手術組(P<0.01)。陽性對照組大鼠腎小管上皮細胞有中等量TUNEL陽性細胞表達。rhKD/APP(小、中、大劑量)組大鼠腎小管上皮細胞的TUNEL陽性細胞均明顯減少，著色較淺，rhKD/APP各劑量組凋亡指數，與模型組相比均顯著減少(P<0.05)，與依那普利組相近。參見表10和圖9、圖10)。表10rhKD/APP對大鼠腎缺血再灌注細胞凋亡的影響<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>與模型組比較*p<0.05，**p<0.01體外給予絲氨酸蛋白酶抑制劑rhKD/APP，可以通過幾個途徑保護細胞免于凋亡，包括拮抗絲氨酸蛋白酶依賴的NF-KB炎癥轉錄途徑，抑制了炎癥的發生；拮抗絲氨酸蛋白酶依賴的次黃嘌呤脫氫酶誘導的自由基的連鎖反應，抑制了自由基損傷；拮抗鈉鉀ATP酶依賴的鈣超載和細胞膜損傷，維持了酪氨酸蛋白酶依賴的NF-kB凋亡抑制信號，從而間接防止細胞的凋亡。由于凋亡的整個過程發生非常復雜，其機制仍需要進一步研究。我們的研究顯示，rhKD/APP使腎缺血再灌注損傷中的組織細胞免于凋亡而發揮了器官保護作用。序列表<no>吉林圣元科技有限公司<120>蛋白酶抑制劑的腎細胞保護功能及應用<140><141><160>4<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的PCR擴增引物。<400>1CTCTGAATTCAGGTCTGCAGTGAACAAGCC<210>2<211>31<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的PCR擴增引物。<400>2GAAGTCTAGATTAAATGGCGCTGCCACACAC<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的PCR擴增引物。<400>3TCGAGAAGAGAGAGGTTGTTAGAGAGGTCTGCA<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>根據特定核苷酸序列設計的用作構建表達載體的PCR擴增引物。<400>4GACCTCTCTAACAACCTCTCTCTTC權利要求1、Kunitz型蛋白酶抑制劑在生產用于預防和治療腎缺血后再灌注損傷相關疾病的藥物中的應用。2、根據權利要求1的應用，其中所說的Kunitz型蛋白酶抑制劑是以DNA重組技術制備的。3、根據權利要求l的應用，其中所說的Kunitz型蛋白酶抑制劑是人源的。4、根據權利要求1的應用，其中所說的病理性肝損傷選自急性或慢性腎病和腎動脈硬化。5、一種由Kunitz型蛋白酶抑制劑以及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。全文摘要本發明涉及重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑(rhKD/APP)，特別是涉及rhKD/APP的腎細胞保護功能，及其在生產用于預防和治療腎的再灌注損傷性疾病的藥物中的應用。本發明進一步涉及由作為基本活性成分的重組人Kunitz型蛋白酶抑制劑及一種或多種醫藥上可接受的載體或賦形劑組成的藥物組合物。文檔編號A61K38/57GK101337068SQ200710055839公開日2009年1月7日申請日期2007年7月4日優先權日2007年7月4日發明者韓樹海,顏煒群申請人:吉林圣元科技有限責任公司