專利名稱：一種輪狀病毒滅活疫苗的制備方法
技術領域：
本發明涉及一種輪狀病毒滅活疫苗的制備方法，更具體地說，本發明涉及利用人二倍體細胞系培養輪狀病毒，進而制備單價或多價滅活疫苗的方法。
背景技術：
人輪狀病毒(human rotavirus，HRV)的感染是引起嬰幼兒急性脫水性腹瀉的主要原因，HRV在世界范圍內傳播。目前不論在發達國家還是發展中國家，輪狀病毒仍然是造成的嬰幼兒疾病和死亡的主要原因。輪狀病毒的傳染性很強，能在較短的時間內形成傳播和流行。研制疫苗是控制和預防輪狀病毒感染的有效途徑。
輪狀病毒疫苗的研制前期以口服減毒活疫苗為主，為了對多種HRV血清型產生良好的保護效果，研究人員發展了多價重配株疫苗。目前包括中國、美國、比利時、澳大利亞、印度在內的各國研究機構及公司所分別研制的6種輪狀病毒活疫苗(單一血清型或重配株)都已經進入臨床前研究或投放市場。雖然減毒活疫苗服用方便，能在體內增殖，刺激產生腸道保護抗體，但在安全性方面，卻存在著缺陷，例如，1998年美國FDA批準的人猴重配疫苗Rotashield由于存在著引發腸套疊的隱患而撤出了美國市場)，尤其是HRV屬于RNA病毒，具有高變異性的特點，且疫苗株在人體內和環境中的循環還存在著毒力回復突變及產生新的變異株的風險。在疫苗的安全性方面，滅活疫苗具有絕對的優勢。但輪狀病毒的滅活疫苗目前仍處于研究階段，還沒有進入臨床。
由于滅活疫苗是以注射的方式進行接種，選擇許可的，安全的細胞基質對病毒進行擴增是非常重要的。人二倍體細胞系是目前疫苗生產首選的細胞基質。從目前發展來看，用二倍體細胞制備疫苗將有取代其它原代細胞和傳代細胞的趨勢。作為滅活疫苗，經肌肉注射多次免疫，可能引起免疫超敏反應，因此滅活疫苗的細胞基質要求更高。將輪狀病毒適應至人二倍體細胞，采用人二倍體細胞系作為大規模培養的細胞基質，將具有低超敏反應，有高價值的開發前景。
輪狀病毒在細胞上的增殖存在著如下的特點即動物來源的輪狀病毒較易繁殖，人的輪狀病毒在體外培養時的增殖能力較弱，滴度也較低。輪狀病毒在其敏感細胞如MA104，CV-1等細胞上增殖較快，但在人二倍體細胞上則不能增殖，或增殖很弱。現有技術中，關于輪狀病毒株在人二倍體細胞上的高效增殖尚無相關的文獻報道。
美國專利5,610,049，Human rotavirus HCR3A and method of growing saidrotavirus描述了一種輪狀病毒株HCR3A在人二倍體細胞WI38上擴增至高滴度(106-109PFU/mL)的能力。該專利采用較獨特的方法從糞便中的分離該病毒，并采用了逐步適應的方法將其適應到人二倍體細胞上。該專利覆蓋了利用此病毒株制備疫苗，或與其它血清型輪狀病毒的制備重配株的方法和開發成為疫苗的應用權力。專利中提到，HCR3A作為一株從臨床標本中分離到的新的輪狀病毒，屬于G3型，與猴輪狀病毒SA11具有相似的抗原性，但是核酸電泳帶型完全不同，對該毒株適應于人二倍體細胞培養的原因并未作深入的分析和闡述，并且為特定的輪狀病毒株HCR3A在人二倍體細胞WI38培養，只有一種血清型，并未解決輪狀病毒在人二倍體細胞上培養擴增的難題。
美國專利US 2005/0277194A1，A Packaging Cell Line中提到，利用腺病毒35型E1區轉化人二倍體細胞系，使其表達Ad35，E1B序列，這個細胞系可有效繁殖除腺病毒以外的如人流感病毒、皰疹病毒、輪狀病毒和麻疹病毒。但未見進一步相關的報道。
中國發明專利申請CN 1686540A報道了一種四價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法，利用小牛腎細胞或vero細胞擴增輪狀病毒G1、G2、G3和G4型。擴增后的輪狀病毒經物理混合后，濃縮純化，用福爾馬林或β丙內酯滅活，經無菌檢定后作為疫苗原液，但使用的培養細胞系仍然不是人二倍體細胞，可能具有較高的超敏反應。
因此，如何制備出安全性高、具有良好免疫原性的輪狀病毒滅活疫苗，是本領域急待解決的一個技術難題。
發明內容
本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種以人的二倍體細胞為培養基質的輪狀病毒滅活疫苗的制備方法。
本發明的目的通過下述技術方案予以實現。
*除非另有說明，本發明中所采用的百分數均為重量百分數。
本發明提供了一種輪狀病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于，該方法使輪狀病毒株G1，G2，G3，G4適應至人二倍體細胞系，并在人二倍體細胞系上高效繁殖，將制得的輪狀病毒作為輪狀病毒滅活疫苗的生產毒株。
其中，所述的人二倍體細胞系為KMB17，同時，本發明提供了輪狀病毒的滅活和純化方法，適用于不同血清型輪狀病毒滅活疫苗的研制；純化后的滅活病毒與佐劑混合免疫實驗豚鼠后，采集動物的血清，用純化后的輪狀病毒或其外殼蛋白作為抗原包被酶標板，用ELISA方法檢測輪狀病毒特異的中和抗體，中和抗體滴度最高為1∶1024，最低為1∶128，幾何平均滴度為415.8。
與現有的技術相比，本發明具有以下有益效果1.本發明第一次將輪狀病毒適應到人二倍體細胞KMB17上，從輪狀病毒在其許可細胞系MA104的增殖過程中，篩選出可以在人二倍體細胞系上高效繁殖的毒株，同時對人二倍體細胞系進行篩選，發現KMB17細胞系最適于這些輪狀病毒株的培養，并且找到了敏感克隆。擴增得到的輪狀病毒可作為輪狀病毒疫苗毒種，經濃縮純化滅活后，制成輪狀病毒單價或多價滅活疫苗，用于預防嬰幼兒的輪狀病毒感染性疾病。
2.選用人二倍體細胞系作為滅活輪狀病毒疫苗生產的細胞基質，與現有的其它細胞基質(例如vero細胞)相比，更安全。因此，利用建立的技術平臺，可以采用輪狀病毒的其它血清型作為研究對象，開發成為輪狀病毒滅活疫苗。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，對本發明作進一步清楚地說明，但它們并不是對本發明保護范圍的限定。
實施例1——單價至五價滅活輪狀病毒的制備方法，采用以下步驟(1)細胞的培養人二倍體細胞2BS，SL-7，WI38，KMB17，優選K/MB17用MEM培養基進行培養，培養基的成分為5％-10％的胎牛血清(體積比)，300-592mg/L的L谷氨酰胺，青霉素和鏈霉素各100～200U/mL，0.66g-1.32g/L的碳酸氫鈉；于37℃，5％二氧化碳培養至長成單層后，用于接種輪狀病毒。
(2)病毒的接種病毒毒種的滴度大于或等于107.5TCID50/mL，使用終濃度為15-50μg/mL的胰酶，優選25μg/mL的胰酶于37℃激活20-45分鐘(優選45分鐘)，以感染復數為m.o.i＝0.1～3接種細胞，于37℃吸附40-90分鐘，吸棄病毒液，加入含有終濃度為0.5-1μg/mL胰酶的無血清MEM培養基，于37℃培養至產生明顯的細胞病變。
(3)病毒的收獲當有75％的細胞發生病變時，收獲病毒。將培養物于37℃，和-20℃反復凍融2-4次，以8000-10,000rpm/min離心30-60分鐘，棄細胞沉淀，收集上清液，于-80℃保存。
(4)病毒的濃縮將收獲的上清液用截流分子量為100kD-300kD的超濾膜超濾濃縮。應用QuickStand超濾設備，對病毒收獲液進行濃縮，通過計算濃縮前后的體積比，超濾外液中的輪狀病毒顆粒含量進行檢測，統計濃縮的比例和得率應等于或大于為1∶35和95％，也可以用PEG 8000來濃縮，濃縮目的達到即可。
(5)病毒的純化利用凝膠過濾，上樣緩沖液為0.5-1M的PBS，洗脫緩沖液為20-30mM的PBS，pH值為7.0-7.4。病毒顆粒將主要存在于洗脫峰中，而核酸和其它分子量較小的雜蛋白將出現在后續的峰中。經過凝膠過濾粗純后，使用陰離子交換層析進一步的精純。也可用蔗糖密度梯度離心法來純化，純度達到95％即可。
(6)病毒的滅活采用1∶4000的β-丙內酯于4℃滅活24-72小時。經0.2μm或0.45μm的濾膜除菌過濾后，即為單價的病毒原液。也可以用福爾馬林來滅活，滅活后滅活完全，滅活試劑殘留量達到指標即可。
(7)成品的配制將單價的病毒原液按等體積比混合。混合后的疫苗原液即為成品。
實施例2四價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法，采用以下的工藝步驟(1)細胞的制備將KMB17細胞用胰酶消化分散，加入MEM完全培養基，于37℃培養至長成匯流狀單層，于種毒前12小時將培養基更換為不含血清的MEM維持液。
(2)病毒的接種和培養將輪狀病毒株G1，G2株，G3株，G4株用終濃度為20μg/mL的胰酶，于37℃激活45分鐘，吸棄維持液，用同樣的維持液將KMB17細胞再清洗一次，以感染復數為m.o.i＝3接種細胞，于37℃吸附90分鐘，吸棄病毒液，加入含有終濃度為0.5μg/mL胰酶的無血清MEM培養基，于37℃培養至產生明顯的細胞病變(一般為3-5天，m.o.i＝3)。
(3)病毒收集約有75％的細胞發生病變時，收獲病毒。將培養物于37℃，和-20℃反復凍融3次，以10,000rpm/min離心30分鐘，棄細胞沉淀，收集上清液，于-80℃保存。
(4)病毒的濃縮將收獲的上清液用截流分子量為100kD的超濾膜超濾濃縮。應用QuickStand超濾設備，對病毒收獲液進行濃縮，通過計算濃縮前后的體積比，超濾外液中的輪狀病毒顆粒含量進行檢測，統計濃縮的比例和得率為1∶35和95％。
(5)病毒的純化利用凝膠過濾，上樣緩沖液為1M的PBS，洗脫緩沖液為20mM的PBS，pH值為7.2。病毒顆粒將主要存在于洗脫峰中，而核酸和其它分子量較小的雜蛋白將出現在后續的峰中。經過凝膠過濾粗純后，使用陰離子交換層析進行進一步的精純。
(6)病毒的滅活采用1∶4000的β-丙內酯于4℃滅活24小時。經0.2μm的濾膜除菌過濾后，即為單價的病毒原液。
(7)單價的病毒疫苗原液應經滅活效力試驗，即在輪狀病毒敏感細胞上盲傳3次，結果應為陰性。將各單價的滅活病毒原液過濾除菌，即為滅活輪狀病毒疫苗原液，滅活病毒原液加入終濃度為3mg/mL的甘氨酸作為穩定劑，終濃度為5.0mg/mL的2-苯氧乙醇作為防腐劑。選擇氫氧化鋁作為佐劑，將濃度為6-8％的氨水溶液緩慢加入至濃度為4％(g/V)的三氯化鋁中，于60℃下以每分鐘15-20轉的速度攪拌，至pH6.9制成氫氧化鋁佐劑。免疫的滅活樣品中氫氧化鋁的終濃度為1.0mg/mL，與滅活疫苗于室溫攪拌30分鐘混合。配不同價疫苗時，佐劑的終濃度與混合方法都是一樣的。
實施例3——參考中國生物制品規程進行原液檢定，(1)蛋白含量測定利用Lowry法測定，蛋白質含量應不高于20μg/mL。測定結果均小于20μg/mL。
(2)抗原量用購買或自制針對兩種輪狀病毒型特異的商品化單克隆抗體包被酶標板，進行檢測。采用雙抗體夾心酶聯免疫法，抗原量應不低于3200EU/mL。
(3)無菌檢查依法檢查，樣品為無菌，符合規定。
(4)牛血清白蛋白殘留量用酶聯免疫法檢測，牛血清白蛋白殘留量應不高于50ng/mL。檢測結果的平均值為20ng/mL。
(5)病毒滅活驗證試驗滅活后取樣在KMB17細胞上于37℃培養5天，同法連續盲傳三代，用ELISA法檢測輪狀病毒抗原，應為陰性。檢測合格。
(6)pH值應為6.0～7.0。檢測合格。
(7)細菌內毒素檢查應小于10EU/mL(凝膠限量試驗法)。檢測合格。
(8)佐劑含量檢測氫氧化鋁的含量應為0.80～1.20mg/mL。檢測合格。
(9)輔料含量測定2-苯氧乙醇的含量應為4.0～6.0mg/mL。
(10)效力測定經檢定合格的病毒原液即為滅活病毒疫苗成品。
實施例4～8將接種的輪狀病毒株分別改為G1，G3株，G2株，G4，G9株中的一種，其它過程重復實施例2。
實施例9～18將接種的輪狀病毒株分別改為G1和G3株，G1和G2株，G1和G4株，G3和G2株，G3和G4株，G2和G4株，G1和G9株，G2和G9株，G3和G9株，G4和G9株中的一種組合，其它過程重復實施例2。
實施例19五價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將接種的輪狀病毒株改為G1，G3株，G2株，G4株和G9株，其它過程同實施例4。
實施例20～27將接種的輪狀病毒株改為G1G2G3株，G2G3G4株，G1G3G4株，G1G2G9株，G2G3G9株，G1G3G9株，G3G4G9株，G2G4G9株中的一種組合，其它工藝步驟同實施例2。
實施例28四價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將培養輪狀病毒的細胞基質改為人二倍體細胞2BS，其它過程與實施例2相同。
實施例27～31單價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——接種的輪狀病毒株改為G1，G3株，G2株，G4株和G9株，其它工藝步驟同應用實施例4～8。
實施例32～41二價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將培養輪狀病毒的細胞基質改為人二倍體細胞2BS，其它工藝步驟同應用實施例9～18。
實施例42五價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將培養輪狀病毒的細胞基質改為人二倍體細胞2BS，其它工藝步驟同應用實施例17。
實施例43～50三價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將培養輪狀病毒的細胞基質改為人二倍體細胞2BS，其它工藝步驟同應用實施例20～27。
實施例51四價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將培養輪狀病毒的細胞基質改為人二倍體細胞SL-7，其它工藝步驟同應用實施例2。
實施例51～56單價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將培養輪狀病毒的細胞基質改為人二倍體細胞SL-7，其它工藝步驟同應用實施例4～8。
實施例57～66二價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將培養輪狀病毒的細胞基質改為人二倍體細胞SL-7，其它工藝步驟同應用實施例9～18。
實施例67五價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將培養輪狀病毒的細胞基質改為人二倍體細胞SL-7，其它工藝步驟同應用實施例19。
實施例68～75三價輪狀病毒滅活疫苗的制備方法——將培養輪狀病毒的細胞基質改為人二倍體細胞SL-7，其它工藝步驟同應用實施例20～27。
權利要求
1.一種輪狀病毒滅活疫苗的制備方法，其特征在于，該方法使輪狀病毒株G1，G2，G3，G4適應至人二倍體細胞系，并在人二倍體細胞系上高效繁殖，將制得的輪狀病毒作為輪狀病毒滅活疫苗的生產毒株。
2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述的人二倍體細胞系為KMB17，
3.根據權利要求1或2所述的制備方法，其特征在于，將純化后的滅活病毒與佐劑混合免疫實驗豚鼠后，采集動物的血清，用純化后的輪狀病毒或其外殼蛋白作為抗原包被酶標板，用ELISA方法檢測輪狀病毒特異的中和抗體，中和抗體滴度最高為1∶1024，最低為1∶128，幾何平均滴度為415.8。
全文摘要
本發明公開了一種輪狀病毒滅活疫苗的制備方法。該方法使輪狀病毒株G1，G2，G3，G4適應至人二倍體細胞系，并在人二倍體細胞系上高效繁殖，將制得的輪狀病毒作為輪狀病毒滅活疫苗的生產毒株。其中，所述的人二倍體細胞系為KMB17。本發明選用人二倍體細胞系作為滅活輪狀病毒疫苗生產的細胞基質，與現有的其它細胞基質相比，更安全。因此，利用建立的技術平臺，可以采用輪狀病毒的其它血清型作為研究對象，開發成為輪狀病毒滅活疫苗。
文檔編號A61P31/14GK101020053SQ200710065708
公開日2007年8月22日 申請日期2007年3月13日 優先權日2007年3月13日
發明者劉馨, 孫茂盛 申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所