專利名稱：用二次諧波和雙光子激發熒光實現高空間分辨視網膜成像的方法
技術領域：
本發明將二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像以及雙光子激發熒光成像相結合，對視 網膜進行高空間分辨成像，以實現眼底疾病的早期診斷。由于視網膜各細胞層在結構及光學 性質上各異，利用這種成像方法不僅能夠根據視網膜細胞層各自的特點采用相應的成像手段， 而且能夠對同一細胞層進行多種成像方法的復合測量，從而獲得互補的功能信息。因此，本 發明將為各類視網膜疾病的早期診斷以及視覺科學的研究提供一種新型的具有三維高空間分 辨率的視網膜單細胞成像手段，對降低視網膜患者的失明風險具有重要意義。
背景技術：
視覺科學的研究以及眼科臨床上對各類視網膜疾病的早期診斷，要求發展新型的具有更 高空間分辨率、可三維成像、靈敏度高、能夠獲取視網膜組織功能信息的成像手段。將自適 應光學技術與具有高空間分辨率并能夠提供更多新型功能對比信息的成像方法相結合是新一 代視網膜成像技術的發展方向，而發展一種能滿足視網膜成像特殊要求的具有高空間分辨率 的光學成像技術是實現這一目標的關鍵。目前已在臨床獲得應用或正在發展的視網膜成像手段包括激光掃描共焦成像、光學相干 層析成像以及眼底自體熒光成像等。雙光子激發熒光和二次諧波是近幾年來發展起來的并在 生物醫學領域獲得廣泛應用的新型成像技術，具有高空間分辨率、靈敏度高、特異性好以及 對樣品損傷小等優點，有望在新一代視網膜成像設備中獲得應用。雙光子激發熒光可以顯著提高熒光成像的穿透深度，避免紫外光對視網膜的損傷。由于 雙光子激發的吸收譜很寬，利用單一光源可以激發視網膜內不同的熒光團，而且可以很好地 解決熒光探測中的光譜交疊問題。在色素上皮細胞層主要有兩種自體熒光團，即脂褐素和黑 色脂褐素。研究表明，這些熒光團在色素上皮細胞層的集聚和分布與年齡以及視網膜疾病有 關。因此采用雙光子激發視網膜色素上皮細胞層的自體熒光成像可以為眼疾病的病理研究和 早期診斷提供方法和依據。二次諧波成像是近年迅速發展并引起生物醫學界關注的一種新型高分辨光學成像方法。 與雙光子激發熒光相同，二次諧波也是二階非線性過程，因此具有雙光子熒光成像的優點。 但與雙光子熒光相比，二次諧波成像的獨特之處在于信號光的空間分布與微觀結構有關，并 且對分子排列敏感，具有很高的三維空間分辨能力。因此，二次諧波成像已經被用于細胞膜、 細胞和組織等各類生物體系的活體觀察，如有絲分裂細胞中的紡錘體和微絲微管。對于成層 狀分布的視網膜感光細胞陣列，二次諧波是一種很好的觀測手段，可以對感光細胞的細胞膜 成像，研究細胞的分布密度；借助于染料還可測量細胞膜的膜電位，進行細胞的功能成像。 另外，二次諧波具有偏振敏感特性，對于神經節細胞層的成像具有重要的意義。當偏振激發 光通過微絲狀的神經節細胞的軸突傳輸并反射回探測器時，其偏振態發生變化，改變的大小 取決于光所通過的微絲的數量，因此通過測量反射光的偏振態改變，就可以得到神經節細胞 層的厚度，判定視神經細胞的丟失多少。本發明是一種用二次諧波和雙光子激發熒光實現高空間分辨視網膜成像的新方法，有望 在視網膜疾病的早期診斷以及視覺科學研究中發揮巨大作用。發明內容本發明通過光路系統、機械系統以及電子學系統的特殊設計，將超短脈沖激光器和激光 掃描共焦檢眼鏡相耦合，利用檢眼鏡對人眼視網膜檢査的同時，獲取二次諧波信號、偏振敏 感二次諧波信號以及雙光子激發熒光信號。采用計算機處理與控制系統得到視網膜各細胞層圖像，并與激光掃描共焦檢眼鏡產生的視網膜反射圖像形成對比信息。本發明主要針對視網膜三個重要功能的細胞層色素上皮細胞層、感光細胞層以及神經 節細胞層，分別進行雙光子激發熒光成像、二次諧波成像以及偏振敏感二次諧波成像，通過 計算機處理與控制系統得到視網膜三個重要功能細胞層的圖像。本發明可對視網膜三個重要功能細胞層的各細胞層，進行二次諧波成像、偏振敏感二次 諧波成像、雙光子激發熒光成像的復合測量。通過計算機處理與控制系統得到視網膜三個重 要功能細胞層的各細胞層的二次諧波與雙光子激發熒光的合成圖像或偏振敏感二次諧波與雙 光子激發熒光的合成圖像或二次諧波與偏振敏感二次諧該的合成圖像或二次諧波、偏振敏感 二次諧波與雙光子激發熒光的合成圖像，從而獲得同一細胞層的互補功能信息。本發明將超短脈沖光源與激光掃描共焦檢眼鏡相耦合，利用單通道法實現二次諧波和雙 光子激發熒光視網膜高空間分辨成像原理及系統的舉例說明如圖1所示。系統主要由高重復頻 率超短脈沖激光器101、半波片102、功率衰減器103、激光掃描共焦檢眼鏡105、雙色鏡107、 窄帶濾光片112、帶通或高通濾光片IIO、檢偏器U3、光電倍增管114以及計算機處理與控制 系統117等組成。本發明將超短脈沖光源與激光掃描共焦檢眼鏡相耦合，利用雙通道法實現二次諧波和雙 光子激發熒光視網膜高空間分辨成像原理及系統的舉例說明如圖2所示。系統主要由高重復頻 率超短脈沖激光器201、半波片202、功率衰減器203、激光掃描共焦檢眼鏡205、雙色鏡207、 窄帶濾光片212、帶通或高通濾光片210、偏振分光棱鏡213、光電倍增管214以及計算機處理 與控制系統216等組成。本發明采用高重復頻率超短脈激光器，如鈦寶石鎖模飛秒激光器或其它高重復頻率飛秒 或皮秒激光器或超快鎖模激光器作為雙光子激發測量系統的激發光源。其波長可調且允許變 化范圍700-1000nm。根據視網膜不同細胞層特點選擇合適波長進行檢測。本發明在高重復頻率超短脈沖激光器如飛秒激光器光路中采用了功率衰減器，衰減從高 重復頻率超短脈沖激光器如鈦寶石激光器輸出的功率，使輸入到眼睛的光功率滿足關于激光 安全應用的美國國家標準ANSI 。本發明利用半波片改變激光的偏振方向，使之能夠在相互垂直的兩個方向進行切換。本發明利用雙色鏡使視網膜二次諧波信號和雙光子激發熒光信號從視網膜反射光信號中 分離，實現二次諧波和雙光子激發熒光與視網膜反射光的對比成像。本發明利用帶通或高通濾光片，有效避開二次諧波的峰值波長，挑選出雙光子激發熒光，號B本發明利用窄帶濾光片，挑選出二次諧波信號，過濾熒光信號和一次諧波信號。 本發明利用檢偏器，透過平行與垂直于激發光偏振方向的二次諧波信號。 本發明利用偏振分光棱鏡，將二次諧波信號分成平行與垂直于激發光偏振方向的兩個偏 振正交信號。本發明采用高靈敏度的光電倍增管作為二次諧波、偏振敏感二次諧波、雙光子激發熒光 以及視網膜反射光的探測裝置，將探測結果輸入到計算機處理與控制系統，實現成像。本發明采用一個通道依次記錄平行與垂直于激發光偏振方向的兩種偏振態信號，不必對 系統進行校準，提高精度。本發明利用二次諧波、偏振敏感二次諧波、雙光子激發熒光與反射光同時成像的方法， 將反射圖像中視網膜血管網狀分布與二次諧波、偏振敏感二次諧波、雙光子激發熒光所成圖 像對應，用以校正眼底檢査過程中由于眼球微動而造成的誤差。
圖1超短脈沖光源耦合激光掃描共焦檢眼鏡單通道測量方法及其裝置示意圖。 圖2超短脈沖光源耦合激光掃描共焦檢眼鏡雙通道測量方法及其裝置示意圖。
具體實施例方式
下面結合附圖對技術方案的實施作進一步的詳細描述。
如圖1所示，由高重復頻率超短脈沖激光器如鈦寶石鎖模飛秒激光器101，輸出的近紅 外超短脈沖經半波片102、功率衰減器103后，以光纖104輸入激光掃描共焦檢眼鏡105的 掃描頭，逐點掃描人眼106的視網膜三個重要功能細胞層，并將計算機處理與控制系統117 和激光掃描共焦檢眼鏡105的掃描控制單元120相連，實現同步掃描。此時，光脈沖到達角 膜的最大輻射能量小于允許的最大曝光量。從激光掃描共焦檢眼鏡105輸出的光信號，通過 雙色鏡107分光后，將二次諧波信號和熒光信號與反射光信號分離。反射光信號被光電倍增 管108收集并用于隨后的反射光成像119; 二次諧波信號和熒光信號經分束鏡109，分成兩束 光。 一束光經帶通或高通濾光片110，挑選出雙光子激發熒光信號，通過高靈敏度的光電倍 增管lll探測，實現雙光子激發熒光成像118;另一束光經窄帶濾光片112，挑選出二次諧波 信號，通過高靈敏度的光電倍增管114探測，實現二次諧波成像115。根據視網膜各細胞層 的特點，在窄帶濾光片112和光電倍增管114之間插入檢偏器113，將檢偏器113的透光軸依 次旋轉到平行、垂直于激發光的偏振方向，通過同一光電倍增管114接收探測，得到兩個相 互垂直的偏振光分量的二次諧波圖像；切換半波片102，使激發光的偏振方向與原激發光的 偏振方向垂直，再次得到兩個相互垂直的偏振光分量的二次諧波圖像，通過計算機處理與控 制系統對這四幅二次諧波圖像進行處理，提取出二次諧波的各向異性度信息，實現偏振敏感 二次諧波成像116。
為補償眼球在光照時微動造成的成像偏差，采用二次諧波、偏振敏感二次諧波、雙光子 激發熒光與視網膜反射光同時成像，并以反射圖像中視網膜血管網狀分布為標準與二次諧波、 偏振敏感二次諧波、雙光子激發熒光所成圖像結果對應，即在記錄反射光成像時，眼球移動 的位移矢量被計算機117計算并用于成像過程的校準。用這種方法，計算機處理與控制系統 117每次記錄將校正為眼球發生移動前的原始狀態。
如圖2所示，由高重復頻率超短脈沖激光器如鈦寶石鎖模飛秒激光器201，輸出的近紅 外超短脈沖經半波片202、功率衰減器203后，以光纖204輸入激光掃描共焦檢眼鏡205的 掃描頭，逐點掃描人眼206的視網膜三個重要功能細胞層，并將計算機處理與控制系統216 和激光掃描共焦檢眼鏡205的掃描控制單元223相連，實現同步掃描。從激光掃描共焦檢眼 鏡205輸出的光信號，通過雙色鏡207分光后，將二次諧波信號和熒光信號與反射光信號分 離，反射光信號被光電倍增管208收集并用于隨后的反射光成像222; 二次諧波信號和熒光 信號經分束鏡209，分成兩束光。 一束光經帶通或高通濾光片210，挑選出雙光子激發熒光信 號，通過高靈敏度的光電倍增管211探測，實現雙光子激發熒光成像221;另一束光經窄帶 濾光片212，挑選出二次諧波信號，經偏振分光棱鏡213后，偏振方向與213的光軸平行的 二次諧波分量透射，與之垂直的二次諧波分量反射。這兩個分量分別由對應的光電倍增管214、 215探測，得到兩個相互垂直的偏振光分量的二次諧波圖像219、 220。此時，偏振分光棱鏡 213光軸與激發光偏振方向平行；切換半波片，使激發光的偏振方向與原激發光的偏振方向垂直，再次得到兩個相互垂直的偏振光分量的二次諧波圖像，通過計算機處理與控制系統216
對這四幅二次諧波圖像進行處理，實現偏振敏感二次諧波成像218和二次諧波成像217。
綜上所述，本發明將二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像以及雙光子激發熒光成像相 結合，對視網膜進行高空間分辨成像。為目前多種視網膜疾病，如糖尿病視網膜病、青光眼 和老年黃斑變性等疾病的病理研究和早期診斷提供了新方法和依據。因此，本發明對各類視 網膜疾病的早期診斷，降低視網膜患者的失明風險具有重要意義，可廣泛用于醫學研究領域 及臨床醫學診斷方面。
權利要求
1. 一種利用超短脈沖激光器，實現視網膜成像的方法。
2. 根據權利要求l所述的方法，超短脈沖激光器既可以是鈦寶石鎖模飛秒激光器，也可以是 各類光纖激光器。
3. 根據權利要求1和2所述的方法，飛秒激光器用于激發視網膜的不同層的細胞和組織，通 過非線性的效應，產生二次諧波信號或雙光子激發熒光信號，作為對比度，對視網膜進 行高空間分辨的成像方法。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特征是將二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像以及雙光 子激發熒光成像相結合，實現視網膜的復合測量的方法。
5. 根據權利要求4所述的方法，視網膜的成像系統是將高重復頻率超短脈沖激光器、功率衰 減器、激光掃描共焦檢眼鏡以及計算機處理與控制系統等組成的成像系統。
6. 根據權利要求5所述的方法，該成像對視網膜三個重要的功能細胞層色素上皮細胞層、 感光細胞層以及神經節細胞層，分別進行雙光子激發熒光成像、二次諧波成像以及偏振 敏感二次諧波成像，獲得視網膜三個重要功能細胞層的圖像。
7. 根據權利要求6所述的方法，對測量結果，通過計算機處理與控制系統得到視網膜三個重 要功能細胞層的各細胞層的二次諧波與雙光子激發熒光的合成圖像或偏振敏感二次諧波 與雙光子激發熒光的合成圖像或二次諧波與偏振敏感二次諧波的合成圖像或二次諧波、 偏振敏感二次諧波與雙光子激發熒光的合成圖像，從而獲得同一細胞層的互補功能信息。
8. 根據權利要求2所述的方法，其特征是用高重復頻率超短脈沖激光器，如鈦寶石鎖模飛秒 激光器或其它高重復頻率飛秒或皮秒激光器或超快鎖模激光器作為視網膜雙光子激發光 源。
9. 根據權利要求2所述的方法，其特征是激光器的光譜范圍既可是固定波長也可是可調波 長，波長允許變化范圍700-1000nm，其脈沖重復頻率既可是固定，也可在一定的范圍內 改變，但每一次工作頻率穩定，重復頻率變化范圍50MHz-500MHz。
10. 根據權利要求1所述的方法，其特征是在高重復頻率激光器光路中采用功率衰減器，將 高重復頻率激光器輸出的超短脈沖的功率衰減到ANSI安全標準以下。
11. 根據權利要求3所述的方法，其特征是利用半波片改變激光的偏振方向，使之能夠在相 互垂直的兩個方向進行切換。
12. 根據權利要求2所述的方法，其特征是進入激光掃描共焦檢眼鏡掃描頭的光脈沖經過瞄 準儀聚焦后由光纖輸入。
13. 根據權利要求l， 2和3所述的方法，其特征是利用雙色鏡將二次諧波信號和雙光子激發 熒光信號從視網膜反射光信號中分離出來。
14. 根據權利要求3和6所述的方法，其特征是利用窄帶濾光片和帶通或高通濾光片，分別 挑選出二次諧波信號和雙光子激發熒光信號。
15. 根據權利要求l， 3，和7所述的方法，其特征是根據視網膜各細胞層的特點插入檢偏器， 透過二次諧波信號平行與垂直于激發光偏振方向的信號；或利用偏振分光棱鏡，將二次 諧波信號分成平行與垂直于激發光偏振方向的信號。
16. 根據權利要求3所述的方法，其特征是視網膜同一位置的反射光與二次諧波和雙光子激發 熒光分別成像，在記錄反射光成像時，眼球移動的位移矢量被計算機數據處理系統記錄 并用于成像過程的校準。
全文摘要
本發明將二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像以及雙光子激發熒光成像相結合，對視網膜進行高空間分辨成像，以實現眼底疾病的早期診斷。通過激光掃描共焦檢眼鏡與超短脈沖激光器相耦合，主要對視網膜三個重要功能的細胞層色素上皮細胞層、感光細胞層以及神經節細胞層，分別進行雙光子激發熒光成像、二次諧波成像以及偏振敏感二次諧波成像，并對同一細胞層進行二次諧波成像、偏振敏感二次諧波成像、雙光子激發熒光成像的復合成像，通過計算機處理系統得到各細胞層圖像和同一細胞層的合成圖像，從而獲得各細胞層的功能信息。本發明將為各類視網膜疾病，如糖尿病視網膜病、青光眼和老年黃斑變性等疾病的病理研究和早期診斷以及視覺科學的研究提供一種新型的具有三維高空間分辨率的視網膜單細胞成像手段，對降低視網膜患者的失明風險具有重要意義。
文檔編號A61B3/14GK101254091SQ200710085330
公開日2008年9月3日 申請日期2007年2月28日 優先權日2007年2月28日
發明者孫怡雯, 屈軍樂, 牛憨笨, 許改霞, 趙羚伶 申請人:深圳大學