化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療血液、骨髓造血系統癌癥藥物的應用的制作方法

專利名稱：化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療血液、骨髓造血系統癌癥藥物的應用的制作方法
技術領域：
本發明屬于采用免疫治療法治療腫瘤的技術領域，特別是涉及 一種蛋氨酸腦啡肽在體內注射和體外細胞培養條件下對血液系統(包括造血系 統)癌癥細胞進行治療，以達到治療目的的方法。
背景技術：
1975年Hughes等人從豬腦抽提液中分離的、具有內源性嗎啡 樣活性的蛋氨酸腦啡肽(methionine enk印halin， MEK)。后來研究發現是由 腎上腺產生的前激素和前腦啡肽衍生來，釋放入血，由酪-甘-甘-苯丙-蛋氨酸 五個氨基酸構成的五肽。正常體內含量極低，每毫升血漿50-150pg。 1975年 被首次發現蛋氨酸腦啡肽具有免疫調節作用。白細胞包括有粒白細胞(中性 粒細胞，嗜酸性粒細胞，嗜堿性粒細胞)無粒白細胞(淋巴細胞，單核細胞). 正常的T淋巴細胞，巨噬細胞，自然殺傷細胞(NK)含有MEK受體， 一些的腫 瘤細胞也含有MEK受體。近年來研究證明蛋氨酸腦啡肽對免疫系統具有如下作 用增加淋巴細胞數量和活性，增加CD2， CD4， CD8等受體分子的表達，增加 T細胞玫瑰花節形成百分率，增加NK細胞數量活性，增加有絲分裂素誘導的 細胞增殖，增加Y-干擾素^白介素和腫瘤壞死因子等多種細胞因子的產生， 增加單核細胞(巨噬細胞)和中性粒細胞的趨化作用，對樹突狀細胞的成熟和 活性有明顯的促進作用，同時可以誘導腫瘤細胞調亡。我們的研究也證明了上 述部分結果。雖然蛋氨酸腦啡肽具有顯著的免疫調節作用，誘導腫瘤細胞凋亡 作用，但如何對血液系統腫瘤患者加以治療，卻沒有具體方法。有些文獻中提 到在患者血液中加入蛋氨酸腦啡肽溶液，在一定條件下培養，再輸入人體內。 但經大量的實驗等研究發I見，這些方法不能有效地用于腫瘤患者的治療，也不 能增加患者的免疫能力。

發明內容
發明目的本發明提供一種化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療血液、骨髓 造血系統癌癥藥物的應用，其目的在于解決現有的蛋氨酸腦啡肽在治療白血病 方面不能有效治療、也不能增加患者的免疫力方面存在的問題。
技術方案本發明是通過以下技術方案實現的
化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療血液、骨髓造血系統癌癥藥物的應用， 所述的蛋氨酸腦啡肽以0. 0001-10mg/ml制備成注射劑作為治療血液、骨髓造 血系統癌癥的藥物。
將上述濃度范圍內的蛋氨酸腦啡肽在體外T淋巴細胞的細胞培養條件中 進行培養，體外培養的溫度25-38C°范圍、2-7天的時間，使其濃度范圍為 10—2 10—16克分子/升制成混合注射劑。
蛋氨酸腦啡肽加在體外淋巴細胞的細胞培養條件中與一定濃度的淋巴因 子、胸腺肽中的一種一起使用，淋巴因子選用白細胞介素，蛋氨酸腦啡肽與白 細胞介素的重量比為l: 100 10000;蛋氨酸腦啡肽與胸腺肽的重量比為1: 100 10000。
蛋氨酸腦啡肽還包括其它蛋氨酸腦啡肽的類似物，如亮氨酸腦啡肽以相
同的方法使用。
優點及效果本發明的特點在于蛋氨酸腦啡肽在體內或體外直接作用于培 養條件下的免疫系統細胞，用量小，效率高。經蛋氨酸腦啡肽激活的免疫系統 細胞具有比普通方法激活更高效的免疫細胞增殖數量和細胞活性，一般應高出 5-10倍，特別是T淋巴細胞數量明顯增加。但是，應當指出，蛋氨酸腦啡肽是
一種對免疫系統細胞數量和活性雙向調節劑，僅僅在一定的濃度范圍內有正向 調節作用，超出此范圍及呈現負向調節作用，抑制免疫系統細胞的生長。
具體實施例方式下面通過具體實施例詳細說明如下 實施例l:
將化合物蛋氨酸腦啡肽溶解于注射用水或生理鹽水，分別制成濃度為 0. 0005mg/ml、 0. 001mg/ml 0. 7mg/ml、 2mg/ml注射齊lj。
實施例2:
將化合物蛋氨酸腦啡肽溶解于注射用水或生理鹽水，分別制成濃度為 0.0005mg/ml、 0. 001mg/ml 0. 7mg/ml、 2mg/ml的凍干粉針制劑。
給藥方式為通過皮下、靜脈或腹腔注射的方式直接施用于患者。 實施例3:
取正常人靜脈血30毫升，放入含有肝素抗凝劑的試管內(每毫升血液加 入O. 1毫升125-205U)，領取含有淋巴細胞分離液20毫升的試管，將血液輕 輕加到淋巴細胞分離液上，2000轉/分，離心20分鐘，用吸管吸取淋巴細胞 層，用1640培養液洗滌兩次，每次加入30毫升，1500轉/分，5分鐘。調整 細胞濃度為106個/毫升，按下列設計分組培養
(1) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清的細胞培養液；
(2) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—2克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(3) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—5克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(4) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，1(T克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(5) ， 106淋巴細胞+ 10亳升含有10%小牛血清，10—7克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(6) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—8克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(7) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—9克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(8) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—1()克分子/升蛋氨酸腦啡肽的細胞培養液；
(9) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，1(T'克分子/升蛋氨酸 腦啡肽的細胞培養液；
(10) ， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—'6克分子/升蛋氨 酸腦啡肽的細胞培養液；
將上述培養放入37t:細胞培養箱中進行培養，分別在24、 48、 72、 96、 120、 168小時時取樣進行細胞計數，按照免疫學實驗技術進行E-花環形成試 驗，檢測陽性百分率(百分率越高，表示T細胞活性越高)，并將120小時的 結果作為最終結果，通過靜脈或腹腔注射的方法回輸患者體內。通過實驗證明， 蛋氨酸腦啡肽在體外培養再回輸體內的方法，只有在此濃度下(10—2 10—'6克 分子/升)及這種培養條件(體外培養的溫度25-38C。范圍、2-7天的時間) 才有治療和免疫的效果，其它情況均為無效。
實施例4:
.1， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清的細胞培養液；
2， 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清，10—3克分子/升蛋氨酸腦啡 肽的細胞培養液+ 1毫克小牛胸腺肽；胸腺肽的濃度為1毫克/毫升。
將上述培養放入37。C細胞培養箱中進行培養，分別在24、 48、 72、 96、 120小時時取樣進行細胞計數，按照免疫學實驗技術進行E-花環形成試驗，并 將120小時的結果作為最終結果，將細胞處理后回輸體內。
實施例5:
1, 106淋巴細胞+ 10毫升含有10%小牛血清的細胞培養液；
2， 106淋巴細胞+10毫升含有10%小牛血清，10—3克分子/升蛋氨酸腦啡 肽的細胞培養液+ l毫克白細胞介素；白細胞介素的濃度為2毫克/毫升。
將上述培養放入37-C細胞培養箱中進行培養，分別在24、 48、 72、 96、 120小時時取樣進行細胞計數，按照免疫學實驗技術進行E-花環形成試驗，并
將120小時的結果作為最終結果，將細胞處理后回輸體內。 在以上實施例的研究基礎上；
李某，男，25歲，中性粒細胞白血病晚期，經多次化療效果有限，生命 垂危，后采用蛋氨酸腦啡肽體內外治療。體內采用靜脈注射法，用量為 O.OOOlmg-100mg不等。每日一次或隔日一次，連續治療30天。體外治療取靜 脈血30毫升，分離淋巴細胞，計數，調濃度為10V毫升，加入蛋氨酸腦啡肽， 濃度為10—2-10—'8克分子，37C°培養6天，細胞數量增殖到IOV毫升.回輸， 30日檢測，免疫系統細胞恢復正常，白細胞從2000/毫升升至3500 3600/毫 升，異常淋巴細胞、幼稚粒細胞消失，血紅蛋白和血小板恢復正常，骨髓穿刺 取材分析，各種血液指標分析表明均恢復正常，人體狀態全面恢復。
韓某，女，56歲，骨髓瘤，經多次化療效果有限，后采用蛋氨酸腦啡肽 體內外治療。體內采用靜脈注射法，用量為O.OOOlmg-100mg不等。每日一 次或隔日一次，連續治療40天。體外治療取靜脈血30毫升，分離淋巴細胞， 計數，調濃度為10V毫升，加入蛋氨酸腦啡肽，濃度為10—2-10—18克分子，37C °培養6天，細胞數量增殖到IOV毫升.回輸，30日檢測，免疫系統細胞恢復 正常，抗體(IgG)產生正常。
實驗結論上述病例7例，在特定濃度范圍的蛋氨酸腦啡肽加在體內注射 和體外淋巴細胞細胞培養條件下對血液細胞癌癥均有有明顯的治療作用，血液 細胞腫瘤患者均出現明顯的癥狀改善，有效率100%。
權利要求
1、化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療血液、骨髓造血系統癌癥藥物的應用，所述的蛋氨酸腦啡肽以0.0001-10mg/ml制備成注射劑作為治療血液、骨髓造血系統癌癥的藥物。
2、 根據權利要求1所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療血液、骨髓 造血系統癌癥藥物的應用，其特征在于將權利要求l濃度范圍內的蛋氨酸 腦啡肽在體外T淋巴細胞的細胞培養條件中進行培養，體外培養的溫度25-38C °范圍、2-7天的時間，使其濃度范圍為10—2 10—16克分子/升制成混合注射 劑。
3、 根據權利要求2所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療血液、骨髓 造血系統癌癥藥物的應用，其特征在于蛋氨酸腦啡肽加在體外淋巴細胞的細 胞培養條件中與一定濃度的淋巴因子、胸腺肽中的一種一起使用，淋巴因子選 用白細胞介素，蛋氨酸腦啡肽與白細胞介素的重量比為1: 100 10000;蛋氨 酸腦啡肽與胸腺肽的重量比為1: 100 10000。
4、 根據權利要求1所述的化合物蛋氨酸腦啡肽作為制備治療血液、骨髓 造血系統癌癥藥物的應用，其特征在于蛋氨酸腦啡肽還包括其它蛋氨酸腦啡 肽的類似物，如亮氨酸腦啡肽以相同的方法使用。
全文摘要
本發明涉及一種化合物蛋氨酸腦啡肽用于治療血液、骨髓造血系統癌癥的領域，特別是涉及一種蛋氨酸腦啡肽在體內注射和體外細胞培養條件下對血液系統(包括造血系統)癌癥細胞進行治療，以達到治療目的的方法。所述的蛋氨酸腦啡肽以0.0001-10mg/ml制備成注射劑或在體外T淋巴細胞的細胞培養條件中進行培養，使其濃度范圍為10^-2～10^-16克分子/升制成混合注射劑。本發明的特點在于蛋氨酸腦啡肽在體內或體外直接作用于培養條件下的免疫系統細胞，用量小，效率高。經蛋氨酸腦啡肽激活的免疫系統細胞具有比普通方法激活更高效的免疫細胞增殖數量和細胞活性，一般應高出5-10倍，特別是T淋巴細胞數量明顯增加。
文檔編號A61K38/08GK101176784SQ20071015874
公開日2008年5月14日 申請日期2007年12月6日 優先權日2007年12月6日
發明者單風平, 呂昌龍, 尼古拉·波羅尼可夫, 黃建寅 申請人:單風平