專利名稱：：N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬藥物領域，涉及N-4-羥苯視黃酰胺新的藥用用途，具體涉及N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途。技術背景N-4-羥苯視黃酰胺[N-4-(hydroxyphenyl)retinamide]，簡稱4-HPR(fenretinide)，為一種人工合成視黃酸衍生物，目前主要作為腫瘤化療藥物，用于多種腫瘤的治療，包括白血病、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、皮膚癌、頭頸部的腫瘤。而且其對人體毒性較小，無肝臟毒性。研究表明，N-4-羥苯視黃酰胺(4-HPR)抗腫瘤的機制在于誘導腫瘤細胞發生凋亡，4-HPR對其它細胞是否有誘導凋亡的作用是個未知數。肝纖維化是指肝組織學上有廣泛的纖維結締組織增生、沉積；肝星狀細胞(HSC)是肝纖維化病變過程中膠原等細胞外基質的主要生成細胞，抑制HSC的活化與增殖是目前開發研究肝纖維化治療藥物的主要靶目標，現有技術不斷有報道針對肝臟纖維結締組織增生制備的肝纖維化的中藥制劑。有關該領域已將肝纖維化的逆轉、抑制HSC活化與增殖以及生成、分泌膠原等細胞外基質，提高間質性膠原酶活性作為研究開發肝纖維化治療藥物的重要目標之一。目前，有關抗肝纖維化的有效的化學藥物報道尚未多見。
發明內容本發明的目的是提供N-4-羥苯視黃酰胺新的藥用用途，具體涉及N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途。本發明對N-4-羥苯視黃酰(簡稱4-HPR(fenretinide))，進行了體外細胞實驗，結果顯示，很低劑量的4-HPR就能誘導肝纖維化過程中產生細胞外基質的主要細胞一肝星狀細胞發生凋亡，而對肝細胞，則需要很高的劑量才可誘導凋亡，兩者相差十倍。進一步采用N-4-羥苯視黃酰胺進行動物體內實驗，采用四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型，分別在肝纖維化建模的第1周(預防)和第5周(治療)用4-HPR進行干預。測得肝組織內膠原蛋白含量(肝組織切片天狼猩紅染色結合圖象分析技術半定量)的變化，肝組織羥脯氨酸含量的變化及血清谷丙轉氨酶(ALT)、血清白蛋白(ALB)和球蛋白(GLO)的變化，結果表明，4-HPR具有抗肝纖維化的藥理作用，證實4-HPR對肝纖維化有明顯的干預作用，而且無明顯加重肝功能異常的副作用。所述的4-HPR購自美國國立癌癥研究院(NCI)腫瘤預防研究所。本發明經實驗證實了N-4-羥苯視黃酰胺新的防治慢性肝病肝纖維化的醫療用途，所述的N-4-羥苯視黃酰胺可制成注射制劑、緩釋劑或口服制劑，使用方便。有推廣價值。具體實施方式實施例l一、體內實驗清潔級BALB/c雄性小鼠(中國科學院上海實驗動物部)，體重18-20g,隨機分為以下幾組正常對照組(n=10)、正常小鼠37.5mg/kgBW用藥組(11=11)、正常小鼠112.5mg/kgBW用藥組(n-11)、肝纖維化模型組(n42)、肝纖維化模型+溶劑干預組(11=12)、預防性干預作用又分:低劑量(12.5mg/kgBW)組(n=14)、中劑量(37.5mg/kgBW)組(n=15)、高劑量(112.5mg/kgBW)組(n=ll);治療性干預作用又分低劑量(12.5mg/kgBW)組(n=14)、中劑量(37.5mg/kgBW)組(n=15)、高劑量(112.5mg/kgBW)組(n=13)。正常對照組用生理鹽水代替四氯化碳及4-HPR;肝纖維化模型組用25%四氯化碳橄欖油溶液以5ml/kgBW的劑量進行腹腔注射，每周二次，共10周；溶劑采用含1.65mg/ml牛血清白蛋白的生理鹽水制備5%乙醇溶液，預防性干預均從實驗第l周開始用藥，均腹腔注射，每周4次，共10周；治療性干預從實驗第5周開始用藥，方法同上，至實驗結束的第IO周為止。實驗結束后，小鼠在乙醚麻醉下眼球后血管采血，用于肝功能指標血清ALT、ALB、及GLO的生化測定。繼而處死，準確稱取0.5g肝組織兩份，液氮速凍后-70'C保存，用于羥脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)含量測定；部分肝組織置于10%中性福爾馬林固定后，常規酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切成5um連續切片，用于HE和天狼猩紅染色，后者染色結果在Axiophot-2數碼圖象分析儀(Zeiss)上，用隨機分析軟件KS400進行相對定量。二、實驗結果1.肝組織內膠原蛋白的變化天狼猩紅可特異地與組織內膠原蛋白反應而染成猩紅色，在偏振光下，還可大致區分I型和III型膠原，因此肝臟組織切片經天狼猩紅染色后進行圖象分析可以對組織內膠原含量進行半定量。各組小鼠肝組織內膠原蛋白含量變化如表1所示。正常小鼠單用不同劑量4-HPR后，肝內膠原蛋白含量與正常小鼠無差別，說明4-HPR不會增加正常肝臟膠原蛋白含量。四氯化碳誘導肝纖維化的小鼠肝臟膠原蛋白明顯增加，說明肝纖維化模型建立成功。統計處理結果是純粹使用溶劑與模型組相比，無統計學顯著性意義，說明溶劑對肝纖維化無干預作用；而無論是預防性還是治療性干預，4-HPR均能明顯降低肝纖維化小鼠肝臟內膠原的含量中劑量時平均降低66%，且呈現劑量依賴性。表l.是各組小鼠肝臟膠原蛋白及羥脯氨酸含量。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>*與正常對照組比較，/<0.05;A與肝纖維化模型組比較，；<0.052.肝組織羥脯氨酸含量的變化羥脯氨酸是膠原蛋白特有的氨基酸，與膠原分子內交聯有關，故羥脯氨酸含量可以間接反映膠原蛋白的含量。用生化方法測得的各組小鼠肝臟內羥脯氨酸的含量見表l。正常小鼠單用不同劑量4-HPR后，肝內羥脯氨酸含量與正常小鼠無差別，說明4-HPR不會增加正常肝臟膠原蛋白含量。四氯化碳誘導肝纖維化的小鼠肝臟羥脯氨酸含量明顯增加，說明肝臟內膠原含量明顯增多，肝纖維化模型建立成功。純粹使用溶劑與模型組相比，羥脯氨酸含量無統計學顯著性意義，說明溶劑對肝纖維化無干預作用。而無論是預防性還是治療性干預，4-HPR均能明顯降低肝纖維化小鼠肝臟內羥脯氨酸的含量中劑量時平均降低39.7%,且呈現劑量依賴性。從另一個方面證實4-HPR的確可以明顯減輕肝纖維化。3.血清ALT、ALB、及GLO的變化各組小鼠血清ALT、ALB和GLO的測定結果如表2所示。和正常小鼠比，肝纖維化組小鼠血清ALT有升高，但統計學無顯著性意義，使用4-HPR的各組血清ALT與對照組比統計學上也無顯著性意義。說明長期使用4-HPR對肝細胞無明顯損傷。但使用高劑量4-HPR后，與模型組相比血清白蛋白水平有所下降，大量使用該藥時可能會影響肝臟中白蛋白代謝。表2.是各組小鼠血清肝功能測定結果。表2,<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>本發明經動物實驗，結果證實N-4-羥苯視黃酰胺(4-HPR)對四氯化碳所致的肝纖維化有明顯的干預作用。同時無明顯加重肝功能異常的副作用。權利要求1、N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途。2、按權利要求1所述的用途，其中所述的用途是預防性或治療性干預。3、按權利要求2所述的用途，其中所述的預防性或治療性干預呈劑量依賴性。4、一種預防或治療肝纖維化的藥物，其特征是含權利要求l所述的N-4-羥苯視黃酰胺。5按權利要求4所述的預防或治療肝纖維化的藥物，其特征是制成注射制劑、緩釋劑或口服制劑。全文摘要本發明屬藥物領域，涉及N-4-羥苯視黃酰胺在制備抗肝纖維化藥物中的用途。本發明對N-4-羥苯視黃酰進行了體外細胞實驗，結果顯示，低劑量的4-HPR能誘導肝纖維化過程中產生細胞外基質的主要細胞—肝星狀細胞發生凋亡；采用四氯化碳誘導的小鼠肝纖維化模型進行體內實驗，分別進行預防或治療干預，結果表明，4-HPR具有抗肝纖維化的藥理作用，證實4-HPR對肝纖維化有明顯的干預作用，而且無明顯加重肝功能異常的副作用。證實了N-4-羥苯視黃酰胺新的防治慢性肝病肝纖維化的醫療用途，可進一步制成注射制劑、緩釋劑或口服制劑，使用方便，有推廣價值。文檔編號A61P1/16GK101229147SQ200710172980公開日2008年7月30日申請日期2007年12月24日優先權日2007年12月24日發明者張錦生,朱虹光,瑾錢申請人:復旦大學