不使用蛋制備流感病毒疫苗的制作方法

專利名稱：：不使用蛋制備流感病毒疫苗的制作方法
技術領域：
：本發明屬于保護免受流感病毒感染的疫苗的制造領域。
背景技術：
：目前對抗人流感病毒感染的季節性疫苗的制備方法包括以下步驟[l，2]:(a)分離流通的病毒株；(b)對分離的病毒進行抗原和遺傳分析；(C)選擇在將要來臨的季節中適用的病毒株；(d)通過重配或采用反向遺傳學制備高生長種株；(e)將種株分發給疫苗生產商；(f)由生產商評價該種株在工業生產中的適用性；和(g)培養種株以制備病毒，然后由該病毒制造疫苗。該過程中步驟(a)-(e)由FDA和政府批準的國際流感中心進行，通常得到世界衛生組織的資助；步驟(f)和(g)由生產商自己進行。步驟(d)將病毒從天然適合感染人體的形式轉化為可以在工業培養條件下生長至高效價的形式。對于甲型流感病毒，該步驟通常包括產生6:2重配株，該重配株包括來自(c)中選擇的毒株的HA和NA編碼基因組區段，其余6個基因組區段來自在雞蛋中有效培養的毒株，該毒株通常是A/PR/8/34。重配步驟后，毒株在含胚蛋中反復傳代以實現蛋適應和生長促進。對于乙型流感病毒，通常可直接獲得具有優良生長特征的原型株并在含胚蛋中反復傳代而無需產生重配病毒。因此，分發給疫苗生產商之前進行的步驟包括在蛋中對流感病毒進行傳代。即使在步驟(g)中由生產商在細胞底物上而不是蛋上培養病毒，病毒仍將在步驟(a)的分離和步驟(e)的生產商接受之間的某些階段通過蛋進行傳代。例如，步驟(a)包括使底物與患者樣品相接觸，使得任何樣品上的病毒可感染底物。然后，底物擴增存在的病毒，得到擴增后的病毒用于進一步研究。該步驟在蛋或哺乳動物細胞中進行。已知可用于原代分離的細胞包括MRC-5細胞[3]、Vero細胞[4、5]、MDCK細胞[6]、HepG2細胞[7]、LLCMK2細胞[8]等。但是，通常仍然使用雞蛋來分離用于制造流感病毒的參比株。雞蛋的使用在當前操作中至關重要，在2003年第四季度，FDA否決了大多數適當的H3N2毒株的使用(A/Fujian/411/2002)，因為它們最初不是從雞蛋分離的[29]，并且也沒有獲得抗原性類似的從蛋分離的毒株。過去曾提出在流感病毒生產的多個階段不再使用雞蛋。參考文獻10提出，疫苗應采用(i)經傳代的高生長臨床分離株或(ii)從至少一種天然來源的哺乳動物流感病毒株衍生的重配株，在細胞培養物中培養，前提是所述分離株或重配株沒有經過禽蛋傳代。因此，參考文獻10所述的方法從經選擇或操作利于在所選細胞培養物中培養的種病毒開始。參考文獻11比較了通過蛋傳代的病毒和通過MDCK細胞傳代的病毒，但特別選擇前者用于疫苗制備。參考文獻12建議，大流行性流感疫苗的種病毒可通過以下方式制備大流行毒株在哺乳動物細胞培養物上直接繁殖而不是通過胚胎蛋，但指出蛋傳代是大流行間期制造所必須的。這種強制性蛋傳代的原因在于，人們相信蛋傳代可用作外來物質的"濾器"管理機構已接受，在從人體進行最初臨床分離到給予人體的最終疫苗產品的過程中，在禽類系統中進行一系列傳代能防止哺乳動物類型的外來物質與流感病毒共同復制。本發明的目的是提供適用于流感疫苗生產的額外方法，該方法減少了蛋的使用，較佳地避免使用蛋。在一個具體的方面，本發明的目的是提供在流感病毒分離過程中有用的額外和改善的操作。
發明內容雖然過去曾提出在流感病毒生產的多個階段不再使用雞蛋，本發明在多個方面與這些建議不同。種病毒的制備本發明的第一方面提供了制備用于制造疫苗的流感種病毒的方法，該方法包括以下步驟(i)用從患者直接獲得的或來自原代分離物的流感病毒感染細胞系；(ii)將步驟(i)中所得受感染細胞系的病毒進行至少一次傳代；和(iii)對步驟(ii)的受感染細胞進行培養以制備流感病毒。從步驟(iii)培養物純化的流感病毒即可用作種病毒。與參考文獻12不同，步驟(i)中使用的流感病毒是乙型流感病毒或是非大流行性甲型流感病毒，即目前是甲型流感病毒H1N1或H3N2株。步驟(i)、(ii)或(iii)都不涉及在蛋中進行病毒培養或傳代。優選地，至少兩個步驟，理想地所有三個步驟都在相同的細胞類型中進行，例如都在MDCK細胞中進行。步驟(ii)的傳代通常包括使流感病毒在細胞培養物中復制；例如從培養物上清液收集復制的病毒；和將收集的復制病毒轉移到未感染的細胞培養物中。可重復該過程。至少一次傳代之后，在步驟(iii)使病毒復制，收集病毒，只是病毒用作種病毒而不是轉移到未感染的培養物進行進一步傳代。第一方面所用細胞系優選不是人細胞系。通過避免使用人細胞，即使不使用蛋也可維持對外來試劑的"濾除"。因為與人的近親關系，細胞系也優選不是靈長類細胞系，例如不是Vero細胞系(猴腎細胞系)。參考文獻10提出在疫苗制造期間使用Vero細胞，但這種細胞可感染許多人病毒，因而步驟(i)中使用的流感病毒樣品中存在的任何其它人病毒將與流感病毒平行生產，導致最終種病毒的污染。用于本發明第一方面的優選細胞系是犬細胞系，如MDCK細胞系(馬-達二氏犬腎細胞系)，不同于參考文獻10的具體公開內容。MDCK細胞的進一步細節在下文中給出。已經發現，MDCK細胞具有相當于禽蛋所能實現的對抗外來物質的"濾除"作用。因此，基于該發現，MDCK細胞可用于代替蛋而不會增加管理風險，雖然參考文獻13中報道了流感病毒蛋傳代可具有MDCK培養期間的生長優點，但避免了蛋中的培養。參考文獻14描述，從人患者分離的流感毒株，無需在蛋或細胞培養物中進行任何傳代，即可在包含無血清培養基的MDCK細胞培養物中進行有效培養。因此，步驟(i)的感染可采用從患者直接獲取的臨床樣品(例如由咽部拭子等)中的流感病毒，或者可采用己經過原代分離的病毒。在一些情況下，步驟(i)之前的原代分離可在蛋中進行，但用于本發明的優選原代分離物是不使用蛋獲得的分離物，例如在哺乳動物細胞中獲得的分離物。已知可用于原代分離的細胞包括但不限于MRC-5細胞[3]、Vero細胞[4、5]、MDCK細胞[6]、HepG2細胞[7]、LLCMK2細胞[8]等。如果本發明在步驟(i)中釆用原代分離物，原代分離優選在與步驟(i)-(iii)相同的細胞類型中進行。已知MDCK適用于流感病毒的原代分離、傳代和培養，但下面將描述MDCK分離的改良形式。為了盡可能多地了解流感病毒分離物的歷史，優選采用從臨床分離物直接獲得病毒而不是使用原代分離物。目前的流感監控系統包括醫院原代分離，將感興趣毒株送到國家和國際流感中心。除使用患者樣品進行原代分離之外，通常還需要留出一部分并進行儲存(例如通過冷凍)，從而能夠恢復原始材料進行再次分離。如果可獲得儲存的樣品，則可在步驟(i)中使用該樣品代替原代分離物。如果分離物的來源不明，尤其是用不是從臨床樣品直接獲得的病毒開始時，可在步驟(i)和(iii)之間使用反向遺傳學以產生新的病毒株，該新的病毒株具有至少一個來自親本病毒的病毒基因組區段。在步驟(i)和(iii)之間采用反向遺傳學可從步驟(iii)中使用的病毒產品中分離步驟(i)中使用的病毒產品，因而可用作對抗可能在步驟(i)之前已經引入的外來物質的濾器。除了以這種方式用作"濾器"之外，反向遺傳學技術也可用于其他原因，例如產生重配株、操縱編碼序列、置換特定區段等。進一步的細節將在本發明第二方面中給出。瞎合伸用后向遺傳學柃犬與流威病羞的細胸諒羔本發明的第二方面提供了制備用于制造疫苗的流感種病毒的方法，該方法包括以下步驟(i)用從患者直接獲得的或來自原代分離物的流感病毒感染細胞系；(ii)制備由步驟(i)中所得受感染細胞系產生的流感病毒的至少一個病毒RNA區段的cDNA，并在反向遺傳學方法中采用該cDNA制備新的流感病毒，該新的流感病毒中至少一個病毒RNA區段與步驟(i)的流感病毒相同；(iii)用新的流感病毒感染細胞系，然后培養該細胞系以制備新的流感病毒。步驟(i)中使用的病毒可以是任何亞型的甲型流感病毒，或者可以是乙型流感病毒。優選的甲型流感病毒亞型是H1、H3和H5。步驟(i)、(ii)或(m)都不涉及在蛋中進行病毒培養或傳代。優選地，所有步驟在相同類型的細胞中進行，例如它們都可以在MDCK細胞中進行。本發明第二方面的其他特征如上文第一方面中所述。因此，優選使用MDCK細胞，等等。下文中更詳細地描述反向遺傳學技術。步驟(ii)中轉移的基因組區段可包括HA區段，可包括NA區段和/或一個或多個其他區段。種病毒本發明的第一和第二方面提供了種病毒。這些種病毒可以各種方式使用。種病毒的表征(例如)包括，對核酸和/或蛋白質序列進行測序，檢査其與其他毒株(例如流通株)的抗原相關性，檢査其免疫原性，等等。種病毒可用于引發抗血清。種病毒可分配給疫苗生產商。種病毒可儲存備用。種病毒可用于制備工作種子批。該系統能實現原始種病毒的安全儲存，而可采用工作種子批進行日常應用。可將工作病毒種冷凍備用。工作種子批的制備可包括在細胞培養物中進行病毒培養的步驟，優選在與制造種病毒相同的細胞類型上進行。不采用蛋中生產來制備工作種子批。種病毒可用于感染細胞系，培養細胞系以提供用于疫苗生產的病毒或用于制備診斷試劑。本發明種病毒與目前使用的蛋衍生的種病毒存在許多共有特征，但在多個方面不同。例如，本發明優選的甲型流感病毒種病毒包括不到6個(即0、1、2、3、4或5個)來自PR/8/34流感病毒的病毒區段，如下更詳細所述。無需蛋的疫苗生產本發明的第三方面提供了制備用于制造疫苗的流感病毒的方法，該方法包括以下步驟(i)獲得在群體中流通的流感病毒或者包含血凝素的流感病毒，該血凝素具有在群體中流通的流感病毒的代表性抗原性；(ii)用步驟(i)獲得的流感病毒感染細胞系；(iii)將由步驟(ii)受感染細胞系獲得的病毒進行至少一次傳代，以得到種株；和(iv)培養步驟(iii)的種株以產生流感病毒。與第一和第二方面存在相互差異一樣(見上文)，本發明的第四方面提供了制備用于制造疫苗的流感病毒的方法，該方法包括以下步驟(i)獲得在群體中流通的流感病毒或者包含血凝素的流感病毒，該血凝素具有在群體中流通的流感病毒的代表性抗原性；(ii)用步驟(i)獲得的流感病毒感染細胞系；(iii)制備由步驟(i)中所得受感染細胞系產生的流感病毒的至少一個病毒RNA區段的cDNA，并在反向遺傳學方法中采用該cDNA制備流感種病毒，該流感種病毒中至少一個病毒RNA區段與步驟(i)的流感病毒相同；和(iv)用流感種病毒感染細胞系，然后培養來自步驟(iii)的經傳代的細胞系以產生流感病毒。本發明還提供了制備流感病毒疫苗的方法，該方法包括第三和第四方面的這些步驟(i)-(iv)，然后是步驟(v):處理步驟(iv)所得病毒以產生疫苗。步驟(v)中采用的技術詳情在下文中給出。步驟(i)、(ii)、(iii)、(iv)或(v)都不涉及在蛋中培養或傳代病毒。步驟(i)中使用的病毒可以是任何亞型的甲型流感病毒，或者可以是乙型流感病毒。優選的甲型流感病毒亞型是H1、H3和H5，例如H1N1或H3N2。步驟(i)中使用的病毒自從最初分離開始就不曾在蛋上繁殖，優選地從最初提供病毒的患者一直到步驟(i)開始的過程中的任何階段都不曾在蛋上繁殖。流感疫苗領域中使用的術語"具有代表性抗原性"用于描述實際上可能沒有在群體內廣泛流通，但可引發對抗流通中的毒株的免疫應答，同時便于生產的病毒株。"具有代表性抗原性"的毒株引發的血清(例如)在血凝抑制試驗能夠抑制流通毒株。步驟(i)可包括從許多不同的毒株開始，然后選擇進一步使用的毒株。例如，步驟(i)可包括從許多不同的甲型流感病毒HlNl毒株開始，然后選擇進一步使用的毒株。步驟(i)可包括從許多不同的甲型流感病毒H3N2毒株開始，然后選擇進一步使用的毒株。步驟(i)可包括從許多不同的乙型流感病毒株開始，然后選擇進一步使用的毒株。選擇將基于選擇包含在流感病毒中的毒株時常規使用的免疫和血清學標準，例如選擇具有流通中最常見毒株和/或致病株的代表性抗原性的毒株。步驟(iii)之后可進行以下步驟證明種病毒具有步驟(i)所得毒株的代表性抗原性。該驗證步驟可以在步驟(iv)開始之前進行，或者可以與步驟(iv)平行進行。本發明還提供了制備流感病毒疫苗的方法；該方法包括以下步驟(a)獲得通過包括第一方面的步驟(i)-(iii)或者第二方面的步驟(i)-(iv)的方法制備的病毒；和(b)處理該病毒以制備疫苗。因此，本發明的第三和第四方面能夠從患者樣品(或原代分離物)制備流感疫苗，而用于制備疫苗的流感病毒在任何階段都沒有經過蛋傳代。病毒重配本發明的第五方面提供了制備重配的流感病毒的方法，該方法包括以下步驟(i)用具有第一組基因組區段的第一流感病毒株和具有第二組基因組區段的第二流感病毒株感染細胞系，其中所述第一毒株具有編碼所需血凝素的HA區段；和(ii)培養步驟(i)的受感染細胞以制備流感病毒，該流感病毒中至少一個區段來自第一組基因組區段，至少一個區段來自第二組基因組區段，前提是所述來自第一組基因組區段的至少一個區段包括來自第一毒株的HA區段。因此，該方法至少能夠將第一毒株的HA區段轉移到第二毒株，從而產生具有來自第一或第二毒株的不同病毒基因組區段集合的新的重配株而不需要使用蛋。從步驟(ii)培養物純化的流感病毒可用于本文其他部分所述的應用。相對于第一毒株，重配株的生長特征得到改善。重配株也可包括來自第一毒株的編碼所需神經氨酸酶的NA區段。通常，重配株中所包含的來自第一毒株和第二毒株的區段比例為l:7、2:6、3:5、4:4、5:3、6:2或7:1。通常，大部分區段來自第二毒株。該方法可用于制備甲型流感病毒和乙型流感病毒的重配株。對于甲型流感病毒，在一些實施方式中，第二病毒是PR/8/34，但也可采用其他毒株，包括那些NP、M、NS、PA、PB1或PB2區段中只有1、2、3、4或5個區段與PR/8/34相同的病毒。本發明還提供了通過第五方面的重配方法得到的流感病毒。本發明還提供了該病毒在疫苗制造中的應用。步驟(i)或(ii)都不涉及在蛋中進行病毒培養、重配或傳代。重配過程可方便地在與本文其他部分中所述的分離和傳代所用相同的細胞類型(例如MDCK細胞)中進行。第一毒株宜是從患者直接獲得或來自原代分離物的流感病毒。如上所述，存在使用蛋進行流感病毒分離的強烈傾向。相反，本發明的第六方面采用MDCK細胞。在一些實施方式中，懸浮培養MDCK細胞。在其它實施方式中，MDCK細胞在無血清培養基或在無蛋白培養基中培養。在其它實施方式中，MDCK細胞是非致瘤性的。在其它實施方式中，MDCK細胞不是在覆蓋培養基存在下培養的。因此，本發明提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用MDCK細胞培育患者樣品，所述MDCK細胞在懸浮培養液中培養。本發明還提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用MDCK細胞培育患者樣品，所述MDCK細胞在無血清培養基中培養。本發明還提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用MDCK細胞培育患者樣品，所述MDCK細胞在無蛋白培養基中培養。本發明還提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用非致瘤性MDCK細胞培育患者樣品。本發明還提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用MDCK細胞培育患者樣品，未向所述MDCK細胞提供覆蓋培養基。本發明還提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用勵CK細胞培育患者樣品，所述MDCK細胞在無血清懸浮培養液中培養。本發明還提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用MDCK細胞培育患者樣品，所述MDCK細胞在無蛋白懸浮培養液中培養。本發明還提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用非致瘤性MDCK細胞培育患者樣品，所述MDCK細胞在懸浮培養液中培養。本發明還提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用非致瘤性MDCK細胞培育患者樣品，所述MDCK細胞在無血清懸浮培養液中培養。本發明還提供了從患者樣品分離流感病毒的方法，該方法包括以下步驟用非致瘤性MDCK細胞培育患者樣品，所述MDCK細胞在無蛋白懸浮培養液中培養。本發明還提供了通過上述方法之一分離的流感病毒。本發明還提供了該病差龍;itF苗法lK吿由的^7田一患者樣品和MDCK細胞的培育通常導致MDCK細胞被流感病毒，例如人流感病毒，尤其是人甲型流感病毒感染。病毒可以在細胞中復制，然后收集復制的細胞。任選地，可以在下游方法中采用以下步驟，例如檢測、表征、分析、制備種病毒、操作等。在MDCK細胞中分離之后，病毒也可以在MDCK細胞中傳代和/或培養。作為替代方式，或者也可以在非MDCK細胞，或者蛋，或者其他底物中傳代和/或培養。本發明的第六方面涉及MDCK細胞系的使用。原始MDCK細胞系從ATCC獲得，但本發明的第六方面采用該細胞系的衍生物。如下所示，在這些衍生物中的分離優于在原始MDCK細胞系中的分離。合適的MDCK細胞及其特征在下文中更詳細描述。例如，第六方面的一些實施方式采用可以在懸浮培養液中自發進行復制的MDCK細胞系。參考文獻30描述了適合在懸浮培養液中培養的MDCK細胞系，該細胞系('MDCK33016，)尤其適用于第六方面的方法。MDCK33016可以在無血清培養基中生長，無需覆蓋培養基即可生長。可以在懸浮培養液(包括無血清培養基)中培養的另一種MDCK細胞系是'B-702'細胞系[36;參見下文]。用于第六方面的非致瘤性MDCK細胞系包括參考文獻37中描述的那些，例如'MDCK-S，、'MDCK-SF101'、'MDCK-SF102，和'MDCK-SF103，(參見下文)。在第六方面的一些實施方式中，在無血清培養基和/或無蛋白培養基中培養MDCK細胞。與現有技術的方法不同，本發明第六方面可避免在流感病毒分離期間使用覆蓋培養基。優選如上文所述接觸MDCK細胞之前，不在蛋中培養病毒。也優選，如上文所述在MDCK細胞中培養的病毒隨后不在蛋中培養。對于第六方面所用的患者樣品，流感病毒分離中使用的臨床樣品可以是各種形式，但通常包括呼吸分泌物，包括但不限于直接抽吸物；漱口水；鼻腔洗滌液；鼻腔拭子；咽管拭子；咽部拭子等。這些樣品通常從疑似被流感病毒感染的患者獲取，包括患有新型流感病毒株的患者。通過第六方面方法分離的流感病毒可用于制備用于制造疫苗的流感種病毒。因此，本發明的第六方面還可包括對來自受感染MDCK細胞系的病毒進行至少一次傳代的步驟。然后，該方法可包括培養受感染細胞以制備流感病毒的步驟。培養步驟后純化的流感病毒可用作種病毒，如本文其他部分所述。根據第六方面分離的病毒也可用作反向遺傳技術的來源。因此，可從根據第六方面分離的流感病毒的至少一個病毒RNA區段制備cDNA。然后，該cDNA可用于反向遺傳過程以便制備與分離的流感病毒具有至少一個相同的病毒RNA區段的新流感病毒。然后，該新流感病毒可用于感染(例如)細胞系以進一步培養。本發明的第六方面可用于分離任何合適的流感病毒，包括人流感病毒。這些病毒可以是甲型流感病毒、乙型流感病毒或丙型流感病毒。常見和有用的甲型流感病毒亞型是H1、H3和H5。在目前的大流行階段間期，疫苗通常包括兩種甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感毒株。第六方面可用于分離這些毒株，或分離大流行病毒株，如H2、H5、H7或H9亞型毒株。通常，第六方面可用于分離具有HA亞型Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16之一的甲型流感病毒。根據本發明第六方面分離的流感病毒可包括與具有Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖相比，更偏向于與具有Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖結合的血凝素。優選地，發現本發明的分離方法有助于穩定保留病毒HA序列及其寡糖偏好。根據第六方面分離的病毒可用于疫苗制造及治療方法。因此，本發明也提供了根據第六方面分離的病毒制備的抗原在制造用于提高患者免疫應答的藥物中的應用。受體結合人流感病毒結合具有Sia(a2,6)Gal末端二糖(a-2,6連接至半乳糖的唾液酸)的受體寡糖，而蛋具有Sia(a2,3)Gal末端二糖的受體寡糖。人流感病毒在蛋中1的生長提供了與Sia(a2,6)Gal結合相比，更傾向于Sia(a2,3)Gal結合的血凝素的選擇壓。和蛋一樣，Vero細胞主要表達Sia(a2，3)Gal受體[15]。相反，MDCK細胞和PER.C6細胞同時表達Sia(a2，3)Gal和Sia(a2，6)Gal。參考文獻16報道轉染MDCK細胞以過度表達a-2,6唾液酸轉移酶，以利于選擇Sia(a2,6)Gal結合。但是，即使沒有這種操作，也可在MDCK細胞上培養流感病毒，而不使它們偏向Sia(a2,3)Gal結合。因此，本發明可采用同時表達Sia(a2,3)Gal和Sia(a2,6)Gal的細胞，所產生的流感病毒具有與含(a2,3)Gal末端二糖的寡糖相比，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好。在本發明第一和第二方面的優選實施方式中，步驟(i)中用于感染的流感病毒具有相對于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好。結合偏好在步驟(ii)和步驟(iii)期間保留，使得步驟(iii)所產生的流感病毒具有相對于含Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好。在本發明第三和第四方面的優選實施方式中，步驟(ii)中用于感染的流感病毒具有相對于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好。這種結合偏好在步驟(iii)和步驟(iv)期間保留，使得步驟(iv)所產生的流感病毒具有相對于含Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好。為了確定病毒是否具有相對于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好，可利用各種分析試驗。例如，參考文獻17描述了測定流感病毒受體-結合活性的固相酶聯試驗，它能夠靈敏地定量測定親合常數。參考文獻18采用評估病毒與兩種不同的唾液酸糖蛋白(卵類粘蛋白，具有Sia(a2,3)Gal決定簇；和豬012巨球蛋白，具有Sia(a2，6)Gal決定簇)的結合的固相試驗，也描述了評價病毒與兩種受體類似物游離唾液酸(Neu5Ac)和3'-唾液酸乳糖(Neu5Aca2-3Gaipi-4Glc)的結合的試驗。參考文獻19報道了采用能夠清楚區分a2,3或a2，6連接的受體偏好的聚糖陣列的試驗。參考文獻20報道了一種基于經過酶修飾包含Sia(a2，6)Gal或Sia(a2,3)Gal的人紅細胞凝集的試驗。根據試驗類型，可利用病毒本身直接進行試驗，或者可利用從病毒純化的血凝素間接進行試驗。參比物質目前制造流感病毒的過程包括制備每種毒株的參比試劑，即(i)抗-HA血清和(ii)純化的全病毒顆粒。SRID試驗中可利用這些校正試劑來測定制造商生產的大批抗原中的HA水平，從而能夠將該批次抗原稀釋，得到每劑量具有所需HA含量的疫苗。在目前的方法中參比毒株通過蛋傳代且生產毒株根據蛋培養進行優化，此時參比試劑中的血清和抗原很好地匹配。然而發現，在細胞培養物中產生的血清的抗原匹配較差，很可能是因為在不同系統中的選擇壓不同。參比血清與抗原之間的反應性差表示HA水平被低估，導致(i)給定批次的劑量較低和(ii)疫苗中HA劑量過多。為了克服細胞培養物衍生抗原與蛋衍生物質產生的血清的匹配問題，本發明提供了基于未曾適應蛋基培養的病毒的參比物質。因此，本發明提供了從動物制備抗血清的方法，該方法包括以下步驟(i)給予動物純化的流感病毒血凝素；然后(ii)從動物回收含有該血凝素識別抗體的動物血清，其特征在于，步驟(i)中使用的血凝素來自在細胞系中培養的病毒。步驟(i)中使用的血凝素優選來自從未在蛋中培養過的病毒。例如，血凝素可具有相對于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好。可利用在哺乳動物細胞系(例如本文所述的細胞系)如MDCK中生長得到的多糖對用于產生抗血清的血凝素進行糖基化修飾。抗血清可以是甲型流感病毒和乙型流感病毒抗血清。動物優選是哺乳動物，如山羊，更優選綿羊。抗血清不難在綿羊中制備，即通過菠蘿蛋白酶處理提取純化病毒的HA，然后在蔗糖梯度上沉降純化。將劑量約50pg的血凝素與完全弗氏佐劑(FCA)—起肌內給予綿羊。兩周后給予劑量l(Hig，然后以每周的間隔再給予2-4次劑量。然后，收集血清。使用之前，可稀釋(例如用含有疊氮化鈉的PBS緩沖液)該血清并裝填到容器中。該血清可暴露于酸性pH(例如pH5，持續2小時)以符合口蹄疫規定。本發明還提供了從動物制備抗血清的方法，該方法包括以下步驟(i)在細胞系中培養流感病毒；(ii)從步驟(i)培養的病毒純化血凝素抗原；(hi)將步驟(ii)純化的血凝素給予動物；和然后(iv)從動物回收含有血凝素識別抗體的動物血清。本發明還提供了通過這些方法得到的抗血清。本發明還提供了包含這種抗血清的凝膠。因此，上述從動物制備抗血清的方法包括將抗血清與凝膠混合的額外步驟。凝膠適用于進行SRID試驗，例如，它是瓊脂糖凝膠。除了提供抗血清，本發明還提供了抗原參比物質。因此，本發明提供了制備抗原參比物質的方法，該方法包括以下步驟(i)在細胞系中培養流感病毒；(ii)純化步驟(i)中培養的病毒；和(iii)滅活病毒，其特征在于，步驟(i)中試驗的流感病毒從未在蛋中培養過。該方法可還包括以下步驟(iv)將滅活的病毒凍干。步驟(i)中試驗的病毒從未在蛋中培養過。例如，血凝素可具有相對于含Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好。參比物質不含蛋衍生物質(例如，不含卵清蛋白、不含卵類粘蛋白、不含雞DNA)。可利用在哺乳動物細胞系(例如本文所述的細胞系)如MDCK中生長得到的多糖對參比物質中的糖蛋白進行糖基化修飾。參比物質可以是甲型流感病毒和乙型流感病毒的參比物質。參比物質通常成對使用，所以本發明也提供了包含以下物質的藥劑盒(i)從這些方法得到的抗血清和(ii)從這些方法得到的抗原參比物質。本發明還提供了制備藥劑盒的方法，該方法包括以下步驟(i)如上所述制備抗血清；(ii)如上所述制備抗原參比物質;和(iii)將步驟(i)和(ii)的產品組合成藥劑盒。抗原和抗血清是合適的且可用于SRID試驗，本發明提供流感病毒血凝素的單向放射免疫擴散試驗，其特征在于，該試驗采用從這些方法獲得抗血清和/或從這些方法獲得的抗原參比物質。SRID試驗包括以下步驟制備包含抗血清的凝膠，將抗原參比物質(需要時用水性介質重建)應用于凝膠(通常加入孔中)，然后使抗原放射狀擴散到凝膠中。使用前可用去污劑如兩性離子去污劑處理抗原。通過本發明的技術制備或分離的病毒(包括種病毒)。本發明優選的甲型流感病毒(包括種病毒、用MDCK細胞從患者樣品分離的病毒、重配病毒等)包括不到6個(即0、1、2、3、4或5個)來自PR/8/34流感病毒的病毒區段。優選不含PR/8/34區段。如果存在一個或多個任意的PR/8/34區段，則它們不包含PR/8/34HA區段并且通常不包含PR/8/34NA區段。因此，優選的病毒是區段NP、M、NS、PA、PB1和/或PB2中至少一個不來源于PR/8/34的病毒。更優選，區段NP、M、PA、PB1和/或PB2中至少一個不來源于PR/8/34。因此，本發明通過在正常HA和NA抗原中加入一個或多個代表流通株的含表位抗原而改善了現有的疫苗。類似地，優選的甲型流感病毒包括不到6個(即0、1、2、3、4或5個)來自AA/6/60流感病毒(A/AnnArbor/6/60)的病毒區段。優選不含AA/6/60區段。如果存在一個或多個任意的AA/6/60區段，則它們不包含AA/6/60HA區段并且通常不包含AA/6/60NA區段。因此，優選的病毒是區段NP、M、NS、PA、PB1禾B/或PB2中至少一個不來源于AA/6/60的病毒。更優選，區段NP、M、PA、PB1禾口/或PB2中至少一個不來源于AA/6/60。優選的乙型流感病毒包括不到6個(即0、1、2、3、4或5個)來自AA/1/66流感病毒(A/AnnArbor/l/66)的病毒區段。優選不含AA/1/66區段。如果存在一個或多個任意的AA/1/66區段，則它們不包含AA/1/66HA區段并且通常不包含AA/1/66NA區段。因此，優選的病毒是區段NP、M、NS、PA、PB1禾口/或PB2中至少一個不來源于AA/1/66的病毒。更優選，區段NP、M、PA、PB1和/或PB2中至少一個不來源于AA/1/66。本發明優選的流感病毒(包括種病毒、用MDCK細胞從患者樣品分離的病毒、重配病毒等)包括相對于具有Sia(u2,3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于結合具有Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的血凝素。這種結合偏好如上文更詳細所述。本發明優選的流感病毒(包括種病毒、用MDCK細胞從患者樣品分離的病毒、重配病毒等)包括糖基化模式不同于蛋衍生病毒的糖蛋白(包括血凝素)。因此，糖蛋白將包括雞蛋培養病毒所沒有的糖形，例如可具有非禽類糖鍵，包括哺乳動物糖鍵。細胞系本發明涉及使用支持流感病毒復制的細胞系，并避免使用蛋。細胞系通常是哺乳動物來源。合適的哺乳動物細胞來源包括但不限于倉鼠、牛、靈長類(包括人和猴)及犬細胞，但靈長類細胞的使用是不優選的。可使用各種細胞類型，如腎細胞、成纖維細胞、視網膜細胞、肺細胞等。合適的倉鼠細胞的例子是稱為BHK21或HKCC的細胞系。合適的猴細胞是(例如)非洲綠猴細胞，例如腎細胞如Vero細胞系[21-23]。合適的犬細胞是(例如)腎細胞，如CLDK和MDCK細胞系。因此，合適的細胞系包括但不限于MDCK;CHO;CLDK;HKCC;293T;BHK;Vero;MRC5;PER.C6[24];FRhL2;WI-38;等。合適的細胞系可由各種來源獲得，例如美國典型培養物保藏中心(ATCC)[25]、克利爾(Coriell)細胞庫[26]或歐洲細胞培養物保藏中心(ECACC)。例如，ATCC提供各種不同Vero細胞，目錄號為CCL81、CCL81.2、CRL-1586和CRL-1587;并提供MDCK細胞，目錄號為CCL34。PER.C6可獲自ECACC，保藏號為96022940。任何這些細胞類型可用于本發明的培養、重配和/或傳代。最優選的細胞系是具有哺乳動物型糖基化的細胞系。作為一種較不優選的哺乳動物細胞系的替代方式，可以在禽類細胞系上培養病毒[例如，參考文獻27-29]，這些禽類細胞系包括來自鴨(例如鴨視網膜細胞)或雞(例如雞胚胎成纖維細胞(CEF))等的細胞系，但哺乳動物細胞的使用意味著，疫苗可不含禽類DNA和蛋的蛋白質(如卵清蛋白和卵類粘蛋白)，從而降低變應原性。用于培養流感病毒的最優選的細胞系是來自馬-達二氏犬腎的MDCK細胞系[30-33]。原始MDCK細胞系可購自ATCC(CCL34)，但也可利用該細胞系的衍生細胞系。例如，參考文獻30公開了適合懸浮培養的MDCK細胞系('MDCK33016'或'33016-PF，，保藏號DSMACC2219，也可見于參考文獻34和35)。類似地，參考文獻36公開了在無血清培養基中懸浮培養的MDCK衍生細胞系('B-702'，保藏號FERMBP-7449)。參考文獻37公開了非致瘤性MDCK細胞，包括'MDCK-S'(ATCCPTA-6500)、'MDCK-SF101'(ATCCPTA-6501)、'MDCK-SF102'(ATCCPTA-6502)和'MDCK-SF103'(PTA-6503)。參考文獻38公開了具有非常容易感染的MDCK細胞系，包括'MDCK.5F1'細胞(ATCCCRL12042)。本發明可采用任何這些MDCK細胞系。病毒可以在貼壁培養或懸浮培養的細胞上培養。也可使用微載體培養。在一些實施方式中，細胞可能使用懸浮培養。細胞系優選在無血清培養基和/或無蛋白培養基中培養。在本發明的內容中，培養基是指沒有來自人或動物來源的血清添加劑的無血清培養基。這種培養物中生長的細胞在天然情況下本身包含蛋白質，但無蛋白培養基應理解成表示在不包含(培養基中不加入)蛋白質、生長因子、其他蛋白質添加劑和非血清蛋白質的條件下進行細胞增殖的培養基，但可任選地包含(在培養基中)病毒生長所必需的蛋白質如胰蛋白酶或其他蛋白酶。在病毒復制期間，支持流感病毒復制的細胞系優選在低于37'C的溫度下培養[39](例如，30-36°C，或約30°C、31°C、32°C、33°C、34°C、35°C、36°C)。例如，在第六方面，MDCK細胞可以在這些溫度下培養(分離步驟之前、期間或之后)，尤其是病毒復制期間。在培養的細胞中繁殖病毒的方法(例如，根據第六方面在培養的MDCK細胞中培養流感病毒)通常包括以下步驟對培養細胞接種待培養的毒株，將受感染的細胞培養病毒繁殖所需的時間，例如通過病毒滴度或抗原表達測定的時間(如，接種后24-168小時)，收集繁殖的病毒。以病毒和細胞之比為1:500-1:1，優選1:100-1:5，更優選1:50-1:10(通過PFU或TCID50檢測)接種培養的細胞。可將病毒加入細胞懸液中，或施加于細胞單層，病毒于25-40。C，優選28-37。C，在細胞上吸附至少60分鐘，但通常少于300分鐘，優選在90-240分鐘之間。可通過凍融或酶促作用除去感染的細胞培養物(例如，單層)，以增加收獲的培養上清液中的病毒含量。然后使收集的液體滅活或冷凍保存。以約0.0001-10，優選0.002-5，更優選0.001-2的感染復數("m.o丄")感染培養的細胞。更優選以約O.Ol的m.o丄感染細胞。感染后30-60小時收集感染的細胞。優選在感染后34-48小時收集細胞。更優選在感染后38-40小時收集細胞。通常在細胞培養期間加入蛋白酶(通常是胰蛋白酶)以釋放病毒，可在培養期間的任何合適階段，例如接種前、接種同時或接種后加入蛋白酶[39]。在優選實施方式中，尤其是MDCK細胞，細胞系自主要工作細胞庫的傳代次數不超過40次。病毒接種物和病毒培養物優選不含(即，經測試得到陰性污染結果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、環病毒和/或細小病毒[40]。類似地，第六方面中使用的優選MDCK細胞系不含(E卩，經測試得到陰性污染結果)單純皰疹病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒3、SARS冠狀病毒、腺病毒、鼻病毒、呼腸病毒、多瘤病毒、雙RNA病毒、環病毒和/或細小病毒。特別優選不存在單純皰疹病毒。本發明中使用的MDCK細胞優選不含G418耐藥性標記(參考文獻16)。因此，該細胞系對G418治療敏感。本發明中使用的細胞系優選不含外源性質粒(參考文獻16)，除非反向遺傳技術所需的任何外源性質粒。反向遺傳技術如上所述，本發明可直接使用臨床分離物或原代分離物。然而，此外，本發明也可使用重配毒株，包括用反向遺傳技術產生的毒株(例如，參考文獻41-45)。反向遺傳技術可利用質粒的體外操作以產生病毒區段的組合，便于操作病毒區段中的編碼序列或非編碼序列，以引入突變等。該技術可用于甲型和乙型流感病毒。反向遺傳技術一般包括表達(a)例如，由poll啟動子、細菌RNA聚合酶啟動子、噬菌體聚合酶啟動子等啟動的編碼所需病毒RNA分子的DNA分子，和(b)例如，由polII啟動子啟動的編碼病毒蛋白的DNA分子，以便在細胞中表達兩種類型的DNA，導致組裝成完整的感染性病毒顆粒。DNA優選提供所有病毒RNA和蛋白質，但也可能用輔助病毒提供一些RNA和蛋白質。優選采用不同質粒產生各病毒RNA的質粒方法[46-48]，這些方法也包括使用質粒表達所有或一些病毒蛋白(例如僅PB1、PB2、PA和NP蛋白)，一些方法中使用12種質粒。為了降低所需的質粒數量，近期方法[49]將多個RNA聚合酶I轉錄盒(用于合成病毒RNA)合并到同一質粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8個甲型流感vRNA節段的序列)上，并且將多個蛋白編碼區與RNA聚合酶II啟動子合并到另一個質粒(如編碼1、2、3、4、5、6、7或所有8種甲型流感mRNA轉錄物的序列)上。參考文獻49方法的優選方面包括(a)PBl、PB2和PAmRNA編碼區位于同一質粒上；和(b)所有8個vRNA編碼區位于同一質粒上。一個質粒上包含NA和HA節段而另外六個節段位于另一質粒上也可能是有利的。因為poll啟動子的物種特異性，在MDCK細胞中進行反向遺傳時可利用犬polI啟動子[50]。作為使用polI啟動子來編碼病毒RNA區段的另一種替代方式，可利用噬菌體聚合酶啟動子[51]。例如，可方便地使用SP6、T3或T7聚合酶的啟動子。因為poll啟動子的物種特異性，對于許多細胞類型(例如MDCK)更宜使用噬菌體聚合酶啟動子，但必須用編碼外源性聚合酶的質粒轉染細胞。在其它技術中，可使用poll和polll雙啟動子由一個模板同時編碼病毒RNA和可表達的mRNA[52,53]。雖然用于在蛋中培養的毒株通常包括六個源自PR/8/34甲型流感病毒的RNA區段(HA和N區段來自疫苗株，即6:2重配株)，但避免使用蛋意味著能夠消除PR/8/34區段。因此，甲型流感病毒可包括不到6個(即0、1、2、3、4或5個)來自PR/8/34流感病毒的病毒區段。因此，優選的病毒是區段NP、M、NS、PA、PB1和/或PB2中至少一個不來源于PR78/34的病毒。病毒可包含在禽流感病毒中起源的NS區段。本發明使用反向遺傳技術時，能使源自流感病毒的病毒RNA區段轉移到目的流感病毒的基因組中。因而這兩種病毒中將具有至少一個相同的病毒RNA區段。術語"相同"在這里表示整個區段的相同拷貝，但也可延伸表示在編碼區或非編碼區中含有修飾的該區段的修飾拷貝。在編碼區中進行修飾時，基本上不會改變編碼蛋白質的免疫原性和/或活性。因此，可以在HA1/HA2切割位點附近操作HA區段而不改變其在給予患者后誘發有效抗HA抗體的能力。因此，可使用反向遺傳技術來修飾根據第六方面分離的病毒的天然HA，例如去除導致病毒在禽類中產生高度致病性的決定簇(例如HA1/HA2切割位點周圍的超堿性區域)。疫苗制備目前可以獲得各種形式的流感病毒疫苗(例如參見參考文獻54的第17和18章)。疫苗通常基于活病毒或滅活病毒。滅活疫苗可基于全病毒顆粒、"分裂"病毒顆粒或基于純化的表面抗原。流感抗原也可以病毒體形式出現。制造任意這些類型的疫苗時都可使用本發明。活病毒包括米迪繆尼公司(Medlmmune)的FLUMISTTM產品(三價活病毒)。通過以下方法制備疫苗在合適的底物上培養病毒，然后從含病毒顆粒的流體純化病毒顆粒。例如，所述流體可通過離心分離并用緩沖液(例如含蔗糖、磷酸鉀和谷氨酸單鈉)穩定。釆用滅活病毒時，該疫苗可包含完整的病毒顆粒、分裂病毒顆粒或純化的表面抗原(包括血凝素，通常也包括神經氨酸酶)。用于滅活病毒的化學方式包括使用有效量的一種或多種以下試劑進行處理去污劑、甲醛、(3-丙內酯、亞甲藍、補骨脂素、羧基富勒烯(C60)、二乙胺(binaryethylamine)、乙酰基乙烯亞胺或它們的組合。本領域已知病毒滅活的非化學方法，例如UV射線或Y射線輻射。可通過各種方法由含病毒液體收獲病毒顆粒。純化方法可包括用線性蔗糖梯度溶液(含有去污劑以破壞病毒顆粒)進行區帶離心。任選稀釋后，可通過滲濾純化抗原。用去污劑(如乙醚、聚山梨醇酯80、脫氧膽酸鹽、三正丁基磷酸鹽、曲通X-IOO、曲通NIOI、溴化十六烷基三甲銨、TergitolNP9等)處理純化的病毒顆粒以獲得裂解病毒顆粒，從而產生亞病毒顆粒制劑，包括"吐溫-醚"裂解方法。裂解流感病毒的方法是本領域熟知的，例如參見參考文獻55-60等。一般使用破壞濃度的裂解劑破壞或片段化完整病毒來裂解病毒，無論該病毒有無感染性。這種破壞導致病毒蛋白的完全或部分溶解，改變病毒的完整性。優選的裂解劑是非離子型和離子型(例如陽離子型)表面活性劑，如烷基糖苷、烷基硫苷、酰基糖、磺基甜菜堿、甜菜堿、聚氧乙烯烷基醚、N,N-二烷基-葡糖酰胺、Hecameg、烷基苯氧基-聚乙氧基乙醇、NP9、季銨化合物、肌氨酰、CTAB(溴化十六烷基三甲銨)、三正丁基磷酸酯、塞塔隆(Cetavlon)、十四烷基三甲銨鹽、脂質轉染試劑、利非他明(lipofectamine)和DOT-MA、辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(如曲通表面活性劑，如曲通X-100或曲通N101)、聚氧乙烯去水山梨糖醇酯(吐溫表面活性劑)、聚氧乙烯醚、聚氧乙烯酯等。一種有用的裂解方法利用脫氧膽酸鈉和甲醛的連續作用，并且裂解可在病毒顆粒初始純化期間發生(例如在蔗糖密度梯度溶液中)。因此，裂解過程可包括澄清含病毒顆粒的物質(以去除非病毒顆粒物質)，濃縮收獲的病毒顆粒(例如使用吸附方法，如CaHP04吸附)，從非病毒顆粒材料分離全病毒顆粒，用裂解劑在密度梯度離心步驟中裂解病毒顆粒(例如，用含有裂解劑如脫氧膽酸鈉的蔗糖梯度)，然后過濾(例如超濾)以去除不需要的物質。可將裂解的病毒顆粒重懸于磷酸鈉緩沖的等滲氯化鈉溶液中。BEGRIVACtm、FLUARIX、FLUZONE丁m和FLUSHffiLD產品是裂解疫苗。純化的表面抗原疫苗包含流感表面抗原血凝素，一般還包含神經氨酸酶。制備純化形式的這些蛋白質的方法是本領域熟知的。FLUVIRINtm、AGRJPPALtm和INFLUVACTM產品是亞基疫苗。另一種形式的滅活流感抗原是病毒體[61](不含核酸的病毒樣脂質體顆粒)。病毒體可通過用去污劑增溶流感病毒，然后去除核殼和重建含病毒糖蛋白的膜來制備。另一種制備病毒體的方法包括加入病毒膜糖蛋白至磷脂過量，得到膜中具有病毒蛋白質的脂質體。本發明可用于儲存大量病毒體，如INFLEXALVtm和磨AVAC丁m產品。流感病毒可被減毒。流感病毒可以是溫度敏感型。流感病毒可以是冷適應性病毒。使用活病毒作為抗原時這三種特征特別有用。HA是滅活流感疫苗中的主要免疫原，一般通過SRID檢測參考HA水平使疫苗劑量標準化。疫苗通常含有約15iigHA/毒株，雖然在例如兒童，或大流行情況下還可使用較低的劑量。與較高劑量(例如，3x或9x劑量[62,63])—樣，已使用了分數劑量，例如"2(即，7.5嗎HA/毒株)、V4和V8[81,82]。因此，疫苗可包含0.1-150嗎，優選0.1-50嗎，例如0.1-20pg、0.1-15嗎、0.1-10嗎、0.1-7.5叫、0.5-5叱HA/流感毒株，等等。具體的劑量包括，例如每個毒株約45、約30、約15、約10、約7.5、約5、約3.8、約1.9、約1.5，等等。對于活疫苗，通過中值組織培養感染劑量(TCID5o)而不是HA含量來檢測給藥，每種毒株的TCIDs。一般在106-108之間(優選106'5-1075)。本發明所用的毒株可以含有野生型病毒中發現的天然HA，或者是經修飾的HA。例如，已知可修飾HA以除去導致病毒在禽類中高度致病的決定簇(例如，HA1和HA2切割位點附近的超堿性區域(hyper-basicregion))。用于疫苗的流感病毒毒株隨季節而變。在目前的大流行間期，疫苗一般包括兩種甲型流感毒株(H1N1和H3N2)和一種乙型流感毒株，一般是三價疫苗。本發明也可釆用大流行毒株(即疫苗接受者和普通人群從未與其發生過免疫接觸的毒株，特別是甲型流感病毒)，如H2、H5、H7或H9亞型毒株，大流行毒株的流感疫苗可以是單價疫苗，或者可以基于補充有大流行毒株的正常三價疫苗。然而，根據季節和疫苗中包含的抗原特性，本發明可保護免受HA亞型Hl、H2、H3、H4、H5、H6、H7、H8、H9、HIO、Hll、H12、H13、H14、H15或H16中一種或多種亞型的感染。本發明可保護免受甲型流感病毒NA亞型N1、N2、N3、N4、N5、N6、N7、N8或N9中一種或多種亞型的感染。本發明組合物不僅適用于免疫大流行間期的免疫，尤其適用于獲得對大流行毒株的免疫。可能引起大流行爆發的流感毒株的特征是(a)與目前流通的人毒株中的血凝素相比，它含有新的血凝素，即有數十年在人群中沒有發現的血凝素(如H2)，或者從未在人群中發現的血凝素(如通常只出現在鳥群體中的H5、H6或H9)，以至于人群未曾免疫接觸過該毒株的血凝素；(b)它能夠在人群中水平傳播；和(c)它能使人致病。含有H5血凝素類型的病毒優選用于獲得對大流行流感，如H5N1毒株的免疫。其它可能的毒株包括H5N3、H9N2、H2N2、H7N1和H7N7，以及任何其它可能出現的大流行毒株。在H5亞型中，病毒分為HA進化支1、HA進化支l'、HA進化支2或HA進化支3[64]，進化支1和3尤其相關。其抗原可有用地包含在本發明組合物中的其它毒株是對抗病毒治療有抗性(例如對奧塞米韋[65]和/或扎那米韋有抗性)的毒株，包括抗性大流行毒株[66]。因此，本發明組合物可包含一種或多種(如1、2、3、4或更多種)流感病毒毒株，包括甲型流感病毒和/或乙型流感病毒的抗原。疫苗包含一種以上流感毒株時，一般單獨培養不同毒株，收獲病毒并制備抗原后將它們混合在一起。因此，本發明方法可包括混合一種以上流感毒株的抗原的步驟。優選包括來自兩種甲型流感病毒株和一種乙型流感病毒株的抗原的三價疫苗。在本發明的一些實施方式中，組合物可包含來自一種甲型流感毒株的抗原。在一些實施方式中，組合物可包含來自兩種甲型流感毒株的抗原，只要這兩種毒株不是H1N1和H3N2。在一些實施方式中，組合物可包含來自兩種以上甲型流感毒株的抗原。本發明提供了制備疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，該方法包括以下步驟(i)接受流感病毒；(ii)用該流感病毒感染細胞系；和(iii)培養步驟(ii)的感染細胞以產生流感病毒。步驟(iii)所得病毒可用于制備疫苗，例如通過滅活、配制等方法制備疫苗。步驟(i)接受的流感病毒具有一種或多種以下特性(a)從未在蛋底物上繁殖過；(b)從MDCK細胞，如MDCK33016細胞和/或無血清培養基中培養的MDCK細胞中分離；(c)從未在含血清培養基培養的底物上繁殖；(d)用反向遺傳技術產生；(e)它是一種甲型流感病毒，其中不到6個病毒區段來自PR/8/34流感病毒和/或不到6個病毒區段來自AA/6/60流感病毒，或者它是一種乙型流感病毒，其中不到6個病毒區段來自AA/1/66流感病毒；(f)其包括血凝素，血凝素具有相對于含Sia(a2，3)Gal末端二糖的寡糖，更偏向于含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好；和/或(g)其具有糖基化模式不同于蛋衍生病毒的糖蛋白(包括血凝素)。因此，可能如本文其他部分所述獲得步驟(i)中接受的流感病毒。宿主細胞DNA當用細胞系培養病毒時，標準方法是使最終疫苗中殘余細胞系DNA的量最小化，以便使DNA的致癌活性最小化。因此，當用細胞系培養病毒，則每劑組合物優選含有少于10ng(優選少于lng，更優選少于100pg)的殘留宿主細胞DNA，雖然可以存在痕量的宿主細胞DNA。優選每15嗎血凝素中宿主細胞DNA含量〈10ng(如〈1ng"100pg)的疫苗，以及每0.25ml體積中宿主細胞DNA含量<10ng(如〈1ng、〈100pg)的疫苗。更優選每50昭血凝素中宿主細胞DNA含量<10ng(如〈ng、〈100pg)的疫苗，以及每0.5ml體積中宿主細胞DNA含量<10ng(如〈1ng、〈100pg)的疫苗。優選任何殘余宿主細胞DNA的平均長度小于500bp，例如小于400bp、小于300bp、小于200bp、小于100bp，等等。可釆用標準純化方法，例如層析等在疫苗制備期間除去污染性DNA。通過核酸酶處理，例如用DNA酶可促進除去殘留的宿主細胞DNA。參考文獻67和68披露了減少宿主細胞DNA污染的便利方法，其涉及兩步處理，首先可在病毒培養期間使用DNA酶(例如，Benzonase)，然后可在病毒粒子破裂期間使用陽離子洗滌劑(例如，CTAB)。用垸化劑，例如P-丙內酯處理也可用于除去宿主細胞DNA，該方法還可優選用于滅活病毒粒子[69]。現在，殘留宿主細胞DNA的測定是生物制品的常規管理要求，它在技術人員的普通能力范圍內。用于測定DNA的實驗一般是已驗證的實驗[70,71]。可通過數學和可以量化的條件來描述驗證實驗的性能特征，并鑒定可能的誤差來源。通常測試該實驗的某些特征，如精確性、準確性、特異性。一旦校正(例如用已知標準量的宿主細胞DNA校正)并檢測了某個實驗，則可按常規進行定量DNA測定。可采用三種DNA定量的基本技術雜交方法，如Southern印跡或狹線印跡[72];免疫測定方法，如ThreshokFM系統[73];和定量PCR[74]。本領域技術人員熟悉這些方法，但各方法的準確特征，例如雜交探針的選擇、引物的選擇和/或用于擴增的引物等可能取決于所研究的宿主細胞。來自分子設備公司(MolecularDevices)的ThreshokFM系統是皮克水平總DNA的定量實驗，己用于監測生物藥品中污染DNA的水平[73]。典型實驗包括生物素化ssDNA結合蛋白、脲酶偶聯的抗ssDNA抗體和DNA之間以非序列特異性方式形成反應復合物。購自生產商的總DNA測定試劑盒(TotalDNAAssayKit)中包含所有實驗組分。多個商業生產商均提供用以檢測殘留宿主細胞DNA的定量PCR實驗，例如AppTec實驗室服務公司(AppTecLaboratoryServices)、BioRelianceTM公司奧西科技公司(AltheaTechnologies)等。對測定人病毒疫苗的宿主細胞DNA污染的化學發光雜交實驗和總DNAThresholdTM系統的比較參見參考文獻75。藥物組合物根據本發明制造的疫苗組合物是藥學上可接受的。除了流感抗原，它們通常包含一種或多種藥物載體和/或賦形劑。如下所述，也可包含佐劑。對這些組分的全面討論見參考文獻76。疫苗組合物通常是水性形式。疫苗組合物可包含防腐劑，例如硫柳汞或2-苯氧基乙醇。然而，這些疫苗優選基本上不含(即，少于5(ig/ml)汞物質，例如不含硫柳汞[59，77]。更優選不含汞的疫苗。可摻入琥珀酸a-生育酚作為汞物質的替代品[59]。特別優選不含防腐劑的疫苗。優選包含生理鹽，例如鈉鹽以控制張力。優選l-20毫克/毫升之間的氯化鈉(NaCl)。可存在的其它鹽包括氯化鉀、磷酸二氫鉀、脫水磷酸氫二鈉(disodiumphosphatedehydrate)、氯ifc鎂、氯^[七!丐等。疫苗組合物的重量克分子滲透濃度通常在200mOsm/kg-400mOsm/kg之間，優選240-360mOsm/kg之間，更優選處于290-310mOsm/kg范圍內。以前有報道說重量克分子滲透濃度對疫苗接種所致的疼痛沒有影響[78]，但最好將重量克分子滲透濃度維持在該范圍內。疫苗組合物可包含一種或多種緩沖劑。典型的緩沖劑包括磷酸鹽緩沖劑；Tris緩沖劑；硼酸鹽緩沖劑；琥珀酸鹽緩沖劑；組氨酸緩沖劑(特別是含有氫氧化鋁佐劑的組氨酸緩沖劑)；或檸檬酸鹽緩沖劑。所含的緩沖劑范圍一般是5-20mM。疫苗組合物的pH通常在5.0-8.1之間，更常見在6.0-8.0之間，例如6.5和7.5之間，或7.0-7.8之間。因此，本發明方法可包括先調節散裝疫苗的pH再包裝的步驟。疫苗組合物優選無菌。組合物優選無熱原，例如每劑量含有<1EU(內毒素單位，標準量度)，優選每劑量〈0.1EU。組合物優選無谷蛋白。本發明疫苗組合物，特別是對于裂解或表面抗原疫苗可包含洗滌劑，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑(稱為"吐溫")，辛苯聚醇(例如，辛苯聚醇-9(曲通X-100)或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)，溴化十六垸基三甲銨(CTAB)，或脫氧膽酸鈉。可以只存在痕量的洗滌劑。因此，疫苗中辛苯聚醇(octoxynol)-10和聚山梨醇酯80的含量各自低于1毫克/毫升。其它痕量的殘留組分可以是抗生素(例如，新霉素、卡那霉素、多粘菌素B)。疫苗組合物可包含一次免疫的物質，或可包含多次免疫的物質(即，"多劑量"藥劑盒)。在多劑量配置中，優選包含防腐劑。除了在多劑量組合物中包含防腐劑以外，還可將組合物置于裝有用于轉移物質的無菌適配器的容器中。一般給予的流感疫苗劑量體積是約0.5ml，但可將一半劑量(g卩，約0.25ml)給予兒童。組合物和藥劑盒優選保存在2'C-8"C之間。不應冷凍它們。最好避免光線直射。佐劑本發明組合物宜包含佐劑，佐劑的作用是增強在接受組合物的患者中引起的免疫應答(體液免疫和/或細胞免疫)。曾經描述過將佐劑與流感疫苗一起使用。參考文獻79和80中使用氫氧化鋁，參考文獻81中使用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物。參考文獻82也描述了鋁鹽佐劑的應用。希龍疫苗公司(ChironVaccines)的FLUADTM產品包含水包油乳液。可用于本發明的佐劑包括但不限于*包含鈣鹽和鋁鹽(或其混合物)的含礦物質組合物。鈣鹽包括磷酸鈣(如參考文獻83公開的"CAP"顆粒)。鋁鹽包括氫氧化鋁、磷酸鋁、硫酸鋁等，所述鹽采取任何合適形式(如凝膠、晶體、無定形態等)。優選吸附于這些鹽。也可將含有礦物質的組合物制成金屬鹽的顆粒[84]。下面開始更詳細地描述鋁鹽佐劑。細胞因子誘導劑(詳述見下)皂苷[參考文獻112的第22章]是在許多種類植物的樹皮、葉、莖干、根甚至花中發現的甾醇糖苷和三萜糖苷的異質群體。已廣泛研究了作為佐劑的來自皂樹(gw7/a^犯/o"an'fl)Molina樹皮的皂苷。皂苷也可商品化購自麗花菝葜0SVm7axomato)(墨西哥菝葜)、滿天星(Qy戸o;/n7/fl;am'cw/ato)(婚紗花)和肥皂草0&/70"『^0#"'""0//力(皂根)。皂苷佐劑制劑包括純化制劑如QS21以及脂質制劑如ISCOM。QS21以商標StimulonTM出售。已采用HPLC和RP-HPLC純化皂苷組合物。已鑒定了用這些技術純化的特定組分，包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH-A、QH-B禾BQH-C。制備QS21的方法參見參考文獻85。皂苷制劑也可包含甾醇，如膽固醇[86]。皂苷和膽固醇的組合可用于形成稱為免疫刺激復合物(ISCOM)的獨特顆粒[參考文獻112的第23章]。ISCOM通常也含有磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿。ISCOM中可釆用任何已知的皂苷。ISCOM優選包含QuilA、QHA和QHC中的一種或多種。參考文獻86-88中進一步描述了ISCOM。任選地，ISCOM可不含其它去污劑[89]。開發基于皂苷的佐劑的綜述可參見參考文獻90和91。脂肪佐劑(詳述見下)細菌ADP-核糖基化毒素(例如大腸桿菌不耐熱腸毒素"LT"、霍亂毒素"CT"、或百日咳毒素"PT")以及它們的解毒衍生物，如稱為LT-K63和LT-R72的突變體毒素[92]。將解毒的ADP-核糖基化毒素用作粘膜佐劑描述于參考文獻93，用作腸胃外佐劑描述于參考文獻94。生物粘附劑和粘膜粘著劑，如酯化的透明質酸微球[95]或脫乙酰殼多糖及其衍生物[96]由生物可降解和無毒性材料形成的微粒(即直徑為約100nm到約150|im，更優選約200nm到約30|im，或者約500nm到約10|iim的顆粒)，所述材料例如聚(a-羥酸)、聚羥丁酸、聚原酸酯、聚酐、聚已酸內酯等等，其中優選聚乙丙交酯共聚物，任選地對其處理，使其具有帶負電荷表面(例如用SDS處理)或帶正電荷表面(例如用陽離子型去污劑，例如CTAB)處理。脂質體(參考文獻112第13和14章)。適合用作佐劑的脂質體制劑的例子見參考文獻97-99所述。聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯[IOO]。此類制劑還包括與辛苯聚醇組合的聚氧乙烯去水山梨糖醇酯表面活性劑[IOI]，以及與至少一種其它非離子型表面活性劑(例如辛苯聚醇)組合的聚氧乙烯烷基醚或酯表面活性劑[102]。優選的聚氧乙烯醚選自聚氧乙烯-9-月桂醚(月桂醇聚醚9)、聚氧乙烯-9-硬脂酰基(steoryl)醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰基醚、聚氧乙烯-4-月桂醚、聚氧乙烯-35-月桂醚和聚氧乙烯-23-月桂醚。胞壁酰肽，例如N-乙酰基-胞壁酰-L-蘇氨酰基-D-異谷氨酰胺("thr-MDP")、N-乙酰基-去甲胞壁酰-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺("nor-MDP")、N-乙酰基葡糖胺-N-乙酰基胞壁酰-L-Al-D-異谷-L-Ala-二棕櫚酰丙酰胺(N-acetylglucsaminyl-N陽acetylmuramyl-L-Al-D-isoglu-L-Ala-dipalmitoxypropylamide)("DTP-DPP"，或"Theramide")或N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰基-D-異谷氨酰胺-L-丙氨酸-2-(l'-2'-二棕櫚酰基-sn-甘油基-3-羥基磷酰氧基)-乙胺("MTP-PE")。從第一種革蘭氏陰性菌制備的外膜蛋白蛋白體制品與衍生自第二種革蘭氏陰性菌的脂多糖(LPS)制品的組合，其中所述外膜蛋白蛋白體和LPS制品形成穩定的非共價佐劑復合物。這類復合物包括"IVX-908"，它是由腦膜炎奈瑟球菌外膜和LPS組成的復合物。它們已被用作流感疫苗的佐劑[103]。甲基肌苷5'-單磷酸酯("MIMP")[104]。如下式所示的多羥基化吡咯雙烷(pyrrolizidine)化合物[105]或其藥學上可接受的鹽或衍生物其中R選自下組氫，直鏈或支鏈、未取代或取代的、飽和或不飽和的酰基、垸基(例如，環垸基)、烯基、炔基和芳基。例子包括但不限于木麻黃素(casuarine)、木麻黃素-6-a-D-吡喃型葡萄糖、3-表-木麻黃素、7-表-木麻黃素、3,7-二表-木麻黃素，等等。Y菊粉[106]或其衍生物，如藻類菊粉(algammulin)。CDld配體，如a-半乳糖苷神經酰胺。'聚氧鏡離子(polyoxidonium)聚合物[107，108]或其它N-氧化的聚乙烯-哌嗉衍生物。這些佐劑和其他佐劑活性物質更加詳細的描述見參考文獻112和113。組合物可包含兩種或多種所述佐劑。例如，組合物宜同時包含水包油乳液和細胞因子誘導劑，因為這種組合能改善流感疫苗引發的細胞因子應答，如干擾素Y應答，這種改善作用比單用乳液或細胞因子誘導劑的情況要好得多。組合物中的抗原和佐劑一般形成混合物。水包油乳液佐劑己發現水包油乳液特別適用于佐劑配制的流感病毒疫苗中。已知各種這樣的乳液，它們通常包含至少一種油和至少一種表面活性劑，其中一種或多種油和一種或多種表面活性劑是生物可降解(可代謝)和生物相容的。乳液中的油滴通常直徑低于5pm，甚至可具有亞微米直徑，用微流化儀可實現這些小尺寸，從而能提供穩定的乳液。優選尺寸小于220nm的油滴，因為能對它們進行過濾滅菌。本發明可使用諸如動物來源(例如魚)或植物來源的油。植物油來源包括堅果、種子和谷物。堅果油的例子是最常購得的花生油、大豆油、椰油和橄欖油。例如，可利用從霍霍巴豆(jojobabean)獲得的霍霍巴油。種子油包括紅花油、棉籽油、葵花籽油、芝麻油等。在谷物油中，玉米油是最易購得的，但其它谷物如小麥、燕麥、黑麥、大米、畫眉草(teff)、黑小麥等的油也可利用。通過水解、分離和酯化合適的堅果和種子油起始物質可制備種子油中天然不存在的甘油和1,2-丙二醇的6-10碳脂肪酸酯。哺乳動物乳汁的脂肪和油類是可代謝的，因此可用于實施本發明。本領域熟知從動物來源獲得純油所需的分離、純化、皂化和其它方法。大多數魚含有不難回收的可代謝油。例如，本發明可用的幾種魚油的例子是鱈魚肝油、鯊魚肝油和鯨油，如鯨蠟。可以5-碳異戊二烯單位通過生物化學方法合成許多支鏈油，這些支鏈油通常稱為類萜。鯊魚肝油含有稱為角鯊烯(2,6,10,15,19，23-六甲基-2,6,10，14,18,22-二十四己烯(tetracosahexaene))的支鏈不飽和類萜，這是本發明特別優選的。角鯊垸是角鯊烯的飽和類似物，其也是優選的油。包含角鯊烯和角鯊垸的魚油不難從商業來源購得，或可通過本領域已知的方法獲得。其它優選的油是生育酚(參見下文)。可利用油的混合物。可根據表面活性劑的"HLB"(親水/親油平衡)將其分類。優選的本發明表面活性劑的HLB至少為IO，優選至少15，更優選至少16。本發明可用的表面活性劑包括但不限于聚氧乙烯失水山梨糖醇酯表面活性劑(通常稱為吐溫)，特別是聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80;環氧乙垸(EO)、環氧丙烷(PO)和/或環氧丁烷(BO)的共聚物，以DOWFAXTM為商品名出售，例如線形EO/PO嵌段共聚物；重復的乙氧基(氧-l,2-乙二基)基團數目可能不同的辛苯聚醇，其中特別感興趣的是辛苯聚醇-9(曲通X-100或叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇)；(辛基苯氧基)聚乙氧基乙醇(IGEPALCA-630/NP-40);磷脂，例如磷脂酰聚膽堿(卵磷脂)；壬基苯酚乙氧基化物，例如TergitolTMNP系列；衍生自月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇的聚氧乙烯脂肪醚(稱為Brij表面活性劑)，例如三乙烯乙二醇單月桂基醚(triethyleneglycolmonolaurylether)(節澤30);和失水山梨糖醇酯(通常稱為司盤(SPAN))，例如失水山梨糖醇三油酸酯(司盤85)和失水山梨糖醇單月桂酸酯。優選非離子型表面活性劑。乳液中所含的優選表面活性劑是吐溫80(聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯)、司盤85(失水山梨糖醇三油酸酯)、卵磷脂和曲通X-IOO。可利用表面活性劑的混合物，例如吐溫80/司盤85混合物。聚氧乙烯失水山梨糖醇酯，例如聚氧乙烯失水山梨糖醇單油酸酯(吐溫80)和辛苯聚醇，例如叔辛基苯氧基聚乙氧基乙醇(曲通X-100)的混合物也適用。另一有用的混合物包含月桂醇聚醚9加上聚氧乙烯失水山梨糖醇酯和/或辛苯聚醇。表面活性劑的優選用量(重量％)是聚氧乙烯失水山梨糖醇酯(例如，吐溫80)0.01-1%，特別是約0.1%;辛基-或壬基苯氧基聚氧乙醇(例如曲通X-100或曲通系列的其它洗滌劑)0.001-0.1%，特別是0.005-0.02%;聚氧乙烯醚(例如月桂醇聚醚9)0.1-20%，優選0.1-10%,特別是0.1-1%或約0.5%。本發明所用的具體水包油乳液佐劑包括但不限于角鯊烯、吐溫80和司盤85的亞微米乳液。以體積計，所述乳液的組成可以是約5%角鯊烯，約0.5%聚山梨醇酯80和約0.5%司盤85。以重量計，這些比例可以是4.3%角鯊烯，0.5%聚山梨醇酯80和0.48%司盤85。該佐劑稱為"MF59"[109-111]，如參考文獻112的第10章和參考文獻112的第12章所詳述的。MF59乳液優選包含檸檬酸離子，例如10mM檸檬酸鈉緩沖液。角鯊烯、生育酚和吐溫80的乳液。該乳液可包含磷酸緩沖鹽水。其還可包含司盤85(例如，1%)和/或卵磷脂。這些乳液可具有2-10%角鯊烯、2-10%生育酚和0.3-3%吐溫80，角鯊烯:生育酚的重量比優選S1，因為這能提供更穩定的乳液。角鯊烯和吐溫80的體積比可以約為5:2。可將吐溫80溶解于PBS中獲得2%的溶液，然后將90ml該溶液與(5gDL-a-生育酚和5ml角鯊烯)的混合物混合，隨后微流化該混合物來制備這樣一種乳液。得到的乳液可具有亞微米油滴，例如平均直徑在100-250nm之間，優選約180角鯊烯、生育酚和曲通洗滌劑(例如，曲通X-100)的乳液。該乳液還可包含3d-MPL(見下文)。該乳液可包含磷酸緩沖液。含有聚山梨醇酯(例如，聚山梨醇酯80)、曲通洗滌劑(例如，曲通X-100)和生育酚(例如，a-生育酚琥珀酸酯)的乳液。該乳液所包含的這三種組分的質量比約為75:11:10(例如，750pg/ml聚山梨醇酯80，110pg/ml曲通X-100和100嗎/mla-生育酚琥珀酸酯)，這些濃度應包括來自抗原的這些組分的影響。該乳液還可包含角鯊烯。該乳液還可包含3d-MPL(見下文)。水相可含有磷酸鹽緩沖劑。角鯊烷、聚山梨醇酯80和泊洛沙姆401("普羅流尼克TML121")的乳液。可以用磷酸緩沖鹽水，pH7.4配制該乳液。該乳液是一種有用的胞壁酰二肽遞送載體，已與用"SAF-r佐劑(0.05-l。/。Thr-MDP、5。/。角鯊烯垸、2.5。/0普羅流尼克L121和0.2%聚山梨醇酯80)配制的蘇氨酰-MDP聯用[114]。也可不與Thr-MDP聯用，例如用"AF"佐劑(5。/。角鯊烷、1.25%普羅流尼克L121和0.2%聚山梨醇酯80)配制[115]。優選微流體化。包含角鯊烯、水性溶劑、聚氧乙烯烷基醚親水性非離子型表面活性劑(例如聚氧乙烯(12)鯨蠟基/硬脂基醚)和疏水性非離子型表面活性劑(例如失水山梨糖醇酯或二縮甘露醇酯，如失水山梨糖醇單油酸酯或'司盤80')的乳液。乳液優選是熱致可逆的和/或至少90%油滴(按體積計)的大小小于200nm[116]。乳液中還可包含以下一種或多種醛醇；冷凍保護劑(例如糖，如十二烷基麥芽苷和/或蔗糖)；和/或垸基聚糖苷。這種乳液可被凍干。角鯊烯、泊洛沙姆105和AbilCare的乳液[117]。佐劑疫苗中這些組分的終濃度(重量)為5%角鯊烯、4%泊洛沙姆105(普流羅尼類多元醇)和2%AbilCare85(雙PEG/PPG-16/16PEG/PPG-16/16二甲硅油；辛酸/癸酸甘油三酯)。*具有0.5-50%的油、0.1-10%磷脂和0.05-5%非離子表面活性劑的乳液。如參考文獻118所述，優選的磷脂組分是磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油、磷脂酸、鞘磷脂和心磷脂。優選亞微米液滴大小。不可代謝的油(例如，輕質礦物油)和至少一種表面活性劑(例如，卵磷脂、吐溫80或司盤80)的亞微米水包油乳液。可包含添加劑，例如QuilA皂苷、膽固醇、皂苷-親脂偶聯物(例如，參考文獻119所述的GPI-OIOO，通過將脂族胺通過葡糖醛酸的羧基加成到脫酰基皂苷上制備)、二甲基二(十八烷基)溴化銨和/或N,N-二(十八垸基)-N,N-二(2-羥乙基)丙二胺。包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親水性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液[120]。包含礦物油、非離子親脂性乙氧基化脂肪醇和非離子親脂性表面活性劑(例如，乙氧基化脂肪醇和/或聚氧乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物)的乳液岡。其中皂苷(例如，QuilA或QS21)和固醇(例如，膽固醇)結合成螺旋狀膠束的乳液[121]。這些乳液優選在遞送之時與抗原臨時混合。因此，在包裝或分發的疫苗中，佐劑和抗原通常分開存放，最后在使用時即時配制。抗原一般以水性形式存在，使得可通過混合兩種液體來最終制備疫苗。用于混合的兩種液體的體積比可以不同(例如，在5:1和1:5之間)，但通常是約l:l。抗原和佐劑混合后，血凝素抗原通常維持在水溶液中，但其自身可能在油/水界面附近分配。進入乳液的油相的血凝素通常極少(如果有的話)。如果組合物包含生育酚，a、P、y、5、s或g生育酚均可用，但優選a-生育酚。生育酚可采取幾種形式，例如不同的鹽和/或異構體。鹽包括有機鹽，例如琥珀酸鹽、乙酸鹽、煙酸鹽等等。D-a-生育酚和DL-ot-生育酚均可用。老年患者(例如，60歲或更大)所用的疫苗中優選包含生育酚，因為據報道維生素e在該患者組中對免疫應答有正面影響[122]。它們還具有抗氧化特性，從而有助于穩定溶液[123]。優選的a-生育酚是DL-a-生育酚，該生育酚的優選鹽是琥珀酸鹽。現已發現琥珀酸鹽在體內能與TNF-相關的配體協作。此外，已知a-生育酚琥珀酸鹽與流感疫苗相容，是替代汞化合物的有用防腐劑[59]。37細胞因子誘導劑給予患者時包含在本發明組合物中的細胞因子誘導劑能夠引發免疫應答，以釋放細胞因子，包括干擾素和白細胞介素。已知細胞因子應答與針對流感病毒感染的宿主防御的早期和決定階段有關[124]。優選的藥劑可引發以下一種或多種物質的釋放干擾素y;白介素l;白介素2;白介素12;TNFa;TNFp;和GMCSF。優選的藥劑可誘發與Thl-型免疫應答有關的細胞因子的釋放，例如干擾素Y，TNFa，白介素2。優選刺激干擾素Y和白介素2。因此，接受本發明組合物的結果是，用流感抗原刺激時，患者具有以抗原特異性方式釋放所需細胞因子的T細胞。例如，體外接觸流感病毒血凝素時，從血液純化的T細胞將釋放y干擾素。測定外周血單核細胞(PBMC)這種應答的方法是本領域已知的，這些方法包括ELISA、ELISPOT、流式細胞術和實時PCR。例如，參考文獻125報道了監測針對破傷風類毒素的抗原特異性T細胞介導的免疫應答，特別是Y干擾素應答的研究，發現ELISPOT是區別抗原特異性TT-誘導的應答與自發應答的靈敏度最高的方法，但流式細胞術檢測胞質內細胞因子是測定再次刺激效果的最有效方法。合適的細胞因子誘導劑包括但不限于，免疫刺激性寡核苷酸，例如含有CpG基序(含有通過磷酸鍵連接于鳥嘌呤的未甲基化胞嘧啶的二核苷酸序列)的寡核苷酸、或雙鏈RNA、或含有回文序列的寡核苷酸、或含有聚(dG)序列的寡核苷酸。3-0-脫酰基單磷酰脂質A('3dMPL'，也稱為'MPL，)[126-129]。咪唑并喹啉化合物，例如咪喹莫特("R837")[130,131]、瑞喹莫德("R-848")[132]和它們的類似物；和它們的鹽(例如，鹽酸鹽)。免疫刺激性咪唑并喹啉的其它細節見參考文獻133-137。縮氨基硫脲化合物，例如參考文獻1-38披露的那些。參考文獻138還描述了配制、制造和篩選活性化合物的方法。縮氨基硫脲對于刺激人外周血單核細胞產生細胞因子如TNF-a尤其有效。色胺酮化合物，例如參考文獻139披露的那些。參考文獻139還描述了配制、制造和篩選活性化合物的方法。縮氨基硫脲對于刺激人外周血單核細胞產生細胞因子如TNF-a尤其有效。核苷類似物，例如(a)艾沙托拉濱(Isatorabine)(ANA-245;7-硫雜-8-氧代鳥苷)及其前藥OO(b)ANA975;(c)ANA-025-l;(d)ANA380;(e)參考文獻140-142所述的化合物；(f)下式所示化合物R,和R2各自獨立為H、鹵素、-NRaRb、-OH、d.6烷氧基、取代的Q.6烷氧基、雜環基、取代的雜環基、C6-k)芳基、取代的C6-h)芳基、Cl6焼基或取代的Cl6院基；R3不存在，或是H、Cl6院基、取代的CL6垸基、<:6.1()芳基、取代的Q.u)芳基、雜環基或取代的雜環基；R4和Rs各自獨立為H、鹵素、雜環基、取代的雜環基、-C(0)-Rd、Cl6烷基、取代的Q-6烷基，或結合在一起形成5元環，如R4，5:在一所示鍵處實現結合。X!和X2各自獨立為N、C、O或S;Rs是H、鹵素、-OH、CV6垸基、(:2.6烯基、C2，6炔基、-OH、-NRaRb、-(CH2)n-0-Rc、-0-(d.6烷基)、-S(O)pRe或-C(O)-Rd;R9是H、Cl6院基、取代的Cl6院基、雜環基、取代的雜環基或R9a，其中R9a是:式中:叫RR*RioRm在^w所示鍵處實現結合。R10和R各自獨立為H、鹵素、Cl6烷氧基、取代的d.6烷氧基、-NRaRb或-OH;Ra和Rb各自獨立為H、Cl6院基、取代的Cl6焼基、-C(0)Rd、C6.10芳基；Rc各自獨立為H、磷酸酯基、二磷酸酯基、三磷酸酯基、Cl6院基或取代的Cl6院基；Rd各自獨立為H、鹵素、Cl6院基、取代的Cl6院基、CL6烷氧基、取代的CL6垸氧基、-NH2、^11((:1.6垸基)、-NH(取代的d-6垸基)、-N(d.6垸基)2、^(取代的(:1.6烷基)2、(VK)芳基或雜環基；Re各自獨立為H、Cl6院基、取代的Cl6院基、Cw。芳基、取代的C6.,0芳基、雜環基或取代的雜環基；Rf各自獨立地為H、Cl6院基、取代的Cl6院基、-C(0)Rd、磷酸酯基、二磷酸酯基或三磷酸酯基；n各自獨立為0、1、2或3;p各自獨立為O、l或2;或者(g)(a)-(f)中任一項的藥學上可接受的鹽，(a)-(f)中任一項的互變異構體，或該互變異構體的藥學上可接受的鹽。羅唑利賓(Loxoribine)(7-烯丙基-8-氧代鳥苷)[143]。參考文獻144披露的化合物，包括酰基哌嗪化合物、吲哚二酮(Indoledione)化合物、四氫異喹啉(THIQ)化合物、苯并環二酮(Benzocyclodione)化合物、氨基氮雜乙烯基(Aminoazavinyl)化合物、氨基苯并咪唑喹啉酮(Aminobenzimidazolequinolinone)(ABIQ)化合物[145，146]、羥鄰苯二甲酰胺(Hydrapthalamide)化合物、二苯甲酮化合物、異噁唑化合物、固醇化合物、喹唑酮(Quinazilinone)化合物、吡咯化合物[147]、蒽醌化合物、喹喔啉化合物、三嗪化合物、吡唑嘧啶(Pyrazalopyrimidine)化合物和氮茚(Benzazole)化合物[148]。40參考文獻149披露的化合物。氨烷基氨基葡糖苷磷酸酯衍生物，如RC-529[150,151]。磷腈，例如參考文獻152和153中描述的聚[二(羧基苯氧基)磷月青]("PCPP"，poly[di(carboxylatophenoxy)phosphazene])。小分子免疫增強劑(SMIP)，例如N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-乙基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；l-(2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N2-戊基-lH-咪哇并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N2-丙-2-烯基-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；l-(2-甲基丙基)-2-[(苯基甲基)硫]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-4-胺；1-(2-甲基丙基)-2-(丙硫基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-4-胺；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙醇；2-[[4-氨基-l-(2-甲基丙基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-基](甲基)氨基]乙基乙酸酯；4-氨基-l-(2-甲基丙基)-l，3-二氫-2H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2-酮；N2-丁基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；N2-丁基-N2-甲基-1-(2-甲基丙基)-N4，N4-雙(苯基甲基)-1H-咪唑并[4，5-c]喹啉-2,4-二胺；N2-甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉隱2,4-二胺；N2,N2-二甲基-l-(2-甲基丙基)-N4,N4-雙(苯基甲基)-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2，4-二胺；l-(4-氨基-2-[甲基(丙基)氨基]-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-l-基卜2-甲基丙-2-醇；l-[4-氨基-2-(丙基氨基)-lH-咪唑并[4，5-c]喹啉-l-基]-2-甲基丙-2-醇；N4，N4-二芐基-l-(2-甲氧基-2-甲基丙基)-N2-丙基-lH-咪唑并[4,5-c]喹啉-2,4-二胺。用于本發明的細胞因子誘導劑可以是Toll樣受體(TLR)調節劑和/或激動劑。例如，它們可以是人TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR7、TLR8和/或TLR9蛋白中的一種或多種的激動齊U。優選的細胞因子誘導劑是TLR7的激動劑(例如，咪唑并喹啉類)和/或TLR9的激動劑(例如，CpG寡核苷酸)。這些免疫增強劑可用于活化先天免疫途徑。可以在本發明組合物生產過程的各個階段加入細胞因子誘導劑。例如，它可位于抗原組合物內，然后將該混合物加入到水包油乳液中。另一種可選方式是細胞因子誘導劑位于水包油乳液中，在這種情況下，可將試劑在乳化之前加入乳液組分，或者可以在乳化之后加入乳液中。類似地，試劑可以凝聚在乳液液滴中。細胞因子誘導劑在最終組合物中的位置和分布將取決于其親水/親脂特性，例如該藥劑可位于水相、油相和/或油水界面上。該細胞因子誘導劑可偶聯于另一種藥劑，如抗原(如CRM197)。參考文獻154中提供了有關小分子偶聯技術的綜述。作為另一種可選方式，佐劑可與其它試劑非共價(例如通過疏水作用或離子相互作用)結合。兩種優選的細胞因子誘導劑是(a)免疫刺激性寡核苷酸和(b)3dMPL。免疫刺激性寡核苷酸可包含核苷酸修飾/類似物，如硫代磷酸酯修飾，可以是雙鏈或(除RNA外)單鏈。參考文獻155、156和157公開了可能的類似取代，例如用2'-脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥苷。參考文獻158-163中進一步討論了CpG寡核苷酸的佐劑作用。CpG序列可能導向TLR9，例如基序GTCGTT或TTCGTT[164]。CpG序列可特異性誘導Thl免疫應答，例如CpG-AODN(寡脫氧核糖核苷酸)，或更特異地誘導B細胞應答，例如CpG-BODN。參考文獻165-167中討論了CpG-A和CpG-BODN。CpG優選CpG-AODN。優選構建CpG寡核苷酸時使其5，端可為受體所識別。任選將兩個CpG寡核苷酸序列的3'端相連接形成"免疫聚體"。參見例如，參考文獻164和168—170。有用的CpG佐劑是CpG7909，也稱為ProMune(科雷制藥集團公司(ColeyPharmaceuticalGroup,Inc.))。除使用CpG序列以外，還可使用TpG序列[171]。這些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸可以富含嘧啶。例如，其可包含多個連續的胸苷核苷酸(例如，參考文獻171所述的TTTT)，和/或其核苷酸組成可含有>25%的胸苷(例如，>35%、>40%、>50%、>60%、>80%，等等)。例如，其可包含多個連續的胞嘧啶核苷酸(例如，參考文獻171所述的CCCC)，和/或其核苷酸組成可含有>25°/。的胞嘧啶(例如，>35%、〉40%、>50%、>60%、>80%，等等)。這些寡核苷酸可不含未甲基化的CpG基序。免疫刺激性寡核苷酸通常包含至少20個核苷酸。它們可包含少于100個核苷酸。3dMPL(也稱為3脫-O-酰化單磷酰基脂質A或3-0-脫酰基-4'-單磷酰基脂質A)是單磷酰基脂質A中還原端葡糖胺的3位被脫酰化的佐劑。3dMPL從明尼蘇達沙門菌(Sfl/mo"e〃am/""^Wa)的無庚糖突變體(heptoselessmutant)制備，其在化學上類似于脂質A但缺乏酸不穩定的磷酰基和堿不穩定的酰基。它活化單核細胞/巨噬細胞譜系的細胞，刺激幾種細胞因子釋放，包括IL-1、IL-12、TNF-a和GM-GSF(還可見參考文獻172)。參考文獻173最先描述了3dMPL的制備。3dMPL可釆取酰化程度不同的相關分子混合物的形式(例如，具有長度可能不同的3、4、5或6條酰基鏈)。兩個葡糖胺(也稱為2-脫氧-2-氨基-葡萄糖)單糖的2-位碳(即，2和2'位)被N-酰基化，3'位也被0-酰基化。與碳2相連的基團如式-NH-CO-CH2-CR^'所示。與碳2'相連的基團如式^1"1-(:0-(:12-012112'所示。與碳3'相連的基團如式-0-CO-CH2-CR3R3'所示。代表性的結構是基團R1、112和R3各自獨立為-(CH2)n-CH3。n值優選在8-16之間，更優選在9-12之間，最優選10。基團R「、R"和R3'各自獨立為(a)-H;(b)-OH;或(c)-O-CO-R4，其中R4是-H或-(CH。m-CH3，其中m值優選在8-16之間，更優選10、12或14。在2位，m優選14。在2'位，m優選10。在3'位，m優選12。因此基團R"、R"和W優選十二垸酸、十四烷酸或十六垸酸的-O-酰基。當Rr、112'和R3'均是-H時，3d-MPL只有3條酰基鏈(2、2鄰3'位上各有一條)。當R"、R"和R'中只有兩個是-H時，3d-MPL可具有4條酰基鏈。當R"、R2'和R3'中只有一個是-H時，3d-MPL可具有5條酰基鏈。當R"、R"和W中無一是-H時，3d-MPL可具有6條酰基鏈。本發明所用3d-MPL佐劑可以是具有3-6條酰基鏈的這些形式的混合物，但混合物中優選包含具有6條酰基鏈的3d-MPL，特別是要確保以重量計6酰基鏈形式至少占總3d-MPL的10%，例如^20%、230°/。、240°/。、^50%或更高。發現具有6條酰基鏈的3d-MPL是最有活性的佐劑形式。因此，本發明組合物中包含的3dMPL的最優選形式具有以下通式(IV):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage45</formula>通式(IV)當采用混合物形式的3dMPL時，提及本發明組合物中3dMPL的用量或濃度指該混合物中混合的3dMPL諸種類。在水性條件下，3dMPL可形成大小不同，例如直徑<150nm或>500nm的膠束聚集體或顆粒。本發明可使用任一種或二者，通過常規試驗可選擇較佳的顆粒。較小的顆粒因其較佳的活性而優選用于本發明(例如，足夠小從而能得到3dMPL的澄清水性混懸液)[174]。優選顆粒的平均直徑小于220nm，更優選小于200nm或小于150nm或小于120nm，平均直徑甚至可以小于100nm。然而，在大多數情況中，平均直徑不會小于50nm。這些顆粒足夠小，從而適于過濾滅菌。可通過動態光散射的常規技術評估顆粒直徑，該技術能揭示平均顆粒直徑。當說到顆粒的直徑為xnm時，顆粒分布一般在該平均值附近，但以數量計至少50%(例如，260%、^70%、280%、290%或更多)的顆粒的直徑在乂±25%范圍內。3dMPL與水包油乳液組合使用是有利的。最好基本上所有3dMPL位于乳液的水相中。可單獨使用3dMPL，或與一種或多種其它化合物聯用。例如，可將3dMPL與下述物質聯用QS21皂苷[175](包含在水包油乳液中[176])、免疫剌激性寡核苷酸、QS21和免疫刺激性寡核苷酸、磷酸鋁[177]、氫氧化鋁[178]、或者磷酸鋁和氫氧化鋁。脂肪佐劑本發明中使用的脂肪佐劑包括上述水包油乳液，還包括例如*式1、II或III的化合物或其鹽iiiin如參考文獻179所述，如'ER803058'、'ER803732'、'ER804053'、'ER804058'、'ER804059'、'ER804442'、'ER804680'、'ER804764'、'ER803022'或'ER804057'，如<formula>formulaseeoriginaldocumentpage47</formula>大腸桿菌(^c/^/c/z/aco/Z)如OM174的脂質A的衍生物(如參考文獻180禾口181所述)。陽離子脂質與(通常為中性)共脂質(co-lipid),如氨基丙基-二甲基-肉豆蔻烯酰氧基-溴化丙銨-二植酰基磷脂酰-乙醇胺("VaxfectinTM")或氨基丙基-二甲基-雙十二垸基氧基-溴化丙銨-二油酰基磷脂酰-乙醇胺("GAP-DLRIE:DOPE")的制劑。優選含有-N-(3-氨基丙基)-N,N-二甲基-2，3-雙(順-9-十四烯酰氧基)-l-丙銨鹽(2，3-bis(syn-9-tetradeceneyloxy)-1-propanaminium)的制齊!j[182]。3-0-脫酰基單磷酰脂質A(如上所述)。含有連接于含磷酸無環主鏈的脂質的化合物，如TLR4拮抗劑E5564[183,184]:鋁鹽佐劑可使用稱為氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名稱是常規的，但只是為方便而使用，并未精確描述所存在的實際化學構成[例如，見參考文獻112的第9章]。本發明可用常規用作佐劑的任何"氫氧化物"或"磷酸鹽"佐劑。稱為"氫氧化鋁"的佐劑一般是羥基氧化鋁鹽，其通常至少部分結晶。羥基氧化鋁以分子式A10(OH)表示，其與其它鋁化合物，例如氫氧化鋁Al(OH)3的區別在于紅外(IR)光譜，特別是在1070cm"處存在吸收帶和在3090-3100cm"處存在強烈的肩峰[參考文獻112的第9章]。半峰高處衍射帶的寬度(WHH)反映了氫氧化鋁佐劑的結晶程度，結晶不佳的顆粒因晶體尺寸較小而顯示更強的譜線增寬。表面積隨WHH的增加而增加，WHH值較大的佐劑顯示吸附抗原的能力較強。氫氧化鋁佐劑呈典型的纖維形態(例如，電子透射顯微照片所見的)。氫氧化鋁佐劑的pl通常約11，即在生理pH下佐劑本身具有表面正電荷。據報道，pH7.4時，氫氧化鋁佐劑的吸附能力在每mgA1+++1.8-2.6mg蛋白質之間。稱為"磷酸鋁"的佐劑一般是羥基磷酸鋁，這些佐劑也常含有少量硫酸根(即，羥基磷酸硫酸鋁)。可通過沉淀獲得這些佐劑，沉淀期間的反應條件和濃度影響磷酸根取代該鹽中羥基的程度。羥基磷酸鹽中P04/A1摩爾比通常在0.3-1.2之間。羥基磷酸鹽因存在羥基而有別于嚴格的A1P04。例如，3164cm"的IR光譜帶(例如，當加熱至200°C時)表明存在結構性羥基[參考文獻112的第9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A1"摩爾比通常在0.3-1.2之間，優選在0.8-1.2之間，更優選0.95±0.1。磷酸鋁通常是無定形的，特別是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是PCVA產摩爾比在0.84-0.92之間，含0.6mgAl3+/ml的無定形羥基磷酸鋁。磷酸鋁通常是顆粒狀的(例如，電子透射顯微照片中所見的平板樣形態)。這些顆粒在吸附任何抗原后的典型直徑是0.5-20)im(例如，約5-10pm)。據報道，pH7.4時，磷酸鋁佐劑的吸附能力在每11^八1+++0.7-1.5mg蛋白質之間。磷酸鋁的零電荷點(PZC)與磷酸根取代羥基的程度成反比，而該取代程度依據沉淀制備該鹽所用的反應條件和反應物濃度而不同。也可通過改變溶液中游離磷酸根離子的濃度(磷酸根越多=PZC酸性越高)或通過添加例如組氨酸緩沖液(使得PZC更具堿性)等緩沖液來改變PZC。本發明所用磷酸鋁的PZC通常在4.0-7.0之間，更優選在5.0-6.5之間，例如約5.7。用于制備本發明組合物的鋁鹽懸液可含有緩沖劑(例如，磷酸鹽或組氨酸或Tds緩沖劑)，但不一定。這些懸液優選無菌、無熱原。懸液可含有游離的水性磷酸根離子，例如濃度在1.0-20mM之間、優選在5-15mM之間、更優選約10mM。這些懸液也可含有氯化鈉。本發明可使用佐劑包含氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物[81]。在這種情況中，磷酸鋁可能多于氫氧化鋁，例如重量比至少為2:1，例如25:1、26:1、>7:1、28:1、29:1，等等。給予患者的組合物中八1+++的濃度優選低于10毫克/毫升，例如S5毫克/毫升、S4毫克/毫升、S3毫克/毫升、S2毫克/毫升、Sl毫克/毫升，等等。優選的范圍在0.3-1毫克/毫升之間。優選最高為0.85毫克/劑。除包含一種或多種鋁鹽佐劑外，佐劑組分還可包含一種或多種其它佐劑或免疫刺激劑。其它這類組分包括但不限于3-0-脫酰基單磷酰脂質A佐劑('3dMPL');和/或水包油乳液。疫微會赫包發本發明組合物(或藥劑盒組分)的合適容器包括小瓶、注射器(例如，一次性注射器)、鼻噴霧器等。這些容器應無菌。如果將組合物/組分存于小瓶中，所述小瓶優選由玻璃或塑料材料制49成。優選先將小瓶滅菌再加入組合物。為避免患者對乳膠過敏的問題，優選用無乳膠的塞子密封小瓶，所有包裝材料最好均不含乳膠。小瓶可裝有單劑量疫苗，或可裝有多劑量("多劑量"小瓶)，例如10份劑量。優選用無色玻璃制成小瓶。小瓶可裝有蓋子(例如，盧氏(Luer)鎖扣)，從而可將預填充的注射器插入蓋子中，將注射器的內含物推入小瓶中(例如，重建其中的凍干材料)，再將小瓶的內含物抽回注射器中。將注射器從小瓶中取出后，裝上針頭，將組合物給予患者。優選使蓋子位于封口或覆蓋物內，從而要先除去封口或覆蓋物再接觸蓋子。小瓶可具有蓋子，從而能無菌取出其內含物，特別是多劑量小瓶。如果要將某組分包裝入注射器，注射器可裝有針頭。如果未裝針頭，可隨注射器提供單獨的針頭用于裝配和使用。這種針頭可以是有鞘的。優選安全針頭。常見的是1英寸23號、1英寸25號和5/8英寸25號針頭。注射器可貼有可剝離標簽，其上打印了批號、流感季節和內含物的有效期，從而有助于記錄保管。注射器的活塞優選具有抑止部件，從而能防止柱塞在抽吸期間意外掉出。注射器可裝有乳膠橡膠蓋子和/或柱塞。一次性注射器可含有單劑量疫苗。在裝上針頭之前，注射器一般裝有針帽以密封頂端，所述針帽優選由丁基橡膠制成。如果注射器和針頭分開包裝，則優選給針頭裝有丁基橡膠罩。優選的注射器是以"Tip-Lok"TM為商品名投入市場的那些。可給容器做上顯示半劑量體積的標記，例如以有助于遞送給兒童。例如，含有0.5ml劑量的注射器可具有顯示0.25ml體積的標記。如果使用玻璃容器(例如，注射器或小瓶)，則優選使用硼硅酸玻璃而不是鈉鈣玻璃制成的容器。可隨藥劑盒或組合物提供(例如，裝在同一盒子中)插頁，該插頁包括疫苗的細節，例如給藥的使用說明書，疫苗中抗原的細節等。使用說明書還可包括警告，例如準備腎上腺素溶液以防疫苗接種后的過敏反應，等等。浙方法艦難絲本發明提供了根據本發明制造的疫苗。根據本發明制造的疫苗組合物適合給予人類患者，本發明提供了引起患者免疫應答的方法，該方法包括給予患者本發明組合物的步驟。本發明還提供了用作藥物的本發明組合物。本發明還提供了根據本發明制備的流感病毒抗原在制造引起患者免疫應答的藥物中的應用。通過這些方法和應用引起的免疫應答通常包括抗體反應，優選保護性抗體反應。本領域熟知評估流感病毒疫苗接種后的抗體應答、中和能力和保護作用的方法。人類研究證明針對人流感病毒血凝素的抗體滴度與保護作用有關(血清樣品血凝反應-抑制滴度約30-40時，對同源病毒感染的保護作用約為50%)[185]。一般通過血凝反應抑制、微量中和、單向放射免疫擴散(SRID)和/或單向放射溶血(SRH)檢測抗體應答。本領域熟知這些試驗技術。可以各種方法給予本發明組合物。最優選的免疫途徑是肌肉內注射(例如，注射入手臂或腿中)，但其它可用的途徑包括皮下注射、鼻內[186-188]、口服[189]、真皮內[190,191]、透皮、經皮[192]等途徑。本發明制備的疫苗可用于治療兒童和成年人。流感疫苗目前推薦用于兒科和成年人免疫接種，年齡自6個月起。因此，患者可以小于l歲、1-5歲、5-15歲、15-55歲、或至少55歲。接受疫苗的患者優選老年人(例如，250歲，260歲，優選265歲)，年輕人(例如，S5歲)，住院患者，衛生保健人員、軍隊和軍事人員，懷孕的婦女，慢性病、免疫缺陷患者，在接受疫苗前7天中服用抗病毒化合物(例如，奧塞米韋或扎那米韋化合物；例如磷酸奧塞米韋，參見下文)的患者，和出國的人。然而，這些疫苗不僅適用于這些群體，還可應用于更廣泛的人群中。對于流行毒株，優選給予所有的年齡組。本發明的優選組合物滿足效力的CPMP標準的1、2或3條。在成年人(18-60歲)中，這些標準是(1)^70%血清保護作用；(2)^40%血清轉化；禾口/或(3)GMT增加22.5-倍。在老年人(>60歲)中，這些標準是(1)^60%血清保護作用；(2)^30%血清轉化；和/或(3)GMT增加22-倍。這些標準51是依據至少50位患者的標簽公開研究(openlabelstudy)。可以通過單劑量方案或多劑量方案進行治療。多劑量可用于初免方案和/或加強免疫方案。在多劑量方案中，可通過相同或不同途徑給予各種劑量，例如初免采用胃腸道外途徑而加強免疫采用粘膜途徑，或者初免采用粘膜途徑而加強免疫采用胃腸道外途徑等。給予一個以上劑量(一般是兩個劑量)特別可用于免疫未曾免疫接觸的患者，例如從未接受過流感疫苗的人，或者用于免疫接種新的HA亞型(如大流行爆發中的亞型)。一般以至少1周(例如約2周、約3周、約4周、約6周、約8周、約10周、約12周、約16周等)的間隔給予多個劑量。可將本發明疫苗與其它疫苗基本上同時(例如，可在醫療保健專家或疫苗接種中心的同一次用藥咨詢或就診期間)給予患者，例如與以下疫苗基本上同時給予麻疹疫苗、腮腺炎疫苗、風疹疫苗、MMR疫苗、水痘疫苗、MMRV疫苗、白喉疫苗、破傷風疫苗、百日咳疫苗、DTP疫苗、偶聯的乙型流感嗜血桿菌疫苗、滅活的脊髓灰質炎病毒疫苗、乙肝病毒疫苗、腦膜炎球菌偶聯物疫苗(例如，四價A-C-W135-Y疫苗)、呼吸道合胞體病毒疫苗、肺炎球菌偶聯物疫苗，等等。與肺炎球菌疫苗和/或腦膜炎球菌疫苗基本上同時給予在老年患者中特別有用。類似地，可將本發明疫苗與抗病毒化合物，特別是有效抵御流感感毒的抗病毒化合物(例如，奧塞米韋和/或扎那米韋)基本上同時(例如，可在醫療保健專家的同一次用藥咨詢或就診期間)給予患者。這些抗病毒(化合物)包括神經氨酸酶抑制劑，例如(3R,4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-環己烯-l-羧酸或5-(乙酰基氨基)-4-[(氨基亞氨基甲基)-氨基]-2,6-脫水-3，4，5-三脫氧-D-丙三基-D-半乳糖壬(galactonon)-2-烯酸(enonicacid)，包括它們的酯(例如乙酯)和它們的鹽(例如磷酸鹽)。優選的抗病毒化合物是(3R，4R,5S)-4-乙酰基氨基-5-氨基-3(l-乙基丙氧基)-l-環己烯-l-羧酸乙酯磷酸鹽(l:l)，也稱為磷酸奧塞米韋(達菲(TAMIFLU)TM)。概述術語"含有"包括"包含"以及"由...組成"，例如"含有"X的組合物可僅由X組成或可包含其它物質，例如X+Y。詞語"基本上"不排除"完全"，例如"基本上無"Y的組合物可完全無Y。該詞語"基本上"可視需要從本發明定義中省去。與數值X有關的術語"約"表示，例如Xi100/0。除非另有說明，包括混合兩種或多種組分的步驟的方法不需要任何特定的混合順序。因此，可以任何順序混合這些組分。有三種組分時，兩種組分可以相互混合，然后將混合的組分再與第三種組分混合等。將動物(具體是牛)材料用于培養細胞時，它們應獲自未患傳染性海綿狀腦病(TSE)，特別是未患牛海綿狀腦病(BSE)的來源。總體上，優選在完全不含動物來源的材料中培養細胞。當某化合物作為組合物的一部分給予人體時，該化合物可被合適的前藥所替換。附圖簡要說明圖1顯示了從臨床樣品分離流感病毒的流程。圖2比較了在MDCK-33016細胞中分離的9種病毒樣品的HA滴度。在每種樣品中，左手邊的柱表示第2代，右手邊的柱表示第5代。圖3比較在三種不同的MDCK細胞類型中培養的10個流感病毒樣品的HA滴度。對于每一種樣品，三個柱各自的涵義是左邊表示懸浮培養的33016，中間表示貼壁培養的33016，右邊表示CCL-34MDCK細胞。圖4顯示了三種病毒與SNA或MAA凝集素的結合。圖4A顯示了初始分離物的結合，4B顯示了在MDCK33016細胞中生長后的結合，4C顯示了在蛋中生長后的結合。圖5和6顯示病毒與3-SL或6-SLN的結合。在這兩幅圖中共有六組，分別是靠左邊三組表示在不同濃度(lpM、0.5pM、0.25itiM)下與3-SL的結合；靠右邊三組表示在不同濃度(0.25pM、0.125|iM、0.0625liM)下與6-SLN的結合。在這六組的各組中，每個方柱表示不同的病毒。在圖5中，從左到右的三個方柱是(i)細胞分離的病毒；(ii)蛋分離的病毒；和(iii)禽類病毒。在圖6中，從左到右的四個方柱是(i)在蛋中進行兩次傳代后的病毒；(ii)在MDCK中進行兩次傳代后的病毒；(iii)在蛋中進行五次傳代后的病毒；(iv)在MDCK中進行五次傳代后的病毒。實施本發明的方式從患者樣品中分離病毒在2006-2007北半球流感季節期間從兒童和成人獲取含甲型和/或乙型流感病毒亞型的臨床樣本(鼻腔或喉嚨拭子)。通過確定血凝素(HA)滴度、聚合酶鏈反應(PCR)和病毒滴定，將無血清懸浮培養的MDCK33016細胞系(DSMACC2219)的易感性和可靠性與已建立的MDCKCCL34細胞系(ATCC)和雞蛋進行比較。通過診斷性聚合酶鏈反應(PCR)鑒別了248個流感陽性樣品。通過以下方法在MDCK33016細胞系和雞蛋中評價流感病毒復制和分離的易感性和可靠性(i)血凝素(HA)滴度；(ii)用于測量病毒負荷的實時聚合酶鏈反應(PCR);和(iii)病毒滴定。通過對原始臨床樣本中以及MDCK細胞和雞蛋中第二代分離物的HA基因進行測序，評價細胞中復制的準確性。將由懸浮培養的MDCK33016細胞的分離物獲得的病毒滴度與貼壁培養的MDCK33016細胞所得結果進行比較。結果表明，MDCK33016懸浮細胞系的分離能力優于已建立的MDCKCCL34細胞系，顯著優于雞蛋所得結果。在MDCK33016細胞中對病毒樣品進行傳代之后，分離物中均未鑒定到氨基酸取代。相反，幾乎所有蛋傳代病毒都包含一個或多個氨基酸取代，主要發生在HA1基因中。蛋中傳代后觀察到的HA基因抗體結合位點中的突變可導致流感病毒的免疫原性改變。55%從急性呼吸道疾病患者獲取的臨床樣品鑒別為流感陽性，具有以下病毒類型79%A/H3N2;12,5%A/H1N1;1.6%B;0.4%H3/B和6.5%未分型。可以利用MDCK33016細胞從臨床樣品分離病毒(圖1)。相反，注入蛋的源自臨床樣品的病毒中，都沒能實現成功分離。用新鮮制備的雞胚成纖維細胞(CEF)中得到類似的陰性結果。只有利用陽性HA滴度的MDCK33016培養物上清液才能分離和建立蛋中的流感病毒。進一步用源自各個細胞的最初獲取物接種蛋，用于參比目的。采用各種方法，成功分離病毒的數量如圖l方框所示，也顯示了注入的不同病毒類型的數量。從MDCK33016細胞分離的所有三種病毒亞型在蛋中第二次傳代后都獲得合理的HA滴度(>32)和病毒滴度(>^106)，兩種滴度隨傳代次數增加(圖2)。對于所有三種亞型，由臨床拭子分離流感病毒時，懸浮生長的MDCK33016細胞優于貼壁細胞系(CCL-34)。懸浮細胞系對陽性流感拭子材料靈敏度較高，如回收率所示(表l)。將在MDCK33016細胞和蛋中進行不同傳代次數后的HA序列與原始分離物進行比較(表2)，在MDCK33016細胞中即使傳代5次后分離的甲型流感毒株仍未發現突變，而蛋中傳代2次后分離的甲型流感毒株即在HA蛋白的抗體結合位點存在突變。在MDCK33016或蛋中分離的乙型流感毒株都未發現突變。分離物在MDCK33016懸浮細胞中復制后的病毒產量比MDCK33016貼壁細胞高至少一個對數值。因此，MDCK33016懸浮細胞系是分離和復制野生型流感毒株的理想體系，因為它具有比雞蛋更高的分離能力。而且，由于高復制準確性，使用細胞分離物制備人流感疫苗可產生更可靠的疫苗。流通的野生型毒株與疫苗中包含的毒株之間的匹配得到改善，導致疫苗產生更好的流感保護作用。結論(a)相對于蛋，在MDCK33016細胞中所有病毒毒株得到成功分離；(b)從MDCK33016細胞分離的病毒毒株能夠在蛋中成功繁殖；(c)與貼壁細胞相比，在懸浮生長的MDCK33016細胞中所有三種流感病毒亞型的回收率較佳；和(d)與原始物質相比，任何在MDCK33016細胞中培養的分離物中不存在HA基因取代，而在蛋中傳代兩次后即出現這種取代。因此，MDCK33016懸浮細胞系是非常適用于分離和繁殖人流感病毒亞型的底物，因為其能高度可靠地對來自臨床分離物的野生型流感病毒進行傳代，并能保持野生型病毒的真實特征。受體結合研究了原始分離的病毒、蛋培養的病毒以及MDCK培養的病毒的受體偏好。研究釆用具有2，3-唾液酸連接鍵(MAA)或2，6-唾液酸連接鍵(SNA)的凝集素，或2,3-唾液酸乳糖(3SL，一種蛋受體的類似物)和2，6-唾液酸-N-乙酰基乳糖胺(6-SLN，一種人受體類似物)唾液酸糖聚合物(sialylglyc叩olymer)[193]。55圖4示出代表性研究結果。標記的峰表明與SNA或MAA凝集素的結合。原始病毒(4A)和在MDCK33016上培養的病毒(4B)具有不同的SNA和MAA峰，而在蛋中培養的病毒SNA和MAA峰基本重疊C4C)。在進一步的實驗中采用3-SL和6-SLN檢查結合特異性。示例性結果在圖5中示出。圖左側的結合表明禽類受體偏好，而右側結合表明人受體偏好。如圖5所示，細胞分離的病毒對人受體有強烈偏好。圖6顯示了使用在蛋中或MDCK33016懸浮細胞中進行2次或5次傳代后的斯圖加特分離物(A/H1N1)獲得的數據。MDCK傳代病毒對6SLN有強烈偏好。結論是，所有MDCK培養的臨床人甲型或乙型病毒相對于3SL更易結合6SLN，但發現一些分離物在該試驗中對兩種物質都不結合。與原始臨床分離物不同，蛋適應病毒能結合3SL，或是對3SL和6SLN都不結合。蛋中培養導致的改變在MDCK細胞中分離甲型和乙型流感病毒的各毒株，然后通過以下底物至多傳代5次蛋；MDCK細胞CCL-34;MDCK細胞33016;Vero細胞或HEK293-T細胞。每次傳代后對病毒HA基因進行測序并測定HA滴度。雖然一些毒株(例如，A/HlNl/Bayern/7/95)的HA序列在蛋和MDCK33016傳代過程中穩定存在，但另一些不是這樣。例如，在蛋中傳代2次后，A/HINI/NordrheinWestfalen/1/05的HA序列在抗體結合位點D出現突變D203N，再傳代2次后還出現R329K突變。相反，通過MDCK33016平行傳代的病毒中序列未改變。對于A/H1N1/NRW/1/05毒株，用Vero細胞培養時未見生長。另外四種底物可支持其生長，但HA滴度不同。例如，蛋中觀察到滴度為32-256，但293T細胞產生的滴度較低(16-32)，而MDCK33016產生的滴度較高(32-512)。應理解，僅以舉例的方式描述了本發明，可在本發明的范圍和構思內進行修改。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>參考文獻(通過引用將其內容納入本文)Gerdil(2003)Vaccine21:1776-9。Palese(2006)EmergingInfectiousDiseases12:61-65。deOfia等(1995)JClinMicrobiol33:1948-49。Monto等(1981)JClinMicrobiol13(1):233-235。Govorkova等(1995)JInfectDis.172(l):250-3。Tobita等(1975)MedMicrobiolImmunol(Berl).162(1):9-14和23-27。Oilier等(2004)JClinMicrobiol42(12):5861-5。Schepetiuk&Kok(1993)JVirolMethods42(2-3):241-50。WHO(2003)Weeklyepidemiologicalrecord78:73-80美國專利6,344,354。也參見WO97/38094。美國專利5,162,112Medema等(2004)VirusRes.103(l-2):9-15。[13]Robertson等(1995)Vaccine13:1583-8。Merten等(1996)AdvancesinExperimentalBiology397:141-151。[15]Govorkova等(1996)J.Virol"70:5519-24。[16]Mastrosovich等(2003)JVirol77:8418-25。Gambaryan&Matrosovich(1992)JVirolMethods39(1-2):111-23。Mastrosovich等(1999)JVirol73:1146-55。Stevens等(2006)JMolBiol355:1143-55。Couceiro&Baum(1994)MemInstOswaldoCruz89(4):587-91。Kistner等(1998)Vaccine16:960-8。Kistner等(1999)DevBiolStand98:101-110。Bruhl等(2000)Vaccine19:1149-58。Pau等(2001)Vaccine19:2716-21。http:〃www.atcc.org/http:〃locus.umdnj.edu/WO03/076601。WO2005/042728。58[29]WO03/043415。WO97/37000。Brands等(1999)DevBiolStand98:93-100。Halperin等(2002)Vaccine20:1240-7。Tree等(2001)Vaccine19:3444-50。WO03/023021WO03/023025EP-A-1260581(WOO1/64846)。WO2006/071563。WO2005/113758。WO97/37001。WO2006/027698。Hoffmann等(2002)Vaccine20:3165—3170。Subbarao等(2003)Virology305:192—200。Liu等(2003)Virology314:580—590。Ozaki等(2004)J.Virol.78:1851—1857。Webby等(2004)Lancet363:1099—1103。WO00細50。WOO1/04333。美國專利6649372。Neumann等(2005)ProcNatlAcadSciUSA102:16825-9。WO2007脂008。WO2006/067211。WO01/83794。Hoffmann等(2000)Virology267(2):310-7。Vaccines(疫苗)(2004)，Plotkin和Orenstein編，ISBN0-7216-9688-0。WO02脂22。WO02/067983。WO01/21151。[59]WO02/097072。[60]WO2005/113756。Huckriede等(2003)MethodsEnzymol373:74-91。[62]Treanor等(1996)JInfectDis173:1467-70。[63]Keitel等(1996)ClinDiagnLabImmunol3:507-10。[64]世界衛生組織(WorldHealthOrganisation)(2005)EmergingInfectiousDiseases11(10):1515-21。Herlocher等(2004)JInfectDis190(9):1627-30。[66]Le等(2005)Nature437(7062):1108。[67]EPB0870508。[68]US5948410。[69]WO2007/052163。Lundblad(2001)BiotechnologyandAppliedBiochemistry34:195-197。GuidanceforIndustry:BioanalyticalMethodValidation(工業指南生物分析驗證方法).美國衛生和人類服務食品藥品管理部(U.S.DepartmentofHealthandHumanServicesFoodandDrugAdministration),藥物評價禾口石開究中心(CenterforDrugEvaluationandResearch,CDER)，獸醫藥物中心(CenterforVeterinaryMedicine,CVM).2001年5月。Ji等(2002)Biotechniques.32:1162-7。Briggs(1991)JParenterSciTechnol.45:7-12。Lahijani等(1998)HumGeneTher.9:1173-80。Lokteff等(2001)Biologicals.29:123-32。Gennaro(2000)Remington:TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明頓藥物科學和實踐).第20版ISBN:0683306472[77]Banzhoff(2000)ImmunologyLetters71:91-96。[78]Nony等(2001)Vaccine27:3645-51。[79]美國專利6,372,223。[80]WO00/15251。60<formula>formulaseeoriginaldocumentpage61</formula>[110]Podda&DelGiudice(2003)ExpertRevVaccines2:197-203。[111]Podda(2001)Vaccine19:2673-2680。VaccineDesign:TheSubunitandAdjuvantApproach浪苗設計亞基和佐劑方法)(Powell和Newman編)普萊努(Plenum)出版社1995(ISBN0-306-44867-X)。Vaccineadjuvants:PreparationMethodsandResearchProtocols浪苗佐劑制備方法和研究方案)(分子醫學方法叢書(MethodsinMolecularMedicineseries)第42巻)，ISBN:1-59259-083-7，O，Hagan編。Allison&Byars(1992)ResImmunol143:519-25。Hariharan等(1995)CancerRes55:3486-9。US2007/014805。Suli等(2004)Vaccine22(25-26):3464-9。[118]WO95/11700。[119]美國專利6,080,725。[120]WO2006/113373。[121]WO2005/097181。Han等(2005)"維生素E對老年人的免疫功能和感染性疾病的影響"(ImpactofVitaminEonImmuneFunctionandInfectiousDiseasesintheAged)，"歐洲營養、免疫功能和健康大會"(Nutrition,ImmunefunctionsandHealthEuroConference)，巴黎，2005年6月9-10曰。US-6630161。Hayden等(1998)JC//"/"w^101(3):643曙9。[125]Tassignon等(2005)J/mmw"o/M"/z305:188-98。[126]Myers等(1990)Cellularandmolecularaspectsofendotoxinreactions(內毒素反應的細胞和分子方面)第145-156頁。Ulrich(2000)參考文獻250第16章(第273-282頁)。[128]Johnson等(1999)7MedC7ze/42:4640-9。[129]Baldrick等(2002)i^gw/flto^7b;a'co/尸/zarmaco/35:398-413。[130]US4,680,338。[131]US4,988,815。[132]W092/15582。Stanley(2002)C//"五xpDermato/27:571-577。Wu等(2004)Jw"w'ra/7^.64(2):79-83。Vasi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因組區段的至少一個區段包括來自所述第一毒株的HA區段。44.一種制備在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步驟(i)接受從未在蛋底物上繁殖過的流感病毒；(ii)用該流感病毒感染細胞系；和(iii)培養步驟(ii)的受感染細胞以制備流感病毒。45.—種制備在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步驟(i)接受在MDCK33016細胞中分離的流感病毒；(ii)用該流感病毒感染細胞系；和(iii)培養步驟(ii)的受感染細胞以制備流感病毒。46.—種制備在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步驟(i)接受從未在含血清培養基培養的底物上繁殖過的流感病毒；(ii)用該流感病毒感染細胞系；和(iii)培養步驟(ii)的受感染細胞以制備流感病毒。47.—種制備在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步驟(i)接受利用反向遺傳技術產生的流感病毒；(ii)用該流感病毒感染細胞系；和(iii)培養步驟(ii)的受感染細胞以制備流感病毒。48.—種制備在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步驟(i)接受含有不到6個來自PR/8/34流感病毒的病毒區段的甲型流感病毒；(ii)用該流感病毒感染細胞系；和(iii)培養步驟(ii)的受感染細胞以制備流感病毒。49.一種制備在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步驟:(i)接受含有不到6個來自AA/6/60流感病毒的病毒區段的甲型流感病毒；(ii)用該流感病毒感染細胞系；和(iii)培養步驟(ii)的受感染細胞以制備流感病毒o50.—種制備在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步驟(i)接受流感病毒，該流感病毒中的血凝素具有相對于含Sia(a2,3)Gal末端二糖的寡糖，更傾向于結合含Sia(a2,6)Gal末端二糖的寡糖的結合偏好；(ii)用該流感病毒感染細胞系；和(iii)培養步驟(ii)的受感染細胞以制備流感病毒。51.—種制備在疫苗中使用的流感病毒抗原的方法，所述方法包括以下步驟(i)接受具有雞蛋中未曾觀察到的血凝素和/或神經氨酸酶糖形的流感病毒；(ii)用該流感病毒感染細胞系；和(iii)培養步驟(ii)的受感染細胞以制備流感病毒。全文摘要目前，在將流感毒株分發給疫苗生產商之前進行的步驟包括在蛋中對流感病毒進行傳代。本發明的目的是提供適用于制造流感疫苗的方法，該方法中減少了蛋的使用，較佳地避免使用蛋。例如，不使用雞蛋進行流感疫苗分離，可利用(例如)懸浮培養、在無血清培養基中培養、在無蛋白培養基中培養、非致瘤性、不存在覆蓋培養基的情況下培養的MDCK細胞(馬-達二氏犬腎細胞)。文檔編號A61K39/145GK101511385SQ200780033583公開日2009年8月19日申請日期2007年9月11日優先權日2006年9月11日發明者H·特魯賽姆,T·F·蔡申請人:諾華有限公司