專利名稱：用源自hiv-tat的多肽片段穩定的肉毒桿菌毒素的組合物及其局部施用和透皮遞送的方法
技術領域：
本發明涉及新的肉毒桿菌毒素組合物，其可以局部施用以用于多 種治療、美容和/或化妝目的，并且其用源自HIV-TAT的多肽片段穩定。
背景技術：
皮膚保護身體器官免受外部環境的威脅，并起保持體溫的恒溫器 作用。其由幾個不同的層組成，每層都具有特定的功能。主要的層包 括表皮、真皮和皮下組織。表皮是覆蓋真皮的上皮細胞的分化層，真 皮由結締組織組成。表皮和真皮都受皮下組織的進一步支持，皮下組 織是脂肪組織的內層。
表皮，皮膚的最上層，僅僅為0. 1至1. 5毫米厚(Inlander, Skin， New York, NY: People's Medical Society, 1—7 (1998))。其由角質 形成細胞組成，根據它們的的分化狀態，其被分成幾層。可以進一步 將表皮分成角質層和有活力的表皮，該有活力的表皮由granular melphigian和基細胞組成。角質層是吸濕性的，需要至少10%重量的 水分以保持其彈性和柔軟性。吸濕性部分歸于角蛋白的持水能力。當 角質層喪失其柔軟性和彈性時，其變得粗糙且脆，產生干燥皮膚。
真皮，其緊位于表皮之下，為1.5至4毫米厚。其是皮膚的三個 層中最厚的。另外，真皮還具有大部分皮膚結構，包括汗腺和脂腺(其 通過皮膚中稱為毛孔或痤瘡的孔分泌物質)、毛嚢、神經末梢和血管及淋巴管(Inlander, Skin， New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998))。然而，真皮的主要組分是膠原和彈性蛋白。
皮下組織是皮膚的最深層。其起用于身體熱量保存的絕緣體和用 于器官保護的減震器作用(Inlander, Skin, New York, NY: People's Medical Society, 1-7 (1998))。另外，皮下組織也貯藏用于能量儲 備的脂肪。皮膚的pH通常為5至6之間。該酸性是由于存在來自于皮 脂腺分泌物的兩性氨基酸、乳酸和脂肪酸。術語"酸外膜(acid mantle)"指在皮膚的大多數區域存在水溶性物質。皮膚的緩沖能力部 分由于儲存在皮膚角質層中的這些分泌物。
皺紋，年齡的指示特征之一，可能是由皮膚受環境損害而蓄積的 生物化學、組織學和生理學變化引起(Benedetto, International Journal of Dermatology, 38:641-655 (1999))。另外，存在可能引 起面部皺紋的皺褶、皺紋和皺痕(creases)的其他第二因子(Stegman 等人，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery 第2版，St. Louis編著，M0: Mosby Year Book: 5-15 (1990))。這 些第二因子包括重力的持續牽拉、皮膚上經常和持續的位置壓力(例 如，在睡眠期間)和由于面部肌肉收縮引起的反復面部運動(Stegman 等人.，The Skin of the Aging Face Cosmetic Dermatological Surgery, 第 2版，St. Louis 編著，M0: Mosby Year Book: 5-15 (1990))。
為了可能緩和某些老化體征，已經使用了不同的技術。這些技術 從包含a羥酸和視黃醇的面部增濕劑到外科手術方法和注射神經毒 素。例如，在1986年，Jean和Alastair Carruthers, —對由眼整 形外科醫生和皮膚科醫生組成的夫妻團隊，研究了一種使用A型肉毒 桿菌毒素治療眉間區域與運動相關的皺紋的方法(Schantz和Scott， In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum, New York: Academic Press, 143-150 (1981))。在1992年，Carruthers'使用A 型肉毒桿菌毒素來治療皺紋引起該方法最初/^布(Schantz和Scott， In Lewis GE(Ed)Biomedical Aspects of Botulinum, New York:Academic Press, 143-150 (1981))。直到1994年，同一團隊報道了 對于面部的其它運動相關的皺鄉丈的經驗(Scott， Ophthalmol, 87: 1044-1049 (1980))。這依次引起使用A型肉毒桿菌毒素進行化妝處理 的時代的誕生。
有趣地，據認為A型肉毒桿菌毒素是人類所知最致命的天然生物 劑。肉毒桿菌(C. botulinuffl)的孢子可在土壤中找到，并可在不正 確地殺菌和密封的食物容器中生長。攝入該細菌可導致肉毒中毒，其 可能是致命的。肉毒桿菌毒素通過阻止乙酰膽堿穿過神經肌肉接點的 突觸傳遞或釋放而導致產生肌肉麻瘠，并且其被認為也以其它方式起 作用。其作用主要是阻斷通常引起肌肉痙攣或收縮的信號，導致麻痹。 然而，已經將肉毒桿菌毒素的肌肉-麻痹效應用于治療功效。已經使用 控制施用肉毒桿菌毒素來提供肌肉麻痹以治療病癥，例如以骨骼肌活 動過度為特征的神經肌肉失調。已經用肉毒桿菌毒素治療的病癥包括 偏側面肌痙攣、成年人發病的痙攣性斜頸、肛裂、眼瞼痙攣、大腦性 癱瘓、頸張力障礙、偏頭痛、斜視、顳下頜關節障礙和各種類型的肌 痛性痙攣和肌痙攣。近來，在治療和化妝性面部應用中已經利用肉毒
桿菌毒素的肌肉-麻痹效應，所述應用例如治療皺紋、皺眉線(frown lines)及其它面部肌肉痙攣或收縮的后果。
除了 A型肉毒桿菌毒素之外，存在七種其它的血清學不同形式的 肉毒桿菌毒素，其也由革蘭氏陽性菌肉毒桿菌產生。在這八種血清學 不同類型的肉毒桿菌毒素中，可引起麻痹的七種被稱為肉毒桿菌毒素 血清型A、 B、 C (也稱為d) 、 D、 E、 F和G。這些中的每種以用特定 類型的抗體中和為特征。肉毒桿菌毒素蛋白分子的分子量，對于所有 七種這些活性肉毒桿菌毒素血清型，為約150kD。不同血清型的肉毒 桿菌毒素在動物種類方面不同，它們影響它們引起的麻痹的嚴重性和 持續時間。例如，已經確定A型肉毒桿菌毒素的功效為B型肉毒桿菌 毒素的500倍以上，如通過在大鼠中產生的麻痹速率所測定。另外， 已經確定B型肉毒桿菌毒素在靈長類中以480 U/kg的劑量是無毒的， 為A型的靈長類LDs。的約12倍。由于肉毒桿菌毒素的分子尺寸和分子當由肉毒桿菌細菌釋放時，肉毒桿菌毒素為毒素復合物的組分，
所述毒素復合物包含約150kD的肉毒桿菌毒素蛋白分子和締合的非毒 素蛋白。這些內源性的非毒素蛋白被認為包括血凝素蛋白家族和非血 凝素蛋白家族。所述非毒素蛋白被認為穩定毒素復合物中的肉毒桿菌 毒素分子和保護它防止變性，例如，當毒素復合物被攝取時被消化酸 變性。因此，所述毒素復合物的非毒素蛋白保護肉毒桿菌毒素的活性 和增加全身穿透，特別是當經由胃腸道施用所述毒素復合物時。更特 別地，據認為某些非毒素蛋白特異性增加穿透胃腸上皮細胞，而其它 非毒素蛋白穩定血液中的肉毒桿菌毒素分子。另外，非毒素蛋白在毒 素復合物中的存在通常引起毒素復合物具有比單純的肉毒桿菌毒素分 子更大的分子量，所述單純的肉毒桿菌毒素分子的分子量為約150 kD, 如之前指出的。例如，肉毒桿菌細菌可以產生A型肉毒桿菌毒素復合 物，其具有約900 kD、 500 kD或300 kD的分子量。有趣地，B型和C 型肉毒桿菌毒素顯然產生僅為700 kD或500 kD的復合物。D型肉毒 桿菌毒素產生300 kD和500 kD兩種復合物。E型和F型肉毒桿菌毒 素產生僅僅為約300 kD的復合物。
為了向肉毒桿菌毒素提供另外的穩定性，通常通過在制備期間將 毒素復合物與外源性穩定劑(例如明膠、多糖或最常見的另外的白蛋白) 組合來穩定它們。所述穩定劑在不同的環境中起結合和穩定毒素復合 物的作用，所述環境包括與制備、運輸、貯藏和給藥相關的那些。
通常，通過仔細地控制包含肉毒桿菌毒素復合物和白蛋白的組合 物的注射，給患者施用肉毒桿菌毒素，但是存在與該方法相關的一些 問題。例如，因為注射的毒素復合物包含非毒素蛋白和白蛋白，這二 者穩定肉毒桿菌毒素，且增加所述毒素復合物的分子量，所以該毒素 復合物在體內具有長半衰期，不易擴散進入組織，可能在患者中引起 不想要的抗原應答。而且，因為所述非毒素蛋白和白蛋白穩定血液中 的肉毒桿菌毒素，所以必須仔細地進行注射，以便他們不會將大量毒 素釋放到患者的血流中，導致致命的全身中毒。因此，通常必須由深入了解人體解剖學的受過高級訓練的醫學專業人員精確地注射。
鑒于前述討論的所有問題，非常期望提供一種不使用白蛋白的穩 定肉毒桿菌毒素的方法。另外，也非常希望這樣的方法能降低肉毒桿 菌毒素的抗原性和血液穩定性，同時增加肉毒桿菌毒素復合物在體內 的擴散速率，從而使得肉毒桿菌毒素更安全地用于各種治療、美容和/ 或化妝目的。還期望提供一種給藥方法，其不會決定性地依賴醫學專 業人士精確地注射肉毒桿菌毒素，以便實現毒素的安全施用。
發明概述
本發明的一個方面是認識到，HIV-TAT的某些多肽片段、或源自 HIV-TAT片段的多肽片段可以添加到肉毒桿菌毒素復合物、尤其是減 少的肉毒桿菌毒素復合物中，以穩定它們。在一個特別優選的實施方 案中，所述多肽片段具有與HIV-TAT的氨基酸殘基49-57 (RKKRRQRRR， SEQ ID NO. l)相對應的序列。在另一個優選的實施方案中，所述多肽 片段具有與HIV-TAT的氨基酸殘基49-57的反向序列(RRRQRRKO，下 文稱作SEQ ID NO. 2)相對應的序列。另外，本發明也涉及在功能上 等價的SEQ ID NO l和2序列的多肽類似物，例如其中已經進行保守 置換的情況。如在本申請中使用的，術語"HIV-TAT片段衍生物"包 含由SEQ ID NO, 2定義的反向的HIV-TAT多肽、以及其中已經進行保 守置換的SEQ ID NO 1或2的任何多肽類似物。
本發明的另一個方面是認識到，從肉毒桿菌細菌獲得的肉毒桿菌 毒素復合物中的內源性非毒素蛋白(即無毒的血凝素和非血凝素蛋白) 會不希望地增加所述毒素復合物的穩定性和毒性，同時不希望地降低 所述毒素擴散穿過皮膚上皮的能力。本發明進一步認識到，當在常規 制備期間將外源性穩定劑例如白蛋白結合到肉毒桿菌毒素時，會加強 這些作用。因此，本發明的一個方面是，提供肉毒桿菌毒素復合物， 其中血凝素、非毒素非血凝素和/或外源性白蛋白的量與常規市售可 得的肉毒桿菌毒素(例如B0T0X⑧或MYOBLOC⑧)相比選擇性地且獨立地 減少。這樣的肉毒桿菌毒素復合物下文稱作"減少的肉毒桿菌毒素復合物"。
因此，本發明的一個目的是提供一種組合物，其包含用具有與SEQ ID NO. 1或2相對應的序列的多肽穩定的肉毒桿菌毒素復合物(或減 少的肉毒桿菌毒素復合物)。所述組合物任選地可包含加入的外源性穩 定劑，例如白蛋白。
本文使用的術語"穩定"是指HIV-TAT片段(例如，SEQIDNO. 1) 或HIV-TAT片段衍生物(例如，SEQ ID NO. 2)防止肉毒桿菌毒素變性 和保持毒素活性的能力，這可以通過SMPtide測定或Digital Abduction Scoring (DAS)測定來測量。在優選的實施方案中，本發明 的肉毒桿菌毒素組合物被充分穩定，以在加工和患者給藥步驟中保留 基本上所有的生物學活性，所述步驟包括、但不限于，填充、凍干、 儲存和遞送重構。
本發明還涉及一種產生生物學效應的方法，其中將本發明的穩定 的肉毒桿菌復合物或穩定的減少的肉毒桿菌毒素復合物施用給患者。 在某些優選實施方案中，所述穩定的肉毒桿菌復合物或穩定的減少的 肉毒桿菌毒素復合物以有效量局部地施用于需要這種處理的受試者或 患者的(優選)皮膚。所述生物學效應可以包括，例如，肌肉麻痹、 減少分泌過多或出汗、治療神經性疼痛或偏頭痛、減少肌肉痙攣、預 防或減少痤瘡、減少或增加免疫應答、減少皺紋或預防或治療各種其 它病癥。在其它實施方案中，所述穩定的肉毒桿菌毒素復合物或穩定 的減少的肉毒桿菌毒素復合物通過腸胃外注射例如皮下注射來施用。
本發明還提供了試劑盒，其用于制備包含肉毒桿菌毒素復合物 (或減少的肉毒桿菌毒素復合物)和具有根據SEQ ID NO. 1或2的序列 的多肽的制劑，或可用于產生這種制劑的預混物。還提供了試劑盒， 其包含用于向受試者順次施用肉毒桿菌毒素復合物(或減少的肉毒桿 菌毒素復合物)和粘附分子的工具。
發明詳述
本發明涉及新的組合物，其包含肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒桿菌毒素復合物，如本文所述，它們通過添加多肽而被穩定，所述
多肽是HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物。在優選的實施方案中， 所述起穩定作用的多肽具有根據SEQ ID N0 1或2的序列，或可以通 過保守置換而與那些序列相關聯。在某些實施方案中，根據本發明的 穩定的肉毒桿菌毒素組合物能夠穿過皮膚上皮運輸或遞送肉毒桿菌毒 素(也稱作"透皮遞送，，)，且具有提高的穿透性、減少的抗原性和血 液穩定性。如本文所述，本發明的組合物可以用作向受試者提供肉毒 桿菌毒素的局部施用劑，用于各種治療、美容和/或化妝目的。本發 明的組合物還具有比肉毒桿菌毒素的其它組合物和遞送方法更高的安 全特征。
本文使用的術語"肉毒桿菌毒素"指任一種已知類型的肉毒桿菌 毒素(即，約150kD的肉毒桿菌毒素蛋白分子)，無論是由細菌生成的 還是通過重組技術生成的，和可能隨后發現的任何這樣的類型，包括 新發現的血清型和工程改造的變體或融合蛋白。如上所述，目前已經 表征了七種免疫上不同的肉毒桿菌神經毒素，即肉毒桿菌神經毒素血 清型A、 B、 C、 D、 E、 F和G,其各自以用特定類型的抗體中和為特征。 所述肉毒桿菌毒素血清型為市售可得的，例如，得自 Sigma-Aldrich(St. Louis, M0)和Metabiologics, Inc. (Madison, Wiscons in)和其它來源。不同血清型的肉毒桿菌毒素隨動物種類而不 同，影響它們引起的麻痹的嚴重性和持續時間。至少兩種肉毒桿菌毒 素，A型和B型，是以用于治療某些病癥的制劑市售可得的。例如，A 型包含在具有商標B0T0X⑧的Allergan制劑中和具有商標DYSPORT 的Ipsen制劑中，B型包含在具有商標MY0BL0C⑧的Elan制劑中。
在本發明的組合物中使用的術語"肉毒桿菌毒素"可以可選地指 肉毒桿菌毒素衍生物，即，具有肉毒桿菌毒素活性但相對于天然存在 的或重組的天然肉毒桿菌毒素在任何部分或任何鏈上包含有一個或多 個化學或功能改變的化合物。例如，所述肉毒桿菌毒素可以是修飾的 神經毒素，即與天然的相比具有至少一個氨基酸被刪除、修飾或替換
的神經毒素，或者所述修飾的神經毒素可以是重組生成的神經毒素或其衍生物或片段。在本發明的一個特別優選的實施方案中，肉毒桿菌
毒素衍生物是具有序列GDSCSVEAETAGK (SEQ ID NO. 3)的多肽。該序 列與A型肉毒桿菌毒素分子負責所述毒素在人體中的生物學活性的部
分相對應。肉毒桿菌毒素也可以是已經以一種方式修飾的毒素，所述 方式例如增加其性質或減少不想要的副作用，但仍然保持希望的肉毒 桿菌毒素活性。所述肉毒桿菌毒素可以來自由細菌生成的任一種肉毒 桿菌毒素復合物，如上所述。可選地，本發明所用的肉毒桿菌毒素可 以是使用重組或合成化學技術制備的毒素，例如重組肽、融合蛋白、 或雜種神經毒素，例如從不同肉毒桿菌毒素血清型的亞基或域制備 (例如，參見美國專利6, 444, 209)。所述肉毒桿菌毒素也可以是整個 分子的一部分，其已經顯示具有必需的肉毒桿菌毒素活性，并且在這 種情況下，可以單獨使用或作為組合或綴合分子例如融合蛋白的一部 分使用。或者，所述肉毒桿菌毒素可以是肉毒桿菌毒素前體的形式， 其本身可以是無毒的，例如無毒的鋅蛋白酶，在蛋白酶剪切后其變成
有毒的。
本文使用的術語"肉毒桿菌毒素復合物"或"毒素復合物"是指 肉毒桿菌毒素(例如，屬于肉毒桿菌毒素血清型A-G的任一種的約150 kD肉毒桿菌毒素蛋白分子或SEQ ID NO. 3的肉毒桿菌毒素片段)連同 結合的內源性非毒素蛋白(即，由肉毒桿菌細菌生成的血凝素蛋白和 非毒素非血凝素蛋白)一起。然而，應當注意，所述肉毒桿菌毒素復 合物不必作為一種單一毒素復合物來源于肉毒桿菌細菌。例如，可以 首先重組制備肉毒桿菌毒素或修飾的肉毒桿菌毒素，然后將其與非毒 素蛋白混合。重組的肉毒桿菌毒素還可以是購買的(例如，購自List Biological Laboratories, Campbell, CA)，然后將其與非毒素蛋白 混合。
本發明還涉及"減少的肉毒桿菌毒素復合物，，，其中所述肉毒桿 菌毒素復合物(包括含有肉毒桿菌毒素衍生物、例如SEQ ID NO. 3中 的多肽序列的那些)具有與在由肉毒桿菌細菌生成的肉毒桿菌毒素復 合物中天然發現的數量相比減少量的非毒素蛋白。在一個實施方案中，使用任何常規蛋白分離方法，從來源于肉毒桿菌細菌的肉毒桿菌 毒素復合物中提取一部分血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白，從而制 備減少的肉毒桿菌毒素復合物。例如，減少的肉毒桿菌毒素復合物可
以通過將其暴露在pH 7.3下的紅細胞以分離肉毒桿菌毒素復合物來 產生(例如參見EP 1514556 Al，其通過引用并入本文)。可以使用 HPLC、透析、柱、離心及其它方法來從蛋白中提取蛋白。或者，當通 過混合合成產生的肉毒桿菌毒素與非毒素蛋白來產生減少的肉毒桿菌 毒素復合物時，人們可僅僅向該混合物中加入比天然存在的肉毒桿菌 毒素復合物中所含的更少的血凝素或非毒素非血凝素蛋白。根據本發 明，可以獨立地以任何量減少在減少的肉毒桿菌毒素復合物中的任何 非毒素蛋白(例如血凝素蛋白或非毒素非血凝素蛋白或兩者)。在某些 示例性的實施方案中， 一種或多種非毒素蛋白相對于在肉毒桿菌毒素 復合物中通常發現的量減少了至少約0.5%、 1%、 3%、 5%、 10%、 20%、 30%、 40%、 50%、 60%、 70%、 80%或90%。 MY0BL0C含有5000 U 的B型肉毒桿菌毒素/ml和0. 05%的人血清白蛋白、0. 01 M 丁二酸鈉 和0. 1 M氯化鈉。DYSPORT含有500 U的A型肉毒桿菌毒素-血凝素復 合物與125 meg的白蛋白和2. 4 mg的乳糖。在一個特別感興趣的實施 方案中，從所述肉毒桿菌毒素復合物中除去了基本上所有通常在來源 于肉毒桿菌細菌的肉毒桿菌毒素復合物中發現的非毒素蛋白(例 如>95%的血凝素蛋白和非毒素非血凝素蛋白)。此外，盡管在某些情 況下可以以相同的數量減少內源性非毒素蛋白的量，本發明還涉及以 不同的量減少每種內源性非毒素蛋白，和減少至少 一種內源性非毒素 蛋白，但不減少其它的。
除了 (或代替)減少使肉毒桿菌毒素復合物不穩定的內源性非毒素 蛋白的量之外，本發明還涉及減少通常在制備期間加入的外源性穩定 劑的量。這種外源性穩定劑的一個實例是白蛋白，其在制備肉毒桿菌 毒素復合物期間通常加入的量等于在天然存在的肉毒桿菌毒素復合物 的內源性非毒素、非血凝素組分中發現的白蛋白量的1000倍。根據本 發明，加入的外源性白蛋白的量可以是少于常規千倍過量的外源性白
12蛋白的任何量。在本發明的某些示例性的實施方案中，加入僅僅約
500x、 400x、 300x、 200x、 100x、 50x、 10x、 5x、 lx、 0.5x、 0.lx或 0. Olx在天然存在的肉毒桿菌毒素復合物中的白蛋白的量。在一個實 施方案中，不向本發明的組合物加入作為穩定劑的外源性白蛋白。在 其它實施方案中，將除了 (或代替)白蛋白之外的外源性穩定劑加入本 發明的治療用局部組合物中。例如，本發明涉及的其它穩定劑包括乳 糖、明膠和多糖。
盡管所述穩定的肉毒桿菌毒素復合物或穩定的減少的肉毒桿菌毒 素復合物可以從任一種肉毒桿菌毒素血清型(即，類型A-G)得到或衍 生，但在本發明的優選實施方案中，它們從A型血清型肉毒桿菌毒素
得到或衍生。
在優選的實施方案中，本發明的肉毒桿菌毒素組合物通過添加非 天然多肽來穩定，所述非天然多肽是HIV-TAT片段(例如，SEQIDNO. l)或源自.HIV-TAT片段(例如，SEQ ID. NO 2,它是SEQ ID NO. l多 肽的反向序列)。HIV-TAT片段或其衍生物可以與肉毒桿菌毒素分子 共價地或非共價地結合，以穩定肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒桿 菌毒素復合物。在一個優選的實施方案中，HIV-TAT片段或其衍生物 與肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒桿菌復合物物理地結合，從而非 共價地使它們穩定。HIV-TAT片段或其衍生物的相對量取決于希望的 穩定程度。例如，當起穩定作用的HIV-TAT片段或其衍生物與SEQ ID NO. l或2的多肽相對應時，起穩定作用的肽的有用的濃度范圍是約 0. 1 ng-約1. 0 mg/單位的肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒桿菌毒素 復合物。更優選地，SEQ ID NO. 1或2的起穩定作用的肽的范圍可以 是約0. 1 mg - 0. 5 mg/單位的肉毒桿菌毒素。
可選地，使用本領域已知的連接化學，可以將起穩定作用的 HIV-TAT片段或其衍生物共價連接至肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉 毒桿菌毒素復合物中的肉毒桿菌毒素分子。作為實例，通過偶聯劑或 綴合劑，可以實現2個組分的偶聯。可以使用多種分子間交聯劑(參 見，例如，Means, G. E.和Feeney， R. E. ， Chemical Modificationof Proteins, Holden-Day， 1974， pp. 39-43)。這些試劑是，例如， J-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二疏)丙酸酯(SPDP)或N， N'-(l，3-亞苯 基)二馬來酰亞胺(二者都是對巰基高度特異性的，并形成不可逆連 接)；N， N'-亞乙基-二-(碘代乙酰胺)或具有6至11個碳亞甲基橋的 其它此類試劑(它們對巰基是相對特異性的)；和1,5-二氟-2，4-二硝 基苯(它與氨基和酪氨酸基團形成不可逆連接)。可用于該目的的其它 交聯劑包括p，p'二氟-m，m'-二硝基二苯基砜(它與氨基和和酚基形 成不可逆的交聯)；二亞胺代己二酸二曱酯(它是氨基特異性的)； 苯酚-1，4-二磺酰氯(它主要與氨基反應)；六亞曱基二異氰酸酯或 二異硫代氰酸酯，或偶氮苯-對二異氰酸酯(它主要與氨基反應)；戊 二醛(它與幾種不同的側鏈反應)和disdiazobenzidine (它主要與酪 氨酸和組氨酸反應)。
交聯劑可以是同雙功能的，即具有2個經歷相同反應的官能團。 優選的同雙功能交聯劑是雙馬來酰亞胺基己烷("BMH" )。 BMH含有 2個馬來酰亞胺官能團，它們在溫和條件(pH 6. 5-7. 7)下與含有巰基 的化合物特異性地反應，所述2個馬來酰亞胺基團由烴鏈連接。因 此，BMH可以用于不可逆地交聯含有半胱氨酸殘基的多肽。
交聯劑也可以是異雙功能的。異雙功能交聯劑具有2個不同的官 能團，例如胺反應性基團和巰基反應性基團，它們分別交聯具有游離 胺基和巰基的2種蛋白。異雙功能交聯劑的實例是琥珀酰亞胺基 4-(N-馬來酰亞胺基曱基)環己烷-l-羧酸酯("SMCC")，間馬來酰 亞胺基苯曱酰基-N-羥基琥珀酰亞胺酯("MBS")，和琥珀酰亞胺 4-(對馬來酰亞胺基苯基)丁酸酯("SMPB" )， MBS的延伸的鏈類似 物。這些交聯物的琥珀酰亞胺基與伯胺反應，巰基反應性馬來酰亞胺 與半胱氨酸殘基的巰基形成共價鍵。
交聯劑在水中的溶解度通常較低。可以將親水基團例如磺酸酯基 團添加到交聯劑上，以提高它的水溶解度。磺基-MBS和磺基-SMCC是 為水溶解度而改良的交聯劑的實例。
許多交聯劑產生在細胞條件下基本上不可切割的綴合物。但是，
14有些交聯劑含有在細胞條件下可切割的共價鍵，例如二疏化物，例
如，二硫雙(琥珀酰亞胺基丙酸酯)("DSP" )。 Traut氏試劑和N-琥珀酰亞胺基3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯("SPDP")是眾所周知的 可切割的交聯物。可切割的交聯劑的應用，允許在遞送進粑區域后將 起穩定作用的HIV-TAT片段或其衍生物與肉毒桿菌毒素分子分離。直 接的二硫鍵也可能是有用的。
有些新的交聯劑例如n-y-馬來酰亞胺基丁酰氧基-琥珀酰亞胺 酯("GMBS")和磺基-GMBS具有降低的免疫原性。在本發明的一些實 施方案中，這樣的降低的免疫原性可能是有利的。
許多交聯劑，包括上面討論的那些，可商業上得到。關于它們的 使用的詳細說明，可以容易地從商業供應商得到。關于蛋白交聯和綴 合物制備的一般參考文獻是S. S. Wong， Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, CRC Press (1991)。
化學交聯可以包括間隔臂的應用。間隔臂提供分子內柔性或調節 綴合的部分之間的分子內距離，從而可以輔助保持生物學活性。間隔 臂可以是包含間隔氨基酸的多肽部分形式，可選地，間隔臂可以是交 聯劑的一部分，例如在"長鏈SPDP" (Pierce Chem. Co. ， Rockford， Ill.， cat. No. 21651 H)中的間隔臂。
除了通過化學連接來生產穩定的肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉 毒桿菌毒素復合物以外，本發明也涉及使用基因融合技術來生產這些 穩定的毒素復合物。例如，使用眾所周知的基因工程技術，可以將編 碼融合的肉毒桿菌毒素/HIV-TAT片段或肉毒桿菌毒素/HIV-TAT片段 衍生物的核酸序列植入細胞，使細胞表達所述穩定的毒素復合物。
在本發明的特別優選的實施方案中，將HIV-TAT片段或HIV-TAT 片段衍生物共價連接到肉毒桿菌毒素分子或其衍生物的末端，形成線 性分子。在這樣的實施方案中，經常有利地在肉毒桿菌毒素(或其衍 生物)和HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物之間使用甘氨酸間隔物。 例如，當肉毒桿菌毒素衍生物是根據SEQ IDN0. 3的多肽時，所述穩 定的肉毒桿菌毒素可以具有形式RRRQRRKKR-GG-GDSCSVEAETAGK (SEQID NO. 4)。當希望向毒素分子添加超過一個的起穩定作用的多肽時， 所述穩定的肉毒桿菌毒素可以具有形式RRRQRRKKR-GG-毒素氨基酸 -GG-RRRQRRKKR。但是，應當注意到，本發明也涉及HIV-TAT片段或 其衍生物的重復單元(例如，RRRQRRKKR RRRQRRKKR)用于穩定的應 用，無論是通過共價還是非共價連接。
穩定肉毒桿菌毒素分子所需的起穩定作用的多肽鏈(無論它們是 HIV-TAT片段還是其衍生物)的數目取決于多種因素，例如具體的目 標血清型，和考慮的肉毒桿菌毒素或肉毒桿菌毒素片段或衍生物的大 小和化學組成。例如，當使用肉毒桿菌毒素衍生物且其是相對較小的
多肽(例如，根據SEQ ID NO. 3的多肽)時，需要共價連接更少的起穩 定作用的多肽鏈， 一個共價連接的起穩定作用的多肽鏈(例如，SEQ ID NO l或2的多肽，或其衍生物)可能足夠某些應用。
本發明的組合物優選地是用于需要特別治療的受試者或患者(即 人類或其它哺乳動物)的皮膚或上皮的產品形式。術語"需要"包括 藥物或健康相關的需要，例如治療涉及不希望的面部肌肉痙攣的病 癥，及化妝和主觀需要，例如，改變或改善面部組織的外觀。通常， 本發明的組合物可以通過本領域已知的任何方式來施用，其非限制性 實例包括腸胃外注射(例如，皮下注射)，局部施用于皮膚上，或通過 位于皮下或皮上的貼劑。
SEQ ID NO. 1的HIV-TAT片段以前被認為促進不同"貨物分子" 的細胞內遞送(參見，例如，美國專利No. 5, 804,604)。因而，當已 經用SEQ ID NO. 1的HIV-TAT片段穩定的肉毒桿菌毒素復合物或減少 的肉毒桿菌毒素復合物接觸患者組織時(例如，在局部給藥過程中)， 會發生肉毒桿菌毒素的增強的細胞穿透。另外，具有序列SEQ ID NO. 2的HIV-TAT衍生的多肽也促進細胞內穿透以及跨膜穿透。因此，當 已經用SEQ ID NO. 2的多肽穩定的肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒 桿菌毒素復合物接觸患者組織時，會發生肉毒桿菌毒素的增強的細胞 內和/或跨膜運輸。
通常，本發明的組合物通過混合所述穩定的肉毒桿菌毒素復合物或穩定的減少的肉毒桿菌毒素復合物與一種或多種附加的藥學可接受 的栽體或者賦形劑來制備。在它們的最簡單的形式中，它們可包含單 一的水性藥學可接受的載體或稀釋劑，例如緩沖鹽水。當要注射施用 本發明的組合物時，這樣的實施方案是特別優選的。然而，當要局部 施用本發明的組合物時，它們可包含在局部藥用或化妝用組合物中常 見的其它成分，即，皮膚用或藥學可接受的載體、媒介物或介質，即 與它們所要施用的組織相容的載體、媒介物或介質。本文使用的術語 "皮膚用或藥學可接受的"指如此描述的適于與這些組織接觸使用或 用于患者而沒有異常毒性、不相容性、不穩定性、變態反應等的組分 或成分。視情況而定，本發明的組合物可包括通常在本領域，特別是 在化妝和皮膚病學中考慮使用的任何成分。
關于它們的形式，本發明的組合物可包括溶液劑、乳劑(包括微乳 劑)、混懸液、乳膏劑、洗劑、凝膠劑、散劑或其它用于施用到皮膚及
的組合物除了包含肉毒桿菌毒素和HIV-TAT片段或其衍生物之外，可 包含通常在這樣的產品中使用的其它成分，例如抗微生物劑、增濕劑 和水化劑、滲透劑、防腐劑、乳化劑、天然油或合成油、溶劑、表面 活性劑、清潔劑、膠凝劑、潤膚劑、抗氧化劑、芳香劑、填充劑、增 稠劑、蠟、去味劑、染料、著色劑、散劑、粘度調節劑和水，且任選 地包括麻醉藥、抗癢活性劑、植物提取物、調節劑、染黑或光亮劑、 閃光劑(glitter)、濕潤劑、云母、礦物質、多酚、硅酮或其衍生物、 防曬劑(sunblocks)、維生素和phytoraedicinals。
根據本發明的組合物可以是控釋或緩釋組合物的形式，其中所述 穩定的肉毒桿菌毒素復合物或穩定的減少的肉毒桿菌毒素復合物被封 裝或者另外包含在物質內，使得它們以受控的方式隨著時間推移釋放 在皮膚上。可以將所述包含肉毒桿菌毒素和HIV-TAT片段或其衍生物 的組合物包含在基質、脂質體、嚢泡、微膠嚢、微球等之內，或者包 含在固體顆粒物質之內，所有這些選擇和/或構建的物質能釋放所述穩 定的肉毒桿菌毒素一段時間。可以以產生麻痹、產生松弛、緩解收縮、預防或緩解痙攣、減少 腺排出或其它預期效果的有效量，將肉毒桿菌毒素遞送至皮膚下的肌 肉或皮膚內的腺結構。相對于可注射的或可植入的物質，用這種方式 局部遞送肉毒桿菌毒素可以提供減少的劑量、降低的毒性和得到用于 預期效果的更精確的劑量最佳化。
施用本發明的組合物以便施用有效量的肉毒桿菌毒素。本文使用 的術語"有效量"指如上定義的肉毒桿菌毒素的量，其足夠產生希望 的肌肉麻痹或其它生物學或美容效應，但無疑是安全量，即，能避免 嚴重副作用的足夠低的量。預期效果包括松弛某些肌肉，其目的是例 如減少細紋線和/或皺紋的出現，特別是在臉上，或者以其它方式調 整面部外觀例如增寬眼睛、提升嘴角或使從上唇散開的紋線平滑或一 般性緩解肌緊張。最后提及的功效， 一般性緩解肌緊張可以在面部或 其它地方實現。本發明的組合物可包含用作單劑量治療的適當有效量 的肉毒桿菌毒素，或者可以是更濃縮的，用于在給藥部位稀釋或者用 于多種應用。所述穩定的肉毒桿菌毒素復合物或穩定的減少的肉毒桿 菌毒素復合物可以透皮施用給受試者，以治療病癥例如不想要的面部 肌肉或其它肌痙攣、多汗、痤瘡或其中想要緩解肌肉疼痛或痙攣的體 內其它地方的病癥。局部施用肉毒桿菌毒素，用于透皮遞送至肌肉或 其它皮膚相關結構。可以施用至例如腿、肩部、背部(包括腰部)、腋 下、掌心、足部、頸、腹股溝、手背或足背、肘、上肢、膝、大腿、 臀、軀干、骨盆或其中希望施用肉毒桿菌毒素的身體的任何其它部 分。
也可以施用肉毒桿菌毒素以治療其它的病癥，包括但不限于治療 神經性疼痛、預防或減輕偏頭痛或其它的頭痛、預防或減輕痤瘡、預 防或減輕張力障礙或張力障礙收縮(無論是主觀的或臨床的)、預防或 減輕與主觀或臨床上的多汗相關的癥狀、減少分泌過多或出汗、減少 或增加免疫應答、或治療已經建議或執行通過注射施用肉毒桿菌毒素 的其它病癥。
最優選地，由醫師或其它衛生保健專業人員或在其指導下施用所述組合物。它們可以按單一的治療或在隨時間的 一 系列周期性治療中 施用。為了透皮遞送肉毒桿菌毒素用于上述的目的，局部施用如上所 述的組合物至其中希望該作用的部位的皮膚。因為其性質，最優選應 當以一定的施用速率和施用頻率慎重地施用 一定量的所施用的肉毒桿 菌毒素，所述速率和頻率將產生希望的結果而不會引起任何不良的或 不希望的結果。因此，例如，本發明的局部組合物應當以如下速率施
用從約1 U至約20， 000 U，優選從約1 U至約2, 000 U的肉毒桿菌 毒素/ci^的皮膚表面。例如，在這些范圍內的較高劑量可以優選地與 控釋物質組合，或在除去之前在皮膚上停留較短的時間。
本發明還包括用于遞送如上所述的包含肉毒桿菌毒素的組合物透 過皮膚的透皮遞送裝置。這樣的裝置可以象皮膚貼劑一樣結構簡單， 或者可以是更復雜的裝置，其包括用于施用和監測組合物施用的工 具，和任選的用于從一個或多個方面監測受試者病癥包括監測受試者 對正在施用的物質的反應的工具。
本發明的組合物適用于pH為約4. 5至約6. 3的生理環境，因此， 其可具有這樣的pH。根據本發明的組合物可以貯藏在室溫下或者冷凍 條件下。
應當理解，本文描述的實施例和實施方案僅僅是用于闡述的目的， 根據它們的各種改良和變化將容易地由本領域技術人員提出，并且這 些改良和變化包括在本申請的精神和范圍及附加的權利要求的范圍 內。將所有本文引用的出版物、專利和專利申請以其全文通過引用并
入本文用于所有的目的。
權利要求
1.一種穩定肉毒桿菌毒素的方法，所述方法包括，提供肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒桿菌毒素復合物；提供一種多肽，其為HIV-TAT片段或HIV-TAT片段衍生物，和將所述肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒桿菌毒素復合物與所述多肽組合。
2. 根據權利要求1的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復合物或減 少的肉毒桿菌毒素復合物共價連接至所述多肽。
3. 權利要求1的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復合物或減少的 肉毒桿菌毒素復合物被所述多肽非共價地穩定。
4. 權利要求l的方法，其中所述HIV-TAT片段具有根據SEQ IDNO. 1的序列。
5. 權利要求l的方法，其中所述HIV-TAT片段具有根據SEQ ID NO. 2的序列。
6. 權利要求1的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復合物或減少的 肉毒桿菌毒素復合物包含具有根據SEQ ID NO. 3的序列的多肽。
7. 權利要求1的方法，其中所述減少的肉毒桿菌毒素復合物包 含與直接從肉毒桿菌中提取的肉毒桿菌毒素復合物中天然存在的量相 比減少量的血凝素蛋白或非毒素、非血凝素蛋白或兩者。
8. 根據權利要求1的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復合物或減 少的肉毒桿菌毒素復合物含有白蛋白作為外源性穩定劑。
9. 權利要求6的方法，其中所述白蛋白的存在量等于在天然存 在的肉毒桿菌毒素復合物中的白蛋白的量的約500、 400、 300、 200、 100、 50、 10、 5、 1、 0.5、 0. l或O. Ol倍。
10. 權利要求l的方法，其中所述肉毒桿菌毒素復合物或減少的 肉毒桿菌毒素復合物包含選自下述的肉毒桿菌毒素肉毒桿菌毒素衍 生物、重組的肉毒桿菌毒素、修飾的肉毒桿菌毒素、A型肉毒桿菌毒 素、B型肉毒桿菌毒素、C型肉毒桿菌毒素、D型肉毒桿菌毒素、E型肉毒桿菌毒素、F型肉毒桿菌毒素和G型肉毒桿菌毒素。
11. 一種穩定的肉毒桿菌毒素組合物，其中所述穩定的肉毒桿菌 毒素包含肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒桿菌毒素復合物；和 具有根據SEQIDNO. 2的序列的多肽。
12. 根據權利要求8的穩定的肉毒桿菌毒素組合物，其中所述多 肽非共價地結合所述肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒桿菌毒素復合 物。
13. 根據權利要求8的穩定的肉毒桿菌毒素組合物，其中所述多 肽共價地連接所述肉毒桿菌毒素復合物或減少的肉毒桿菌毒素復合 物。
全文摘要
本發明涉及使用HIV-TAT片段或HIV-TAT片段的衍生物穩定的新的肉毒桿菌毒素組合物。該組合物可以用于多種治療、美容和/或化妝目的。本發明還提供了使用HIV-TAT片段或HIV-TAT片段的衍生物穩定肉毒桿菌毒素的方法。
文檔編號A61K38/00GK101616682SQ200780048690
公開日2009年12月30日 申請日期2007年12月12日 優先權日2006年12月29日
發明者J·H·李, J·M·瓦烏戈 申請人:雷文斯治療公司