載脂蛋白A-I在制備抑制G⁺菌感染誘導膿毒血癥和組織炎癥損傷藥物中的用途的制作方法

專利名稱：：載脂蛋白A-I在制備抑制G⁺菌感染誘導膿毒血癥和組織炎癥損傷藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發明屬制藥領域，涉及載脂蛋白A-I(ApoA-I)在制藥中的新用途，具體涉及載脂蛋白A-I在制備抑制G+菌感染誘導膿毒血癥和系統性炎癥反應中的用途。技術背景研究報道，LTA是G+菌細胞壁一種毒性成分，在感染膿毒血癥中作為免疫刺激劑引發系統性炎癥反應綜合癥[J.H.M.Levels,P.R.Abraham,E.P.vanBarreveld,J.C.M.Meijers,S丄H.vanDeventer,Distributionandkineticsoflipoprotein-boundlipoteichoicacid.Infect.Immun.71(2003)3280-3284.]，激活巨噬細胞、中性粒細胞，釋放炎癥細胞因子(TNF-a，IL等)，導致組織炎癥損傷、膿毒性休克、多器官功能紊亂和衰竭(MODS,MOF)[S.Bhakdi，T.Klonisch,P.Nuber，W.Fischer,Stimulationofmonokineproductionbylipoteichoicacids,Infect.Immun.59(1991)4614~4620;S.J.DeKimpe,M.Kengatharan，C.Thiemermann,andJ.R.Vane,ThecellwallcomponentspeptidoglycanandlipoteichoicacidfromStaphylococcusaureusactinsynergytocauseshockandmultipleorganfailure,Proc.NatlAcadSciUSA.92(1995)10359-10363.]，是G+菌膿毒血癥死亡的主要原因[A.L.Beal,F.B.Cerra，Multipleorganfailuresyndromeinthe1990's,J.Am.Med.Assoc.271(3)(1994)226~233.]。炎癥性急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫癥(ARDS)是膿毒血癥最常見并發癥，約占總數的25-40%，其死亡率高達40。/。t.B.Ware,M.A.Matthay,Theacuterespiratorydistresssyndrome,N.Engl.J.Med.342(18)(2000)1334~1349.]。G+菌感染誘導膿毒血癥是臨床常見膿毒血癥，約占全部膿毒血癥病例的1/3-1/2[R.C.Bone,Gram-positiveorganismsandsepsis,Arch.Intern.Med.154(1994)26-34;R.F.Kornelisse,R.deGroot,H.J.Neijens,Bacterialmeningitis:mechanismsofdiseaseandtherapy,Eur.J.Pediatr.154(1995)85-96.]。研究證實，雖然抗菌素治療能殺死G+菌，但不能去除LTA毒性。目前臨床上尚未有能直接對抗LTA毒性，抑制膿毒血癥引起系統性炎癥反應及組織炎癥損傷的藥物。
發明內容本發明的目的是提供載脂蛋白A-I(ApoA-I)新的藥用用途，具體涉及載脂蛋白A-I在制備抑制G+菌感染誘導膿毒血癥和組織炎癥損傷藥物中的用途。本發明采用載脂蛋白A-I(ApoA-I)進行了動物實驗和體外細胞實驗，結果證實，ApoA-I具有直接結合和消除脂壁酸(LTA)(G+菌細胞壁中的毒性成分，G+菌感染膿毒血癥的致病因子)毒性作用，能顯著抑制LTA誘導激活巨噬細胞釋放炎癥因子，系統性炎癥反應及器官組織(肺)損傷。本發明實驗證實ApoA-I具有結合、中和LTA毒性的特殊功能，能抑制0+菌感染膿毒血癥誘發系統性炎癥反應及組織炎癥損傷，為G+菌感染誘導膿毒血癥和組織炎癥損傷提供了新的治療途徑。具有潛在臨床應用價值。圖l是小鼠肺HE染色組織顯微圖。A:LTA誘導急性肺損傷；B:ApoA-I治療；C:正常對照。圖2ApoA-I、LTA和ApoA-I與LTA共培養混合物的瓊脂糖電泳圖，其中，Lanel:ApoA-I考馬斯亮蘭染色；Lane2:LTA蘇丹黑染色；Lane3:ApoA-I+LTA考馬斯亮蘭染色；Lane4:ApoA-I+LTA蘇丹黑染色。具體實施例方式實施例l制備ApoA-I從人血漿沉淀IV(血制品企業提取血制品后的廢棄物)分離純化人血漿ApoA-I，純度達98%(專利申請號200610029114.4)。血漿沉淀IV通過以下步驟提取純化ApoA-I:①pH7.365。/o乙醇-10mMNaHCO3液抽提；②pH5.5等電點沉淀，并溶解于pH8.6Tri-HCl-Urea溶液；③氯仿乙醇(1:1)脫脂；等體積乙醇沉淀，取上清液；⑤濃縮、透析后巴氏滅菌，除菌過濾；◎冰凍干燥。實施例2ApoA-I抑制LTA誘導急性肺損傷(ALI)、膿毒血癥和系統性炎癥反應實驗選取18只BALB/C雄性小鼠隨機分成三組(1)LTA組小鼠靜脈注射LTA(20mg/kg)誘發膿毒血癥；(2)ApoA-I治療組LTA給藥后靜注ApoA-I(50mg/kg);(3)對照組小鼠給予生理鹽水注射。給藥ApoA-I24h后取血樣測定血漿IL-l卩，TNF-a濃度。摘除右肺，HE染色后進行組織顯微檢査；摘除左肺，測定肺泡支氣管灌洗液中IL-1P，TNF-a濃度。結果顯示與正常對照組肺組織形態圖(圖1C)相比，LTA組肺組織呈現急性肺損傷，顯示廣泛充血、中性粒細胞積蓄、肺泡壁增厚(圖1A);ApoA-I治療組肺損傷減輕，部分組織恢復正常組織學形態(圖1B);與正常對照組相比，LTA組血清和肺泡支氣管灌洗液中IL-1(3，TNF-a顯著升高，表明LTA誘導系統性炎癥反應。ApoA-I治療后兩者都顯著降低(表l，2)，顯示ApoA-I抑制LTA誘導系統性炎癥反應。表l是血清TNF-a，IL-lp濃度。表2是肺泡支氣管灌洗液TNF-a，IL-1卩濃度。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>^PO.01，與空白對照組比較；AP<0.05，與ApoA-I治療組比較。實施例3ApoA-I抑制LTA激活巨噬細胞釋放炎癥因子對L-929細胞的殺傷作用實驗按常規方法分離小鼠腹腔巨噬細胞。分成四組(l)LTA處理組；(2)LTA+0.25嗎ApoA-I組；(3)LTA+12.5嗎ApoA-I組；(4)LTA+25嗎ApoA-I組。各組共培育后，分離巨噬細胞，然后加入L-929細胞，共培育后，用MTT法測定各組L-929細胞死亡率。結果顯示，ApoA-I抑制LTA激活巨噬細胞釋放炎癥因子，并呈現劑量-效應曲線。表3是ApoA-I抑制LTA激活巨噬細胞釋放炎癥因子對L-929細胞的殺傷作用。表3組別(n-4)L-929細胞死亡率(％)(1)LTA51.32±5.06(2)LTA+0.25嗎ApoA-I46.33±1.95(3)LTA+12.5嗎ApoA-I33.10±2.71**(4)LTA+25嗎ApoA-I29.62±1.36**"PO.01，與(1)組比較。實施例4ApoA-I與LTA體外結合試驗ApoA-I與LTA共培養混合物分別用考馬斯亮蘭和蘇丹黑染色，然后進行瓊脂糖凝膠電泳觀察其遷移率。對照組ApoA-I用考馬斯亮蘭染色，LTA用蘇丹黑染色。電泳結果顯示ApoA-I與LTA共培養混合物，無論用考馬斯亮蘭染色還是蘇丹黑染色都只呈現一條帶，遷移位置與對照ApoA-I相當，未見顯示與對照LTA相當的遷移帶(圖2)。表明ApoA-I與LTA結合。權利要求1、載脂蛋白A-I在制備抑制G+菌感染誘導膿毒血癥誘導和系統性炎癥反應藥物中的應用。2、載脂蛋白A-I在制備抑制G+菌感染誘導組織炎癥損傷藥物中應用。全文摘要本發明屬于制藥領域，涉及載脂蛋白A-I(ApoA-I)在制藥中的新用途。本發明采用載脂蛋白A-I(ApoA-I)進行了動物實驗和體外細胞實驗，結果證實，ApoA-I具有直接結合和消除脂壁酸(LTA)毒性作用，能顯著抑制LTA誘導激活巨噬細胞釋放炎癥因子，系統性炎癥反應及器官組織(肺)損傷。本發明實驗證實ApoA-I具有結合、中和LTA毒性的特殊功能，能抑制G⁺菌感染膿毒血癥誘發系統性炎癥反應及組織炎癥損傷，為G⁺菌感染誘導膿毒血癥和組織炎癥損傷提供了新的治療途徑。具有潛在臨床應用價值。文檔編號A61K38/17GK101234190SQ20081003415公開日2008年8月6日申請日期2008年2月29日優先權日2008年2月29日發明者吳滿平,焦艷玲申請人:復旦大學