專利名稱：包含人載脂蛋白(a)三環lk68或lk8基因作為有效成分用于治療癌癥的治療劑,以及使用 ...的制作方法
技術領域：
本發明涉及用于基因治療的抗癌劑，更準確地，涉及用于基因治療的包括基因載體或細胞的抗癌劑或抗轉移藥劑，以及通過使用其治療癌癥的方法，所述基因載體或細胞包含人載脂蛋白三環(kringle)基因。
背景技術：
腫瘤由失控的紊亂異常的細胞增殖發展而成。如果該腫瘤顯示出破壞性的生長、入侵和轉移，則其被認為是惡性腫瘤。入侵性是一種浸潤或破壞周圍組織的特性，并且特別地，形成組織邊界的基底層被這種特性破壞，導致局部擴散及有時腫瘤通過循環系統流入。轉移指腫瘤細胞從原發病灶通過淋巴管或血管向其它區域的擴散。廣義上講，轉移性也指腫瘤細胞通過漿液體腔或其它空間直接擴散。
外科手術、放射性治療和化學治療單獨或聯合地廣泛用于癌癥的治療。外科手術是除去患病組織的一種方法。這樣，特定區域內的腫瘤，如乳房、結腸和皮膚，可由外科手術有效去除。然而，脊椎內的腫瘤或分散性腫瘤如白血病則不能通過外科手術進行適當的治療。
化學治療阻斷了細胞復制或代謝，并已被應用于乳腺癌、肺癌和睪丸癌的治療。然而，接受化學治療的癌癥患者嚴重遭受了全身化療的副作用的痛苦。其中普遍但嚴重的例子是暈動病和嘔吐。化學治療的副作用甚至會影響患者的生活，因為這些副作用可能使患者的適應性迅速降低。另外，劑量限制毒性(DLT)也是化學治療的一個主要副作用，它引起了對藥品服用的仔細的關注。粘膜炎就是針對抗癌劑的DLT的一個例子，所述抗癌劑諸如作為抗代謝細胞毒劑的5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤、以及抗癌抗生素如多柔比星。如果患者受化療副作用影響嚴重，他或她應該住院并被施以止痛藥以減輕痛苦。所以，化學治療和放射性治療的副作用是癌癥患者治療中最大的問題。
基因治療是通過利用DNA重組技術治療或預防由人細胞中的遺傳性變異所導致的疾病，例如各種遺傳疾病、癌癥、心血管疾病、感染性疾病和自體免疫性疾病的方法，即，將治療基因插入患者中以糾正遺傳缺陷或促進或增加細胞的功能。更準確地，基因治療是通過將治療基因傳遞到靶器官從而誘導受損細胞中治療性或正常蛋白質的表達來治療疾病。基因治療具有多種優勢諸如優良的特異性和提高的恢復率和速度，而這些是難以受其他藥物的調節的，基因治療可以進行長期施用。基因治療不是用于治療疾病的癥狀而是用于治愈或消除疾病的起因。對于成功的治療，重要的是將治療基因遞送到靶細胞從而提高其表達率，這是基因治療中關鍵的技術。
基因載體是用于將治療基因插入靶細胞的必需介體。理想的基因載體必須是對人無害的，大量生產的，必須將基因有效攜帶到靶細胞中，并且必須持續地表達基因。基因載體的制備是基因治療的核心技術。當前，廣泛用于基因治療中的最有代表性的基因載體是病毒載體諸如腺病毒，腺病毒相關病毒，反轉錄病毒和非病毒性載體諸如脂質體，聚乙胺(polyethyleneamine)等。
存在許多遞送基因的方式，例如使用脂質體綴合，使用受體或病毒的方法以及化學或物理方法。每種方法都具有優點和缺點。在考慮遞送功效和表達效率的情況下，本發明人選擇使用病毒載體的方法。在許多病毒載體中，腺病毒、腺病毒相關病毒和逆轉錄病毒是最廣泛應用的。
將腺病毒用于其中E1基因缺陷的重組病毒系統并將治療基因插入該位置。通過該系統已經嘗試了約20％的用于基因治療的載體(Journal of Gene Medicine網址，www.wiley.co.uk/genemd/clinical/)。腺病毒載體隨意感染各種細胞，但是不入侵宿主細胞的染色體，因此，不能預期持續的表達，但是短期內的高表達是可能的。
腺病毒相關病毒包含由ITR，rep，cap和ITR順序組成的基因組。為了使腺病毒相關病毒生長，需要輔助病毒諸如腺病毒和皰疹病毒的協助。當將腺病毒用作輔助病毒時，腺病毒的E1，E2a，E4和VA基因是必需的，從而制備重組腺病毒相關病毒，其中將治療基因插入rep和cap基因缺陷的地方(Samulski，R.J.等，J.Virol.，633822-3828，1989)。腺病毒相關病毒顯示持續的高表達，因為其使靶基因能夠插入宿主細胞的染色體19的腺病毒S1的特定區域。而且，病毒本身不能生長，因此，沒有關于使用該病毒所伴隨的副作用的報道并且沒有懷疑因為野生型病毒污染而影響穩定性的報道，意味著其比其它系統更安全。
作為最常用的載體系統，逆轉錄病毒在用于基因治療的臨床測試中的全部載體中占約40％(Journal of Gene Medicine網址，www.wiley.co.uk/genmed/clinical)。重組逆轉錄病毒通過將治療基因和抗生素抗性基因如新霉素，潮霉素或furomycin插入兩端的LTR(長末端重復序列)之間進行制備，所述LTR類似于腺病毒相關病毒的ITR(末端反向重復序列)(Miller，A.D.等，Biotechniques，7980-990，1989)。至于逆轉錄病毒系統，可以將靶基因非特異性地插入宿主細胞的染色體中并且高水平地持續表達。然而，并不預期該病毒的大量生產，并且其對非增殖(non-proliferateve)性細胞的感染率非常低。與直接將基因插入活體內相比，在該系統中更優選間接基因遞送。即，重組病毒不直接插入活體內，相反，體外培養的細胞首先被包含靶基因的重組病毒所感染，并且接著選擇用靶基因轉導的細胞施用于活體內。然而，前述系統仍舊具有很多問題諸如由RCR(具有復制能力的逆轉錄病毒)所帶來的副作用，不充足的病毒生產的產量或不令人滿意的感染效率，所述RCR所帶來的副作用由宿主細胞中類似堿基序列的同源重組所發展。
作為控制腫瘤細胞的基因治療策略，已經使用了使用腫瘤抑制基因的方法，使用具有復制能力的溶瘤病毒的方法，使用自殺基因的方法和使用免疫調節基因的方法等。使用腫瘤抑制基因的方法是通過將腫瘤抑制基因諸如p53特異性地遞送到患者中來治療癌癥，其中所述基因是缺陷的或變形的。此外，使用具有復制能力的溶瘤病毒的方法是通過將能夠在腫瘤細胞中特異性生長的病毒基因載體轉移到人體中，通過將腫瘤抑制基因的受損活性應用到腫瘤組織中來治療癌癥。這兩種方法是直接殺傷腫瘤細胞的策略。備選地，將使用自殺基因的方法包括在該類別中。自殺基因治療的代表性實例是通過遞送可以誘導腫瘤細胞死亡的HSV-tk基因和化學抗癌劑，諸如9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤來治療疾病。與此相反，引入免疫調節基因的方法是一種間接治療策略，其將一個或多個基因諸如白細胞介素12，白細胞介素4，白細胞介素7，γ干擾素和腫瘤壞死因子等攜帶到活體內從而激發T細胞來識別腫瘤細胞或通過阻斷腫瘤發育蛋白質來誘導程序性細胞死亡。在另一個方面，將通過表達血管發生抑制因子諸如血管生長抑素或內皮生長抑素等來阻斷營養供應從而殺傷腫瘤細胞的方法也包括在間接治療策略的類別中。
三環(kringle)是一種由80個氨基酸和三個分子內二硫鍵組成的蛋白質結構域。三環結構在許多蛋白，諸如制管張素(O’Reilly，M.S等，Cell，79315-328，1994)，凝血酶原(Walz，D.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.，741069-1073，1977)、尿激酶(Pennica，D.等，Nature，301579-582，1983)、間質細胞生長因子(Lukker，N.A.等，Protein Eng.，7895-903，1994)和載脂蛋白(a)(McLean，J.W.等，Nature，330132-137，1987)中都有發現。三環由個體折疊單位組成。三環的功能尚未充分闡明，但是考慮到具有三環結構的蛋白質的各種功能，據信所述多種三環不具有相同的功能。
載脂蛋白(a)，一種僅由肝產生的糖蛋白，具有三環結構。載脂蛋白(a)通過共價結合于apo B-100，一種低密度脂蛋白(LDL)的主要蛋白質成分來形成脂蛋白(a)(Fless，G.M.，J.Biol.Chem.，2618712-8717，1986)。載脂蛋白(a)負責體內遞送膽甾醇。血清本身中的脂蛋白(a)水平的增加是動脈粥樣硬化(artherosclerosis)和心臟病的主要原因(Armstrong，V.W.等，Artherosclerosis，62249-257，1986；Assmann，G.，Am.J.Cardiol.，771179-1184，1996)。載脂蛋白(a)是脂蛋白作用的介體。載脂蛋白(a)包括兩種類型的三環區域，其非常類似于纖維蛋白溶酶原的三環IV和V，和失活的蛋白酶樣區域。按照氨基酸序列的同源性，載脂蛋白(a)三環IV-樣區域被分成10個亞型(亞型；IV1-IV10)，并且它們中的每個僅有一個拷貝，除了IV2三環，其在載脂蛋白(a)基因的各種人等位基因中具有3-42的拷貝數。最后的三環V與纖維蛋白溶酶原三環-5具有83.5％的氨基酸序列同源性。
本發明人已經在2003年申請了關于包含LK8蛋白質作為有效成分的抗癌劑的專利(韓國專利申請號.2003-10797)。實體腫瘤或轉移性腫瘤具有長期的靜止階段，意味著其可以在治療后的長時間后再次發展。然而，包含蛋白質作為有效成分的抗癌劑在體內具有相當短的半衰期。因此，為了保持抗癌效果，所需量的蛋白質必須持續進行施用從而在腫瘤細胞中維持抗癌蛋白質的水平。
上述方法具有許多問題。首先，其需要大量蛋白質，對于此不得不配備設備和技術。第二，盡管大量生產是可能的，其使患者和生產者都花費很多。第三，長期施用藥物對于患者是根本不容易實現的。因此，這些問題在開發包含抗癌蛋白質作為有效成分的抗癌劑前是必須要克服的。
因此，本發明人判斷使用編碼蛋白質的基因的基因治療是一種克服使用蛋白質作為抗癌劑所帶來的問題的有效備選，因為其能夠在全身或局部腫瘤中保持有效抗癌蛋白的含量。并且，本發明人公開了通過使用人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)和KV(LK8)基因的動物測試可以有效抑制腫瘤和轉移瘤的生長。最后，本發明人通過證實LK68和LK8基因能夠被用作抗癌劑來完成本發明。
公開內容技術問題本發明的一個目標是提供抗癌劑或抗轉移藥劑用于基因治療，所述抗癌劑或抗轉移藥劑包含基因載體或細胞作為有效成分，所述基因載體或細胞包含人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因。
本發明的另一個目標是提供用于預防或治療實體腫瘤的方法，其包括向個體腸胃外施用包含LK68或LK8基因的基因載體或細胞的步驟。
技術路線為了實現上述目標，本發明提供抗癌劑或抗轉移藥劑用于基因治療，所述抗癌劑或抗轉移藥劑包含基因載體或細胞作為有效成分，所述基因載體或細胞具有人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因。
本發明還提供用于預防或治療實體腫瘤的方法，其包括向個體腸胃外施用包含LK68或LK8基因的基因載體或細胞的步驟。
附圖描述
圖1是顯示結腸癌細胞系的制備方法的示意圖和一組照片，在所述細胞系中，通過使用重組病毒引入LK68或LK8基因。(a)用于克隆編碼LK68和LK8蛋白質的基因的載體’pLXSN-LK68’和’pLXSN-LK8’的示意圖，(b)蛋白質印跡分析的照片，其顯示LK68和LK8蛋白質在用重組病毒轉染的結腸癌細胞系中的表達，(c)RT-PCR的照片，其顯示LK68和LK8蛋白質在用重組病毒轉染的結腸癌細胞系中的表達。
圖2是一組曲線圖，其顯示通過錐蟲藍染色進行測量的重組結腸癌細胞系的體外生長(a)(在該圖中，Y軸表示細胞數量，而X軸表示觀察時間)，和使用膜聯蛋白-V和PI(碘化丙錠，Clontech)染色(處理10μg/ml的紫杉醇用于陽性對照)通過FACS(熒光激活細胞分選儀；BectonDickinson，San Jose，CA，USA)來觀察重組結腸癌細胞系的程序性細胞死亡(b)。進行測量和觀察來研究LK68或LK8基因的引入對靶細胞的程序性細胞死亡和生長的影響。
CT-模擬品未被病毒感染的結腸癌細胞系，CT-載體被不攜帶LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系，CT-LK68被包含LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系，10μg/ml紫杉醇用紫杉醇處理的CT-模擬品(陽性對照)圖3是一組照片和曲線圖，其顯示在將每個結腸癌細胞系皮下注射到Balb/c裸鼠(Charles River，Wilmington，MA，USA)中后測量的實體腫瘤的生長(a)(統計學顯著性通過斯氏t檢驗來檢查(*p＜0.0005)，Y軸表示通過式[長度×(寬度)2×0.52]計算的腫瘤的體積，X軸表示在腫瘤移植后的天數)，在結腸癌細胞系培養的最后一天從小鼠中分離的實體腫瘤(b)，和實體腫瘤的重量(c)。
CT-模擬品未被病毒感染的結腸癌細胞系，CT-載體被不攜帶LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系，CT-LK68被包含LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系，圖4是一組照片和曲線圖，其顯示對結腸癌細胞向肝的轉移的比較(a)和在肝表面上形成的轉移瘤結節的數量的比較(b)。將結腸癌細胞移植到脾中并誘導向肝中的轉移。在實驗組和對照組之間比較從脾向肝的轉移，從而研究是否LK68或LK8基因在被引入結腸癌細胞中后能夠抑制轉移。并且，通過計算在肝的表面上形成的癌細胞的數量來研究對向肝中的轉移的抑制。
CT-載體被不攜帶LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系，CT-LK68被包含LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系，CT-LK8被包含LK8基因的質粒感染的結腸癌細胞系圖5是一組照片和曲線圖，其顯示其中被轉移了結腸癌細胞的肝的組織化學形態(a)，顯示為百分比的被證實針對PCNA染色為陽性的細胞的數量(b)，和顯示為百分比的被證實針對TUNEL為陽性的細胞的數量(c)。為了鑒定是否腫瘤結節的數量和大小被明顯減少，以及是否是程序性細胞死亡，而不是細胞增殖在被轉移了LK68-轉化結腸癌細胞的肝的區域中大大增加，以組織學或免疫組化染色(這次，進行了H&E(蘇木精-曙紅)染色觀察一般轉移，進行PCNA(增殖細胞核抗原)染色和TUNEL(末端脫氧核苷酸轉移酶生物素-dUTP切口末端標記)觀察了癌細胞的增殖和程序性細胞死亡)檢查了肝中癌癥發展區域的主要部分。從總細胞數量，對那些被證實針對PCNA染色和TUNEL都是陽性的細胞進行計數，并將相對比例在曲線圖中表示為％(通過斯氏t檢驗來檢查統計學顯著性)。
CT-載體被不攜帶LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系，CT-LK68被包含LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系圖6是顯示在肝播散模型中，攜帶肝轉移瘤的小鼠的存活率的曲線圖。比較了對照(CT-載體)和攜帶LK68基因的結腸癌細胞系(CT-LK68)兩者的存活率(通過Kaplan-Meier存活曲線的對數等級檢驗來檢查統計學顯著性)。
CT-載體被不攜帶LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系，CT-LK68被包含LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系圖7是顯示在腹膜播散模型中，攜帶肝轉移瘤的小鼠的存活率的曲線圖。比較了對照(CT-載體)和攜帶LK68基因的結腸癌細胞系(CT-LK68)兩者的存活率(通過Kaplan-Meier存活曲線的對數等級檢驗來檢查統計學顯著性)。
CT-載體被不攜帶LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系，CT-LK68被包含LK68基因的質粒感染的結腸癌細胞系圖8是一組示意圖和照片，其顯示包含LK68或LK8的載體的質粒圖譜，瓊脂糖凝膠電泳的結果，和編碼FLAG的核苷酸序列。以包括編碼FLAG的核苷酸序列的引物組來進行PCR，從而將FLAG的結合位點引入LK68或LK8蛋白質的羧基末端。
圖9是一組示意圖和照片，其顯示將擴增的LK68和LK8DNA克隆到腺病毒相關病毒的質粒載體中，并且瓊脂糖凝膠電泳的結果證實上面的克隆的結果。
圖10是質粒圖譜，其顯示每個基因在通過圖9的克隆所構建的質粒載體中的定位。
圖11是一組照片，其顯示蛋白質印跡的結果。將用于產生腺病毒相關病毒基因載體的質粒載體體外轉染到HEK 293細胞中從而誘導LK68和LK8蛋白質的表達，并且該結果被蛋白質印跡分析(a)所證實。將用于產生腺病毒相關病毒基因載體的質粒載體和輔助質粒共轉染到HEK 293細胞中從而制備重組腺病毒相關病毒(rAAV)，接著將其用于體外感染HEK293細胞從而表達LK68和LK8蛋白質，并且該結果通過蛋白質印跡分析(b)進行證實。
圖12是一組照片和曲線圖，其顯示在小鼠的血液中的基因的表達。將包含LK8基因(a)，載脂蛋白的38三環，LK68基因(b)或制管張素(angiostatin)(K13)基因(c)的重組腺病毒相關病毒注射到Balb/c裸鼠中的下肢的肌肉中，接著檢查那些基因的表達。將包含LK68或LK8基因的質粒通過基于流體動力學的轉染技術遞送到C57BL/6野生型小鼠中，接著還研究了上述基因在血液中的表達(d)。
圖13是一組照片(a)和曲線圖(b)，其顯示被轉移到肺中的B16F10腫瘤細胞的轉移在表達LK68或LK8蛋白質的小鼠中因為重組腺病毒相關病毒轉移而受到抑制。
圖14是一組曲線圖，其顯示實體肝腫瘤的生長曲線(a)和生長抑制的程度(b)。通過使用Huh-7肝細胞癌細胞構建了實體肝腫瘤模型。并且互相比較了在通過肌內注射用LK68或LK8基因載體處理的組中的實體肝腫瘤和未用其處理的組中的實體肝腫瘤的生長和生長抑制(這次，通過斯氏t檢驗來檢查統計學顯著性)。
圖15是顯示實體肝腫瘤的生長曲線的曲線圖。通過使用Hep3B肝細胞癌細胞來構建實體肝腫瘤模型。相互比較了在通過肌內注射用LK68和LK8基因載體處理的組，和在未用其處理的組中的實體肝腫瘤的生長曲線(在這次，通過斯氏t檢驗來檢查統計學顯著性)。
圖16是一組照片(a)和曲線圖(b)，其顯示基因治療對EL4淋巴瘤細胞生長的抑制作用。將EL4淋巴瘤細胞施用到因為重組腺病毒相關病毒(rAAV)的轉移而表達LK68和LK8蛋白質的小鼠的脾中。研究了對從脾向肝的轉移的抑制，和轉移瘤的生長(通過斯氏t檢驗來檢查統計學顯著性，并且為了幫助理解圖，分別將rAAV-GFP，-LacZ，-K13，-LK68和-LK8以GFP，LacZ，K13和LK8表示)。
圖17是曲線圖，其顯示通過肌內注射用包含LK68和LK8基因的重組病毒處理的小鼠組和未用其處理的組在huh-7肝細胞癌細胞的實體肝腫瘤模型中的存活曲線(在這次，通過Kaplan-Meier存活曲線的對數等級檢驗來檢查統計學顯著性)。
最佳方式術語基因載體意為用于將LK8或LK68基因插入治療靶點的基因的轉運載體。其包括適合于在靶標個體中表達的啟動子，增強子，LK8或LK68基因和轉錄終止區域，并且選自由包含線性DNA片段的載體，環狀質粒載體和病毒表達載體，重組腺病毒，重組逆轉錄病毒，重組腺病毒相關病毒，重組單純皰疹病毒和重組慢病毒組成的組。啟動子是器官或組織特異性啟動子之一，并且可以包括在靶器官或組織中用于增殖的復制起點。
AAV代表腺病毒相關病毒。其包括表達外源基因的重組腺病毒相關病毒，但是在本發明中，其意為野生型病毒，除非有特殊指定。重組腺病毒相關病毒(rAAV)指這樣的腺病毒相關病毒，所述病毒當基因被插入其中時能夠表達外源基因，并且是一種用于基因治療的基因載體。重組腺病毒相關病毒也被稱為重組AAV載體。同時rAAV-LK8指表達LK8的重組腺病毒相關病毒，其由被pAAV-LK8，一種LK8蛋白質的表達載體轉染的細胞產生。類似地，rAAV-LK68指表達LK68蛋白質的重組腺病毒相關病毒。
重組腺病毒相關病毒表達載體(其后，稱為“rAAV表達載體”)，狹義地說，指包含外源基因的表達載體，其被設計用于在被轉染了重組腺病毒相關病毒的細胞中表達外源基因。在廣義上講，rAAV表達載體包括AAV rep-cap基因表達載體，輔助質粒或輔助病毒，即，其包括所有的能夠通過轉染細胞構建重組腺病毒相關病毒的載體。在本發明中，rAAV表達載體指后者，除非有特殊指定。
AAV rep-cap基因表達載體指用于這樣的基因的表達載體，所述基因可以分別編碼，來自重組腺病毒相關病毒表達載體的基因組的拷貝所需要的酶(Rep)，和可用于形成腺病毒相關病毒顆粒的殼體蛋白質(Cap)，并且可以與重組腺病毒表達載體同時被插入，使重組腺病毒相關病毒在細胞中產生。輔助病毒是幫助形成本身不能復制的感染性腺病毒相關病毒顆粒的病毒，并且可以通過腺病毒、痘苗病毒和單純皰疹病毒等進行擴增。同時，輔助質粒是代表輔助病毒功能的質粒。提及的AAV rep-cap基因表達載體和輔助病毒可以體現為一個載體，并且pDG(DKFZ，Germany)是最有代表性的實例。由于所有的AAV rep-cap基因表達載體和輔助病毒或輔助質粒可以幫助本身不能形成感染性腺病毒相關病毒顆粒的rAAV表達載體來形成感染性rAAV顆粒，在本發明中，將包含AAV rep-cap基因和形成感染性腺病毒相關病毒顆粒所必需的腺病毒的最少基因的質粒(例如pDG)稱為輔助質粒。并且將與輔助病毒一起的輔助質粒稱為“輔助載體”。因此，輔助質粒包括上述AAV rep-cap基因表達載體和形成感染性腺病毒相關病毒顆粒所必需的最少腺病毒基因的表達載體，除非關于它有特殊的指示。
發明描述為了實現上述目標，本發明提供用于基因治療的抗癌劑或抗轉移藥劑，其包括具有人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因載體或細胞作為有效成分。
本發明還提供用于預防或治療實體腫瘤的方法，其包括向個體腸胃外施用包含LK68或LK8基因的基因載體或細胞的步驟。
其后，詳細描述本發明。
本發明提供用于基因治療的抗癌劑或抗轉移藥劑，其包括具有人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因載體或細胞作為有效成分。
上述的LK68基因優選地包括由SEQ.ID.No.1所表示的核苷酸序列，但是不一定受其限制。包含LK68基因的基因載體優選地包括在人或動物中表達的線性DNA，質粒載體，包含病毒表達載體或重組逆轉錄病毒載體的載體，重組腺病毒載體，重組腺病毒相關病毒載體，重組單純皰疹病毒載體或包含重組慢病毒載體的重組病毒載體，但是不一定受其限制。最優選的是從由pSecTag-LK68，pLXSN-LK68，rAAV-LK68和pAAV-LK68組成的組中選擇基因載體。包含LK68基因的細胞優選地選自由造血干細胞，樹突細胞，自體腫瘤細胞，和建立的腫瘤細胞組成的組，但是也不一定受其限制。
LK8基因優選地包括由SEQ.ID.No.2所表示的核苷酸序列，但是不一定受其限制。包含LK8基因的基因載體優選地包括在人或動物中表達的線性DNA，質粒載體，包含病毒表達載體或重組逆轉錄病毒載體的載體，重組腺病毒載體，重組腺病毒相關病毒載體，重組單純皰疹病毒載體或包含重組慢病毒載體的重組病毒載體，但是不一定受其限制。最優選的是從由pSecTag-LK8，pLXSN-LK8，rAAV-LK8和pAAV-LK8組成的組中選擇基因載體。包含LK8基因的細胞優選地選自由造血干細胞，樹突細胞，自體腫瘤細胞，和建立的腫瘤細胞組成的組，但是也不一定受其限制。
在本發明的治療劑是包含LK68或LK8基因的載體的情形中，優選0.05-500mg的劑量。并且更優選0.1-300mg的劑量。在本發明的治療劑是包含LK68或LK8基因的重組病毒的情形中，優選103-1012IU(10-1010PFU)的劑量，并且更優選105-1010IU的劑量。在本發明的治療劑是包含LK68或LK8基因的細胞的情形中，被包括的細胞的優選數量是103-108，更優選的數量是104-107。
優選前述重組病毒是腺病毒或腺病毒相關病毒。以包含載體基因組的病毒顆粒或感染性病毒的數量來計算治療需要的病毒的數量。即，感染性病毒的有效數量是在1％的病毒顆粒下，其通過IU(感染單位)或PFU(噬斑形成單位)來得出。
將細胞用于使用重組逆轉錄病毒的治療。例如，因為重組逆轉錄病毒被血液補體所失活，將其通過離體傳播的方法進行使用。具體地，首先制備包含LK68或LK8的重組逆轉錄病毒，接著將靶基因通過病毒遞送到人造血干細胞(CD34+)中，并且最后，將細胞施用于個體以治療疾病。此時，細胞可以被樹突細胞，自體腫瘤細胞，建立的腫瘤細胞等取代。在許多本發明的優選實施方案中，通過使用逆轉錄病毒載體，將LK68或LK8基因遞送到CT26細胞系，一種建立的腫瘤細胞中，接著將細胞施用于個體，隨后進一步觀察疾病的進展。
優選地，將這些本發明的治療劑施用于抑制癌癥轉移或治療原發腫瘤。并且，靶標癌癥優選地選自由結腸癌，肝癌，肺癌，乳腺癌，腦腫瘤，前列腺癌，皮膚癌，胃癌，胰腺癌，淋巴瘤，腎癌，卵巢癌和轉移瘤組成的組中。
可以將用于本發明的基因治療的藥劑腸胃外施用并且用在藥物制劑的一般形式中，所述藥劑包含作為有效成分的包含LK68或LK8基因的基因載體或細胞。
本發明的治療劑可以通過混合以一般使用的填充劑，補充劑，粘合劑，濕潤劑，崩解劑，稀釋劑諸如表面活性劑，或賦形劑來進行制備以用于腸胃外施用。用于腸胃外施用的制劑是無菌的水溶液，不可溶于水的賦形劑，混懸液，乳劑，凍干產品，和栓劑。除了活性化合物或多種化合物之外，不可溶于水的賦形劑和混懸液可以包含丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄欖油，可注射的酯如ethylolate等。除了活性化合物或多種化合物之外，栓劑可以包含，witepsol，聚乙二醇，吐溫61，可可脂，月桂油(laurin butter)，甘油化明膠等。為了增加藥物效果，可以將鈣或維生素D3另外包括進來。
劑量單位可以包含，例如，1，2，3或4的個體劑量或1/2，1/3或1/4的個體劑量。個體劑量優選地包括在一次施用中所給藥的活性化合物的量，并且其通常對應于全部，1/2，1/3或1/4的每日劑量。
本發明的治療劑可以包含下列的任一個；載體，重組病毒和被轉染的細胞。并且每種情形的有效劑量分別是0.05-12.5mg/kg，107-1011顆粒/kg，和103-106細胞/kg，并且更優選地0.1-10mg/kg，108-1010顆粒(106-108IU)/kg，和102-105細胞/kg。并且施用次數是每天2-3次。劑量不一定受其限制并且按照患者的情形和疾病的嚴重程度來確定。
本發明已經證實LK68和LK8蛋白質在體內和離體都充當非常有效的抗癌劑(韓國專利申請號.2003-10797)。抗癌劑中的許多必須被長期持續施用從而保持靶蛋白的需要水平，這導致了高生產費用和得到的生產的蛋白的高單位價格等問題。LK68和LK8蛋白質能夠與作為細胞外基質的主要成分的許多高分子(纖維蛋白原，血纖蛋白等)結合，顯示它們可能在達到靶標腫瘤之前，通過與高分子的非特異性反應而受到損失。
為了克服這些問題，基因治療是備選方法之一。準確地說，將編碼靶蛋白質的基因，而不是蛋白質本身體內插入靶細胞中，從而在那些轉化細胞中直接表達蛋白質。例如，取代插入作為一種抗癌劑的LK68或LK8蛋白質，將編碼該蛋白質的基因插入從而在體內表達該蛋白質，這樣可以使抗癌效果最大化。基于該觀點，本發明人獲得了在人載脂蛋白(a)的許多三環結構中，每個僅具有KIV9-KIV10-KV(LK68)結構和KV(LK8)結構的基因，接著將那些基因離體(ex vivo)遞送到腫瘤細胞中，隨后引入活體中。觀察腫瘤細胞的生長和轉移。結果，證實了腫瘤的生長和轉移被那些基因的遞送成功抑制。
本發明人制備了具有編碼LK68或LK8蛋白質的基因的重組逆轉錄病毒。接著，將該病毒離體遞送到結腸癌細胞中，并且接著將其轉移到活體內，隨后觀察腫瘤細胞的生長和轉移。本發明人還制備了作為治療性基因載體的重組腺病毒相關病毒(rAAV)，其包含LK68或LK8基因。接著，將該病毒引入活體內，隨后觀察所述腫瘤細胞的生長和轉移從而研究該系統的抑制效果。本發明人最終證實前述基因可以被有效地用作抗癌劑。
在本發明的優選實施方案中，本發明人通過RT-PCR，從人肝cDNA文庫中，制備了包含編碼LK68和LK8蛋白質的基因的約1kbps DNA，其對應于載脂蛋白(a)末端的三個三環結構(KIV9，KIV10和KV)。通過自動測序儀證實了獲得的DNA的相容性，并接著將該DNA稱為“LK68基因”。用選擇性引物僅擴增了LK68 DNA末端的KV三環區，隨后通過用于分離LK68的相同的方法來進行克隆。將該產物稱為“LK8基因”。
為了構建重組逆轉錄病毒，將制備的基因克隆到逆轉錄病毒載體pLXSN(Clontech，USA)中。將包含LK68基因的載體稱為“pLXSN-LK68”，并將包含LK8基因的載體稱為“pLXSN-LK8”(見圖1)。將重組載體pLXSN-LK68和pLXSN-LK8引入PT67包裝細胞系中從而產生重組病毒，通過所述重組病毒，將LK68或LK8基因遞送到靶標小鼠結腸癌細胞系CT26。將穩定表達LK68基因的CT26細胞系稱為“CT-LK68”，并且將穩定表達LK8基因的CT26細胞系稱為“CT-LK8”。同時，將其中僅引入了不攜帶LK68或LK8的pLXSN載體的細胞系稱為“CT-載體”，將所述CT-載體作為對照。
LK68或LK8基因的引入并不直接影響靶細胞的生長和程序性細胞死亡(見，圖2)。通過觀察體內實體腫瘤的生長和轉移來研究在CT-LK68或CT-LK8細胞系中表達的LK68或LK8蛋白質的抗癌效果(見，圖3到圖7)。結果，證實了包含LK68和LK8的基因治療劑極好地抑制了腫瘤的生長和轉移。
基于上述結果，本發明人通過將誘導免疫球蛋白kappa(Igk)鏈和FLAG抗原的細胞外分泌的信號核苷酸序列連接于上述LK68和LK8 DNA而制備DNA。將該DNA引入腺病毒相關病毒基因載體遞送系統從而構建包含LK68或LK8基因的重組腺病毒相關病毒載體。將構建的載體稱為“pAAV-LK68”或“pAAV-LK8”。并且，將從該載體產生的病毒顆粒稱為“rAAV-LK68”或“rAAV-LK8”(見圖8到圖10)。證實了上述重組基因載體將LK68或LK8基因成功遞送到細胞或組織中并且由此那些基因的表達也得以成功完成(見圖11)。通過動物試驗證實了通過重組病毒遞送的表達的LK68和LK8蛋白質抑制了轉移性腫瘤B16F10黑素瘤細胞向肺中的轉移約30-60％(見圖12和圖13)，并且抑制了轉移性腫瘤EL4淋巴瘤細胞向肝的轉移40-90％(見圖16)。因此，證實了可以將rAAV-LK68或rAAV-LK8重組腺病毒相關病毒用作用于基因治療的抗癌劑。
本發明還提供了用于預防或治療實體腫瘤的方法，所述方法包括向個體腸胃外施用抗癌劑或抗轉移藥劑的步驟，所述抗癌劑或抗轉移藥劑包含作為有效成分的具有人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因載體或細胞。通過動物試驗證實了通過重組病毒遞送的表達的LK68和LK8蛋白質抑制肝細胞癌Huh7和Hep3B細胞的腫瘤生長約80-90％(見圖14和圖15)，并且在Huh-7細胞的實體肝腫瘤模型中增加動物的存活率30-40％(見圖17)。
在上述治療劑的施用方法中沒有限制，優選的是從由化學方法，物理方法，通過使用脂質體綴合，使用受體和病毒的方法等組成的組中選擇一種方法來將基因載體引入細胞，所述基因載體包含人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因。在本發明中預防或治療實體腫瘤優選地是通過抑制腫瘤的生長和轉移來完成。在本發明的另一個優選實施方案中，所述施用優選地通過將人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因引入細胞，并接著體內施用細胞的方法來進行，所述細胞選自由造血干細胞，樹突細胞，自體腫瘤細胞，和建立的腫瘤細胞組成的組。
本發明人證實了LK68或LK8基因的引入通過抑制體內腫瘤的生長和轉移顯示抗癌效果(見圖3到圖7)，并且包含LK68或LK8基因的基因治療劑可以有效抑制腫瘤的生長和向其它器官的轉移。并且，在通過上述基因載體被遞送后，在細胞中表達的LK68和LK8蛋白質抑制了轉移性腫瘤B16F10黑素瘤細胞向肺的轉移約30-60％(見圖12和圖13)。此外，證實了包含LK68或LK8基因的重組腺病毒相關病毒基因載體抑制轉移性腫瘤EL4淋巴瘤細胞向肝的轉移40-90％(見圖16)。
發明方式本發明的實施和目前優選的實施方案如在下面實施例中所顯示的那樣進行舉例說明。
然而，將理解的是，在考慮本文公開內容后，本領域那些技術人員可以在不背離本發明精神和范圍的前提下，作出多種改進和改善。
<實施例1>表達重組蛋白質LK68或LK8的結腸癌細胞系的構建通過使用逆轉錄病毒，將編碼LK68或LK8蛋白質的基因引入結腸癌細胞系。在后面，明確闡述構建方法。
<1-1>表達LK68或LK8蛋白質的重組載體的構建為了獲得從人肝中分離的包含編碼LK68或LK8蛋白質的基因的DNA片段(在后面，稱為“LK68或LK8基因”)，所述DNA片段由SEQ.ID.No.1和SEQ.ID.No.2表示，用由SEQ.ID.No.3表示的LK68基因的有義引物或由SEQ.ID.No.4表示的LK8基因的有義引物和由SEQ.ID.No.5表示的病毒載體的有義引物，通過如下方法來進行PCR；在94℃變性5分鐘，接著在94℃30秒，在56℃退火30秒，在72℃延伸1分鐘，并且該循環重復30次，隨后在72℃進行另外的反應5分鐘。設計每個有義引物使其包括限制性內切核酸酶Sfi I裂解位點，并設計反義引物使其具有限制性內切核酸酶Xho I裂解位點從而容易與載體進行DNA連接。將PCR產物插入載體，得到重組載體。為了誘導靶標蛋白(LK68或LK8蛋白)的表達和靶標蛋白在細胞外的平穩地分泌，進行上述PCR產物與在pSecTag載體(Invitrogen，USA)中的Sfi I和Xho I消化區域中的連接，隨后插入Igk前導序列的Sfi I限制性內切核酸酶位點。結果，將每個PCR產物設定在LK68和LK8基因的上游，得到了載體“pSecTag-LK68”和“pSecTag-LK8”構建體。
接著，為了將LK68或LK8基因引入逆轉錄病毒載體，以由SEQ.ID.No.6表示的病毒載體的有義引物和由SEQ.ID.No.5表示的LK68或LK8的反義引物通過下列程序來進行PCR；在94℃變性5分鐘，在94℃達30秒，在56℃退火30秒，在72℃延伸1分鐘。在重復30次循環后，在72℃進行另外的反應5分鐘。通過PCR，分別從pSecTag-LK68和pSecTag-LK8載體選擇性地擴增Igk-LK68和Igk-LK8DNA。在那時，所用的引物具有EcoR I和Xho I裂解位點從而與載體容易地進行DNA連接。用限制性內切核酸酶EcoR I和Xho I消化通過PCR擴增的Igk-LK68和Igk-LK8 DNA片段。將該DNA片段插入逆轉錄病毒載體pLXSN(Clontech，USA)，所述載體預先用如上所述的相同限制性內切核酸酶消化，得到pLXSN-LK68和pLXSN-LK8的構建。通過核苷酸序列分析和通過使用限制性內切核酸酶制成的遺傳學圖來證實靶基因插入載體中(圖1a)。
<1-2>具有LK68或LK8基因的結腸癌細胞系的構建為了制備包含LK68或LK8基因的重組逆轉錄病毒，用在上述實施例1-1中構建的pLXSN-LK68或pLXSN-LK8載體通過商購脂質體(LipofectaminTM，Life Technologies Inc.，Rockville，MD，USA)來轉染包裝細胞系PT67(Clontech，USA)。將制備自被轉染的PT67細胞系的重組病毒貯存在-80℃，并且如果對于結腸癌細胞系CT26(KoreanCell Line Bank)的轉染是必須的，將其進行融解。用病毒轉染的CT26細胞系由于包括在pLXSN中的報道基因而具有針對抗生素G418(濃度1mg/ml)的抗性。這種針對G418的抗性成為確定細胞系穩定表達LK68或LK8蛋白質的提示。將具有被插入的LK68基因的細胞系稱為“CT-LK68”，而將具有被插入的LK8基因的細胞系稱為“CT-LK8”。作為對照組，將僅包含不具有編碼蛋白質(LK68或LK8)的基因的pLXSN的細胞系稱為“CT-載體”，并將未被病毒轉染的細胞系稱為“CT-模擬品”。
進行蛋白質印跡分析和RT-PCR來證實LK68和LK8蛋白質是否在CT-LK68和CT-LK8細胞系中進行表達(圖1b和1c)。結果，LK68和LK8蛋白質成功地在那些細胞系中進行表達。
<實施例2>CT-LK68和CT-LK8細胞系的體外生長和預期的程序性細胞死亡的觀察為了研究LK68和LK8基因的引入在CT26細胞中的效果，觀察CT-LK68和CT-LK8細胞系和的體外生長和預期的程序性細胞死亡。
具體地，為了觀察細胞生長，將CT-LK68，CT-LK8，CT-載體和CT-模擬品細胞系以2.5×104細胞/孔的濃度分散到24孔組織培養板的每個孔中。接著，將細胞于37℃，在5％的CO2培養箱中，培養于補充以10％FBS(胎牛血清)的DMEM培養基(Dulbecco’s modified Eagles medium)中。通過錐蟲藍排阻(exclusion)計數方法(Freshney，R.I.，1994，Culture of Animal Cells.A manual of Basic Technique，第三版，Wiley-Liss.New York，USA)來測量時間依賴型細胞生長達5天。結果，在插入LK68或LK8基因的兩種細胞系和對照細胞系中都觀察到相同的細胞生長(圖2a；X軸表示觀察時間，而Y軸表示增殖的細胞的數量)。
為了證實預期的程序性細胞死亡，將約1×105細胞用anexin-V和PI進行染色，隨后通過FACS進行觀察。用10μg/ml的紫杉醇處理CT26細胞系達24小時，接著將其用作陽性對照。當在陽性對照中觀察到83％的程序性細胞死亡的時候，在CT-模擬細胞系中觀察到0.89％的程序性細胞死亡，所述陽性對照是用10μg/ml的紫杉醇處理的CT26細胞系。在CT-載體細胞系和CT-LK68細胞系中分別觀察到1.21％和0.96％的程序性細胞死亡(圖2b)。上述結果顯示LK68基因的表達沒有影響CT26細胞系的生長和預期的程序性細胞死亡。
<實施例3>通過插入LK68基因來抑制實體腫瘤生長在同種異體移植的腫瘤模型中，研究在結腸癌細胞中表達的LK68蛋白質會是否抑制實體腫瘤的生長。
具體地，將培養在補充以10％FBS的DMEM培養基中的5×105CT-LK68細胞皮下注射在Balb/c小鼠(Charles River，Yokohama，Japan)的背脊中央。每個組由8-10只小鼠組成。腫瘤移植后，觀察腫瘤的生長一個月。用CT-載體或CT-模擬細胞取代CT-LK68細胞來移植到對照組小鼠中。每3天或4天測量腫瘤大小，并且通過式(長×寬2×0.52)來計算腫瘤的體積。
結果，與對照相比，在其中插入LK68基因的CT-LK68中的腫瘤生長受到明顯抑制。準確地講，在從移植所述細胞系的第33天，在CT-載體處理組，CT-模擬處理組和CT-LK68處理組中比較腫瘤生長率，結果腫瘤生長在CT-LK68處理組中被80％的抑制(圖3a)。在結束觀察后，處死小鼠并將腫瘤從小鼠中分離。測量那些腫瘤的重量。在其中引入了LK68基因的CT-LK68處理組中的腫瘤比在CT-載體處理組中的腫瘤更輕，這與測量那些腫瘤的體積的結果相似(圖3b和3c)。
<實施例4>通過引入LK68基因來抑制從脾向肝的轉移為了研究在結腸癌細胞中表達的LK68或LK8蛋白質是否能抑制實體腫瘤的轉移，通過將結腸癌細胞移植到Balb/c小鼠的脾中來制備動物模型，隨后觀察向肝的轉移。
具體地，將5×104CT-LK68細胞移植到Balb/c小鼠的脾中。在從移植的第14天，將肝從小鼠中提取并計算轉移的腫瘤群體的數量從而確定轉移的程度。圖4a是照片，其顯示其中結腸癌細胞被轉移的最典型的肝。在CT-載體處理組情形中，在肝中異常是顯而易見的，所述肝的表面被覆蓋了大或小的腫瘤群體。與此相對，在CT-LK68和CT-LK8處理組中轉移被顯著減少，并且肝的形狀似乎象是正常的。還對在肝的表面上形成的結節的數量進行計數。結果，結節的數量在CT-LK68處理組中是47±30/單位面積，而在CT-LK8處理組中是86±50。在另一方面，在CT-載體處理對照組中，結節是125±14。上述結果顯示其中被插入LK68或LK8基因的細胞系，與對照組相比(圖4b)顯示顯著減少的通過轉移形成的結節數量。
將肝樣品固定在甲醛水溶液中。接著，進行H&E染色來觀察結腸癌的一般轉移。還進行PCNA染色來觀察癌癥細胞生長，并且使用TUNEL染色的免疫組化方法來研究程序性細胞死亡(圖5a，Junqueria等，BasicHistology，Lange，2003)。將針對每種染色試劑被證實為陽性的細胞的數量計算為對在確定區域中的總細胞數量的百分比，從而計算癌細胞的生長指數和程序性細胞死亡指數。
H&E染色的結果顯示與對照，移植了CT-載體的小鼠相比，一般轉移減少，并且在其中移植了CT-LK68細胞的宿主小鼠肝中，在第二位置新形成的腫瘤的尺寸非常小。從上述結果，證實了LK68基因還通過血管發生抑制了微轉移向大轉移的發展。
PCNA染色細胞與總細胞的比率在CT-LK68處理組和在CT-載體處理組中分別是64.5±3％和64.3±2％，顯示了在兩個組之間相似的比率(圖5b)。然而，在CT-LK68處理組和在CT-載體處理組中TUNEL染色細胞與總細胞的比率分別是5.36±1.35％和0.47±0.14％，顯示了在CT-LK68處理組中的癌癥細胞的預期程序性細胞死亡顯著增加(圖5c)。上述結果顯示在結腸癌細胞中表達的LK68蛋白質不影響癌癥細胞的生長，但是有效增加癌癥細胞的程序性細胞死亡。即，LK68基因的引入大大有利于對結腸癌細胞生長和向肝轉移的抑制。
因此，在考慮H&E，PCNA和TUNEL的所有結果中，認為LK68基因插入的轉移抑制效果是通過LK68蛋白質的表達，使預期的癌癥細胞的程序性細胞死亡的增加所導致的。
<實施例5>通過將LK68基因引入肝轉移模型中來增加宿主的存活率將在上述實施例4中制備的，其中誘導了移植在脾中的結腸癌細胞向肝中轉移的動物模型用于研究LK68基因的引入對宿主的存活率的影響，所述LK68基因在前被證實了抑制了向肝的轉移。
具體地，將4×105CT-LK68細胞和CT-載體細胞(對照)，分別注射到小鼠的脾中，并且接著每天檢查小鼠的狀況和生存力。從注射的第23天，移植了CT-載體的小鼠開始迅速死亡。組的50％存活過24天，但是沒有任何小鼠存活超過28天。同時，以CT-LK68細胞移植的小鼠的50％存活過36天，但是沒有任何小鼠存活超過48天(圖6)。通過Kaplan-Meier存活曲線的對數等級檢驗檢查了兩組的存活率的統計學顯著性。從所述結果，證實了LK68基因的插入通過抑制轉移大大有利于宿主存活率的增加。
<實施例6>在腹腔轉移模型中通過引入LK68基因導致的宿主存活率的增加除了肝以外，結腸癌細胞可以轉移到腹腔中。轉移的兩種方式是具有結腸癌的患者在治療后復發和死亡的主要原因。因此，本發明人研究了LK68基因的引入在結腸癌的腹腔轉移模型中是否能夠增加宿主的生存力。
具體地，將4×105CT-LK68細胞和CT-載體細胞(對照)分別注射于在上述實施例3中使用的Balb/c小鼠的腹腔中，隨后觀察那些小鼠的狀況和生存力達32天。從移植的第14天，在移植了CT-載體細胞的組中，開始迅速有死亡的報道。在該組中，沒有任何小鼠存活超過21天。同時用CT-LK68細胞處理的組的50％存活過23天，并且沒有任何小鼠存活超過28天(圖7)。通過Kaplan-Meier存活曲線的對數等級檢驗檢查了在兩組之間的存活率的差異的統計學顯著性。從上述結果，證實了LK68基因的引入通過抑制結腸癌細胞向腹腔的轉移，大大有利于宿主的生存力的增加。
<實施例7>構建質粒載體pAAV-LK68和pAAV-LK8用于制備重組腺病毒相關病毒基因載體本發明人將LK68和LK8基因引入腺病毒相關病毒載體，接著將它們稱為pAAV-LK68和pAAV-LK8。其后詳細闡述pAAV-LK68和pAAV-LK8質粒的構建方法。
<7-1>LK68或LK8 cDNA的擴增為了擴增由SEQ.ID.No.1表示的LK68DNA，用由SEQ.ID.No.7和SEQ.ID.No.8代表的引物，通過使用人肝細胞cDNA文庫(Clontech，Palo Alto，CA，USA)作為模板以如實施例1-1所用的相同反應條件和方法來進行PCR。將編碼LK68的氨基基團末端的堿基序列組合以信號核苷酸序列Igk，接著將其克隆到pcDNA3.1(+)載體(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中從而誘導蛋白質的細胞外分泌。在克隆后，通過使用DNA測序儀(Applied Biosystems，CA，USA)來分析DNA的核苷酸序列從而證實是否LK68 DNA被成功插入。將上述載體命名為pcDNA-LK68。通過將上述pcDNA-LK68用作模板，使用SEQ.ID.No.8和SEQ.ID.No.9表示的引物進行PCR來擴增LK8 DNA。通過用于克隆LK68 DNA的相同方法來克隆LK8 DNA，并且將得到的載體命名為pcDNA-LK8。
通過使用pcDNA-LK68和pcDNA-LK8作為模板，以SEQ.ID.No.10和SEQ.ID.No.11所代表的引物來進行PCR從而擴增LK68和LK8DNA。在那時，設計由SEQ.ID.No.10表示的引物從而與連接LK68和LK8 cDNA的5’末端的Igk的信號核苷酸序列的5’末端結合，并且在所述引物的5’末端包括EcoR I識別位點。設計由SEQ.ID.No.11表示的引物從而將編碼FLAG的核苷酸序列包括在內從而用于FLAG與LK68或LK8 cDNA的3’末端的成功連接。將FLAG抗原標志物用于容易地檢測LK68或LK8DNA。
將用作模板的100ng pcDNA-LK68或pcDNA-LK8載體，2μl的每種25mM引物，5μl的10×PCR緩沖液，4μl的dNTP混合物(每種2.5mM)和2.5U的Ex-Taq聚合酶加入0.2ml的PCR管中。通過使用三蒸(tertially distilled)水將混合物的最終體積調整到50μl，隨后如下進行PCR；在95℃變性5分鐘，在95℃30秒，在52℃30秒，在72℃1分鐘，并且將循環重復30次，接著在72℃誘導另外的反應3分鐘。進行瓊脂糖凝膠電泳來證實PCR是否正確進行(圖8)。
<7-2>質粒載體pAAV-LK68和pAAV-LK8的構建在將定位在pAAV-hrGFP載體(Stratagene，La Jolla，CA，USA)的GFP基因之前和之后的EcoR I和Xho I區域切除從而消除GFP基因。接著，將LK68或LK8 cDNA連接于該區域。
具體地，用限制性內切核酸酶EcoR I和Xho I消化通過PCR制備的LK68和LK8 DNA，并且接著通過凝膠提取來分離DNA片段。使得到的DNA片段與T4DNA連接酶在16℃反應4小時，導致了感受態細胞系DH5α(ATCC)的轉化(圖9)。在次日，從增殖的被轉化DH5α細胞中提取DNA。進行以EcoR I和Xho I進行的消化從而證實是否LK68和LK8 DNA成功地插入缺乏GFP基因的pAAV-hrGFP(其后，稱為’pAAV’)。將正確插入LK68DNA的媒介質粒載體命名為pAAV-LK68，并將LK8 DNA成功插入的媒介質粒載體稱為pAAV-LK8(圖10)。
<實施例8>遞送LK68或LK8基因的重組腺病毒相關病毒的制備和分離為了制備遞送腺病毒相關病毒LK68或LK8基因的基因載體，以1∶5的比率將pAAV-LK68或pAAV-LK8 DNA混合以包含腺病毒的E2a，E4和VA基因和腺病毒相關病毒的rep和cap基因的輔助質粒。在室溫，以對應于N/P為5的量，使混合物與轉化用試劑PEI(PolyPlus，Illkirch，France)反應15分鐘。將得到的溶液逐滴滴到被插入并穩定表達腺病毒的E1基因的HEK293細胞(Microbix，Toronto，Ontario，Canada)上，并接著將細胞培養在37℃48小時。回收培養的細胞，隨后在3,000rpm離心10分鐘從而分離培養基和細胞。將細胞重懸在由0.15M NaCl和50mM Tris-HCl(pH 8.5)組成的緩沖液中，隨后凍融三次，導致細胞的裂解。為了除去沒有被病毒殼體覆蓋的DNA，在37℃用50U/ml的脫氧核糖核酸酶來處理它30分鐘從而進行進一步的反應。接著，在3,000rpm進行離心20分鐘從而分離上清液。為了從上清液分離病毒，進行iodixanol密度梯度超離心(Zolotukhin，S.等，Gene Therapy，6973-985，1999)。將通過上述方法制備的得到的病毒各自稱為rAAV-LK68或rAAV-LK8。
<實施例9>通過重組腺病毒相關病毒遞送的LK68或LK8基因的表達為了證實通過在上述實施例8中制備的媒介質粒載體pAAV-LK68和pAAV-LK8遞送的LK68或LK8基因是否成功進行表達，將質粒載體在體外插入HEK 293細胞中，接著在體內以及體外研究LK68或LK8基因的表達和細胞外分泌。
<9-1>通過體外轉導和腺病毒相關病毒基因載體來表達LK68或LK8基因通過使用PEI試劑(PolyPlus，Illkirch，France)以3mg的pAAV-LK68或pAAV-LK8質粒載體轉染在6孔板中被培養到70-80％匯合的HEK 293細胞，隨后在37℃進一步培養24小時。
同時，用在上述實施例8中制備的rAAV-LK68或rAAV-LK8轉染在不含FBS的6孔板中被培養到70-80％匯合的HEK 293細胞，其中接種物的大小是每個細胞5個感染復數。一小時后，用新鮮的培養基取代該培養基，隨后在37℃另外培養24小時。
回收上述不同培養的細胞，隨后在3,000rpm離心5分鐘以分離細胞和培養基。將細胞重懸在1×SDS-PAGE緩沖液(50mM Tris(pH 6.8)，2％SDS(十二烷基硫酸鈉)，100mM DTT(二硫蘇糖醇)，0.1％BPB(溴酚藍)，10％甘油)中，并接著在100℃煮沸5分鐘。在10,000rpm離心2分鐘以分離上清液。通過使用濃縮器(CentriconYM-10；Amicon，Beverly，MA，USA)來將培養基濃縮10倍，導致通過如上述所用相同的方法進行的樣品制備。
通過使用電泳試劑盒，在15％SDS-PAGE中，以20mA進行電泳2小時。通過使用傳質單元(transfer unit)在tris-甘氨酸緩沖液(39mM甘氨酸，48mM tris，0.037％SDS，20％甲醇)中再次進行電泳90分鐘，導致向PVDF膜(聚偏1，1-二氟乙烯膜)的移動。通過使用5％脫脂乳/1×TBST緩沖液(10mM Tris，150mM NaCl，0.1％ Tween-20)在室溫進行過夜封閉。以1∶3,000的比率將作為初次抗體的小鼠抗-FLAG單克隆抗體(Sigma，St.Louis，MO，USA)進行稀釋，將其置于室溫約1小時用于反應。接著，以5分鐘間隔用TBST緩沖液洗滌反應溶液6次。還將作為次級抗體的小鼠抗-HRP(KPL，Gaithersburg，MD，USA)以1∶5,000的比率稀釋在1×TBST緩沖液中，進行反應30分鐘。以5分鐘間隔，用TBST緩沖液來洗滌溶液6次。通過使用化學發光試劑盒(ECLTMChemiluminescent Western Blotting Detection Reagents kit；Amersham，Buckinghamshire，UK)來證實LK68或LK8蛋白質的表達(圖11a和11b)。
<9-2>LK68基因在Balb/c裸鼠中的表達載脂蛋白(a)不是小鼠的特性(assets)。因此，本發明人預期當將由本發明人制備的LK68基因插入野生型小鼠時，LK68蛋白將被在小鼠中存在的免疫應答通過針對該蛋白形成的抗體而破壞。
將在上述實施例8中制備和分離的腺病毒相關病毒基因載體，rAAV-LK68和rAAV-LK8，以1×109IU(感染單位，表示感染病毒的單位)的濃度注射到在上述實施例3中使用的Balb/c裸鼠中的后腿肌肉中的三個不同的點中。將僅注射鹽水用作陰性對照，并且將注射rAAV-K13，表達制管張素(K13)的重組腺病毒相關病毒用于陽性對照。以三天間隔，從眼靜脈叢中取血液，一直持續到總共取了100μl的血液。接著，處理蛋白酶抑制劑混合物。將血液樣品置于室溫約1小時，隨后在12,000rpm離心10分鐘，導致紅細胞和血漿的分離。通過ELISA來分析一些分離的血漿從而測量在血液中表達的LK68，LK8和K13基因的量。還進行了如在實施例9-1中的蛋白質印跡分析來研究那些蛋白質的表達。ELISA使用兩種不同的抗體，其具有針對在LK68蛋白質的三個三環中的羧酸末端的三環(LK8蛋白質)的不同血清型。它們中的一個是兔抗-LK8抗體，而另一個是小鼠抗-LK8抗體。將兔抗-LK8抗體在板(F8 MAXISORP LOOSE；Nunc，Rosklide，Denmark)中以0.25mg/切片的濃度混合以包被緩沖液(10mM PBS，pH 7.2)，將其置于37℃ 1小時，接著用洗滌緩沖液(1×PBS，0.1％ Tween 20)洗滌3次，所述板被設計為使孔結合免疫球蛋白(Ig)。加入補充以1％BSA(牛血清白蛋白)的200ml洗滌緩沖液，其后在室溫封閉2小時。以不同的濃度稀釋獲得的血漿，將其在37℃反應1小時，并接著用洗滌緩沖液洗滌3次。以1∶1,000的比率稀釋小鼠抗-LK8抗體，使其于37℃反應1小時。最終，以1∶20,000的比率稀釋抗-小鼠HRP(KPL，Gaithersburg，MD，USA)，并接著用洗滌緩沖液洗滌3次。在此處理TMB酶底物(KPL，Gaithersburg，MD，USA)。通過設定在450nm的光度計來研究顏色顯現以測量LK68在血液中的表達，并且將該結果與已經量化的LK68蛋白質比較組的結果進行比較。還通過比較已經量化的LK8蛋白質比較組的結果來測量LK8基因在血液中的表達。還通過與上面使用的相同的方法來研究K13的表達。
結果，由病毒載體遞送的LK68基因的表達逐漸增加并且在遞送2周后達到150-200ng/ml。LK8基因的表達也如LK68基因一樣逐漸增加，它是20-30ng/ml，但是表達的總量少于LK68的表達總量(圖12a，12b和12c)。
<9-3>通過流體動力學技術表達插入的LK68或LK8基因在7秒內，將包括質粒的1.8ml 0.25％的鹽水注射到C57BL/6野生型小鼠(Charles River，Yokohama，Japan)的尾靜脈中，所述質粒每個包含25mg的LK68或LK8基因。對于陰性對照，僅有鹽水而沒有任何質粒進行注射，且將rAAV-K13注射用于陽性對照。自注射的1周后，從眼靜脈從中取血以測量血液中LK68或LK8基因的表達。結果，LK68蛋白質的表達量是20-25mg/ml，而LK8蛋白質的表達量是200-250ng/ml(圖12d)。將這些結果與通過腺病毒相關病毒載體進行的蛋白質的表達進行比較。結果，LK68的表達是100倍更高，而LK8的表達是10倍更高，顯示上述的方法是更有效的。即，與病毒載體相比，流體力學注射誘導更高的基因表達，因為其能夠快速進行DNA注射(在數秒內)，從而在體內注射后迅速誘導靶基因的高表達(Liu，F.等，Gene Therapy，61258-1266，1999)。
<實施例10>通過插入LK68或LK8基因抑制轉移件腫瘤的生長本發明人證實由LK68或LK8基因表達的蛋白質體內抑制了轉移性腫瘤的生長和轉移。
具體地，將在上述實施例8中制備的1×109IU的腺病毒相關病毒LK68基因載體(rAAV-LK68)或LK8基因載體(rAAV-LK8)注射到在上述實施例3中所用的Balb/c裸鼠的后腿肌肉的三個不同的點中。接著，以三天的間隔從眼叢靜脈中取血從而研究LK68或LK8基因在血液中的表達。在那時，將rAAV-lacZ用于陰性對照，而將rAAV-K13用于陽性對照，在所述rAAV-lacZ中插入了表達β-半乳糖苷酶的pAAV-lacZ(Stratagene，USA)。
自重組腺病毒相關病毒LK68或LK8基因載體注射2周后，將2×105B16F10黑素瘤細胞(ATCC，Manassas，VA，USA)注射到尾靜脈中。B16F10黑素瘤細胞是大量轉移到肺中的細胞，并且通常，自注射后2周，有小的黑色突起樣腫瘤細胞形成于肺的表面上(Fidler，I.J.等，J.Natl.Cancer Inst.，57；1199-1202，1976)。自注射B16F10黑素瘤細胞兩周后，取小鼠的肺來對在肺表面上形成的黑色突起的數量進行計數。結果，證實轉移約被抑制了30-60％(圖13)。
<實施例11>在肝腫瘤模型中，通過插入LK68或LK8基因來抑制腫瘤的生長和轉移本發明人研究了，由LK68或LK8基因表達的蛋白質，是否如制管張素(K13)一樣能夠在體內抑制肝腫瘤的生長和轉移。
<11-1>使用Huh-7細胞(人肝細胞癌細胞)在肝腫瘤模型中通過插入LK68或LK8基因載體來抑制肝腫瘤的生長用PBS洗滌Huh-7細胞(JCRB，Tokyo，Japan)兩次，并且接著將1×107細胞皮下注射到Balb/c裸鼠(Charles River，Wilmington，MA，USA)的右脅區域以誘導實體肝腫瘤。從注射的第10天，實體肝腫瘤開始生長，顯示超過80％的發展率。通過式〔長×寬2×0.52〕每天測量腫瘤的體積。當腫瘤生長到高達50mm3時，將在上述實施例8中制備的1×109IU的腺病毒相關病毒LK68基因載體(rAAV-LK68)或LK8基因載體(rAAV-LK8)注射在Balb/c裸鼠的后腿肌肉的三個不同點中。在自注射LK8或LK68基因載體兩周后，從眼靜脈叢取血以研究LK68或LK8基因在血液中的表達，在該過程中，每天檢查腫瘤的生長。僅注射鹽水來用作陰性對照，而將rAAV-K13注射用于陽性對照。為了檢查感染效率，使用其中插入pAAV-hrGFP(Stratagene，USA)的rAAV-GFP，和rAAV-lacZ。結果，LK68的表達量是50-150ng/ml，而LK8的表達量是30-50ng/ml。同時，K13的表達量是50-100ng/ml。LK68和LK8都抑制了實體肝腫瘤生長80-90％(圖14)。
<11-2>使用Hep3B肝癌細胞在肝腫瘤模型中通過插入LK68或LK8基因載體來抑制肝腫瘤的生長通過與在實施例11-1中使用的相同的方法，使用Hep3B肝細胞癌細胞(ATCC，Manassas，VA，USA)來誘導另外的實體肝腫瘤。從第21天，實體腫瘤開始生長，顯示了約30％的腫瘤化(tumorization)效率。當腫瘤生長到高達50mm3時，將LK68或LK8基因載體注射到肌肉中，并且研究由Hep3B細胞誘導的在肝中的實體腫瘤的生長和LK基因的表達。結果，LK8或LK68的表達量類似于實施例11-1的結果，并且實體腫瘤的生長被抑制了大約80％(圖15a和15b)。
<11-3>使用EL4人淋巴瘤細胞，LK68或LK8在轉移性肝腫瘤模型中的活性打開雄性Balb/c裸鼠的脾，并且將50μl的2×105EL4淋巴瘤細胞(ATCC，Manassas，VA，USA)緩慢注射到其中，在所述脾中，通過肌內注射LK68或LK8基因載體，LK68表達了50-100ng/ml，而LK8表達了30-50ng/ml。僅注射鹽水作為陰性對照，而將rAAV-K13注射用于陽性對照。為了研究感染效率，使用rAAV-GFP和rAAV-lacZ。小心使小鼠不要接觸太多的醚蒸汽，并且給小鼠5分鐘的時間來使介入的癌細胞移動到肝門靜脈。接著，縫合脾。約2周后，取肝來研究轉移的癌細胞的大小和數量，并且還通過分析程序(SigmaScanPro 5.0，SystatSoftware，Point Richmond，CA，USA)來研究腫瘤區域。結果，與對照組相比，腫瘤大小通過rAAV-LK68的施用變得68-90％更小，而通過rAAV-LK8施用變得70-91％更小。同時，在肝中轉移的腫瘤的區域通過rAAV-LK68施用被抑制了37-54％，而通過rAAV-LK8施用被抑制了47-61％(圖16a和16b)。
<11-4>使用Huh-7細胞，LK68或LK8在實體肝腫瘤模型中所導致的存活率的增加上述結果顯示LK68或LK8可以有效抑制癌癥的生長和轉移。為了證實LK68或LK8的治療效果使宿主的生存力增加了多少，使用在實施例11-1中使用的Huh-7細胞，在實體肝腫瘤動物模型中觀察肝腫瘤的生長直到宿主死于它。結果，在沒有注射LK68和LK8基因載體的對照組中，動物在注射肝癌細胞60天后開始死亡，并且沒有一只存活達到100天。與此相對，在以LK68基因載體注射的實驗組中，動物在注射了肝癌細胞后80天開始死亡，并且甚至在自注射140天后，存活率是40％。在以LK8基因載體處理的其它實驗組中，動物在注射了肝癌細胞后68天后開始死亡，并且自注射130天后，存活率達到30％。通過Kaplan-Meier存活曲線的對數等級檢驗檢查在基因載體處理組和基因載體未處理組之間存活率的差異的統計學顯著性。從上述結果，證實了通過在基因載體上遞送來引入LK68或LK8基因大大有利于對實體腫瘤的生長的抑制，導致了宿主生存力的增加(圖17)。
工業應用性如上所闡述，本發明人制備了通過體外基因操作技術具有LK68或LK8基因的重組細胞系(CT-LK68或CT-LK8)，并接著證實被插入的LK68或LK8基因在體內抑制了腫瘤的生長和轉移(離體基因治療)。同時，本發明人制備了其中插入了LK68或LK8基因的腺病毒相關病毒基因載體，并在體內直接注射載體，隨后證實插入的LK68或LK8基因有效抑制了腫瘤的生長和轉移(體內基因治療)。總之，本發明的LK68或LK8基因抑制了轉移性腫瘤的生長，并且可以通過基因載體更有效地進行遞送，從而使它們可以有效地用于預防各種癌癥相關疾病和用于基因治療以及用于開發抗癌劑。
序列表正文SEQ.ID.No.1是來源自人肝載脂蛋白(a)的編碼LK68蛋白質的基因；SEQ.ID.No.2是來源自人肝載脂蛋白(a)的編碼LK8蛋白質的基因；SEQ.ID.No.3和No.4是用于擴增各自編碼上述LK68蛋白質和LK8蛋白質的基因的有義引物；SEQ.ID.No.5是來自病毒載體的用于擴增編碼上述LK68或LK8蛋白質的基因的反義引物；SEQ.ID.No.6是來自病毒載體的用于引入編碼上述LK68或LK8蛋白質的基因的有義引物；SEQ.ID.No.7和No.8是分別用于擴增LK68cDNA的有義引物和反義引物；SEQ.ID.No.9，連同SEQ.ID.No.8一起是用于擴增LK8 cDNA的有義引物；SEQ.ID.No.10是用于擴增LK68或LK8的DNA片段的有義引物；和SEQ.ID.No.11是用于擴增LK68或LK8的DNA片段的反義引物。
SEQ.ID.No.1-No.11存在于下面的序列表中。
本領域那些技術人員將理解在前面的說明中公開的概念和具體實施方案可以容易地用作修改或設計其它實施方案的基礎，所述其它實施方案用于實現本發明的相同目的。本領域那些技術人員還將理解這些等價的實施方案沒有背離如在后附的權利要求中提出的本發明的精神和范圍。
權利要求
1.一種用于基因治療的抗癌劑或抗轉移藥劑，其包含具有人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因載體或細胞作為有效成分。
2.按照權利要求1的藥劑，其中所述LK68基因包括由SEQ.ID.No.1所表示的核苷酸序列。
3.按照權利要求1的藥劑，其中具有所述LK68基因的基因載體是載體或重組病毒。
4.按照權利要求3的藥劑，其中所述載體選自由線性DNA載體，質粒DNA載體和重組病毒載體組成的組。
5.按照權利要求3的藥劑，其中所述重組病毒選自由逆轉錄病毒，腺病毒，腺病毒相關病毒，單純皰疹病毒和慢病毒組成的組。
6.按照權利要求1的藥劑，其中所述細胞選自由造血干細胞，樹突細胞，自體腫瘤細胞和建立的腫瘤細胞組成的組。
7.按照權利要求1的藥劑，其中所述基因載體選自由pSecTag-LK68，pLXSN-LK68，rAAV-LK68和pAAV-LK68組成的組。
8.按照權利要求1的藥劑，其中所述LK8基因包括由SEQ.ID.No.2表示的核苷酸序列。
9.按照權利要求1的藥劑，其中具有所述LK8基因的基因載體是載體或重組病毒。
10.按照權利要求9的藥劑，其中所述載體選自由線性DNA載體，質粒DNA載體和重組病毒載體組成的組。
11.按照權利要求9的藥劑，其中所述重組病毒選自由逆轉錄病毒，腺病毒，腺病毒相關病毒，單純皰疹病毒和慢病毒組成的組。
12.按照權利要求9的藥劑，其中所述基因載體選自由pSecTag-LK8，pLXSN-LK8，rAAV-LK8和pAAV-LK8組成的組。
13.按照權利要求3或權利要求9的藥劑，其中所述載體以0.05-500mg被包括在內。
14.按照權利要求3或權利要求9的藥劑，其中所述重組病毒以103-1012IU被包括在內。
15.按照權利要求1的藥劑，其中所述細胞以103-108e.a被包括在內。
16.按照權利要求1的藥劑，其中所述癌癥選自由下列組成的組結腸癌、肝癌、肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、前列腺癌、皮膚癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、腎癌、卵巢癌和轉移性腫瘤。
17.按照權利要求16的藥劑，其中所述癌癥選自由結腸癌、肝癌、淋巴瘤或轉移性腫瘤組成的組。
18.一種用于預防或治療實體腫瘤的方法，其包括向個體腸胃外施用權利要求1的用于基因治療的藥劑的步驟。
19.按照權利要求18的方法，其中對實體腫瘤的預防或治療通過抑制所述實體腫瘤的生長和轉移來實現。
20.按照權利要求18的方法，其中具有人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因載體的施用通過選自由化學方法、物理方法、使用脂質體綴合的方法、使用受體和病毒的方法等組成的組的方法來實現。
21.按照權利要求18的方法，其中所述施用的特征在于向患者注射細胞，所述細胞選自由下列組成的組以人載脂蛋白(a)三環KIV9-KIV10-KV(LK68)或KV(LK8)基因轉染的造血干細胞，樹突細胞，自體腫瘤細胞和建立的腫瘤細胞。
全文摘要
本發明涉及用于基因治療的抗癌劑或抗轉移藥劑，更精確地，涉及用于基因治療的抗癌劑或抗轉移藥劑，其包含具有人載脂蛋白(a)三環KIV9－KIV10－KV(LK68)或KV(LK8)基因的基因載體或細胞作為有效成分，以及使用所述抗癌劑或抗轉移藥劑用于癌癥的治療方法。用于本發明的基因治療的藥劑具有對于腫瘤的生長和轉移的抑制作用，因此其可以作為轉移抑制劑或原發腫瘤的治療劑而有效地用于預防和治療各種實體腫瘤。
文檔編號C07K14/775GK1946430SQ200580002174
公開日2007年4月11日 申請日期2005年1月10日 優先權日2004年1月9日
發明者李圭鉉, 柳賢京, 李好晶, 安珍衡, 金鏱性, 趙義哲, 尹燁, 樸斗鴻, 尹成泰 申請人:財團法人牧巖生命工學研究所