專利名稱：神經干細胞NSCs-NT3在修復神經元損傷中的應用的制作方法
技術領域：
本發明涉及神經干細胞NSCs-NT3在修復神經元損傷及帕金森疾病引起的神經 元損傷中的應用。
背景技術：
帕金森病(Parkinson disease ， PD)是由JameParkinson在1817年對該病的描述 而得名。PD是中老年人群中最常見的神經變性病之一，全球超過2%的65歲以上老年 人患有此種疾病，影響他們的晚年生活質量。因中樞神經系統神經遞質代謝異常所致。 PD的主要臨床表現是靜止性震顫、肌肉僵直、運動遲緩、平衡障礙。PD的主要病 理學特征是黑質紋狀體的多巴胺能神經元變性以及殘存的神經元中出現路易小體 (Lewy bodies ， LB)和路易神經索(Lewy neuritis , LN)。
神經營養因子NT-3(neurotrophin-3)與神經結構和功能密切相關的家族蛋白,調 控著神經元的發育、生長、分化和生存,對維持神經系統的正常功能承擔著重要作用， 也是內耳發育的最基本營養因子。神經營養因子不僅可以減少神經變性阻止疾病進程, 而且還具有刺激軸突生長、促進再生的功能。研究表明，對于阿爾茨海默病、帕金森 病(PD)、亨廷頓病、脊髓損傷和外周神經病變等，神經營養因子表現出能促進神經元 的修復、軸突生長和功能性恢復的作用。
發明內容
本發明的目的之一在于提供神經干細胞系NSCs-NT3在修復神經元損傷中的應用。
本發明的目的之二在于提供神經干細胞系NSCs-NT3在修復帕金森疾病引起的 神經元損傷中的應用。
神經干細胞是一類具有自我更新能力及多向分化潛能的細胞，其可通過對稱或不 對稱分裂產生新的干細胞或分化潛能逐漸減小的子代細胞,并可最終產生中樞神 經系統的三種細胞神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞。在發育中的胚胎神經系 統和成體腦特定區域都存在神經干細胞,其特性標志為一種中間絲狀蛋白巢素蛋白 (nestin)。本發明通過分子與細胞生物學方法建立神經干細胞系(NSCs-NT3)，將神經 干細胞NSCs-NT3移植入帕金森模型大鼠腦部，研究帕金森病(Parkinson's Disease, PD)的修復治療。最后，從大鼠行為水平觀察到神經干細胞(NSCs-NT3)對大鼠帕金森模型的修復。實驗表明神經干細胞NSCS-NT3對帕金森病引起的損傷具有修復作用。
圖1是神經干細胞(NSCs)轉染質粒pEGFP-Cl-NT3，即建立了神經干細胞 NSCs-NT3。
圖2是RT-PCR(A),Realtime PCR(C),Western Blot(B)對NT3基因表達的研究。從 mRNA和蛋白水平證明，神經干細胞NSCs-NT3中，NT3的表達上調。
圖3是NSCs和NSCs-NT3在體外培養7天后，免疫組化檢測其分化情況。從A， B 可以看出，在轉染了 NSCs-NT3中的神經元明顯比NSCs中多。紅色表示神經元標記 NF，綠色表示星型膠質細胞標記GFAP。和C相比，D中，大多數分化的神經干細胞表 現為多巴胺能神經元TH陽性。H, I， J是E, F, G的放大。
圖4是阿樸嗎啡誘導(0.5mg/kg)的帕金森大鼠移植后的旋轉分析。從圖中可以看 出，移植了 NSCs-NT3的帕金森大鼠，旋轉情況明顯好于NSCs組和Vehicle組。
具體實施例方式
本實施例的的神經干細胞(NSCs)，取自新生大鼠海馬區域體外培養。
實施例一帕金森病大鼠模型的建立
用10。/。的水合氯醛腹腔麻醉動物(40mg/kg)，頭部固定于立體定向儀上,齒棒在耳 中線下2.4mm。剪毛備皮,作頭部正中切口,暴露顱骨外板,根據包新民和舒斯云大鼠腦 立體定位圖譜，在右側前腦內側束(MFB)(定位AP: 4.4mm ，L P 1.2mm ,硬膜下7.8mm) 和中腦被蓋腹側區(VTA)(定位AP 4.8mm , L P l.Omm ,硬膜下7.8mm)上方牙科鉆 開顱,暴露硬腦膜后，將微量注射器裝在移動架上，向兩點各注入含0.02 %抗壞血酸的 6-OHDA8路/化l，注射速度為0.5^1/min ,留置空針10min后緩慢退出。對照組兩點 注入含0.02 %抗壞血酸的生理鹽水。用生理鹽水沖洗傷口，縫合皮膚，補液并于皮下 注射青霉素。待動物蘇醒后送至清潔級動物房飼養護理。
實施例二神經干細胞NSCs的分離與培養。
無菌條件下取1 3天新生大鼠，浸泡于75%酒精中，至大鼠昏迷；
① D-Hanks倒入平皿中。
② 大鑷固定鼠，剪刀剪開頭皮，剝下頭皮，用彎剪剪開頭骨(從頭部中線剪至嗅 球部)，用另一把鑷子向外側掀開兩邊顱骨，暴露出大小腦，小心將全腦取出， 放入另一盛有D-Hanks液的小平皿中。
(§)用尖刀和細鑷將腦切成兩半，挑去下皮層。④ 在解剖顯微鏡下，用細鑷和小鑷從服部內側向背部外側剝離腦膜，直至剝離 干凈(以見不到含有血管的腦膜為佳)。
⑤ 于背側表面正中矢狀位，用鑷子向外側小心掀開大腦皮層表面，即可在正中 矢位見"C"字型海馬，用鑷子夾住海馬，向邊緣組織分離，即可獲得整個 海馬。
◎將海馬剪成lmm3組織塊，機械吹散。
⑦ 離心1200rpm，4min。
⑧ 棄上清，加3ml培養液，吹散，靜置片刻(或過細胞篩)。
◎吸上面液體至培養瓶中，底部少許渾濁棄去，細胞的種植濃度為3X105 mL-l，放37。C、 5%(202的培養箱中培養。培養液組成為DMEM/F12 (1:1， V:V)， 1%青霉素和鏈霉素，1%的B27, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml bFGF。 ⑩培養5 7天，細胞成球，取一半細胞培養液，加上新鮮培養液傳代，或細胞 直接用于實驗。
實施例三神經干細胞系NSCs-NT3的構建，參見圖1和圖2。 利用脂質體Lipo2000介導轉染pEGFP-Cl-NT3進入NSCs，在體外培養建立神經 干細胞系NSCs-NT3，轉染后在熒光顯微鏡下觀察。pEGFP-Cl-NT3的構建方法請參 見(張露億、顧舒婷等，Ce//frara;3/a"f,2007;16(5):475-81.)
實施例四神經干細胞系NSCs-NT3體外分化，參見圖3。 將轉染后的神經干細胞，接種在用0.01% poly-D-lysine包被過的3cm小平皿上， 培養至少一周，直至分化；將種植在3cm小平皿上的分化的神經干細胞用PBS漂洗 三次；用固定液固定15min， 2次；吸除固定液，70%酒精洗脫2h;含0.1%Triton-100 的PBS洗3次，每次5min;用5。/。正常山羊血清封閉40min; PBS洗3次，每次 5min; 再力口入一抗(rabbit anti-NF， rabbit anti GFAP， mouse anti MAP2, and mouse anti TH monoclonal antibodies), 4攝氏度下孵育,過夜，次日PBS漂洗三次，每次5min， 除去未反應的非特異性吸附的抗體，減少背景染色。然后加入二抗(FITC-conjugated goat anti-mouse antibodies, FITC-conjugated goat anti-rabbit antibodies ， TRITC -conjugated goat anti-mouse antibodies and TRITC-conjugated goat anti-rabbit antibodies),室溫孵育lh，棄二抗，PBS漂洗三次每次5min;共聚焦顯微鏡下觀察， 拍照。
實施例五阿樸嗎啡誘導大鼠旋轉行為觀察，參見圖4。分別于細胞移植后，第2,4，6,8周進行Apomorphine (APO)誘導,觀察大鼠的旋轉 行為。方法:APO(0.5mg/kg)腹腔注射誘發旋轉行為。動物旋轉時以健側后肢為支點原 地旋轉,身體環曲,首尾相接360度為一轉(r);或沿轉盆周邊旋轉。注射10min后開始 計數，共記錄30min。結果請參見圖4，圖4表明NSC組大鼠旋轉數明顯小于Vehicle 組(P〈0. 01) ， NSC-NT3組的大鼠不僅旋轉數明顯小于Vehicle組(p〈0. 01)，并且旋轉說 也少于NSC組(p〈0. 05)。因此可以判斷出說明NSCs-NT3對帕金森損傷大鼠具有修復作 用。
權利要求
1. 神經干細胞系NSCs-NT3在修復神經元損傷中的應用。
2. 神經干細胞系NSCs-NT3在修復帕金森疾病引起的神經元損傷中的應用。
全文摘要
本發明通過將神經干細胞NSCs-NT3移植入帕金森模型大鼠腦部，研究帕金森病(Parkinson’s Disease，PD)的修復治療，從大鼠阿樸嗎啡(APO)旋轉行為實驗發現神經干細胞(NSCs-NT3)對帕金森損傷大鼠功能恢復具有積極意義。
文檔編號A61P25/16GK101278942SQ20081003772
公開日2008年10月8日 申請日期2008年5月20日 優先權日2008年5月20日
發明者遠 姚, 文鐵橋, 畢建清, 顧舒婷, 海 黃 申請人:上海大學