專利名稱：：全植入式人工角膜基質及其制備方法
技術領域：
：本發明屬生物醫學工程學領域，涉及一種新型的全植入式人工角膜基質(totallyimplantableartificialcornealstroma)及其制備方法。
背景技術：
：因角膜燒傷、角膜潰瘍、角膜白斑等角膜疾病而致盲的患者臨床上較多見。同種異體角膜移植手術是治療這些角膜盲患者主要而有效的方式。目前，我國角膜盲患者達到400萬之多，并且隨著激光手術的逐步開展和人口老齡化的不斷加劇，異體角膜來源日益匱乏，臨床上眼科醫生對供體角膜的需求越發迫切。實踐表明，以異體角膜為供體的高危角膜移植手術遠期預后不佳。眼表局部免疫微環境的破壞造成術后移植物排斥反應的高發是其主要原因。目前，組織工程技術已成功地應用于多種組織構建并修復缺損。因此，構建具有良好生物學活性且能滿足一定生理功能要求的的組織工程角膜具有重大的探索價值與臨床實際應用意義。近年來，技術日趨成熟的組織工程化人工角膜為本領域提供了一個新的思路。它是以可降解材料為支架，在體外進行細胞培養，讓細胞在材料表面及內部進行三維生長、分化成多層細胞，最后得到類似于供體角膜的"人工供體角膜"。角膜基質層是角膜構成的主要部分，占角膜厚度的90%。它主要由角膜基質細胞、膠原纖維和其他細胞外基質組成。正常情況下，角膜基質細胞處于靜止狀態，此外，角膜基質細胞間的膠原纖維成層平行排列，直徑一致，間距相等。角膜基質特征性的組織學結構是維持角膜透明的重要條件，是其他組織所不能替代的。應用組織工程技術構建角膜基質一方面可為角膜上皮、內皮細胞生長和組織形成過程中提供含有必要生長因子、信號的生理環境。另一方面，它還可作為組織工程角膜上皮、內皮的載體，克服體外培養的上皮組織、內皮組織質地松軟無法直接縫合固定、難以轉移的缺陷。因此，角膜基質組織的構建是組織工程技術構建角膜的主要任務、難點和關鍵所在。由于使用自體角膜基質細胞對個體健側角膜損傷較大，使用異體角膜基質細胞又存在排異反應發生的可能性。開辟新的種子細胞來源并將其用于構建角膜基質組織便成為急需解決的難題。近期國內外陸續報道了多種角膜組織外的細胞特別是某些成體干細胞可能參與了角膜基質的構成。2006年Yamagami等研究顯示，正常人角膜基質中存在骨髓來源細胞，盡管該研究并未明確骨髓來源細胞存在的意義，但至少說明了骨髓來源細胞參與了角膜基質的構成。隨著干細胞研究的發展，以自體成體干細胞為種子細胞構建組織工程角膜基質越來越凸現其優越性。成體干細胞(AdultStemCells,ASCs)是存在于成人機體骨髓、脂肪、皮膚等組織基質中的未分化細胞，來源可靠且具有向多種組織定向分化潛能，是目前種子細胞研究的熱點之一。骨髓基質干細胞(BoneMarrowMesenchymalStemCells,BMSCs)是存在于骨髓組織中的ASCs，具有多向分化潛能，體外擴增能力強。但BMSCs在骨髓組織中含量極少，成人骨髓平均10萬個有核細胞中含有1個BMSCs，而且隨著傳代次數增加或捐獻者年齡增加，BMSCs逐漸變大，自我更新的細胞減少，克隆形成率降低，細胞失去多向分化潛能，因此，也限制了BMSCs的應用。ADSCs(Adipose-DerivedStemCells)是存在于脂肪組織中的ASCs。因脂肪組織在人體分布廣泛，來源充足，且獲取自體脂肪組織對機體創傷較小，病人易于接受，是理想的種子細胞來源。自2001年以來，Zuk等報道經脂肪抽吸術獲得的抽吸物含有大量的ADSCs，并且能夠在特定的條件下向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞分化。而且隨年齡增長，細胞數目不減少，仍然保持多向分化的潛能。ADSC不但具有與骨髓基質干細胞相似的向成骨、軟骨、脂肪、肌肉和神經等細胞多分化的能力，而且表達與MSC相同的表面標志如CD29、CD105、CD106、及CD166等。目前國內外尚未見以脂肪干細胞為種子細胞用于構建人工角膜的報道。組織工程的核心是模擬機體正常組織，在體外建立細胞與生物支架復合體，并將其用于替代機體病變的組織或器官。由此可見，良好的細胞外基質替代物即支架材料也是構建組織工程化角膜基質的重要組成部分。合適的支架材料既能維持種子細胞的位置、形態，也能參與細胞分化狀態的調控。與此同時，種子細胞能夠在生物支架所形成的三維空間中能夠攝取營養，排泄廢物。總的來說，理想的組織工程角膜的支架材料應具備以下特點良好的生物相容性，避免對機體的毒性反應及誘發排斥反應；具有一定的堅韌性，既能滿足三維立體成形的需要，又能耐受體內回植時的機械力作用；支架材料的降解速率與機體正常細胞或者種子細胞合成細胞外基質的速率相匹配，盡量依靠新生組織修復病變組織或器官；有一定的透光性，特別是材料吸收后應盡量滿足機體對視力的要求。聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PGA)共聚物PLGA屬于人工合成可降解高分子材料，具有良好的生物相容性，在機體內沒有發現嚴重的機型組織反應和毒理反應，而且無抗原性。
發明內容本發明的目的是提供一種新型的全植入式人工角膜基質(totallyimplantableartificialcornealstroma)。本發明的全植入式人工角膜基質能應用于臨床替代機體病變的角膜組織。本發明的另一目的是提供上述人工角膜基質的制備方法。本發明全植入式人工角膜基質的技術方案是通過模擬機體正常角膜基質組織，在體外建立細胞與生物支架復合體，并將其用于替代機體病變的角膜組織。與此同時，借助可降解生物材料的自然降解特性，在該人工角膜基質修復組織缺損的同時逐步提高角膜透明度，最終使角膜透明，恢復患者視力。本發明全植入式人工角膜基質主要由種子細胞和合適的支架材料組成。所述的種子細胞采用脂肪干細胞，接種于支架材料，能夠在生物支架所形成的三維空間中能夠攝取營養，排泄廢物，所述的脂肪干細胞為自體離體脂肪干細胞，所述的細胞接種密度為35x106/0113優選4xl0"cm、所述的合適的支架材料采用聚乳酸聚羥基乙酸共聚物，其中聚乳酸與聚羥基乙酸的質量比為65~75:35~25，優選70比30，本支架材料既能維持種子細胞的位置、形態，也能參與細胞分化狀態的調控。本發明全植入式人工角膜基質采用具有良好生物相容性的離體自體脂肪干細胞與聚乳酸聚羥基乙酸共聚物復合物，避免了傳統人工角膜基質對機體的毒性反應及誘發排斥反應；該復合物具有一定的堅韌性，既能滿足三維立體成形的需要，又能耐受體內回植時的機械力作用；此外，該復合物的支架降解速率與機體正常細胞或者種子細胞合成細胞外基質的速率相匹配，能依靠新生組織修復病變組織或器官；經動物實驗結果證明，當該復合物植入體內隨著時間推移完全降解后，角膜可恢復透明，從而滿足機體對視力的要求。本發明的技術方案通過下述步驟實現1.制備支架材料首先將聚乳酸與聚羥基乙酸以一定配比溶于1,4二氧六環配置成10%的溶液，然后在溶液中加入一定比例、選定粒徑的NaCl顆粒，并在磁力攪拌機上攪拌制得均勻懸液，將懸液滴入表面皿，并流延成PLGA膜，自然干燥后將材料薄膜從表面皿中取出，用蒸餾水浸泡，最后取出材料薄膜，干燥后分別用PBS及培養基各浸泡以備用；本發明的支架材料，其中聚乳酸與聚羥基乙酸質量比為65~75比35~25，經動物體內回植實驗驗證，該支架材料具有較好的生物相容性及適宜的體內降解速度。2.選擇接種離體自體脂肪干細胞濃度將ADSCs按不同細胞濃度分別接種于支架材料上制得細胞材料復合物，各5塊;于培養箱中放置一定時間后，消化收集細胞，計數儀計數，得出流失的細胞量；細胞材料復合物培養24小時后，將細胞材料復合物于培養液中晃動，并換入另一培養皿培養，收集培養皿培養液并消化收集貼壁的細胞，將原培養液中細胞一并計數，得出未粘附的細胞數；細胞粘附率=(接種的細胞數一流失的細胞數一未粘附的細胞數)/(接種的細胞數一流失的細胞數)。實驗結果表明，35><106/0113范圍內的細胞接種密度具有較高的材料黏附率及細胞粘附量。3.制備全植入式人工角膜基質用無血清的DMEM調整細胞濃度至1xi06/ml，每毫升細胞懸液加5微升的DiO試劑，混合均勻，放入培養箱孵育，去上清，重復洗兩次后把標記好的細胞按4xl06/cmS接種在PLGA材料上，于培養箱中培養l周后備用。4.全植入式人工角膜基質使用實驗將體外構建的兔自體脂肪干細胞與PLGA材料組織工程化復合物回植到的兔角膜基質取健康純種新西蘭大白兔，肌內注射氯胺酮及地西泮麻醉后，在環轉輔助下制作角膜上皮基質瓣，約1/2角膜厚度，然后在暴露的植床上切除一定直徑角膜基質，再將上述兔自體脂肪干細胞與PLGA角膜基質組織工程化復合物放置到角膜板層間，最后用10-0的尼龍線間段縫合，術畢予0.3%妥布霉素/0.1%地塞米松滴眼液局部使用3周。結果顯示，上述人工角膜基質植入體內后隨著時間推移可完全降解，角膜也逐步恢復透明，能更好地修復角膜基質缺損，滿足機體對視力的要求。本發明人工角膜基質的優勢在于1、傳統的人工角膜基質是使用角膜基質細胞作為種子細胞，由于這種細胞若來源于自體角膜基質細胞對個體健側角膜損傷較大；若來源于異體角膜基質細胞則存在排異反應發生的可能性;本發明人工角膜基質采用脂肪干細胞作為種子細胞脂肪組織在人體分布廣泛，來源充足，且獲取自體脂肪組織對機體創傷較小，患者易于接受，是理想的種子細胞來源；研究證實脂肪干細胞能夠在特定的條件下向成骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞分化；脂肪組織隨年齡增長，細胞數目不減少，仍然保持多向分化的潛能。2、傳統的角膜基質支架包括從動物中提取的膠原及明膠，作為支架材料，它們一方面在體內受膠原酶的作用極易降解，另外容易誘發角膜排斥反應，并且與角膜上皮細胞相容性不甚理想且穩定性差，不適用于移植手術。本發明人工角膜基質中的特定質量比的聚乳酸及聚羥基乙酸的共聚物可按要求加工成各種結構形狀，同時它們具有良好的生物相容性且降解產物無毒。3、本發明方法構建的人工角膜基質，使用時僅需先切除病變角膜基質，然后再將該復合物回植，手術易于掌握，術后常規抗炎處理，護理方便。圖l原代rADSC培養72h，倒置顯微鏡X40。圖2rADSC培養96h，倒置顯微鏡X40。圖3PLGA材料大體觀。圖4PLGA材料電鏡掃描圖。圖5熒光倒置顯微鏡觀察DiO標記ADSCs在材料中的粘附生長情況，其中，A，細胞材料復合物體外培養1天，X100;B，細胞材料復合物體外培養1天，X200;C，細胞材料復合物體外培養7天，X100;D，細胞材料復合物體外培養7天，X200。圖6掃描電鏡觀察細胞材料復合物，其中，A圖示rADSCs在材料表面生長良好，可見細胞分布均勻，X50，B圖示細胞形態呈纖維樣，透過細胞間隙可見下方PLGA纖維，X300。圖7雙光子顯微鏡觀察細胞材料復合物，其中，A，細胞材料復合物示意圖；B，雙光子顯微鏡選取30um斷層掃描成像，可見細胞分布均勻；C，單純細胞掃描成像；D,單純材料掃描成像；E,細胞材料復合物共顯像。圖8裂隙燈觀察角膜基質修復情況。圖9HE染色觀察角膜基質修復器概況。圖10活體共聚焦角膜顯微鏡動態觀察角膜，標尺為50um。圖11免疫組織化學檢查波形蛋白及平滑肌肌動蛋白表達XIOO。圖12透射電鏡觀察角膜基質纖維排列方向及大小，其中，A為正常角膜基質，B為復合物組。具體實施例方式實施例1全植入式人工角膜基質的體外制備及檢測1、實驗儀器及試劑6月齡雌性新西蘭大白兔，體重22.5kg(上海市中國科學研動物研究中心)。DMEM(Dulbeco，smodifiedeagle'smedium)粉劑為美國GIBCO公司產品；I型膠原酶為美國Worthington公司產品；胎牛血清(FetalBovineSerum，FBS)為美國Hyclone公司產品；地塞米松及轉鐵蛋白為美國Sigma公司產品；L-谷氨酰胺、抗壞血酸及胰蛋白酶為上海實生生物技術有限公司產品；青霉素及鏈霉素為華北制藥有限公司產品；NaHC03為上海虹光化工廠產品。LSM-510雙光子顯微鏡購自德國Zeiss公司。JSM-6701F掃描電鏡購自日本Jeo公司。2、兔脂肪干細胞的原代培養及傳代按lmg/kg氯胺酮聯合0.5mg/kg安定肌注麻醉。取實驗動物兔皮下脂肪組織約23g，將脂肪組織在無菌條件下裝入含5%FBS的10mlDMEM培養液50ml離心管中；用鏈霉素溶液及PBS;反復沖洗兔脂肪組織；將脂肪組織置培養皿中，剪碎；剪碎的脂肪組織置于50ml離心管中，加入0.075%I型膠原酶溶液40ml，在37。C恒溫消化30min，1500rpm離心10min，去上清，獲得高密度的細胞沉淀物，加入DMEM培養液+10y。FBS培養液使細胞重懸；按10"ml細胞濃度接種于培養皿，加入培養液至8ml;置37'C、5%C02、100%飽和濕度的條件下，培養4872小時后首次換液；倒置相差顯微鏡下觀察有大量細胞貼壁和漂浮的血細胞，用PBS反復沖洗去除漂浮的細胞，加入DMEM+10%FBS培養液；隔天換液，細胞融合至80%傳代；傳代前用PBS洗滌，加入0.25。/。胰蛋白酶和0.02y。EDTA2ml，觀察大部分細胞胞質回縮、形態變圓，加入2ml含血清的DMEM培養液中止消化，收集細胞懸液、計數，以0.5x106/cm2細胞濃度接種于新的培養皿內；34天后細胞達近融合狀態，再次進行傳代；倒置顯微鏡觀察細胞形態，拍照。3、制備PLGA支架材料，首先將PLGA材料(LA/GA-70/30，Mw=104900)溶于1,4二氧六環配置成10%(質量體積比)的溶液，然后在溶液中加入一定比例、選定粒徑的NaCl顆粒，磁力攪拌制得均勻懸液，將懸液滴入表面皿，并流延成厚度為20um的PLGA膜；自然干燥48h,真空干燥24h后，從表面皿中取出制得的材料薄膜，蒸餾水浸泡48h，每隔8h時更換蒸餾水；取出材料薄膜，干燥后分別用PBS及培養基各浸泡ld，備用。4、脂肪干細胞接種于PLGA材料，將步驟l制得的細胞按4xlO"cmS接種于5mmx5mmxlmm的PLGA材料上；倒置熒光顯微鏡觀察細胞形態，拍照。5、結果顯示(1)ADSCs接種于培養皿6h后開始貼壁，24h48h內細胞生長緩慢；72h后，有細胞克隆形成，細胞伸展呈成纖維細胞樣，生長有方向性(圖l);Pl代細胞后可觀察細胞仍為成纖維細胞樣(圖2)。(2)PLGA支架材料大體觀察，材料厚lmm(圖3);掃描電鏡檢查提示PLGA材料均勻鋪開并形成多孔狀的空隙(圖4)。(3)DiO標記的ADSCs與PLGA材料復合物在激光共聚焦顯微鏡下觀察，體外培養1天后可見綠色熒光的細胞均勻粘附于PLGA材料上(圖5A);細胞形態呈纖維樣或卵圓狀(圖5B);細胞材料復合物共培養至第7天時細胞量明顯比第1天時增多，大部分區域細胞融合成片，可見明顯綠色熒光(圖5C);細胞形態以卵圓狀為主(圖5D)。(4)細胞材料復合物培養1周后，細胞與材料粘附良好，細胞分泌基質較旺盛，與PLGA纖維連成一體(圖6)。(5)雙光子顯微鏡的斷層掃描，可見細胞材料復合物的某一斷層，并進行三維成像;培養1周后可見細胞均勻黏附于材料內部，細胞形態以成纖維樣為主(圖7)。實施例2全植入式人工角膜基質的體內(動物)實驗1、實驗儀器6月齡雌性新西蘭大白兔，體重22.5kg(上海市中國科學研動物研究中心)。DMEM(Dulbeco'smodifiedeagle'smedium)粉劑為美國GIBCO公司產品；I型膠原酶為美國Worthington公司產品；胎牛血清(FetalBovineSerum,FBS)為美國Hyclone公司產品；地塞米松及轉鐵蛋白為美國Sigma公司產品；L-谷氨酰胺、抗壞血酸及胰蛋白酶為上海實生生物技術有限公司產品；青霉素及鏈霉素為華北制藥有限公司產品；NaHC03為上海虹光化工廠產品；波形蛋白單克隆抗體購自美國LabVision公司；平滑肌蛋白單克隆抗體購自美國LabVision公司；0.3%妥布霉素/0.1%地塞米松滴眼液購自美國Alcon公司；0.4%倍諾喜購自日本參天制藥公司。LSM-510雙光子顯微鏡購自德國Zeiss公司。JSM-6701F掃描電鏡購自日本Jeo公司。常用醫用材料與器械均為市購。2、脂肪干細胞與PLGA復合物體內移植實驗將體外構建的實驗兔自體脂肪干細胞與PLGA材料組織工程化復合物回植到的兔角膜基質取健康純種新西蘭大白兔，肌內注射15mg/kg的氯胺酮及4mg/kg的地西泮麻醉后，在環轉輔助下制作直徑為8mm的角膜上皮基質瓣，約1/2角膜厚度，在暴露的植床上切除直徑為6.5mm的角膜基質，再將直徑為7mm的上述離體的兔自體脂肪干細胞與PLGA角膜基質組織工程化復合物放置到角膜板層間，最后用10-0的尼龍線間段縫合；術畢予0.3%妥布霉素/0.1%地塞米松滴眼液局部使用3周。手術后l周內每天裂隙燈顯微鏡檢查，在3，6及9周時裂隙燈拍照。3、結果顯示(1)移植手術后，細胞與材料復合物組及單純材料組占據角膜中央，呈不透明白色，第3周開始，材料降解加速，中央角膜組織逐漸恢復透明，第6周時，可見材料降解明顯，但仍有少量材料殘留，故表現為角膜云翳，第9周時，角膜中央基本透明(圖8)。(2)移植手術后9周角膜HE染色切片(圖9)顯示，復合物組新生組織中基質細胞形態較為規則，細胞相對周圍正常角膜基質較大；移植區內新生膠原排列較為規則，與相鄰膠原間連接緊密，二者之間未見明顯的分界線(圖10A)，正常角膜基質(圖10B)為接近，表現為膠原纖維束排列規則、整齊，角膜基質細胞分布均勻；測定石蠟切片角膜厚度，復合物組為(231.0±2.9)mm，正常角膜基質膠原纖維直徑為(29.2士2.9)nm;經秩和檢驗法統計分析，Zc。mplexes=0.286，P-0.775,二者無統計學差異。(3)活體共聚焦角膜顯微鏡動態觀察各實驗組角膜正常的表層上皮細胞有明亮的、中等亮度和暗的三種表現，表皮細胞排列疏松，呈多角形，以六邊形為主，明亮的細胞核可見或不可見；實驗組的上皮層未有明顯異常(圖10A)，基質層中可見在相對暗的背景下明亮的角膜細胞核，被背景物質分隔開，不能觀察到胞漿、細胞邊界和膠原層，修復區附近可見明顯神經纖維生長(圖IIB箭頭所示)；各實驗組內皮層均表現為規則的六邊型鑲嵌體，細胞邊界呈黑色，胞體明亮，未見細胞核(圖IIC)。(4)免疫組織化學檢測Vimentin及SmoothMuscleActin蛋白表達作為纖維母細胞標記的Vimentin以及纖維母細胞活化遷移標記的Smoothmuscleactin在各組角膜基質中均表達陰性(圖ll)，提示角膜基質修復良好。(5)在膠原纖維排列方面，各實驗組角膜膠原排列紊亂，與排列整齊、規則的正常角膜膠原束有明顯不同(圖12);在膠原纖維直徑方面，正常角膜基質膠原纖維直徑為29.2士2.9nm(圖12.A);復合物組為28.5士2.9nm(圖12.B)，實驗組膠原纖維直徑與正常角膜基質比較的統計值分別為Ztc。mplexe々1.725，P=0.086>0.05，實驗組膠原纖維直徑大小與正常角膜基質之間無統計學差異，證實了復合物修復角膜基質缺損后角膜之所以透明的原因。權利要求1、全植入式人工角膜基質，其特征是由種子細胞和支架材料組成，所述的種子細胞接種于所述的支架材料，所述的種子細胞選自自體離體脂肪干細胞，細胞接種密度為3～5×106/cm3；所述的支架材料采用聚乳酸聚羥基乙酸共聚物，其中聚乳酸與聚羥基乙酸的質量比為65～75∶35～25。2、按權利要求1所述的全植入式人工角膜基質，其特征是所述的種子細胞接種密度為4xl06/cm3;所述的支架材料，其中聚乳酸與聚羥基乙酸的質量比為70比30。3、按權利要求1所述的全植入式人工角膜基質的制備方法，其特征是包括下述步驟(l)制備支架材料將聚乳酸與聚羥基乙酸按質量比溶于1，4二氧六環配成的10%溶液;在溶液中加NaCl顆粒攪拌制得均勻懸液，將懸液滴入表面皿，并流延成PLGA膜；干燥后蒸餾水浸泡，再干燥后，分別用PBS及培養基浸泡、備用；(2)選擇接種細胞濃度將不同濃度的離體脂肪干細胞分別接種于支架材料上，培養箱中放置、消化收集細胞，得流失細胞量；培養24小時后，將細胞材料復合物于培養液中晃動并換培養皿培養，收集培養液并消化收集貼壁的細胞，將原培養液中細胞一并計數，得未粘附的細胞數和細胞粘附率；(3)制備全植入式人工角膜基質用無血清的DMEM調整細胞濃度至1xio6/ml，細胞懸液加DiO試劑混合，放入培養箱孵育，去上清，重復洗滌后，將標記的細胞按35xl(^/cr^接種在支架材料上，培養l周后備用。4、按權利要求3的方法，其特征是所述的步驟l的聚乳酸與聚羥基乙酸質量比為65~75比35~25。5、按權利要求3的方法，其特征是所述的步驟2的細胞粘附率=(接種的細胞數一流失的細胞數一未粘附的細胞數)/(接種的細胞數一流失的細胞數)。6、按權利要求3的方法，其特征是所述的步驟2的細胞接種密度為35xl0"cm3。全文摘要本發明屬生物醫學工程學領域，涉及一種新型的全植入式人工角膜基質及其制備方法。本發明的人工角膜基質由自體離體脂肪干細胞為種子細胞，接種于聚乳酸聚羥基乙酸共聚物支架材料。所述的種子細胞能在生物支架所形成的三維空間中能夠攝取營養，排泄廢物，合適的支架材料既能維持種子細胞的位置、形態，也能參與細胞分化狀態的調控。經動物實驗證明，本角膜基質具有良好生物相容性，避免了傳統人工角膜基質對機體的毒性反應及誘發排斥反應，植入后隨著時間推移完全降解后，角膜可恢復透明，能滿足機體對視力的要求。文檔編號A61F2/14GK101584883SQ20081003762公開日2009年11月25日申請日期2008年5月19日優先權日2008年5月19日發明者徐建江,洪佳旭申請人:復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院