專利名稱：：載辛伐他汀緩釋微球體系的制備方法
技術領域：
：本發明屬于生物
技術領域：
，具體涉及一種采用乳化-干燥法將功能藥物包封入生物可降解性聚合物材料中形成納微米微球體系的方法。
背景技術：
：辛伐他汀是羥甲基戊二酸單酰輔酶A還原酶的抑制劑，是目前臨床用于降低膽固醇、預防心血管疾病的常用藥物。Mundy等首次報道他汀類藥物能誘導成骨細胞和骨髓細胞中的骨形成蛋白2(Bonemorphologicalprotein2，BMP-2)基因的表達，說明其具有促進成骨作用。本研究組以拔除下頜中切牙的大鼠為評價剩余牙槽嵴吸收的動物模型，制備了以聚乳酸-羥基乙酸為載體的載辛伐他汀支架材料并應用于該模型，探討辛伐他汀預防剩余牙槽嵴吸收的可行性及其作用機制。發現該支架材料有較強的骨修復作用，成骨速度和骨量均優于對照組；進一步研究發現該支架材料還通過促進局部組織轉化生長因子卩1(translationgrowthfactor,TGF-(31)、BMP2和血管內皮生長因子(vascular印ithelialgrowthfactor,VEGF)的表達而發揮促進成骨作用；而且，辛伐他汀還可促進大鼠骨髓基質細胞來源的成骨細胞的osterix、OPG和PC-1mRNA的表達從而促進成骨細胞的分化和功能。辛伐他汀口服給藥經過肝臟首過代謝后，其生物利用度僅為2.4%，骨組織的吸收會更少，遠遠達不到骨形成部位所需要的劑量；而大量應用辛伐他汀卻會導致肌毒性及其它毒、副作用，增加患者的痛苦和經濟負擔，因此，不能滿足實驗和臨床應用的要求。本研究組制備的載辛伐他汀支架材料可部分地提高辛伐他汀的生物利用度，降低毒副作用，但該載辛伐他汀支架材料的緩釋效果不是很理想，臨床操作不很方便，需要進一步改進劑型。研究既能長期釋放辛伐他汀又能保持其生物活性的緩釋制劑具有重要意義。其中，微球緩釋體系已開始應用于組織工程支架，并取得了一定的促進細胞生長、增殖及組織修復效果，但尚未有關于辛伐他汀緩釋微球制劑研究的報道。生物可降解的聚合物載體材料可分為天然、半合成和合成高分子材料。近年來，合成高分子材料因其生物相容性良好，可生物降解吸收，在體內較穩定，降解期可調控等優點而受到廣泛重視，是一種理想的微球制備材料。納米緩釋系統直徑在1nm100nm之間，藥物和DNA等包裹于微球內部，或者通過靜電結合吸附、附著作用位于粒子表面，通過囊壁瀝濾、滲透和擴散釋放，也可以是膠囊和微球本身的溶蝕使其中的藥物釋放。聚合物載體、支架系統已經應用于骨、皮膚、神經再生，在組織工程中應用廣泛。發明內容本發明的目的在于提供一種以生物可降解聚合物材料為基質，制備載辛伐他汀緩釋微球體系的方法。該方法工藝簡單、操作方便；所制備的微球體系可再加工成多種劑型，應用于骨組織吸收或骨缺損部位；辛伐他汀經緩釋釋放，充分發揮其促進成骨的積極作用而避免其毒副作用，提高生物利用度；辛伐他汀負載量及釋放速率調節范圍寬、釋放穩定。載辛伐他汀緩釋微球體系的制備按如下步驟進行1)將生物可降解聚合物材料與辛伐他汀按質量比為3~10:1共同溶解于生物無毒的有機溶劑中，形成均勻的分散液1~10毫升，溶液中辛伐他汀的濃度范圍是0.001~0.01克/毫升；2)向10~50毫升、質量濃度為1~2%的聚乙烯醇(PVA)或十二垸基苯磺酸鈉的生物無毒乳液穩定劑的水溶液中加入2~5%體積比的乳化劑吐溫80和0.1~5.5克生物無毒的電解質，300~1000rpm電動攪拌，持續1030分鐘；3)將步驟1)獲得的液體緩慢加入到步驟2)獲得的液體中，300~1000rpm，連續攪拌13小時；4)然后于35~45°。減壓蒸發1~3小時，以充分去除微球中的有機溶劑；5)最后于15000~20000rpm離心5~10分鐘、水洗、真空干燥40~60小時，即得載辛伐他汀緩釋微球體系。本發明所用的生物可降解聚合物材料包括聚乳酸(PLA)、聚羥基乙酸(PLGA)、聚乳酸-羥基乙酸共聚物；聚乳酸-羥基乙酸共聚物的比例為75/25或50/50;所用的有機溶劑為二氯甲烷、乙酸乙酯或二者的混合物；采用的生物無毒的電解質為氯化鈉、氯化鉀或硫酸鈉。本發明提供的方法與現有技術相比具有以下優點及突出性效果制備載辛伐他汀緩釋微球體系的方法工藝簡單、操作方便，不要求藥物在水中有很大的溶解度；不要求原料藥物粉末的粒徑很小；微球表面光滑圓整，顆粒規則無粘連，粒徑可控，載藥量(1~10%)和包封率(可達40%以上)可控，緩釋期達2個月以上，其突釋率較低；所制備的微球體系可再加工成多種劑型，應用于骨組織吸收或骨缺損部位；辛伐他汀經緩釋釋放，充分發揮其促進成骨的積極作用而避免毒乳。嚴格控制奶中對人體有害的物質，如硝酸鹽、農藥殘留、抗生素等。原料乳預處理牛乳經過紗布或者雙聯過濾器粗濾，除去較大的異物、雜質；經過離心凈乳，除去細小的污物、脫落的乳房上皮組織、白細胞等，達到高度凈乳，提高產品質量。為了獲得穩定組成組分的成品，必須進行標準化，達到乳脂肪與非脂乳固體之間等指標的平衡。貯存溫度為4'C左右。配料將預處理的牛奶泵入混料罐。如果使用復原乳，將全脂奶粉、脫脂奶粉或者稀奶油(或奶油)復水混合(45°C),泵入混料罐。在45。C加水與乳清濃縮蛋白、糖、酪蛋白磷酸肽、乳鐵蛋白、膽石威、肌醇混合復原均勻后，加入混料罐。植物油與脂溶性維生素、DHA、ARA、乳化劑混合再于45。C以上的奶油混合，加入混料罐。F0S、GOS與水混合，添加水溶性維生素，攪拌混合均勻后，加入混料罐。礦物質與水混合后，加入混料罐。牛磺酸、核苷酸與水混合后加入混料罐。攪拌、混勻、定容物料加入混料罐后，攪拌5-2Gmin,并補充水分，定容。預熱和均質預熱預熱溫度為65-90'C。均質均質壓力總壓力為18-25Mpa,—級壓力為10-20Mpa，二級壓力為8-10Mpa。UHT滅菌滅菌溫度為137-142°C,殺菌時間為2-4秒。UHT滅菌可以采用下面通過幾個典型實施例進一步說明本發明的載辛伐他汀緩釋微球體系的制備方法及其特點。1、可降解聚合物材料空白微球的制備實施例1:將0.09克聚乳酸(分子量0.2萬)溶解于3ml二氯甲烷中，使成均勻混合液，緩慢加入到以700rpm速度攪拌的30ml、質量濃度1.5°/。的PVA的水溶液(含0.6毫升的Tween80)中，繼續攪拌1.5小時，37'C減壓旋轉蒸發1小時，除凈有機溶劑，18000rpm離心，去離子水洗3次，真空干燥48小時，得到聚乳酸空白微球粉末約0.078克，微球平均粒徑為2100nm。按上述步驟應用其他分子量的聚乳酸及其它生物降解聚合物材料獲得的不同粒徑的微球，平均粒徑范圍從358nm到2100nm，結果見表1，可滿足制備不同降解速率載藥微球的需要。表1:生物降解聚合物材料空白微球的制備序號PVA水溶液(ml)二氯甲垸(ml)聚合物、分子量聚合物量(g)微球平均粒徑(nm)空白微球的質量g1303PLA，0.2w0.0921000.0782303PLA，1.0w0.0914650.073303PLA，2.0w0.098170,084303PLGA7525，1w0.217680.25303PLGA7525,2w0.212580.36303PLGA5050,1w0.28690.37303PLGA5050，2w0.23580.22、載辛伐他汀聚合物微球體系的制備實施例2:(1)將質量比為5:1的PLA(0.05克，分子量1.0w)與辛伐他汀(0.01克)的混合物溶解于3毫升二氯甲烷中，使成均勻混合液；(2)將上述混合液緩慢加入到攪拌(700rpm)中的30ml、質量濃度1.5%的PVA水溶液(含0.6毫升Tween80，0.3克氯化鈉，700rpm攪拌15分鐘后使用)中，繼續攪拌1.5小時；(3)37。C減壓旋轉蒸發1小時，除凈有機溶劑；18000rpm離心10分鐘，水洗，真空干燥48小時，獲得載辛伐他汀微球粉末約0.06克，微球平均粒徑為102nm，包封率為20.89%。取干燥的載辛伐他汀微球粉末0.03g，加入1毫升乙腈和2毫升、0.1M磷酸鹽緩沖液，24小時后，紫外分光光度儀檢測、分析，以確定辛伐他汀是否包入微球及計算載藥量(微球所載辛伐他汀與微球的質量比)、包封率(實際載藥量與理論載藥量的比值)。按照上述操作步驟，改變聚合物的種類及其與辛伐他汀的比例分別制備不同包封率及粒徑的載藥微球。表2:載辛伐他汀生物降解聚合物微球的制備<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例3:將質量比為5:1的PLGA7525(0.05克，分子量2w)與辛伐他汀(0.01克)的混合物溶解于3毫升二氯甲垸中，使成均勻混合液，將該液緩慢加入到攪拌(700rpm)中的30毫升、質量濃度1%的PVA水溶液(含0.6毫升Tween80，氯化鈉0.3克，700rpm攪拌15分鐘后使用)中，繼續攪拌1.5小時，37t:減壓、旋轉蒸發1小時，除凈有機溶劑；化000rpm離心10分鐘，水洗，真空干燥48小時，獲得載辛伐他汀微球粉末0.062克，平均粒徑為1400nm，包封率為35.27%。改變攪拌速度，其他條件不變的情況下，制備微球，以探討攪拌速度對制備微球的影響。經系列實驗發現，所形成的微球平均粒徑與攪拌速度呈負相關關系。2、制備過程(1)稱取處方量的原、輔料，將阿奇霉素、蔗糖、甘露醇分別粉碎、過ioo目篩，淀粉過120目篩，得到原、輔料粉末；(2)將上步所得的原輔料粉末置于混合機內密封干混10分鐘，加入95%乙醇，濕混80秒制軟材，制粒，得到濕顆粒；(3)將上步所制得的濕顆粒在65'C的條件下干燥40分鐘，水分含量為3.5%，然后得到干顆粒；(4)將干顆粒和椰子香精加入整粒機整粒，過18目篩，檢驗合格后根據含量確定裝量進行包裝即得本發明的混懸顆粒。以下通過實驗例和比較例來說明本發明產品阿奇霉素混懸顆粒的有益效果。[試驗例1]阿奇霉素混懸顆粒的溶解性和分散性測試根據中國藥典2005年版二部附錄IXE第二法(雙篩分法)的要求，一號篩上物和五號篩下物的總和不得超過供試量的15%，上述顆粒劑樣品檢查結果均符合藥典規定，從而可充分保證顆粒劑粒徑的均一性，不使顆粒因受潮結塊或在運輸和貯存中粉碎而影響質量。取上述顆粒劑樣品10g，加熱水200ml，攪拌5min，觀察本品溶化性，檢査結果表明樣品全部溶化，未見異物。符合中國藥典2005年版二部附錄IN規定。上述制備的可溶性阿奇霉素混懸顆粒能夠完全分散或溶解在水中，從而可保證顆粒劑的生物利用度，方便患者服用。[試驗例2]本發明阿奇霉素混懸顆粒劑穩定性考察根據中國藥典2000年版二部關于藥物穩定性試驗指導原則的規定，對本發明實施例1和按照200510061861.1的方法所制備的阿奇霉素混懸顆粒在溫度、濕度影響下，隨時間變化的規律進行考察，從而對其穩定性進行了比較。一、加速試驗取本發明實施例1和按照200510061861.1的方法所制備的阿奇霉素混懸顆粒，按市售包裝，在溫度4(TC土2。C，相對濕度75%±5%的條件下放置6個月。在試驗期間第O個月、第1個月、2個月、3個月、6個月末各取樣一次，按穩定性重點考察項目進行檢測。檢測結果見表l。權利要求1、載辛伐他汀緩釋微球體系的制備方法，其步驟如下1)將生物可降解聚合物材料與辛伐他汀按質量比為3～10∶1共同溶解于生物無毒的有機溶劑中，形成均勻的分散溶液1～10毫升，溶液中辛伐他汀的濃度范圍是0.001～0.01克/毫升；2)向10～50毫升、質量濃度為1～2％的聚乙烯醇或十二烷基苯磺酸鈉的生物無毒乳液穩定劑的水溶液中加入2～5％體積比的乳化劑吐溫80和0.1～5.5克生物無毒的電解質，300～1000rpm電動攪拌，持續10～30分鐘；3)將步驟1)獲得的液體緩慢加入到步驟2)獲得的液體中，300～1000rpm，連續攪拌1～3小時；4)然后于35～45℃減壓蒸發1～3小時，以充分去除微球中的有機溶劑；5)最后于15000～20000rpm離心5～10分鐘、水洗、真空干燥40～60小時，即得載辛伐他汀緩釋微球體系。2、如權利要求1所述的載辛伐他汀緩釋微球體系的制備方法，其特征在于生物可降解聚合物材料為聚乳酸、聚羥基乙酸或聚乳酸-羥基乙酸共聚物。3、如權利要求1所述的載辛伐他汀緩釋微球體系的制備方法，其特征在于聚乳酸-羥基乙酸共聚物的比例為75/25或50/50。4、如權利要求1所述的載辛伐他汀緩釋微球體系的制備方法，其特征在于生物無毒的有機溶劑為二氯甲垸、乙酸乙酯或二者的混合物。5、如權利要求1所述的載辛伐他汀緩釋微球體系的制備方法，其特征在于生物無毒的電解質為氯化鈉、氯化鉀或硫酸鈉。全文摘要本發明涉及一種將功能藥物包封入生物可降解性聚合物材料中形成納微米微球體系的方法，其是將聚合物材料與辛伐他汀共同溶解于有機溶劑中，形成均勻的分散液；再將該分散液加入到含有乳化劑吐溫80和生物無毒電解質的聚乙烯醇或十二烷基苯磺酸鈉的水溶液中，攪拌后減壓蒸發，最后離心、水洗、真空干燥，即得載辛伐他汀緩釋微球體系。微球表面光滑圓整，顆粒規則無粘連，粒徑可控，載藥量(1～10％)和包封率(可達40％以上)可控，緩釋期達2個月以上。所制備的微球體系可再加工成多種劑型，應用于骨組織吸收或骨缺損部位，微球體系適速降解，辛伐他汀可得到進一步的釋放，聚合物降解可為骨組織提供后續修復空間，最終完成骨組織缺損的修復。文檔編號A61K9/16GK101219119SQ20081005030公開日2008年7月16日申請日期2008年1月25日優先權日2008年1月25日發明者孫宏晨,李祥偉,柏楊,權林申請人:吉林大學