Ard1的單克隆抗體及其應用的制作方法

專利名稱：：Ard1的單克隆抗體及其應用的制作方法
技術領域：
：本發明涉及免疫學領域，具體地涉及針對ARD1的單克隆抗體及其制備方法、分泌該抗體的雜交瘤細胞系、所述單克隆抗體或其生物活性片段的應用。本發明還涉及利用所述單克隆抗體檢測樣品ARD1水平的試劑盒以及抗腫瘤藥物。
背景技術：
：惡性腫瘤的發病率近年來在全球范圍內繼續呈上升之勢。由于惡性腫瘤的發病大多較為隱匿，早期沒有明顯癥狀，病人就診時往往已經到了晚期，并且許多在臨床傳統病理及TNM分期表現相近的病人，其預后也差異很大，反映出惡性腫瘤發生、發展的復雜性。目前尚缺乏能用于診斷或預后判斷的理想腫瘤標志物。如幾十年來作為消化道腫瘤的標志物CEA,在一些非腫瘤性疾病如胃炎、肝硬化、潰瘍性結腸炎中也可有升高，其特異性并不理想。因此，尋找與惡性腫瘤發生、發展相關的腫瘤標志物和(或)腫瘤抗原，對惡性腫瘤的臨床診斷、監視病情發展及判斷預后均有重要意義，同時對腫瘤發生的分子機制也有重要意義。蛋白質乙酰化和去乙酰化是細胞內重要的轉錄后修飾過程，這一過程調節細胞凋亡、細胞周期和腫瘤形成(FuM,WangC,WangJ，ZafonteBT,LisantiMP,PestellRG.Acetylationinhormonesignalingandthecellcycle.CytokineGrowthFactorRev2002;13:259-76)。蛋白氨基乙酰化作為一種重要的修飾過程影響著多種生物學行為。蛋白去乙酰酶抑制劑可提高組蛋白的乙酰化水平，初步臨床研究提示這類抑制劑有望成為潛在的抗腫瘤藥物。Arrestdefective1protein(阻滯缺陷蛋白1，Ard1p)最初是在酵母中發現的，它參與酵母細胞的細胞周期、生長、孢子形成等過程(WhitewayM，SzostakJW.TheARD1geneofyeastfunctionsintheswitchbetweenthemitoticcellcycleandalternativedevelopmentalpathways.CelM985;43:483-92.)。酵母Ard1p在人類的同源物稱為ARD1(阻滯缺陷蛋白1，Arrestdefectiveprotein1)，它可與NATH相互作用，形成功能性的氨基-乙酰轉移酶(N-acetyltransferase)(ArnesenT，AndersonD，BaldersheimC'LanotteM,VarhaugJE，LillehaugJR.IdentificationandcharacterizationofthehumanARD1-NATHproteinacetyltransferasecomplex.BiochemJ2005;386:433-43.)，并在氨基肽酶去除首位甲硫氨酸的翻譯過程之后，特異性乙酰化絲氨酸、蘇氨酸、甘氨酸或丙氨酸的氨基端。氨基酸比對結果提示ARD1屬于GNAT(GCN5相關的氨基末端乙酰轉移酶)家族成員，GNAT家族包括了超過50個家族成員，它們都擁有一個保守的乙酰基-CoA結合區域(Q/R)XXGX(G/A〉(NeuwaldAF,LandsmanD.GCN5-relatedhistoneN-acetyltransferasesbelongtoadiversesuperfamilythatincludestheyeastSPT10protein.TrendsBiochemSci.1997;22:154-5.)。從低等生物酵母到高等生物人都擁有這一保守功能區。在線蟲，RNA干擾ARD1和NATH將導致線蟲胚胎死亡，同時ARD1基因在錐蟲寄生蟲的生長中發揮重要作用。研究發現ARD1可與缺氧誘導因子1a(hypoxia-induciblefactor1a，HIF-1a)相互作用，在體外可乙酰化HIF-1a532位賴氨酸，從而對其起到負調控作用。同時，小鼠ARD1可變剪切體(mARD1"s)對HIF-1a的乙酰化在HIF-1a降解過程中發揮重要作用(JeongJW，BaeMK,AhnMY，etal.RegulationanddestabilizationofHIF-1alphabyARD1-mediatedacetylation.Cell2002;111:709-20.)。然而，在人類細胞中沒有觀察到類似的ARD1對HIF-1a的調節作用。5盡管哺乳動物細胞中ARD1的生物學功能尚未完全闡明，研究結果初步提示ARD1與細胞增殖和生長直接相關。Lim等人研究發現ARD1通過激活(3-catenin參與細胞增殖，而卩-catenin可以進一步誘導參與細胞周期調控的cyclinD1(LimJH，ParkJW,ChunYS.Humanarrestdefective1acetylatesandactivatesbeta-catenin,promotinglungcancercellproliferation.CancerRes2006;66:10677-82.)。此夕卜，ARD1干擾RNA可抑制細胞增殖，并使細胞周期阻滯于G1期，這一過程調節了參與細胞增殖的多種基因。此外，干擾NATH禾BARD1的表達，可誘導細胞凋亡，并促使細胞對柔紅霉素誘導的細胞凋亡更加敏感(ArnesenT,GrormykoD，PendinoF,RyningenA，VarhaugJE，LillehaugJR.InductionofapoptosisinhumancellsbyRNAi-mediatedknockdownofhARD1andNATH,componentsoftheproteinN-alpha-acetyltransferasecomplex.Oncogene2006;25:4350-60.)。越來越多的研究表明，ARD1是一個參與細胞功能調節，和腫瘤發生發展的重要分子。它也有望成為腫瘤治療的一個新靶點。通過應用抗ARD1兔多抗、以及Northemblot的研究結果表明，ARD1穩定表達于多種組織、腫瘤細胞系和內皮細胞(BiltonR，MazureN，TrottierE,etal.Arrest-defective-1protein,anacetyltransferase,doesnotalterstabilityofhypoxia-induciblefactor(HIF)-1alphaandisnotinducedbyhypox舊orHIRJBiolChem2005;280:31132-40.)。目前對腫瘤組織ARD1蛋白水平檢測的相關報道很少。最近的研究表明，ARD1相互作用蛋白NATH在乳頭狀甲狀腺癌和胃癌中高表達。因此，對ARD1表達的檢測有望成為腫瘤診斷和評估預后的重要臨床指標。但目前國內外關于ARD1的研究均是利用ARD1的多克隆抗體進行，未見ARD1單克隆抗體的報道。多克隆抗體的特異性差，用于免疫組化時顯色背景高，質量不易控制，難以在臨床應用推廣。而用PCR方法檢測ARD1的基因表達又存在易被污染產生假陽性的缺點，同時不能準確反映蛋白質的實際水平，從而極大地限制了ARD1檢測在臨床中的應用。單克隆抗體具有特異性強、敏感性高的優點，在臨床檢測中應用廣泛，可以在免疫組化、ELISA等多種方法中使用。Abnova公司(中國臺灣)提供一種商品化抗ARD1單抗(M01;4B7-H4)，但其不能用于檢測哺乳動物細胞中的ARD1、或在免疫組化中應用。目前臨床迫切需要能滿足上述要求的ARD1單克隆抗體，以及能夠分泌高效價上述單克隆抗體的雜交瘤細胞，以便有助于腫瘤的臨床診斷、預后判斷，并指導臨床治療。同時，單克隆抗體可作為ARD1生物學功能研究的重要工具，用于Westernblot、免疫沉淀、免疫細胞化學等實驗。
發明內容本發明的一個目的是提供針對ARD1蛋白質的單克隆抗體或者來源于該抗體的能夠特異性結合ARD1的生物活性片段。本發明的一個目的是提供分泌針對ARD1蛋白質的單克隆抗體的雜交瘤細胞系。本發明的另一目的是提供ARD1蛋白質的單克隆抗體的制備方法。本發明的另一目的是提供一種檢測ARD1蛋白質水平的試劑盒。本發明的另一目的是提供一種抗腫瘤藥物。本發明的另一目的是提供本發明的單克隆抗體或其生物活性片段在體外檢測樣品中ARD1蛋白質表達水平中的應用。本發明的另一目的是提供本發明的單克隆抗體或其生物活性片段在制備用于輔助診斷和/或監測腫瘤的試劑中的應用。一方面，本發明提供一種針對ARD1蛋白質的單克隆抗體，或者來源于該抗體的能夠特異性結合ARD1的生物活性片段，所述單克隆抗體由保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏號為CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355的雜交瘤細胞分泌。經鑒定，所述單克隆抗體的亞類分別是IgG2a、IgG1。此夕卜，ELISA、Westernbolt結果提示當加入抗體濃度相同時，單抗14D4與原核重組蛋白GST-ARD1的反應性較已有的ARD1單克隆抗體(單抗4B7-H4)強；WesternBlot結果提示單抗4B7-H4不能檢測真核細胞內源性的ARD1，或轉染的外源性myc-ARD1;免疫沉淀實驗提示，與單抗4B7-H4相比，單抗10C12與LoVo細胞中天然的ARD1蛋白有更強的相互作用；同時單抗14D4可用于免疫組化檢測，而單抗4B7-H4則不能用于組化檢測。所以本發明的單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高的特點，能夠用于免疫組化、免疫細胞化學、免疫沉淀、免疫印跡(蛋白質印跡，WesternBlot)和酶聯免疫吸附實驗等免疫學的檢測，從而可檢測結腸癌、胃癌、食管癌等腫瘤及多種腫瘤細胞系的ARD1表達水平，進而用于對上述多種胂瘤的輔助診斷和相關的實驗研究，以及指導臨床治療。本發明單克隆抗體可以在普通培養基中傳代培養或者在液氮長時間保存。另一方面，本發明還提供分泌針對ARD1蛋白質的單克隆抗體的雜交瘤細胞系其以保藏號CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)。本發明的雜交瘤細胞系具有較強的分泌本發明的單克隆抗體的能力，能穩定、大量分泌本發明的單克隆抗體。從雜交瘤細胞收集本發明的單克隆抗體時，可以從雜交瘤細胞體外培養上清液中獲得抗體，或者將雜交瘤細胞注入適宜的哺乳動物并從動物腹水中獲取抗體。前一種方法適于獲得高純度的抗體，后一種方法適于大量獲取抗體。通過上述方法獲得的抗體，可以用常規方法純化，例如鹽析、凝膠過濾、親合色譜層析等方法。另一方面，本領域普通技術人員已知，可以直接釆用ARD1蛋白質作為抗原，獲得本發明的單克隆抗體。也可以將本發明ARD1蛋白質與己知的標簽形成重組蛋白作為抗原，獲得本發明的單克隆抗體。所述的于，組氨酸標簽(His標簽)、谷胱苷肽巰基轉移酶標簽(GST標簽)、HA標簽、HSV標簽、Myc標簽或VSV-G-標簽等。在本發明的一個實施方式中，本發明通過原核表達獲得純化的GST-ARD1融合蛋白，并通過雜交瘤技術獲得ARD1的單克隆抗體。因此，本發明還提供本發明單克隆抗體的制備方法，該方法包括用融合蛋白GST-ARD1免疫小鼠，取小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出能夠分泌對ARD1有反應性、對谷胱苷肽巰基轉移酶(GST)沒有反應性的單克隆抗體的雜交瘤細胞，從雜交瘤上清液中或從注射雜交瘤細胞后的動物腹水中獲取單克隆抗體。上述方法僅是示例性的，例如可以用同樣的方法免疫其他哺乳動物，大鼠、兔子、豚鼠或倉鼠等。在本發明的一個實施方式中，以ARD1基因(GenBankAccessionNo.NM一003491)的cDNA為模板，從起始密碼子處設計正義引物，從終止密碼子處設計反義引物，用PCR方法擴增ARD1基因的cDNA片段。將PCR擴增產物定向克隆到原核表達載體pGEX-5X-3上，構建原核重組質粒pGEX-5X-3-ARD1，并在大腸桿菌中表達。挑選單克隆陽性菌，大量誘導表達GST-ARD1蛋白并純化。參照Kohler和Milstein建立的B淋巴細胞雜交瘤技術(KohlerG,MilsteinC,Continuousculturesoffusedcellssecretingantibodyofpredefinedspecificity.Nature.1975Aug7;256(5517):495-7.)，本發明用純化的GST-ARD1蛋白免疫BALB/c小鼠。將免疫小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合，制備雜交瘤細胞。用ELISA方法篩選陽性細胞克隆。本發明人經過多次試驗，獲得了多株陽性細胞克隆。對這些陽性克隆所分泌的單克隆抗體進行分析鑒定，發現一株雜交瘤細胞株，其分泌的ARD1單克隆抗體14D4在免疫組化試驗中呈陽性。該雜交瘤細胞株已于2008年1月24日以保藏號CGMCCNO.2354被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路，9中國科學院微生物研究所)。在天然狀態下，抗原決定簇的構象保持較好，抗原容易與抗體結合。因此，在EL1SA、免疫沉淀、冰凍切片等抗原為天然狀態的檢測實驗中，對單克隆抗體的要求相對不高。但在臨床最常用的石蠟切片免疫組織(細胞)化學(簡稱免疫組化)檢測中，組織經福爾馬林固定、石蠟包埋以及酒精脫水等處理后，由于蛋白質變性而使抗原決定簇的空間構象被部分破壞，因此對單克隆抗體的特異性識別和結合能力要求高。同樣的原因，在石蠟切片免疫組化中需要較高的抗體效價。而本發明的單克隆抗體14D4經實驗驗證，能很好地滿足免疫組化試驗要求。免疫組化是在保持組織和細胞原有形態和結構的基礎上，用特定抗原的抗體與其反應，然后通過示蹤的方法使抗原抗體反應得以顯現的一項專門技術。由于該方法不僅能直觀地顯示某種特定抗原在受檢的組織或細胞中是否存在，更重要的是能直觀地顯示抗原在組織或細胞中存在的部位以及相對含量。因此免疫組化在醫學研究領域中得到廣泛的應用。經鑒定，單克隆抗體14D4的亞類是IgG2a。還發現一株雜交瘤細胞株，其分泌的ARD1單克隆抗體10C12可用于ELISA、免疫印跡、免疫沉淀等免疫學檢測。該雜交瘤細胞株已于2008年1月24日以保藏號CGMCCNO.2355被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)。經鑒定，單克隆抗體10C12的亞類是IgG1。另一方面，本發明提供一種檢測ARD1蛋白質水平的試劑盒，其含有本發明的單克隆抗體。該試劑盒除了含有本發明的單克隆抗體外，還可進一步含有合適的試劑和/或緩沖液。本發明的單克隆抗體可以用任何已知的方法與檢測信號結合，作為檢測信號的標記物可以是放射性同位素、熒光化合物、生物素和酶等。所述酶包括，但不限于，辣根過氧化物酶(horseradishPeroxidase,HRP)、堿性磷酸酶(alkalinephosphatease，AP)、葡萄糖氧化酶、P-D-半乳糖苷酶和脲酶等，優選辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶。本領域普通技術人員已知，針對不同的酶，可使用不同的底物，HRP作用的底物包括，但不限于，鄰苯二胺(QPD)、四甲基聯苯胺(TMB)、ABTS、二氨基聯苯胺(diaminobenzidine,DAB)、等。堿性磷酸酶的底物一般采用對硝基苯磷酸酯(p-NPP)、堿性磷酸酶紅(alkalinephosphatase-red,AP-Red,又稱FastRed,快紅)，AP也有發熒光底物(磷酸4-甲基傘酮)。本發明的試劑盒可用于檢測結腸癌、胃癌、食管癌等腫瘤及多種腫瘤細胞系及血清中的ARD1表達水平，進而用于對上述多種腫瘤的輔助診斷和相關的實驗研究以及指導臨床治療。在本發明的一個具體實施方式中，本發明的試劑盒除了所述單克隆抗體外，還含有第二抗體、顯色系統、或可被檢測的熒光和/或放射標記，以及適宜的緩沖液。優選其中第二抗體上標記有生物素，并進一步含有結合辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶的鏈霉親和素，顯色底物為鄰苯二胺(OPD)和/或堿性磷酸酶紅；或優選其中第二抗體上直接標有辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶，顯色底物為鄰苯二胺和/或堿性磷酸酶紅。標記的第二抗體，現已有商品出售，可以直接商購獲得。在本發明的一個具體實施方式中，本發明的試劑盒含有用純化的ARD1多克隆抗體包被的微量滴定板、ARD1標準抗原、本發明單克隆抗體、標記有生物素的能夠與ARD1單克隆抗體結合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素、辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的相應顯色底物，以及適宜的緩沖液。上述ARD1多克隆抗體可以利用本領域已知技術獲得，例如通過用ARD1蛋白質或其與標簽的融合蛋白免疫動物，取血，分出抗血清并純化制得。上述ARD1標準抗原可以利用本領域已知技術獲得，例如利用聚合酶鏈式反應(PCR)方法。在本發明的另一個具體實施方式中，本發明的試劑盒含有用純化的ARD1多克隆抗體包被的微量滴定板、ARD1標準抗原、本發明單克隆抗體、直接標記有辣根過氧化物酶或的能夠與ARD1單克隆抗體結合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿堿性磷酸酶性磷酸酶的相應顯色底物，以及適宜的緩沖液。在本發明的另一個具體實施方式中，本發明的試劑盒含有本發明單克隆抗體、直接標記有辣根過氧化物酶或的能夠與ARD1單克隆抗體結合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿堿性磷酸酶性磷酸酶的相應顯色底物，以及適宜的緩沖液。在微量滴定板用于作標準抗原曲線的各孔中依次加入不同濃度的標準抗原溶液，在樣品孔中加入待測血清樣品，溫育一段時間以使ARD1蛋白與ARD1多克隆抗體充分結合。洗滌微量滴定板，加入第一抗體，溫育一段時間，以使ARD1單克隆抗體與固定于微量滴定板上的ARD1蛋白充分結合。洗滌微量滴定板，加入第二抗體，溫育一段時間，以使第二抗體與固定于微量滴定板上的ARD1單克隆抗體充分結合。洗滌微量滴定板，加入辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素，溫育一段時間，以使鏈霉親和素與生物素充分結合。洗滌微量滴定板，加入鄰苯二胺，室溫避光顯色。用酶標儀讀取每個反應孔的00492值。繪制標準曲線，計算待測樣品中ARD1的濃度。在本發明一個具體實施方式中，采用免疫組化方法利用本發明的試劑盒檢測組織或細胞ARD1的表達。所用試劑盒包括所述ARD1單克隆抗體，生物素標記的山羊抗小鼠lgG的抗體或兔抗小鼠lgG的抗體，結合辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶的鏈霉親和素，酶相應的顯色底物鄰苯二胺/堿性磷酸酶紅，以及適用于免疫組化的緩沖液。制備結腸癌細胞株LoVo的細胞爬片，固定細胞后，滴加分泌14D4抗體的雜交瘤上清液，溫育。用緩沖液沖洗爬片，然后滴加生物素標記的山羊抗小鼠lgG的抗體(第二抗體)，溫育。用緩沖液沖洗爬片，然后滴加結合辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶的鏈霉親和素，溫育。或者第二抗體上直接標記有辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶，而不再滴加結合辣根過氧化物酶/堿性磷酸酶的鏈霉親和素。然后用DAB/AP-「ed進行顯色反應。如果細胞表達ARD1，則顯色反應結果為細胞漿呈現棕黃色/紅色，否則不顯色。另一方面，本發明提供一種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物含有本發明所述的單克隆抗體或其生物活性片段。如下述附圖和實施例中所證實的，本發明的ARD1單克隆抗體能夠與ARD1特異性、高效結合。因此，給予腫瘤患者本發明的單克隆抗體或該抗體的能夠與ARD1蛋白特異性結合的生物活性片段，可能抑制腫瘤細胞內ARD1的活性，從而起到抑制腫瘤浸潤、轉移的作用。因此，本發明還提供一種治療動物(包括人)腫瘤的方法，包括給予需要治療的動物治療有效量的本發明單克隆抗體或其生物活性片段。對此處所用"腫瘤"沒有特別限制，只要與ARD1的過表達相關即可，但優選為結腸癌、食管癌、直腸癌或肺癌。所述藥物的制備方法可以是本領域技術人員熟知的任何方法，例如將本發明的單克隆抗體或其生物活性片段與適當的賦形劑混合。所述賦形劑是本領域常規用于抗體藥物制備的賦形劑，如水、鹽水、緩沖劑等。所述藥物的給藥途徑可以是任何抗體藥物的常規給藥途徑，例如，靜脈內注射、皮下注射、腫瘤內注射等。另一方面，本發明提供本發明的單克隆抗體或其生物活性片段在體外檢測樣品中ARD1蛋白質表達水平中的應用。所用檢測方法包括可以使用本發明抗體的所有免疫方法，例如ELISA、WesternBlot、免疫沉淀、免疫組化、免疫熒光等，優選為免疫組化。優選所述樣品可為來自受試個體的生物流體(例如血液、組織液)和組織樣品(例如結腸癌組織、食管癌組織、直腸癌組織、肺癌組織)，更優選所述樣品為血清。所述組織樣品經福爾馬林固定、酒精脫水、石蠟包埋，制成35jjm的切片。實驗方法同上述檢測細胞株ARD1表達的方法。另一方面，本發明提供本發明的單克隆抗體或其生物活性片段在制備用于輔助診斷和/或監測腫瘤的試劑中的應用。通過本發明的單克隆抗體或其生物活性片段體外檢測組織樣品中ARD1蛋白質的表達水平和/或監測腫瘤患者樣本中ARD1蛋白質水平的動態變化，可用于輔助診斷和/或監測腫瘤。在本發明的一個具體實施方案中，如上所述用本發明單克隆抗體對取自患者的可能為腫瘤的組織進行免疫組化染色，在顯微鏡下觀察組織染色結果來確定是否表達ARD1蛋白質，從而對組織是否為腫瘤作出診斷。通過判斷ARD1陽性細胞占腫瘤細胞的比例以及表達的多少(陽性信號的強弱)可以進一步協助腫瘤的分期。例如在結腸直腸癌、食管癌、肺癌中，大部分癌細胞表達ARD1，染色結果通常為強陽性。在本發明的一個具體實施例中，如上所述，用純化的ARD1多克隆抗體及本發明ARD1單克隆抗體進行夾心ELISA對取自腫瘤患者的血清進行常規ELISA實驗等免疫學實驗，從而可監測樣本中尤其是血清中ARD1蛋白質的動態變化水平。下面結合附圖和具體實施例進一步闡明本發明，但本發明的范圍并不受這些附圖和實施例的限制。圖1:12%SDS-PAGE電泳鑒定14D4抗體的純度。其中第1，2，3道電泳為66KD的蛋白質分子量Marker(BSA，1BSA，2pg;BSA，3jjg)。4，5道為純化單抗14D4(1pg;2)jg);6，7道為純化單抗10C12(1ijg;2|jg)。電泳方向為從上到下。電泳速度快的條帶(下面的條帶)為分子量較小的單克隆抗體輕鏈，電泳速度慢的條帶(上面的條帶)為分子量較大的單克隆抗體重鏈。結果顯示，篩選出的陽性雜交瘤細胞株所分泌的抗體純度高，無雜帶。圖2:用包被GST-ARD1重組蛋白的微量滴定板以ELISA方法分析14D4抗體的效價。用包被GST的微量滴定板為陰性對照。將濃度分別為O、0,18、0.37、0.625、1.25、2.5、5^g/ml的純《七抗體14D4力口至U微量滴定板中。縱坐標為OD492處的吸光度數值，橫坐標為14D4抗體濃度。結果顯示14D4只特異結合GST-ARD1,與其它蛋白如GST無交叉反應。圖3A和圖3B:用Western-Blot的方法檢測原核蛋白GST-ARD1以及結腸癌細胞系LoVo中內源性ARD1的表達，其中，1:10C12;2:14D4;3:陽性對照(+);4:IgG。12%SDS-PAGE電泳，GST-ARD1每孔上樣量為100ng(GST純化蛋白每孔100ng為陰性對照)，LoVo細胞總蛋白上樣量50iJg，一抗為14D4、10C12濃度2.5pg/ml(正常小鼠血清純化IgG為陰性對照)檢測。結果顯示14D4、10C12可與GST-ARD1結合，而不結合GST(圖3A)。同時應用14D4、10C12可檢測到LoVo細胞中內源性ARD1的表達(圖3B)。圖4:免疫沉淀(IP)檢測LoVo細胞中ARD1的表達，其中，1:10C12;2:14D4;3:陽性對照(+);4:IgG。結果提示，抗體10C12可用于免疫沉淀反應，而單抗14D4則不能進行免疫沉淀反應。圖5:用14D4抗體或10C12抗體進行免疫細胞化學方法以檢測結腸癌細胞株LoVo中ARD1的表達。結果顯示LoVo的細胞漿顯色為棕黃色，說明LoVo細胞株表達ARD1。圖6:用免疫熒光的方法檢測結腸癌細胞株LoVo中ARD1的定位。一抗為14D4或10C12,二抗為FITC標記的熒光二抗，同時應用Hoechest染料染細胞核。結果綠色熒光主要分布于細胞漿中，少量分布于細胞核。從而提示ARD1主要定位于細胞漿，少量定位于細胞核。圖7:夾心ELISA檢測LoVo細胞中的ARD1。結果顯示抗ARD1兔多抗與單抗10C12配對的夾心ELISA，可用于檢測樣品，如血清中的ARD1。圖8:用免疫組化方法檢測結腸癌和結腸良性病變中ARD1的表達。結果顯示結腸癌癌旁正常組織(圖8C)及結腸良性病變中不表達ARD1(圖8D)，而結腸癌組織中可檢測到ARD1表達(圖8A、8B)。圖9:用免疫組化方法檢測食管癌、直腸癌和肺癌中ARD1的表達。結果顯示癌組織中可檢測到ARD1表達(癌)，而癌旁正常組織中不表達ARD1(癌旁)。圖10:應用ELISA對單抗14D4與商品化單抗4B7-H4進行比較。分別以GST-ARD1和GST包被96孔板。以不同濃度的單抗14D4、4B7-H4(0、0.18、0.37、0.625、1.25、2.5、5pg/ml)為一抗、進行常規ELISA檢測。圖中縱坐標為OD492處的吸光度數值，橫坐標為抗體濃度。結果顯示2種單抗均可特異結合GST-ARD1，而與GST無交叉反應；同時單抗14D4與原核重組蛋白GST-ARD1的反應性明顯強于4B7-H4同GST-ARD1的反應性。圖11:應用WesternBlot和免疫沉淀對單抗14D4、10C12與商品化單抗4B7-H4進行比較。12%SDS-PAGE電泳，GST-ARD1每孔上樣量為100ng，瞬時轉染pCMV-myc-ARD1質粒的Hela細胞總蛋白上樣量100jjg，常規SDS-PAGE電泳、轉膜、封閉后，加入一抗，分別為14D4、4B7-H4、正常小鼠血清純化lgG、或抗myc抗體進行常規WesternBlot檢測。結果顯示單抗14D4、4B7-H4均可特異結合GST-ARD1，而單抗14D4與原核重組蛋白GST-ARD1的反應性較4B7-H4強(圖11A);應用14D4可檢測到Hela細胞中內源性ARD1的表達(圖11B)。單抗4B7-H4不能檢測真核細胞內源性的ARD1，或轉染的外源性myc-ARD1(圖"B)。免疫沉淀實驗提示，與單抗4B7-H4相比，單抗10C12與LoVo細胞中天然的ARD1蛋白有更強的相互作用(圖11C)。圖12:用不同抗體進行免疫組化，檢測結腸癌中ARD1的表達。結果顯示單抗14D4可檢測到結腸癌組織中ARD1表達，而商品化單抗4B7-H4不能用于組化檢測。用于專利程序的生物材料保藏信息抗ARD1(Humanarrestdefective1)的雜交瘤細胞株(分泌本發明單克隆抗體14D4)保藏單位全稱及簡稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏編號CGMCCNO.2354;保藏日期2008年1月24日抗ARD1(Humanarrestdefective1)的雜交瘤細胞株(分泌本發明單克隆抗體10C12)保藏單位全稱及簡稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏編號CGMCCNO.2355;保藏日期2008年1月24日具體實施例方式實施例1抗人ARD1單克隆抗體的制備1、ARD1抗原的制備分別設計ARD1基因(GenBankAccessionNo.NM—003491)cDNA片段的5'端正義引物5'-A丌GGATCCTCGCCACCATGAACATCCGCAATGCG-3'(SEQIDNo.1)和3'端反義引物5'-AATGAATTCTAGGAGGCTGAGTCGGAG-3'(SEQIDNo.2)(引物由上海生工生物工程公司合成)，并于引物兩端分別引入SamHI和EcoRI酶切位點。用Trizol(購自lnvitrogen公司)提取人結腸癌細胞LoVo(ATCC編號CCL-229)總RNA，逆轉錄成cDNA，并應用上述17引物進行PCR擴增ARD1cDNA片段，產物長度為712bp。將PCR產物和pGEX-5X-3載體(購自AmershamBiosciences公司)分別都用SamHI和EcoRI酶切后進行連接，將該連接產物轉化入大腸桿菌BL21菌株并挑取單克隆進行酶切鑒定，同時送測序。原核表達載體pGEX-5X-3的SD序列下游就是谷胱甘肽巰基轉移酶(GST)基因，而克隆的外源ARD1基因則與GST基因相連。當基因表達時，表達產物為GST和ARD1基因產物的融合體GST-ARD1，以方便ARD1的純化。挑選測序正確陽性克隆的BL21菌株進行GST-ARD1重組蛋白的小量誘導表達。取小量誘導表達鑒定為陽性的菌株進行GST-ARD1重組蛋白的大量誘導表達。發明人對ARD1的誘導表達條件進行了探索，使用大腸桿菌BL21菌株，溫度為27°C，誘導劑IPTG的濃度為0.2mmol/L，誘導時間為3小時。在此條件下，GST-ARD1的表達量最高，而且表達的蛋白主要是分泌型蛋白。用能夠吸附GST融合蛋白的谷胱甘肽珠子(GlutathioneSepharose4B，購自AmershamBiosciences公司)純化GST-ARD1重組蛋白，并回收、鑒定。2、ARD1單克隆抗體的制備用純化的GST-ARD1重組蛋白免疫68周齡的BALB/c小鼠，6周后強化免疫。將免疫好的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞SP2/0融合。用ELISA方法篩選分泌抗ARD1單克隆抗體的雜交瘤細胞。再用有限稀釋法對陽性的雜交瘤細胞進行多次亞克隆。選取強陽性的克隆擴大培養、建株，其中一株所分泌的抗ARD1單克隆抗體命名為14D4，而該雜交瘤細胞株即為14D4細胞株。該雜交瘤細胞株已于2008年1月24日以保藏號CGMCCNQ.2354被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)；另一株所分泌的抗ARD1單克隆抗體命名為10C12,而該雜交瘤細胞株即為10C12細胞株。該雜交瘤細胞株己于2008年1月24日以保藏號CGMCCNO.2355被保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(地址北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)。將14D4細胞或10C12細胞接種于10周齡BALB/C小鼠的腹腔中，至腹水形成增多腹部特別膨隆時處死小鼠取腹水，其內含大量14D4或10C12抗體。實施例2鑒定14D4抗體或10C12抗體的純度用常規ELISA方法鑒定14D4抗體或10C12抗體的亞類，證實其分別為lgG2a、IgG1，因此選用Pro.AS印harose-4B柱進行純化，并用12%SDS-PAGE電泳鑒定其純度。結果見圖1，顯示14D4抗體或10C12抗體純度高、無雜帶。實施例3測定14D4抗體的效價用PBS緩沖液透析純化的14D4抗體，用紫外線分光光度計在280nm處測定抗體的濃度。1、在GST-ARD1蛋白包被的微量滴定板中分別加入濃度為0、0.18、0.37、0.625、1.25、2.5、5|ag/ml的14D4抗體。并將同樣濃度的14D4抗體加入GST蛋白包被的微量滴定板中作為陰性對照。室溫溫育1小時。2、0.05%Tween-20/PBS洗滌反應孔3次，PBS洗滌反應孔2次。3、加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG的抗體，室溫溫育1小時。4、0.05%Tween-20/PBS洗滌反應孔3次，PBS洗滌反應孔2次。5、向反應孔中加入辣根過氧化物酶底物OPD，室溫顯色30分鐘后，加入終止液(12.5%H2S04)。用酶標儀測量OD492處的吸光度值。結果見圖2，14D4抗體特異結合GST-ARD1，并且與GST無交叉反應。對10C12抗體進行類似的效價實驗，結果未顯示。實施例4Western-Blot檢測ARD1的表達。1、Western-Blot檢測GST畫ARD11)取純化的GST-ARD1和GST蛋白行12%的SDS-PAGE電泳，每孔蛋白上樣量為100ng。2)至溴酚藍達到膠的最下緣時停止，進行電轉移。3)轉膜結束后，麗春紅染色，檢測轉膜效果以及做好標記。4)5%脫脂奶粉封閉，4。C過夜。5)加一抗14D4或10C12抗體，濃度為2.5jug/ml，正鼠lgG為陰性對照，室溫1小時。6)0.1。/。Tween-20/PBS洗滌7次。7)加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG的抗體，室溫溫育40分鐘。8)0.1%Tween-20/PBS洗滌7次，PBS洗滌1次。9)發光顯影。結果見圖3A，14D4抗體或10C12抗體特異結合GST-ARD1，并且與GST無交叉反應。2、Western-Blot檢測LoVo細胞中內源性ARD1表達。細胞裂解液RIPA(Tris(pH7.4),150mMNaCI，1%TritonX-100，1%sodiumdeoxycholate，0.1%SDS)裂解LoVo細胞，提取細胞總蛋白，行12%的SDS-PAGE電泳，每孔蛋白上樣量為50昭。其余步驟同前。結果顯示14D4抗體、10C12抗體能檢測到人結腸癌細胞系LoVo中內源性ARD1(圖3B)。實施例5免疫沉淀(IP)檢測LoVo細胞中ARD1的表達1、細胞裂解液RIPA裂解LoVo細胞，提取細胞總蛋白。2、取200叩細胞總蛋白分別與單抗10C12或14D4雜交瘤上清0.5ml4。C孵育2h。3、力口入ProteinGSepharose4FastFlow(GEHealthcare'Uppsala,Sweden),4°C孵育2h。4、反應混合物用PBST洗滌3遍后，行常規12%的SDS-PAGE電泳。5、轉膜封閉后，以單抗14D4為一抗進行常規Westernblot檢測。結果見圖4，10C12可與LoVo細胞中天然構象的ARD1反應，而單抗14D4則不能進行免疫沉淀反應。實施例6免疫細胞化學檢測結腸癌細胞株LoVo中ARD1的表達1、常規方法制備結腸癌細胞株LoVo的細胞爬片，冷丙酮/甲醇(體積比1:1)固定。2、將爬片浸泡于3%1~1202(PBS稀釋)內10分鐘，以去除內源性過氧化物酶。3、PBS洗漆爬片2次。然后用1%BSA(PBS稀釋)在37。C下封閉30分鐘。滴加適宜濃度的14D4抗體或10C12抗體，在37"C下反應1小時。4、PBS洗滌爬片3次，滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG的抗體工作液(DAKOENVISION+SystemHRPMouse),在37。C下反應1小時。5、用PBS洗滌爬片3次，在辣根過氧化物酶底物DAB的溶液中顯色20分鐘。6、用PBS終止顯色，將爬片反蓋在載玻片上，顯微鏡下觀察，以細胞漿內出現棕黃色顆粒狀為陽性。結果見圖5，顯示LOVO細胞漿為棕黃色，說明LOVO細胞株表達ARD1。實施例7免疫熒光檢測ARD1在結腸癌細胞LoVo中的定位。1、常規方法制備結腸癌細胞株LoVo的細胞爬片，冷丙酮/甲醇(體積比1:1)固定。2、將爬片浸泡于3%1~1202(PBS稀釋)內10分鐘，以去除內源性過氧化物酶。3、PBS洗滌爬片2次。然后用1。/。BSA(PBS稀釋)在37'C下封閉30分鐘。滴加適宜濃度的14D4抗體或10C12抗體在37'C下反應1小時。4、用PBS洗滌爬片3次。5、50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察照相。如圖，LoVo細胞漿可見大量綠色熒光，胞核中隱約可見少量綠色熒光，藍色熒光為Hoechest著染的細胞核。結果顯示ARD1主要定位于細胞漿中，小部分定位于細胞核中(圖6)。實施例8夾心ELISA方法檢測結腸癌細胞中ARD1的表達1、以抗ARD1純化兔多抗10|jg/ml包被96孔板，4°C包被過夜。2、封閉后加入LoVo細胞裂解液50叩，室溫反應1h。同時以25ng純化的His-ARD1蛋白作為陽性對照，PBS作為陰性對照(Control)。3、PBST洗滌5遍后，加入1ijg/ml的抗ARD1單抗10C12，室顯反應1h。4、PBST洗滌5遍后，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠IgG的抗體，室溫孵育1h。5、PBST洗滌5遍后，常規OPD現色，并測定OD啦處的吸光度值。結果見圖7，應用夾心ELISA可檢測到LoVo細胞中的ARD1。實施例9免疫組化檢測結腸癌和結腸良性病變、食管癌、直腸癌和肺癌中ARD1的表達1、選取結腸癌和結腸良性病變組織進行常規福爾馬林固定、酒精脫水、石蠟包埋，切成4pm厚的切片。在6CTC烘烤4小時，以使切片牢固地附著于載玻片上。2、用二甲苯對切片進行脫蠟處理，梯度酒精使切片水化，用PBS洗滌切片2次。3、將切片浸泡于3%1~1202(PBS稀釋)內10分鐘，以去除內源性過氧化物酶。然后用PBS洗滌切片3次。4、將切片浸泡于pH6.0的0.1M枸櫞酸鈉緩沖液中，在92°C~10CTC煮10分鐘，進行抗原修復。待切片自然冷卻至室溫后，用去離子水洗滌切片2次，再用PBS洗滌切片2次。5、將5%脫脂奶粉(PBS稀釋)滴加于切片上，在37。C下溫育1小時，進行抗原封閉。6、在切片上滴加適宜濃度的14D4抗體，4'C孵育過夜。然后用PBS洗滌切片3次。7、在切片上滴加辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠lgG的抗體工作液(DAKOENVISION+SystemHRPMouse),在37。C下溫育1小時。8、用PBS洗滌切片2次，將切片浸泡于在辣根過氧化物酶底物DAB的溶液中顯色20分鐘。9、用PBS終止顯色，用蘇木精對切片進行復染。用1%鹽酸酒精分化切片，梯度酒精脫水，二甲苯透明，然后將蓋玻片蓋在組織切片上，顯微鏡下觀察。結果見圖8，顯示癌旁正常組織(圖8C)結腸良性病變中不表達ARD1(圖8D)，而結腸癌組織中有ARD1的高表達(圖8A，8B)。用與上述類似的步驟采用免疫組化方法檢測食管癌、直腸癌和肺癌中ARD1的表達。結果顯示癌組織中可檢測到ARD1表達(癌)，而癌旁正常組織中不表達ARD1(癌旁)。(結果具體參見圖9)。實施例10單抗14D4、10C12與Abnova公司商品化抗ARD1單抗(M01;4B7-H4)的比較分別應用ELISA、Westernblot、免疫沉淀、免疫組化對抗體進行比較，具體方法同實施例3，4，5，9。ELISA、Westernbolt結果提示當加入抗體濃度相同時，單抗14D4與原核重組蛋白GST-ARD1的反應性較4B7畫H4強(圖10、圖11A);WesternBlot結果提示單抗4B7-H4不能檢測真核細胞內源性的ARD1，或轉染的外源性myc-ARD1(圖"B);免疫沉淀實驗提示，與單抗4B7-H4相比，單抗10C12與LoVo細胞中天然的ARD1蛋白有更強的相互作用(圖11C);同時單抗14D4可用于免疫組化檢測，而單抗4B7-H4則不能用于組化檢測(圖12)。因此本發明的單抗在應用方面優于商品化的單抗。實施例11ARD1表達與多種腫瘤臨床病理特征的相關分析本發明人利用本發明的單抗14D4對收集的50對臨床結腸癌,及20例腸炎組織進行石蠟切片免疫組化分析。結果，50例結腸癌組織中有41例表達ARD1(82%);50例癌旁正常組織中有12例表達ARD1(24。/o);而20例良性病變(腸炎組織)中，均無ARD1表達(0%)。經PearsonX2檢驗，ARD1在結腸良性病變和結腸癌組織中的表達具有顯著性差異(PO.001)(表1)。結果提示ARD1在結腸癌組織中高表達的比例很高，因此它為一個新的結腸癌腫瘤標志物。同時我們對食管癌、直腸癌、肺癌中ARD1的表達進行分析，結果提示ARD1在這三種腫瘤的癌組織和癌旁正常組織的表達具有顯著性差異(P<0.001)(表2、3、4)。表1.免疫組化檢測ARD1在結腸組織中的表達。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>序歹lj表<110>北京市腫瘤防治研究所<120>ARD1的單克隆抗體及其應用<130>GAI08CN0224C<160>2<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1attggstcctcgccaccatga3catccgcaatgcg35<210>2<2">27<212>DNA<213>人工序列<220><223>弓|物<400>2aatgaattctaggaggctgagtcggag2權利要求1.針對ARD1蛋白質的單克隆抗體或者來源于該抗體的能夠特異性結合ARD1的生物活性片段，所述單克隆抗體由保藏號為CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355的雜交瘤細胞分泌。2.分泌權利要求1所述的單克隆抗體的雜交瘤細胞系，其保藏號為CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355。3.權利要求1的單克隆抗體的制備方法，該方法包括用融合蛋白GST-ARD1免疫小鼠，取小鼠的脾細胞與骨髓瘤細胞融合，篩選出能夠分泌對ARD1有反應性、對谷胱苷肽巰基轉移酶沒有反應性的單克隆抗體的雜交瘤細胞，從雜交瘤上清液中或從注射雜交瘤細胞后的動物腹水中獲取單克隆抗體。4.一種檢測ARD1蛋白質水平的試劑盒，其含有權利要求1的單克隆抗體。5.權利要求4的試劑盒，其還含有第二抗體、顯色系統、或可被檢測的熒光和/或放射標記，以及適宜的緩沖液。6.權利要求5的試劑盒，其中第二抗體上標記有生物素，并進一步含有結合辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶的鏈霉親和素，顯色底物為鄰苯二胺和/或堿性磷酸酶紅；或其中第二抗體上直接標有辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶，顯色底物為鄰苯二胺和/或堿性磷酸酶紅。7.權利要求4的試劑盒，該試劑盒含有用純化的ARD1多克隆抗體包被的微量滴定板、ARD1標準抗原、權利要求1所述單克隆抗體、標記有生物素的能夠與ARD1單克隆抗體結合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素、辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的相應顯色底物，以及適宜的緩沖液；或該試劑盒含有用純化的ARD1多克隆抗體包被的微量滴定板、ARD1標準抗原、權利要求1所述單克隆抗體、直接標記有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的能夠與ARD1單克隆抗體結合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶的相應顯色底物，以及適宜的緩沖液；或該試劑盒含有ARD1標準抗原、權利要求1所述單克隆抗體、直接標記有辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶的能夠與ARD1單克隆抗體結合的第二抗體、辣根過氧化物酶和/或堿性磷酸酶的相應顯色底物，以及適宜的緩沖液。8.—種抗腫瘤藥物，該抗腫瘤藥物含有權利要求1的單克隆抗體或其生物活性片段。9.權利要求1的單克隆抗體或其生物活性片段在體外檢測樣品中ARD1蛋白質表達水平中的應用；優選所述樣品為血液、結腸癌組織、食管癌組織、直腸癌組織或肺癌組織等腫瘤組織，更優選所述樣品為血清。10.權利要求1的單克隆抗體或其生物活性片段在制備用于輔助診斷和/或監測腫瘤的試劑中的應用；優選所述的腫瘤為結腸癌、食管癌、直腸癌或肺癌。全文摘要本發明涉及ARD1的單克隆抗體及其應用。具體地說，本發明涉及由保藏號為CGMCCNO.2354或CGMCCNO.2355的雜交瘤細胞分泌的針對ARD1蛋白質的單克隆抗體以及分泌該抗體的雜交瘤細胞系。本發明的單克隆抗體具有特異性強、靈敏度高的特點，能夠用于免疫組化、免疫細胞化學、免疫沉淀、免疫印跡和酶聯免疫吸附實驗等免疫學檢測，從而可檢測結腸癌、胃癌、食管癌等腫瘤及多種腫瘤細胞系的ARD1表達水平，進而用于對上述多種腫瘤的輔助診斷和相關的實驗研究，以及指導臨床治療。文檔編號A61K39/395GK101514230SQ20081005777公開日2009年8月26日申請日期2008年2月18日優先權日2008年2月18日發明者任婷婷,健吳,姜北海,壽成超申請人:北京市腫瘤防治研究所