用于治療癌癥的抗CCR4抗體和4?1BB激動劑的組合的制作方法
本申請要求于2014年5月21日提交的美國臨時申請No.62/001,534的權益，其全部內容通過引用并入本文。
發明領域
本發明涉及可用于治療癌癥的組合療法。特別地，本發明涉及包含特異性結合人CC趨化因子受體4(CCR4)的抗體和4-1BB蛋白的激動劑的組合療法。
發明背景
已經認識到趨化因子是正常免疫監視和應答所必需的以及血細胞生成、血管生成、病毒感染的控制和T細胞分化中的幾種其它功能所必需的基礎白細胞運輸的關鍵組分(Baggiolini等人，Ann.Rev.Immunol.15：675(1997)；Zou等人，Nature 393：595(1998)；Tachibana等人，Nature 393：591(1998))。生物活性的這種多樣陣列，包括對白細胞的一系列促炎效應的介導，例如趨化性的觸發、脫顆粒、脂質介質的合成和整聯蛋白活化，以及它們在炎性疾病的引發和維持中的關鍵作用，已經使趨化因子和趨化因子受體成為有吸引力的新的一組治療靶標。
趨化因子受體4(CCR4)由Power等人鑒定(J.Biol.Chem.270：19495-19500(1995)；Genbank登錄號X85740)和Meyer等人(J.Biol.Chem.271(24)：14445-14451(1996)；Genbank登錄號X94151)。CCR4是七次跨膜G蛋白偶聯受體，并在Th2細胞和調節性T細胞上選擇性表達(D'Ambrosio等人，J.Immunol.161：5111-5115(1998))。正常細胞例如Th2細胞上的CCR4表達可以被配體，特別是巨噬細胞衍生的趨化因子(MDC)部分調節(Mariani等人，Eur.J.Immunol.34：231-240(2004))，而癌細胞上的配體的調節還不清楚。已經表明，抗CCR4單克隆抗體選擇性地耗竭效應子型FoxP3+CD4+調節性T細胞，從而引發人中的抗腫瘤免疫應答(Sugiyama等人，Proc.Nat.Acad.Sci.110(44)：17945-17950(2003))。
KW-0761(莫加利珠單抗或POTELIGEOTM)在日本被批準用于復發性或難治性CCR4陽性成人T細胞白血病/淋巴瘤和復發性或難治性CCR4陽性外周T細胞淋巴瘤(PTCL)和皮膚T細胞淋巴瘤(CTCL)。KW-0761是免疫球蛋白G亞類1(IgG1)κ同種型的人源化單克隆抗體，其靶向CCR4表達細胞并已顯示通過ADCC耗竭表達CCR4的T淋巴細胞的能力。KW-0761由于在恒定(Fc)區從復合型寡糖的去巖藻糖基化而具有增強的ADCC活性。(Ishii等人，Clinical Cancer Research 16：1520-31(2010)；Shitara等人，Human CDR-grafted antibody and antibody fragment thereof，美國專利號7,504,104；美國專利號8,491,901)。
最初被鑒定為在活化的T細胞上表達的誘導型共刺激受體的4-1BB(CD137和TNFRSF9)是腫瘤壞死因子(TNF)受體超家族的跨膜糖蛋白。對4-1BB的當前理解指出表達通常是活化依賴性的，并且涵蓋免疫細胞的廣泛子集，包括活化的NK和NKT細胞，調節性T細胞，樹突狀細胞(DC)包括濾泡DC，刺激的肥大細胞，分化髓樣細胞，單核細胞，嗜中性粒細胞，嗜酸性粒細胞(Wang等人，Immunol Rev.229(1)：192-215(2009))，和活化的B細胞(Zhang等人，J Immunol.184(2)：787-795(2010))。也已經在腫瘤脈管系統(Broll K等人，Am J Clin Pathol.115(4)：543-549(2001)；Seaman等人，Cancer Cell 11(6)：539-554(2007))和動脈粥樣硬化內皮(Olofsson等，Circulation 117(10)：1292-1301(2008))上證實了4-1BB表達。刺激4-1BB(4-1BBL)的配體在活化的抗原呈遞細胞(APC)、骨髓祖細胞和造血干細胞上表達。
在B細胞受體結合時，激活的正常人B細胞上的4-1BB與其配體的相互作用刺激增殖并增強存活(Zhang等人，J Immunol.184(2)：787-795(2010))。在兩項已發表的研究中研究了4-1BB結合在B細胞淋巴瘤中的潛在影響。幾種類型的人原代NHL樣品的評價表明，4-1BB主要在浸潤性T細胞而不是淋巴瘤細胞上表達(Houot等人，Blood 114(16)：3431-3438(2009))。將4-1BB激動劑加入具有利妥昔單抗和NK細胞的B淋巴瘤細胞的體外培養物導致增加的淋巴瘤殺傷(Kohrt等人，Blood 117(8)：2423-2432(2011))。此外，在食蟹猴中以0.001-100mg/kg的劑量使用PF-05082566(抗4-1BB激發型單克隆抗體)的兩個實驗中進行了B細胞免疫分型；在這些實驗中，外周血B細胞數量不變或減少。
4-1BB在幼稚T細胞的表面上是不可檢測的，但是在激活時表達增加。在4-1BB激活時，作為TNFR相關因子(TRAF)家族的促存活成員的TRAF-1和TRAF-2被募集到4-1BB胞質尾區，導致NFκB和有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶級聯(包括ERK，JNK和p38MAP激酶)的下游激活。NFκB活化導致Bfl-1和Bcl-XL(Bcl-2家族的促存活成員)的上調。促凋亡蛋白Bim以TRAF-1和ERK依賴性方式下調(Sabbagh等人，J Immunol.180(12)：8093-8101(2008))。
報道已經顯示，4-1BB激發型mAb增加共刺激分子表達并顯著增強溶細胞T淋巴細胞反應，導致在多種模型中的抗腫瘤功效。4-1BB激發型mAb已經在單一療法和組合療法的預防和治療設置中表現出功效，并且已經建立了持久的抗腫瘤保護性T細胞記憶應答(Lynch等人，Immunol Rev.222：277-286(2008))。4-1BB激動劑還在多種自身免疫模型中抑制自身免疫應答(Vinay等人，J Mol Med 84(9)：726-736(2006))。
概述
本文提供了用于治療個體中的癌癥的方法。在一些實施方案中，所述方法包括向個體施用抗CCR4抗體和4-1BB激動劑。
還提供了藥物。在一些實施方案中，所述藥物包含與4-1BB激動劑組合用于治療癌癥的抗CCR4抗體。在其它實施方案中，藥物包含與抗CCR4抗體組合用于治療癌癥的4-1BB激動劑。
其它實施方案提供了抗CCR4抗體在制備用于當與4-1BB激動劑組合施用時治療個體中的癌癥的藥物中的用途，以及4-1BB激動劑在制備用于當與抗CCR4抗體組合施用時治療個體中的癌癥的藥物中的用途。
其它實施方案提供了抗CCR4抗體和4-1BB激動劑在制備用于治療個體中的癌癥的藥物中的用途。在一些實施方案中，藥物包括試劑盒，并且試劑盒還包括包裝插頁，其包含用于將抗CCR4抗體與4-1BB激動劑組合使用以治療個體中的癌癥的說明書。
在一些實施方案中，所述方法包括向個體施用包含耗竭CD4+T細胞的試劑和4-1BB激動劑的組合療法。在一些實施方案中，CD4+T細胞是FoxP3+CD4+調節性T細胞。在一些實施方案中，耗竭CD4+T細胞的試劑選擇性地耗竭FoxP3+CD4+調節性T細胞。在一些實施方案中，所述方法包括向個體施用包含耗竭CD4+T細胞的試劑、4-1BB激動劑和PD-1拮抗劑的組合療法。在一些實施方案中，耗竭CD4+T細胞的試劑是抗CCR4抗體或抗CD4抗體。
在一些實施方案中，所述方法包括向個體施用包含抗CCR4抗體、4-1BB激動劑和PD-1拮抗劑的組合療法。在一些實施方案中，所述方法包括向個體施用包含抗CD4抗體、4-1BB激動劑和PD-1拮抗劑的組合療法。在一些實施方案中，PD-1拮抗劑抑制PD-L1與PD-1的結合。在一些實施方案中，PD-1拮抗劑還抑制PD-L2與PD-1的結合。在上述治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，PD-1拮抗劑是特異性結合PD-1或PD-L1并阻斷PD-L1與PD-1結合的單克隆抗體或其抗原結合片段。
組合療法還可以包含一種或多種另外的治療劑。另外的治療劑可以是例如化療劑，生物治療劑(包括但不限于針對VEGF，VEGFR，EGFR，Her2/neu，其它生長因子受體，CD20,CD40,CD-40L,CTLA-4,OX-40,4-1BB,PD-1,TIM-3,LAG-3,GITR,CD137,ICOS,CD28,CD27,HVEM,BTLA,VISTA,CCR8,TIGIT,CD4,ARHGEF6,IKZF1,PTPRC,DOCK2,CCR4,CCR5,IL21R,IL2RB,NCKAP1L,SLAMF1,ITGAL,IL10RA,P2RY10,IL2RA,FMNL1,DOCK10,ITK,SASH3,KIAA0748,LCP2,TNFRSF9(4-1BB，CD137)，CYBB和CTLA4)，免疫原性劑(例如，減毒的癌細胞，腫瘤抗原，抗原呈遞細胞，例如用腫瘤衍生的抗原或核酸脈沖的樹突細胞，免疫刺激細胞因子(例如IL-2，IFNα2，GM-CSF)，和用編碼免疫刺激細胞因子例如但不限于GM-CSF的基因轉染的細胞)。
在一些實施方案中，抗CCR4抗體特異性結合人CCR4。在一些實施方案中，抗CCR4抗體可以選擇性地耗竭CD4+T細胞。在一些實施方案中，抗CCR4抗體可以包含重鏈和輕鏈，其中重鏈和輕鏈包含圖4中所示的氨基酸序列(SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16)，前提是SEQ ID NO：15的C末端賴氨酸殘基任選不存在。
在所述治療方法、藥物和用途的所有上述實施方案中，4-1BB激動劑與4-1BB的細胞外結構域結合，并且能夠激動4-1BB。在上述治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，4-1BB激動劑是單克隆抗體或其抗原結合片段。
在一些實施方案中，所述分離的抗體在位于SEQ ID NO：26的氨基酸殘基115-156中的表位處結合人4-1BB。在一些實施方案中，所述抗體包含SEQ ID NO：27的H-CDR1氨基酸序列、SEQ ID NO：28的H-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：29的H-CDR3氨基酸序列。在一些實施方案中，所述4-1BB激動劑是單克隆抗體或其抗原結合片段，其包含SEQ ID NO：30的L-CDR1氨基酸序列，SEQ ID NO：31的L-CDR2氨基酸序列和SEQ ID NO：32的L-CDR3氨基酸序列。
在一些實施方案中，4-1BB激動劑是單克隆抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO：19所示的重鏈可變區氨基酸序列。
在一些實施方案中，4-1BB激動劑是單克隆抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO：20所示的輕鏈可變區氨基酸序列。
在一些實施方案中，4-1BB激動劑是單克隆抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO：19所示的重鏈可變區氨基酸序列，并且還包含如SEQ ID NO：20所示的輕鏈可變區氨基酸序列。
在一些實施方案中，4-1BB激動劑是單克隆抗體或其抗原結合片段，其包含如SEQ ID NO：21所示的重鏈氨基酸序列，并且還包含如SEQ ID NO：22所示的輕鏈氨基酸序列，條件是SEQ ID NO：21的C末端賴氨酸殘基任選不存在。
在本發明的上述治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，所述個體是人，并且癌癥是實體瘤，并且在一些實施方案中，實體瘤是膀胱癌，乳腺癌，透明細胞腎癌，結腸癌，頭/頸鱗狀細胞癌，直腸癌，肺鱗狀細胞癌，甲狀腺癌，膀胱癌，宮頸癌，子宮癌，子宮內膜癌，肺腺癌，卵巢癌，乳頭狀腎癌，惡性黑素瘤，非小細胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，腎細胞癌，小細胞肺癌(SCLC)或三陰性乳腺癌。在一些實施方案中，所述癌癥是晚期實體瘤惡性腫瘤。
在本發明的上述治療方法、藥物和用途的其它實施方案中，所述個體是人，并且所述癌癥是血紅素惡性腫瘤，并且在一些實施方案中，所述血紅素惡性腫瘤是急性成淋巴細胞白血病(ALL)，急性骨髓性白血病(AML)，慢性成淋巴細胞白血病(CLL)，慢性骨髓性白血病(CML)，彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)，EBV陽性DLBCL，原發性縱隔大B細胞淋巴瘤，T細胞/組織細胞富集大B細胞淋巴瘤，濾泡性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(HL)，套細胞淋巴瘤(MCL)，多發性骨髓瘤(MM)，骨髓細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)，骨髓增生異常綜合征(MDS)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)，或小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)。
在任何上述治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，癌癥對于CCR4的表達測試為陽性。在一些實施方案中，癌癥具有升高的CCR4表達。
在任何上述治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，所述個體是人，并且所述癌癥是對人CCR4測試為陽性的晚期實體瘤。
附圖簡述
圖1描述了用于本發明的示例性抗CCR4單克隆抗體的輕鏈和重鏈CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO：1-6)。
圖2描述了用于本發明的另一個示例性抗CCR4單克隆抗體的輕鏈和重鏈CDR的氨基酸序列(SEQ ID NO：7-12)。
圖3描述了用于本發明的示例性抗CCR4單克隆抗體的重鏈可變區和輕鏈可變區的氨基酸序列(SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14)。
圖4描述了抗CCR4單克隆抗體KW-0761的全長重鏈和輕鏈的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：15和16)，以及抗CCR4單克隆抗體KW-0761的重鏈和輕鏈可變區的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：17和18)。
圖5描述了抗-PD-1抗體納武單抗(nivolumab)的重鏈和輕鏈的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：23和24)。
圖6描述了4-1BB激發型抗體的重鏈和輕鏈可變區的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：19和20)。
圖7描述了4-1BB激發型抗體的重鏈CDR序列(SEQ ID NO：27、28和29)和輕鏈CDR序列(SEQ ID NO：30、31和32)的氨基酸序列。
圖8描述了PF-05082566的重鏈和輕鏈的氨基酸序列(分別為SEQ ID NO：21和22)。
圖9描繪了顯示在B16黑素瘤模型中CD4+T細胞耗竭對4-1BB激發型抗體治療、PD-1拮抗劑抗體治療和組合治療的影響的圖。
圖10描述了顯示在CT26結腸腫瘤模型中CD4+T細胞耗竭對4-1BB激發型抗體治療、PD-1拮抗劑抗體治療和組合治療的影響的圖。
詳述
縮寫。在本發明的詳細描述和實施例中，將使用以下縮寫：
BID 一個劑量，每日兩次
CDR 互補決定區
CHO 中華倉鼠卵巢
DFS 無疾病存活
DLT 劑量限制性毒性
FFPE 經福爾馬林固定、石蠟包埋的
FR 構架區
HNSC 頭/頸鱗狀細胞癌。
IgG 免疫球蛋白G
IHC 免疫組織化學或免疫組織化學的
MDSC 髓源性抑制細胞
MTD 最大耐受劑量
NCBI 國家生物技術信息中心
NCI 國家癌癥研究所
OR 總體反應
OS 總體存活
PD 進行性疾病
PFS 無進展存活
PR 部分反應
Q1W 每一周一個劑量
Q2W 每兩周一個劑量
Q3W 每三周一個劑量
Q4W 每四周一個劑量
QD 每天一個劑量
RECIST 實體腫瘤中的應答評價標準
SD 病情穩定
VH 免疫球蛋白重鏈可變區
VK 免疫球蛋白κ輕鏈可變區
I.定義
為了使本發明更容易理解，某些技術和科學術語在下面具體定義。除非在本文的其它地方具體定義，否則本文使用的所有其它技術和科學術語具有本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的含義。
當用于修飾數字限定的參數(例如，抗CCR4抗體或4-1BB激動劑的劑量或本文所述的組合治療的治療時間的長度)時，“約”意指參數可以在該參數的規定數值之上或之下多至10％上變化。例如，約5mg/kg的劑量可以在4.5mg/kg和5.5mg/kg之間變化。
如本文包括所附權利要求書中所使用的，除非上下文另有明確說明，否則單數形式的詞例如“一種”、“一個”和“該”包括它們相應的復數形式。
當應用于動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，“施用”和“治療”是指外源藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體接觸。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中流體與細胞接觸。“施用”和“治療”還指通過試劑、診斷劑、結合化合物或通過另一種細胞體外和離體處理例如細胞。術語“受試者”包括任何生物體，優選動物，更優選哺乳動物(例如大鼠，小鼠，狗，貓，兔)，最優選人。
術語“藥學上可接受的載體”是指適合用于遞送結合分子的制劑中的任何無活性物質。載體可以是抗粘附劑，粘合劑，包衣，崩解劑，填充劑或稀釋劑，防腐劑(例如抗氧化劑，抗細菌劑或抗真菌劑)，甜味劑，吸收延遲劑，潤濕劑，乳化劑，緩沖劑等。合適的藥學上可接受的載體的實例包括水，乙醇，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)右旋糖，植物油(例如橄欖油)，鹽水，緩沖液，緩沖鹽水，和等滲劑，例如糖，多元醇，山梨醇和氯化鈉。
如本文所用，術語“抗體”是指表現出所需生物或結合活性的任何形式的免疫球蛋白分子。因此，其以最廣泛的含義使用，并且具體涵蓋但不限于單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)，多克隆抗體，多特異性抗體(例如雙特異性抗體)，人源化、完全人抗體，嵌合抗體和駱駝化單域抗體。“親本抗體”是通過在針對預期用途修飾抗體(例如用作人類治療劑的抗體的人源化)之前將免疫系統暴露于抗原而獲得的抗體。如本文所用，術語“抗體”不僅包括完整的多克隆或單克隆抗體，而且除非另有說明，還包括與完整抗體競爭特異性結合的其任何抗原結合部分，包含抗原結合部分的融合蛋白，以及包含抗原識別位點的免疫球蛋白分子的任何其它修飾構型。抗原結合部分包括例如Fab，Fab'，F(ab')2，Fd，Fv，結構域抗體(dAb，例如鯊魚和駱駝抗體)，包含互補決定區(CDR)的片段，單鏈可變片段抗體(scFv)，最大抗體，微型抗體，胞內抗體，雙抗體，三抗體，四抗體，v-NAR和雙scFv，以及含有免疫球蛋白的至少一部分(足以賦予多肽特異性的抗原結合)的多肽。抗體包括任何類別的抗體，例如IgG，IgA或IgM(或其亞類)，并且抗體不需要是任何特定類別。取決于其重鏈恒定區的抗體氨基酸序列，免疫球蛋白可以歸于不同類別。有五種主要類別的免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中幾種可以進一步分為亞類(同種型)，例如IgG1,IgG2,IgG3,IgG4,IgA1和IgA2。對應于不同類別的免疫球蛋白的重鏈恒定區分別稱為α，δ，ε，γ和μ。不同類別的免疫球蛋白的亞基結構和三維構型是公知的。
本文所用的術語“4-1BB抗體”是指能夠結合人4-1BB受體的如本文定義的抗體。
如本文所用的“可變區”或“V區”或“V鏈”是指在不同抗體之間在序列上可變的IgG鏈的區段。它延伸到輕鏈中的Kabat殘基109和重鏈中的Kabat殘基113。抗體的“可變區”指單獨或組合的抗體輕鏈的可變區或抗體重鏈的可變區。通常，重鏈和輕鏈的可變區包含位于相對保守的構架區(FR)內的三個高變區，也稱為互補決定區(CDR)。CDR通常通過構架區排列，以使得能夠結合特定表位。一般來說，從N末端到C末端，輕鏈和重鏈可變結構域都包含FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3和FR4。通常，每個結構域的氨基酸的分配符合Sequences of Proteins of Immunological Interest,Kabat,等人；National Institutes of Health,Bethesda,Md.；5th ed.；NIH出版號91-3242(1991)；Kabat(1978)Adv.Prot.Chem.32:1-75；Kabat,等人,(1977)J.Biol.Chem.252:6609-6616；Chothia,等人,(1987)J Mol.Biol.196:901-917或Chothia,等人,(1989)Nature 342:878-883的定義。
如本文所用，術語“高變區”是指負責抗原結合的抗體的氨基酸殘基。高變區包含來自“互補決定區”或“CDR”(即輕鏈可變結構域中的CDRL1，CDRL2和CDRL3以及重鏈可變結構域中的CDRH1，CDRH2和CDRH3)的氨基酸殘基。參見Kabat等人.(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed。Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.(通過序列定義抗體的CDR區)；也參見Chothia和Lesk(1987)Biol.196：901-917(通過結構定義抗體的CDR區)。如本文所用，術語“構架”或“FR”殘基指除本文定義為CDR殘基的高變區殘基外的那些可變結構域殘基。
除非另有說明，否則本文所用的“抗體片段”或“抗原結合片段”是指抗體的抗原結合片段，即保留特異性結合由全長抗體結合的抗原的能力的抗體片段，例如保留一個或多個CDR區的片段。抗體結合片段的實例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子，例如sc-Fv；由抗體片段形成的多特異性抗體和納米抗體。
“特異性結合”特定靶蛋白的抗體是與其它蛋白相比顯示優先結合該靶的抗體，但該特異性不需要絕對的結合特異性。如果其結合決定了樣品中靶蛋白的存在，例如沒有產生不希望的結果如假陽性，則抗體被認為針對其預期靶是“特異性”的。本發明中有用的抗體將以是與非靶蛋白的親和力的至少2倍，優選至少10倍，更優選至少20倍，最優選至少100倍的親和力結合靶蛋白。如本文所用，抗體被認為特異性結合包含給定的氨基酸序列例如成熟人PD-1或人PD-L1分子的氨基酸序列的多肽，前提是其結合包含該序列的多肽但不結合缺少該序列的蛋白質。
“嵌合抗體”是指其中重鏈和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種(例如，人)或屬于特定抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源，而鏈的其余部分與衍生自另一物種(例如小鼠)或屬于另一抗體類別或亞類的抗體中的相應序列相同或同源的抗體，以及此類抗體的片段，只要它們顯示出所需的生物活性。
“人抗體”是指僅包含人免疫球蛋白序列的抗體。如果在小鼠、小鼠細胞或源自小鼠細胞的雜交瘤中產生，人抗體可以包含鼠碳水化合物鏈。類似地，“小鼠抗體”或“大鼠抗體”是指分別僅包含小鼠或大鼠免疫球蛋白序列的抗體。
“人源化抗體”是指包含來自非人(例如鼠)抗體以及人抗體的序列的抗體形式。這樣的抗體含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。通常，人源化抗體將包含基本上所有至少一個，通常兩個可變結構域，其中所有或基本上所有的高變環對應于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR區是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗體任選地還將包含免疫球蛋白恒定區(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白的恒定區。當必要時將前綴“hum”，“hu”或“h”添加到抗體克隆名稱中，以將人源化抗體與親本嚙齒動物抗體區分開。嚙齒動物抗體的人源化形式通常包含親本嚙齒動物抗體的相同CDR序列，盡管可包括某些氨基酸取代以增加親和力，增加人源化抗體的穩定性或出于其它原因。
術語“癌癥”、“癌性”或“惡性”是指或描述哺乳動物中通常特征在于不受調節的細胞生長的生理狀況。癌癥的實例包括但不限于癌，淋巴瘤，白血病，胚細胞瘤和肉瘤。這種癌癥的更具體的實例包括鱗狀細胞癌，肺腺癌，頭/頸鱗狀細胞癌，骨髓瘤，小細胞肺癌，非小細胞肺癌，神經膠質瘤，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，急性骨髓性白血病(AML)，多發性骨髓瘤，胃腸(道)癌，直腸癌，腎癌，卵巢癌，肝癌，成淋巴細胞白血病，淋巴細胞性白血病，結腸直腸癌，子宮內膜癌，腎癌，前列腺癌，甲狀腺癌，黑素瘤，軟骨肉瘤，神經母細胞瘤，胰腺癌，多形性成膠質細胞瘤，骨癌，尤因氏肉瘤，宮頸癌，腦癌，胃癌，膀胱癌，肝癌，乳腺癌，結腸癌，子宮癌，卵巢癌和頭頸癌。涉及4-1BB或CCR4的多種癌癥，無論是惡性的還是良性的，無論是原發性還是繼發性的，可以通過本公開內容提供的方法治療或預防。可根據本發明治療的特別優選的癌癥包括特征為在測試的組織樣品中表達CCR4的那些癌癥。
“生物治療劑”是指在支持腫瘤維持和/或生長或抑制抗腫瘤免疫應答的任何生物學途徑中阻斷配體/受體信號傳導的生物分子，例如抗體或融合蛋白。
除非另有說明，本文所用的“CDR”是指使用Kabat編號系統定義的免疫球蛋白可變區中的互補決定區。
“化療劑”是指可以引起癌細胞死亡或干擾癌細胞的生長、分裂、修復和/或功能的化學或生物物質。化療劑的實例包括公開于WO 2006/129163和US 20060153808中的那些，其公開內容通過引用并入本文。化療劑的類別包括但不限于：烷化劑，抗代謝物，激酶抑制劑，紡錘體毒物植物生物堿，細胞毒性/抗腫瘤抗生素，拓撲異構酶抑制劑，光敏劑，抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，抗孕酮，雌激素受體下調劑(ERD)，雌激素受體拮抗劑，黃體生成素釋放激素激動劑，抗雄激素，芳香酶抑制劑，EGFR抑制劑，VEGF抑制劑，抑制與異常細胞增殖或腫瘤生長相關的基因的表達的反義寡核苷酸。可用于本發明的治療方法的化療劑包括細胞抑制劑和/或細胞毒劑。
本公開內容提供的抗體和組合物可以通過任何合適的腸內施用途徑或胃腸外施用途徑施用。術語施用的“腸內途徑”是指經由胃腸道的任何部分的施用。腸內途徑的實例包括口服、粘膜、頰和直腸途徑或胃內途徑。“腸胃外途徑”是指腸內途徑以外的施用途徑。腸胃外施用途徑的實例包括靜脈內，肌內，皮內，腹膜內，腫瘤內，膀胱內，動脈內，鞘內，囊內，眶內，心內，經氣管，關節內，囊下，蛛網膜下，脊柱內，硬膜外和胸骨內，皮下或局部施用。本公開內容的抗體和組合物可以使用任何合適的方法施用，例如通過口服攝取，鼻胃管，胃造口術管，注射，輸注，可植入輸注泵和滲透泵。施用的合適途徑和方法可以根據許多因素而變化，所述因素例如是所用的特異性抗體，所需的吸收速率，所用的具體制劑或劑型，所治療疾病的類型或嚴重程度，作用的具體位點，和患者的狀況，并且可以由本領域技術人員容易地選擇。
本文所用的關于藥物施用的術語“同時施用”是指施用藥物，以使得個體藥物同時存在于受試者體內。除了同時施用藥物(通過相同或替代途徑)外，同時施用還可包括在不同時間施用藥物(通過相同或替代途徑)。
具有效應A和B的兩種單一化合物的Bliss獨立組合反應C為C＝A+B-A*B，其中每種效應表示為0和1之間的分數抑制。(參考：Bliss(1939)Annals of Applied Biology)被定義為實驗響應和計算的Bliss獨立值之間的差的Bliss值表明組合的兩種化合物是否是加性的或協同的。
零(0)的Bliss值被認為是加性的。術語“加性的”是指兩種靶向試劑的組合的結果是單獨每種試劑的總和。
本文所用的“Chothia”是指在Al-Lazikani等，JMB 273：927-948(1997)中描述的抗體編號系統。
“保守性修飾的變體”或“保守性取代”是指用具有相似特征(例如電荷，側鏈大小，疏水性/親水性，骨架構象和剛性等)的其它氨基酸取代蛋白質中的氨基酸，以使得可以頻繁地進行改變而不改變蛋白質的生物活性或其它所需性質，例如抗原親和力和/或特異性。通常，本領域技術人員認識到，多肽的非必需區域中的單個氨基酸取代基本上不改變生物活性(參見例如Watson等人(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁(第4版))。此外，結構上或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破壞生物活性。示例性保守取代列于下表1中。
表1.示例性保守氨基酸取代
在整個說明書和權利要求書中使用的“基本上由...組成”及其變體，例如“基本由...組成”或“大體上由...組成”表示包括任何列舉的元素或元素組，以及任選地包括與所列舉的元素具有相似或不同性質的其它元素，其不會實質上改變所指定的劑量方案、方法或組合物的基本或新穎性質。作為非限制性實例，基本上由所列舉的氨基酸序列組成的抗CCR4抗體還可以包括一個或多個氨基酸(包括一個或多個氨基酸殘基的取代)，其不會實質上影響結合化合物的性質。
“抗CCR4抗體”是指特異性結合CCR4的抗體。
如本文所用，抗人CCR4是指特異性結合人CCR4的抗體。一個示例性人CCR4分子由以下序列組成：
MNPTDIADTT LDESIYSNYY LYESIPKPCT KEGIKAFGEL FLPPLYSLVF VFGLLGNSVV VLVLFKYKRL RSMTDVYLLN LAISDLLFVF SLPFWGYYAA DQWVFGLGLC KMISWMYLVG FYSGIFFVML MSIDRYLAIV HAVFSLRART LTYGVITSLA TWSVAVFASL PGFLFSTCYT ERNHTYCKTK YSLNSTTWKV LSSLEINILG LVIPLGIMLF CYSMIIRTLQ HCKNEKKNKA VKMIFAVVVL FLGFWTPYNI VLFLETLVEL EVLQDCTFER YLDYAIQATE TLAFVHCCLN PIIYFFLGEK FRKYILQLFK TCRGLFVLCQ YCGLLQIYSA DTPSSSYTQS TMDHDLHDAL (SEQ ID NO：25)(UniProtKB/SWISS-PROT：P51679.1；GenBank登錄號NM_005508.2)。
本文所用的“構架區”或“FR”是指排除CDR區的免疫球蛋白可變區。
“同源性”是指兩個多肽序列在最佳比對時的序列相似性。當兩個比較的序列兩者中的位置被相同的氨基酸單體亞單位占據時，例如，如果兩個不同Ab的輕鏈CDR中的一個位置被丙氨酸占據，則兩個Ab在該位置是同源的。同源性百分比是由兩個序列共有的同源位置的數目除以比較的位置的總數再×100。例如，如果兩個序列中10個位置中的8個在序列最佳比對時匹配或同源，則兩個序列是80％同源的。通常，當兩個序列比對以產生最大百分比同源性時進行比較。例如，可以通過BLAST算法執行比較，其中選擇算法的參數以在各個參考序列的整個長度上給出各個序列之間的最大匹配。
以下參考文獻涉及經常用于序列分析的BLAST算法：BLAST ALGORITHMS:Altschul,S.F.,等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403-410；Gish,W.,等人,(1993)Nature Genet.3:266-272；Madden,T.L.,等人,(1996)Meth.Enzymol.266:131-141；Altschul,S.F.,等人,(1997)Nucleic Acids Res.25:3389-3402；Zhang,J.,等人,(1997)Genome Res.7:649-656；Wootton,J.C.,等人,(1993)Comput.Chem.17:149-163；Hancock,J.M.等人,(1994)Comput.Appl.Biosci.10:67-70；ALIGNMENT SCORING SYSTEMS:Dayhoff,M.O.,等人,"A model of evolutionary change in proteins."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3.M.O.Dayhoff(ed.),pp.345-352,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Schwartz,R.M.,等人,"Matrices for detecting distant relationships."in Atlas of Protein Sequence and Structure,(1978)vol.5,suppl.3."M.O.Dayhoff(ed.),pp.353-358,Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,DC；Altschul,S.F.,(1991)J.Mol.Biol.219:555-565；States,D.J.,等人,(1991)Methods 3:66-70；Henikoff,S.,等人,(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915-10919；Altschul,S.F.,等人,(1993)J.Mol.Evol.36:290-300；ALIGNMENT STATISTICS:Karlin,S.,等人,(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:2264-2268；Karlin,S.,等人,(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:5873-5877；Dembo,A.,等人,(1994)Ann.Prob.22:2022-2039；和Altschul,S.F."Evaluating the statistical significance of multiple distinct local alignments."in Theoretical and Computational Methods in Genome Research(S.Suhai,ed.),(1997)pp.1-14,Plenum,New York。
“分離的抗體”和“分離的抗體片段”是指純化狀態，并且在這樣的上下文中是指所述分子基本上不含其它生物分子，例如核酸，蛋白質，脂質，碳水化合物或其它材料，例如細胞碎片和生長介質。通常，術語“分離的”不意指完全不存在這樣的物質或不存在水、緩沖液或鹽，除非它們以基本上干擾如本文所述的結合化合物的實驗或治療用途的量存在。
本文所用的“Kabat”是指由Elvin A.Kabat((1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，Md.)開創的免疫球蛋白比對和編號系統。
如本文所使用的，“單克隆抗體”或“mAb”或“Mab”是指基本上同質的抗體群，即包含在氨基酸序列上除了可能的可少量存在的天然存在的突變以外是相同的群體的抗體分子。相比之下，常規(多克隆)抗體制備物通常包括在其可變結構域特別是其CDR中具有不同氨基酸序列的多種不同抗體，其通常特異于不同表位。修飾語“單克隆”表示如從基本上同質的抗體群體獲得的抗體的特征，并且不應解釋為需要通過任何特定方法產生抗體。例如，根據本發明使用的單克隆抗體可以通過Kohler等人(1975)Nature 256：495首先描述的雜交瘤方法制備，或者可以通過重組DNA方法制備(參見例如美國專利號4,816,567)。“單克隆抗體”還可以使用例如Clackson等人(1991)Nature 352：624-628和Marks等人(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技術從噬菌體抗體文庫中分離。還參見Presta(2005)J.Allergy Clin.Immunol.116:731。
“患者”或“受試者”是指需要治療或正參與臨床試驗、流行病學研究或用作對照的任何單個受試者，包括人和哺乳動物獸醫患者，例如牛、馬、狗和貓。
結合人CCR4并且可用于本發明的治療方法、藥物和用途的mAb的實例描述于例如US8491902和US20110171210中。在本發明的治療方法、藥物和用途中用作抗CCR4抗體的特異性抗人CCR4 mAb包括：KW-0761，其具有CAS登記號1159266-37-1的人源化IgG1 mAb，并且包含圖4所示的重鏈和輕鏈氨基酸序列；和US20110171210中描述的人源化抗體huCCR4，其包含圖3所示的重鏈和輕鏈可變區氨基酸序列。
在本發明的治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，抗CCR4抗體是單克隆抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)輕鏈CDR SEQ ID NO：1、2和3以及重鏈CDR SEQ ID NO：4、5和6；或(b)輕鏈CDR SEQ ID NO：7、8和9以及重鏈CDR SEQ ID NO：10、11和12。
在本發明的治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，抗CCR4抗體是特異性結合人CCR4的單克隆抗體，并且包含(a)包含SEQ ID NO：13的重鏈可變區和(b)包含SEQ ID NO：14的輕鏈可變區。
在本發明的治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，抗CCR4抗體是特異性結合人CCR4的單克隆抗體，并且包含(a)包含SEQ ID NO：15的重鏈和(b)包含SEQ ID NO：16的輕鏈。
下表2提供了用于本發明的治療方法、藥物和用途的示例性抗CCR4 mAb的氨基酸序列的列表，并且序列顯示在圖1-4中。
“持續反應”意指在停止用治療劑或本文所述的組合療法治療后的持續治療效果。在一些實施方案中，持續反應具有至少與治療持續時間相同的持續時間，或為治療持續時間的至少約1.5、2.0、2.5或3倍。
術語“協同作用”或“協同的”用于表示兩種藥劑的組合的反應大于每種藥劑的單獨反應的總和。更具體地，在體外設置中，協同作用的一種量度被稱為“Bliss協同作用”。Bliss協同作用是指“超過Bliss獨立性的過量(excess over Bliss independence)”，如通過上述Bliss值所確定的。當Bliss值大于零(0)，或更優選大于0.2時，認為其表示協同作用。當然，本文中“協同作用”的使用還包括通過其它和/或替代方法測量的體外協同作用。本文提及的組合的體外生物效應(包括但不限于抗癌作用，其大于或等于組合的單獨組分的總和)可與Bliss值相關。此外，本文中的“協同作用”，包括組分的組合是否表現出等于或大于單獨組分的總和的活性，可以通過另外的和/或替代的方法測量，并且是本領域技術人員已知的或將是明顯的。
“組織切片”是指組織樣品的單個部分或塊，例如從正常組織或腫瘤的樣品切割的薄切片組織。
本文所用的“治療”或“醫治”癌癥是指對患有癌癥或被診斷患有癌癥的受試者施用抗CCR4抗體和4-1BB激動劑的組合療法，以實現至少一種積極的治療效果，例如癌細胞數目減少，腫瘤尺寸減小，癌細胞浸潤到外周器官中的速率降低或腫瘤轉移或腫瘤生長速率降低。癌癥中的積極治療效果可以以多種方式測量(參見，W.A.Weber，J.Nucl.Med.50：1S-10S(2009))。例如，對于腫瘤生長抑制，根據NCI標準，T/C≤42％是抗腫瘤活性的最低水平。T/C<10％被認為是高抗腫瘤活性水平，其中T/C(％)＝治療的中值腫瘤體積/對照的中值腫瘤體積×100。在一些實施方案中，通過本發明的組合實現的治療是PR、CR、OR、PFS、DFS和OS中的任一種。PFS(也稱為“腫瘤進展時間”)表示治療期間和之后癌癥不生長的時間長度，并且包括患者經歷CR或PR的時間量，以及患者經歷SD的時間量。DFS是指治療期間和治療后患者保持無疾病的時間長度。OS是指與未處理或未治療的個體或患者相比，壽命預期的延長。在一些實施方案中，對本發明組合的反應是使用RECIST 1.1反應標準評估的PR、CR、PFS、DFS、OR或OS中的任一種。用于本發明的組合的有效治療癌癥患者的治療方案可以根據諸如患者的疾病狀態、年齡和體重的因素以及治療在受試者中引起抗癌反應的能力而變化。雖然本發明的任何方面的實施方案可能不能有效地在每個受試者中獲得積極的治療效果，但是它應該在統計學顯著數量的受試者中如此，如通過本領域已知的任何統計學測試所確定的，例如學生氏t檢驗，chi2-檢驗，根據Mann和Whitney的U檢驗，Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)，Jonckheere-Terpstra檢驗和Wilcoxon檢驗。
術語“治療方案”、“給藥方案”和“施用方案”可互換使用來指本發明的組合中的每種治療劑的施用劑量和時間。
當應用于診斷患有或懷疑患有癌癥的受試者時，“腫瘤”是指任何大小的惡性或潛在惡性腫瘤或組織塊，并且包括原發性腫瘤和繼發性腫瘤。實體瘤是通常不包含囊腫或液體區域的異常生長的組織塊。不同類型的實體瘤根據形成它們的細胞類型來命名。實體瘤的實例是肉瘤、癌和淋巴瘤。白血病(血液癌癥)通常不形成實體瘤(National Cancer Institute，Dictionary of Cancer Terms)。
“腫瘤負荷”也稱為“腫瘤負擔”，是指分布在整個身體中的腫瘤物質的總量。腫瘤負荷是指在整個身體包括淋巴結和骨髓中的癌細胞的總數或腫瘤的總大小。可以通過本領域已知的多種方法測定腫瘤負荷，例如，通過在從受試者移除后測量腫瘤的尺寸，例如使用測徑器，或通過在體內時使用成像技術(例如超聲，骨掃描，計算機斷層攝影(CT)或磁共振成像(MRI)掃描)。
術語“腫瘤大小”是指可被測量為腫瘤的長度和寬度的腫瘤的總大小。腫瘤大小可以通過本領域已知的多種方法測定，例如，通過在從受試者移除后測量腫瘤的尺寸，例如使用測徑器，或通過在體內時使用成像技術(例如骨掃描，超聲，CT或MRI掃描)。
4-1BB包含信號序列(氨基酸殘基1-17)，其后是胞外結構域(169個氨基酸)，跨膜區(27個氨基酸)和胞內結構域(42個氨基酸)(Cheuk ATC等人,2004Cancer Gene Therapy 11：215-226)。受體在細胞表面上以單體和二聚體形式表達，并且可能與4-1BB配體三聚化以傳導信號。
在幼稚T細胞的表面上不能檢測到4-1BB，但是在激活時表達增加。在4-1BB激活時，作為TNFR相關因子(TRAF)家族的促存活成員的TRAF-1和TRAF-2被募集到4-1BB胞質尾區，從而導致NFκB和有絲分裂原活化蛋白(MAP)激酶級聯(包括ERK，JNK和p38MAP激酶)的下游激活。NFκB活化導致Bcl-2家族的促存活成員Bfl-1和Bcl-XL的上調。促凋亡蛋白Bim以TRAF1和Erk依賴性方式下調(24)。
術語“4-1BB”和“4-1BB受體”在本申請中可互換使用，并且指任何形式的4-1BB受體，以及保留4-1BB受體的至少部分活性的其變體、同種型和物種同源物。因此，如本文定義和公開的結合分子也可以結合來自除人之外的物種的4-1BB。在其它情況下，結合分子可以完全特異于人4-1BB并且可不表現物種或其它類型的交叉反應性。除非另有說明，例如通過特別提及人4-1BB，否則4-1BB包括天然序列4-1BB的所有哺乳動物物種(例如人，犬，貓，馬和牛)。一個示例性人4-1BB是255個氨基酸的蛋白質(登錄號NM_001561；NP_001552)。完整的人4-1BB氨基酸序列的一個實施方案提供于SEQ ID NO：26。
本文所用的“4-1BB激動劑”是指本文定義的任何化學化合物或生物分子，其在結合4-1BB時，(1)刺激或激活4-1BB，(2)增強、增加、促進、誘導或延長4-1BB的活性、功能或存在，或(3)增強、增加、促進或誘導4-1BB的表達。
可用于本發明的任何治療方法、藥物和用途的4-1BB激動劑包括特異性結合4-1BB的單克隆抗體(mAb)或其抗原結合片段。4-1BB的替代名稱或同義詞包括CD137和TNFRSF9。在其中治療人類個體的本發明的任何治療方法、藥物和用途中，4-1BB激動劑增加4-1BB介導的反應。在本發明的治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，4-1BB激動劑顯著增強細胞毒性T細胞反應，從而在幾種模型中導致抗腫瘤活性。
mAb可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，并且可以包含人恒定區。在一些實施方案中，人恒定區選自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4恒定區，并且在一些實施方案中，人恒定區是IgG1或IgG4恒定區。在一些實施方案中，抗原結合片段選自Fab，Fab'-SH，F(ab')2，scFv和Fv片段。
結合人4-1BB并且可用于本發明的治療方法、藥物和用途的mAb的實例描述于US 8,337,850和US 2013-0078240中。在本發明的治療方法、藥物和用途中用作4-1BB激動劑的特異性抗人4-1BB mAb包括PF-05082566。PF-05082566是靶向4-1BB的完全人源化IgG2激發型單克隆抗體。
在本發明的治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，4-1BB激動劑是單克隆抗體或其抗原結合片段，其包含：(a)輕鏈CDR SEQ ID NO：30、31和32以及重鏈CDR SEQ ID NO：27、28和29。
在本發明的治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，4-1BB激動劑是特異性結合人4-1BB的單克隆抗體或其抗原結合片段，并且包含(a)包含SEQ ID NO：19的重鏈可變區或其變體，和(b)包含選自SEQ ID NO：20的氨基酸序列的輕鏈可變區或其變體。重鏈可變區序列的變體與參照序列相同，除了在構架區(即，CDR外部)具有高達17個保守氨基酸取代，并且在構架區中優選具有少于十，九，八，七，六或五個保守氨基酸取代。輕鏈可變區序列的變體與參照序列相同，除了在構架區(即，CDR外部)具有多達五個保守氨基酸取代，并且在構架區中優選具有少于四個，三個或兩個保守氨基酸取代。
在本發明的治療方法、藥物和用途的一些實施方案中，4-1BB激動劑是特異性結合人4-1BB的單克隆抗體，并且包含(a)如SEQ ID NO：21中所示的重鏈氨基酸序列和(b)如SEQ ID NO：22所示的輕鏈氨基酸序列，條件是SEQ ID NO：21的C末端賴氨酸殘基任選不存在。
“PD-1拮抗劑”是指阻斷癌細胞上表達的PD-L1與免疫細胞(T細胞，B細胞或NKT細胞)上表達的PD-1結合的任何化學化合物或生物分子，其優選還阻斷癌細胞上表達的PD-L2與免疫細胞表達的PD-1的結合。PD-1及其配體的替代名稱或同義詞包括：對于PD-1的PDCD1、PD1、CD279和SLEB2；對于PD-1的PDCD1L1、PDL1、B7H1、B7-4、CD274和B7-H；和對于PD-2的PDCD1L2、PDL2、B7-DC、Btdc和CD273。在其中治療人類個體的本發明的任何治療方法、藥物和用途中，抗PD-1抗體阻斷人PD-L1與人PD-1的結合，并且優選阻斷人PD-L1和PD-L2結合人PD1。示例性人PD-1氨基酸序列可以在NCBI Locus No.:NP_005009中找到。示例性人PD-L1和PD-L2氨基酸序列可以分別在NCBI Locus No.:NP_054862和NP_079515中找到。
可用于本發明的任何治療方法、藥物和用途的PD-1拮抗劑包括特異性結合PD-1或PD-L1以及優選特異性結合人PD-1或人PD-L1的單克隆抗體(mAb)或其抗原結合片段。mAb可以是人抗體、人源化抗體或嵌合抗體，并且可以包括人恒定區。在一些實施方案中，人恒定區選自IgG1，IgG2，IgG3和IgG4恒定區，并且在一些實施方案中，人恒定區是IgG1或IgG4恒定區。在一些實施方案中，抗原結合片段選自Fab，Fab'-SH，F(ab')2，scFv和Fv片段。
應當理解，無論何處在本文中用語言“包括”描述實施方案，否則也提供以術語“由......組成”和/或“基本上由......組成”描述的類似實施方案。
在本發明的方面或實施方案以馬庫什組或其它替代分組描述時，本發明不僅包括作為整體列出的整個組，而且單獨地包括該組的每個成員和主要組的所有可能的亞組，以及沒有一個或多個組成員的主要組。本發明還設想明確排除所要求保護的發明中的任何組成員中的一個或多個。
除非另有定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與本發明所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。在沖突的情況下，以本說明書(包括定義)為準。在整個說明書和權利要求書中，詞語“包括”或其變形例如“含有”或“包含”將被理解為暗示包括所述的整數或整數組，但不排除任何其它整數或整數組。除非上下文另有要求，否則單數術語應包括復數，復數術語應包括單數。術語“例如”或“諸如”之后的任何實例不意味著是窮盡的或限制性的。
本文描述了示例性方法和材料，盡管與本文所述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可以用于本發明的實踐或測試中。材料、方法和實例僅是舉例說明性的，而不是限制性的。
II.方法、用途和藥物
本文提供了用于治療個體中癌癥的方法，包括向個體施用包含抗CCR4抗體和4-1BB激動劑的組合療法。在一些實施方案中，組合療法包括抗CCR4抗體、4-1BB激動劑和PD-1拮抗劑。
組合療法還可以包含一種或多種另外的治療劑。另外的治療劑可以是例如化療劑，生物治療劑(包括但不限于針對VEGF，VEGFR，EGFR，Her2/neu，其它生長因子受體，CD20,CD40,CD-40L,CTLA-4,OX-40,4-1BB,PD-1,TIM-3,LAG-3,GITR,CD137,ICOS,CD28,CD27,HVEM,BTLA,VISTA,CCR8,TIGIT,CD4,ARHGEF6,IKZF1,PTPRC,DOCK2,CCR4,CCR5,IL21R,IL2RB,NCKAP1L,SLAMF1,ITGAL,IL10RA,P2RY10,IL2RA,FMNL1,DOCK10,ITK,SASH3,KIAA0748,LCP2,TNFRSF9(4-1BB，CD137)，CYBB和CTLA4)，免疫原性劑(例如，減毒的癌細胞，腫瘤抗原，抗原呈遞細胞，例如用腫瘤衍生的抗原或核酸脈沖的樹突細胞，免疫刺激細胞因子(例如IL-2，IFNα2，GM-CSF)，和用編碼免疫刺激細胞因子例如但不限于GM-CSF的基因轉染的細胞)。
化療劑的實例包括烷化劑，例如塞替派和環磷酰胺；烷基磺酸鹽，例如白消安，英丙舒凡和哌泊舒凡；氮丙啶類，例如苯并多巴，卡波醌，meturedopa和uredopa；乙烯亞胺和甲基蜜胺類包括六甲蜜胺，三乙撐蜜胺，三亞乙基磷酰胺，三亞乙基硫代磷酰胺和三羥甲基三聚氰胺；番荔枝內酯類(特別是牛磺草胺和布地那新)；喜樹堿(包括合成類似物托泊替康)；苔蘚抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多來新、卡折來新和比折來新合成類似物)；cryptophycin(特別是cryptophycin 1和cryptophycin 8)；多拉司他汀；多卡霉素(包括合成類似物KW-2189和CBI-TMI)；電穿孔素；水鬼蕉堿；sarcodictyin；海綿抑制素；氮芥，例如苯丁酸氮芥，萘氮芥，氯磷酰胺，雌莫司汀，異環磷酰胺，氮芥，鹽酸氧化氮芥，美法侖，諾維本，膽甾醇對苯乙酸氮芥，潑尼莫司汀，曲磷胺，尿嘧啶氮芥；亞硝基脲如卡莫司汀，氯唑菌素，福莫司汀，洛莫司汀，尼莫司汀，雷莫司汀；抗生素如烯二炔抗生素(例如卡奇霉素，特別是卡奇霉素γ1I和卡奇霉素參見例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl。，33：183-186(1994)；dynemicin，包括dynemicin A；雙膦酸鹽，例如氯屈膦酸鹽；埃斯波霉素；以及新制癌菌素發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)，aclacinomysins，放線菌素，authramycin，重氮絲氨酸，博萊霉素，放線菌素c，卡拉霉素，caminomycin，嗜癌霉素，色霉素，放線菌素D，柔紅霉素，地托比星，6-重氮基-5-氧-L-正亮氨酸，多柔比星(包括嗎啉代-多柔比星，氰嗎啉代-多柔比星，2-吡咯啉5-多柔比星和脫氧多柔比星)，表柔比星，依索比星，伊達比星，麻西羅霉素，絲裂霉素如絲裂霉素C，霉酚酸，諾加霉素，橄欖霉素，培霉素，potfiromycin，嘌呤霉素，三鐵阿霉素，羅多比星，鏈黑菌素，鏈脲菌素，殺結核菌素，烏苯美司，凈司他丁，佐柔比星；抗代謝物如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物例如二甲葉酸，甲氨蝶呤，蝶羅呤，三甲曲沙；嘌呤類似物如氟達拉濱，6-巰基嘌呤，硫咪嘌呤，硫鳥嘌呤；嘧啶類似物如安西他濱，阿扎胞苷，6-氮尿嘧啶，卡莫氟，阿糖胞苷，二脫氧尿苷，去氧氟尿苷，依諾他濱，氟尿苷；雄激素如卡普睪酮，丙酸甲雄烷酮，環硫雄醇，美雄烷，睪內酯；抗腎上腺藥如氨魯米特，米托坦，曲洛司坦；葉酸補充劑如糠酸；醛磷酰胺糖苷；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；edatraxate；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elformithine；依利醋銨；愛波喜龍；依托格魯；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；氯尼達明；美登木素生物堿如美坦辛和安絲菌素；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌達醇；硝氨丙吖啶；噴司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙肼；丙卡巴肼；丙亞胺；根瘤菌素；西佐呋喃；鍺螺胺；替奴佐酸；三亞胺醌；2,2′,2″-三氯三乙胺；單端孢霉烯(特別是T-2毒素，鞣花素A，桿孢菌素A和anguidine)；氨基甲酸乙酯；長春地辛；達卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；環磷酰胺；塞替哌；紫杉烷類，例如紫杉醇和多西他賽；苯丁酸氮芥；吉西他濱；6-硫鳥嘌呤；巰基嘌呤；甲氨蝶呤；鉑類似物如順鉑和卡鉑；長春堿；鉑；依托泊苷(VP-16)；異環磷酰胺；米托蒽醌；長春新堿；長春瑞濱；諾肖林；替尼泊苷；依達曲沙；道諾霉素；氨基蝶呤；希羅達；伊班膦酸鹽；CPT-11；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥氨酸(DMFO)；類維生素例如視黃酸；卡培他濱；以及任何上述的藥學上可接受的鹽，酸或衍生物。還包括用于調節或抑制對腫瘤的激素作用的抗激素劑，例如抗雌激素和選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫昔芬，雷洛昔芬，屈洛昔芬，4-羥基他莫昔芬，曲沃昔芬，雷洛昔芬，LY117018，奧那司酮和托瑞米芬(Fareston)；抑制芳香酶(其調節腎上腺中的雌激素產生)的芳香酶抑制劑，例如4(5)-咪唑，氨魯米特，乙酸甲地孕酮，依西美坦，福美斯坦，法曲唑，伏羅唑，來曲唑和阿那曲唑；和抗雄激素如氟他胺，尼魯米特，比卡魯胺，亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及任何上述的藥學上可接受的鹽，酸或衍生物。
本發明的組合療法中的每種治療劑可以單獨或在藥物(也稱為藥物組合物)中施用，所述藥物包含治療劑和一種或多種藥學上可接受的載體、賦形劑和稀釋劑，根據標準制藥實踐。
本發明的組合療法中的每種治療劑可以同時(即，在相同的藥物中)、并行(即，在以任何順序一個接一個地施用的單獨的藥物中)或以任何順序相繼施用。當組合治療中的治療劑是不同劑型(一種藥劑是片劑或膠囊，另一種藥劑是無菌液體)和/或以不同的給藥方案(，例如至少每天施用的化療劑和以更低頻率例如每周一次、每兩周一次或每三周一次施用的生物治療劑)施用時，相繼施用是特別有用的。
劑量單位可以以mg/kg(即mg/kg體重)或mg/m2表示。mg/m2劑量單位是指以毫克/平方米體表面積表示的量。
在一些情況下，將抗CCR4抗體和4-1BB激動劑組合或共配制在單一劑型中。
盡管可以在治療或預防的整個期間維持抗CCR4抗體和4-1BB激動劑的同時施用，但是也可以通過隨后單獨施用一種化合物實現抗癌活性(例如，在組合治療后，在沒有4-1BB激動劑的情況下施用抗CCR4抗體，或者替代地，在組合治療后，在沒有抗CCR4抗體的情況下施用4-1BB激動劑)。
在一些實施方案中，4-1BB激動劑在施用抗CCR4抗體之前施用，而在其它實施方案中，4-1BB激動劑在施用抗CCR4抗體之后施用。
在一些實施方案中，組合治療中的至少一種治療劑使用當藥劑用作治療相同癌癥的單一療法時通常使用的相同劑量方案(劑量，頻率和治療持續時間)來施用。在其它實施方案中，患者在組合治療中接受至少一種治療劑的比當藥劑用作單一療法時的更低的總量，例如較小劑量、較低頻率的劑量和/或較短的治療持續時間。
本發明的組合治療可以在手術除去腫瘤之前或之后使用，并且可以在放射治療之前、期間或之后使用。
在一些實施方案中，將本發明的組合治療施用于先前未用生物治療劑或化療劑治療的患者(即，是第一次治療的)。在其它實施方案中，將組合療法施用給在用生物治療劑或化療劑進行預先治療后未能實現持續反應的患者(即，是經歷了治療的)。
本發明的組合療法通常用于治療足夠大以通過觸診或通過本領域熟知的成像技術例如MRI、超聲或CAT掃描發現的腫瘤。在一些實施方案中，本發明的組合治療用于治療尺寸為至少約200mm3，300mm3，400mm3，500mm3，750mm3或高達1000mm3的晚期腫瘤。
本發明的組合治療優選施用于患有對CCR4表達測試為陽性的癌癥的人類患者。在一些實施方案中，在免疫組織化學(IHC)測定中，使用診斷性抗人CCR4抗體在從患者取出的腫瘤樣品的FFPE或冷凍組織切片上檢測CCR4表達。通常，患者的醫生將進行診斷測試以在開始用抗CCR4抗體和4-1BB激動劑治療之前確定從患者取出的腫瘤組織樣品中的CCR4表達，但是設想了醫生可以在開始治療之后的任何時間(例如在治療周期完成后)進行第一次或隨后的診斷測試。
在一個實施方案中，以對于任何治療是常規的方式來定制劑量方案以適應特定患者的病況、反應和聯合治療，并且劑量方案可能需要響應于病況的變化和/或鑒于其它臨床條件來調整。
在一些實施方案中，為本發明的組合治療選擇劑量方案(本文中也稱為施用方案)取決于若干因素，包括實體的血清或組織周轉率，癥狀水平，實體的免疫原性，以及被治療個體中靶細胞、組織或器官的可及性。優選地，劑量方案使遞送給患者的每種治療劑的量最大化，與可接受的副作用水平一致。因此，組合中每種生物治療劑和化療劑的劑量和給藥頻率部分地取決于特定的治療劑、所治療的癌癥的嚴重程度和患者特征。選擇適當劑量的抗體、細胞因子和小分子的指導是可獲得的。參見例如Wawrzynczak(1996)Antibody Therapy,Bios Scientific Pub.Ltd,Oxfordshire,UK；Kresina(ed.)(1991)Monoclonal Antibodies,Cytokines and Arthritis,Marcel Dekker,New York,NY；Bach(ed.)(1993)Monoclonal Antibodies and Peptide Therapy in Autoimmune Diseases,Marcel Dekker,New York,NY；Baert等人(2003)New Engl.J.Med.348:601-608；Milgrom等人(1999)New Engl.J.Med.341:1966-1973；Slamon等人(2001)New Engl.J.Med.344:783-792；Beniaminovitz等人(2000)New Engl.J.Med.342:613-619；Ghosh等人(2003)New Engl.J.Med.348:24-32；Lipsky等人(2000)New Engl.J.Med.343:1594-1602；Physicians'Desk Reference 2003(Physicians'Desk Reference,57th Ed)；Medical Economics Company；ISBN:1563634457；第57版(November 2002)。合適的劑量方案的確定可以由臨床醫生例如使用本領域已知或懷疑影響治療或預測影響治療的參數或因素進行，并且將取決于例如患者的臨床病史(例如，先前的治療)、待治療的癌癥的類型和階段以及在組合治療中對一種或多種治療劑的反應的生物標志物。
本發明的組合療法中的生物治療劑可以通過連續輸注施用，或以例如每天、每隔一天、每周三次或每周、每兩周、每三周、每月、每兩月一次等的間隔的劑量施用。總的每周劑量通常為至少約0.05μg/kg，0.2μg/kg，0.5μg/kg，1μg/kg，10μg/kg，100μg/kg，0.2mg/kg，1.0mg/kg，2.0mg/kg，10mg/kg，25mg/kg，50mg/kg體重或更多。參見，例如Yang等人(2003)New Engl.J.Med.349:427-434；Herold等人(2002)New Engl.J.Med.346:1692-1698；Liu等人(1999)J.Neurol.Neurosurg.Psych.67:451-456；Portielji等人(20003)Cancer Immunol.Immunother.52:133-144。
在采用抗人CCR4 mAb作為組合治療中的抗CCR4抗體的一些實施方案中，施用方案將包括在整個治療過程中以約7天(±2天)或14天(±2天)或約21天(±2天)或約30天(±2天)的間隔施用約0.5、1、2、3、5或10mg/kg劑量的抗人CCR4 mAb。
在使用抗人CCR4 mAb作為組合治療中的抗CCR4抗體的一些實施方案中，施用方案將包括以約0.005mg/kg至約10mg/kg的劑量施用抗人CCR4 mAb，其中患者內劑量逐漸上升。在其它遞增劑量實施方案中，劑量之間的間隔將逐漸縮短，例如第一和第二劑量之間約30天(±2天)，第二和第三劑量之間約14天(±2天)。在某些實施方案中，對于第二劑量之后的劑量，施用間隔將是約14天(±2天)。在某些實施方案中，對于第二劑量后的劑量，施用間隔為約7天(±2天)。
在一些實施方案中，將向受試者靜脈內(IV)輸注包含本文所述的任何抗CCR4抗體的藥物。
在一些實施方案中，組合治療中的抗CCR4抗體是KW-0761，其以選自以下的劑量靜脈內施用：約0.5mg/kg Q2W,1mg/kg Q2W,2mg/kg Q2W,3mg/kg Q2W,5mg/kg Q2W,10mg/kg Q2W,1mg/kg Q3W,2mg/kg Q3W,3mg/kg Q3W,5mg/kg Q3W和10mg/kg Q3W。在一些實施方案中，抗CCR4抗體作為液體藥物施用，其包含在pH 4-7的0.1-50mM檸檬酸鹽緩沖液中的0.01-150mg/mL KW-0761、10-30mg/mL甘氨酸，并且所選藥物劑量通過在約2小時的時間段內溶解在200-250mL鹽水中的IV輸注來施用。在另一個實施方案中，抗CCR4抗體作為液體藥物施用，其包含在pH 5.2-5.8的檸檬酸鹽緩沖液中的4mg/mL KW-0761、22.5mg/mL甘氨酸、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，并且所選藥物劑量通過在約2小時的時間段內溶解在200-250mL鹽水中的IV輸注來施用。
在一些實施方案中，組合治療中的抗CCR4抗體是KW-0761，其在液體藥物中以選自下列的劑量施用：0.5mg/kg Q1W,0.5mg/kg Q2W,1mg/kg Q1W,1mg/kg Q2W,2mg/kg Q2W,3mg/kg Q2W,5mg/kg Q2W,10mg/kg Q2W,1mg/kg Q3W,2mg/kg Q3W,3mg/kg Q3W,5mg/kg Q3W和10mg/kg Q3W。在一些實施方案中，KW-0761作為液體藥物施用，其包含在pH 5.5的10mM組氨酸緩沖液中的25mg/mL KW-0761、7％(w/v)蔗糖、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，并且所選的藥物劑量通過在約30分鐘的時間段內靜脈內輸注來施用。在另一個實施方案中，KW-0761作為液體藥物施用，其包含在pH 4-7的0.1-50mM檸檬酸鹽緩沖液中的0.01-150mg/mL KW-0761、10-30mg/mL甘氨酸，并且所選擇的藥物劑量通過在約2小時的時間段內溶解在200-250mL鹽水中的IV輸注來施用。在另一個實施方案中，KW-0761作為液體藥物施用，其包含在pH 5.2-5.8的檸檬酸鹽緩沖液中的4mg/mL KW-0761、22.5mg/mL甘氨酸、0.02％(w/v)聚山梨醇酯80，并且所選的藥物劑量通過溶解在200-250mL鹽水中的IV輸注在約2小時的時間段內施用。
在一些實施方案中，組合治療中的4-1BB激動劑是PF-05082566，其在液體藥物中以選自下列的劑量施用：0.24mg/ml Q2W,1.2mg/kg Q2W,2.4mg/kg Q2W,3mg/kg Q2W,5mg/kg Q2W,10mg Q2W,0.24mg/ml Q3W,1.2mg/kg Q3W,2.4mg/kg Q3W,3mg/kg Q3W,5mg/kg Q3W和10mg Q3W，包括等效的固定劑量。在一些實施方案中，PF-05082566作為液體藥物施用，并且所選劑量的藥物通過IV輸注在約60分鐘的時間段內施用。
KW-0761與PF-05082566組合的最佳劑量可以通過這些藥劑中的一種或兩種的劑量遞增來鑒定。
在一個實施方案中，KW-0761以1.0mg/kg Q2W的起始劑量施用，PF-05082566以0.24mg/kg，0.3mg/kg，0.6mg/kg，1.2mg//kg，2.4mg/kg，5mg/kg，10mg/kg或等效的固定劑量Q4W施用。
在另一個實施方案中，KW-0761以0.5mg/kg Q3W的起始劑量施用，PF-05082566以0.3mg/kg，0.6mg/kg，1.2mg/kg，2.4mg/kg，5mg/kg或10mg/kg的起始劑量Q3W施用。
在另一個實施方案中，PF-05082566以0.3mg/kg Q4W的起始劑量施用，并且KW-0761以1mg/kg Q2W的起始劑量施用，并且如果患者對起始劑量組合不耐受，則KW-0761的劑量減少至0.5mg/kg Q2W和/或PF-05082566的劑量減少至0.3mg/kg Q4W。
在一些實施方案中，以4周的周期施用治療。在一些實施方案中，在每個周期的第1天每4周(Q4W)施用PF-05082566。在一些實施方案中，PF-05082566作為1小時靜脈內(IV)輸注施用。在一些實施方案中，PF-05082566的起始劑量為1.2mg/kg。
在一些實施方案中，每周(QW)施用KW-0761進行連續4周(第1、8、15和22天)，隨后每兩周一次施用(第1和15天)，劑量為1mg/kg。在一些實施方案中，PF-05082566作為1小時IV輸注施用。
在一些實施方案中，在其中共同施用藥物的每個給藥周期的第1天，KW-0761輸注在PF-05082566輸注完成后30分鐘(±10分鐘)并且在抽取PF-05082566后和KW-0761前的PK血樣后開始。
在一些實施方案中，在第一周期中，每周施用KW-0761作為1小時靜脈內輸注(即，在第1、8、15、22天)。在另一個實施方案中，從周期2開始，每2周施用KW-0761(即，在每個周期的第1天和第15天)。在一些實施方案中，在第1天，在PF-05082566輸注完成后30分鐘(±10分鐘)并且在抽取PF-05082566后和KW-0761前的藥代動力學血樣后開始KW-0761輸注。
在一些實施方案中，劑量方案是下表3中所示的劑量組合之一。
表3
在一些實施方案中，使用研究藥物的治療持續直到完成24個月的治療(大約24個周期)、證實的疾病進展、患者拒絕、不可接受的毒性(無論哪個首先發生)，研究可能過早地終止。
在顯著毒性的情況下，給藥可以延遲和/或減少。在一些實施方案中，劑量修改可以在一個周期內發生。例如，可以中斷給藥直到足夠的恢復，并且如果需要，在給定的治療周期期間可以減少給藥。在另一個實施方案中，可以在周期之間修改給藥。例如，當新周期應該開始時，下一周期施用可能由于持續毒性而延遲。在另一個實施方案中，可以在下一個周期中改變給藥。例如，在后續周期中可能需要基于先前周期中經歷的毒性減少劑量。在一些實施方案中，在所有毒性恢復到本文所述的限度內之后，可以恢復用PF-05082566和/或KW-0761的治療。
在一些實施方案中，低于前述范圍的下限的劑量水平可能是足夠的，而在其它情況下，可以使用如本領域技術人員確定的更大的劑量。
在一些實施方案中，治療周期從組合治療的第一天開始，持續3周或4周。在共同施用藥物的治療周期的任何一天，KW-0761 IV輸注優選在PF-05082566輸注完成后30分鐘開始。或者，在PF-05082566輸注完成后通過IV輸注施用KW-0761。本發明還考慮了PF-05082566和KW-0761的同時IV輸注。
在一些實施方案中，組合療法優選在患者實現CR后施用至少12周(3個4周周期或4個3周周期)，更優選至少24周，甚至更優選至少2至4周。
在另一個實施方案中，使用RECIST 1.1版和irRC評估對組合療法的反應。腫瘤評估將包括所有已知或疑似的疾病部位。在一個實施方案中，成像可包括胸部、腹部和骨盆CT或MRI掃描；腦CT或MRI掃描和骨掃描(如果需要)。在另一個實施方案中，使用造影劑進行CT掃描，除非由于醫學原因而禁忌。在另一個實施方案中，用于在基線處表征每個被識別和報告的損傷的相同成像技術用于以下腫瘤評估。在另一個實施方案中，通過在基線處，然后每3個月以及當懷疑有疾病進展(例如，癥狀惡化)時進行放射學腫瘤評估來評估每8周至多1年的治療的抗腫瘤活性。在另一個實施方案中，在初始反應后至少4周進行反應確認(CR/PR)。在一些實施方案中，從C1D1開始，用于疾病評估的可允許時間窗口為對于篩選的至多-7天(即，篩選時間窗口為登記之前至多35天)和對于治療的±7天。在另一個實施方案中，時間選擇遵循日歷日，并且不應針對周期開始中的延遲進行調整。
在一些實施方案中，選擇用本發明的組合療法治療的患者已被診斷為晚期實體惡性腫瘤。優選地，患者沒有接受晚期腫瘤的先前全身治療。
本發明還提供了包含如上所述的抗CCR4抗體和藥學上可接受的賦形劑的藥物。當抗CCR4抗體是生物治療劑(例如mAb)時，可以使用常規細胞培養和回收/純化技術在CHO細胞中產生拮抗劑。
在一些實施方案中，包含抗CCR4抗體作為抗CCR4抗體的藥物可以作為液體制劑提供或通過在使用前用無菌注射用水重構凍干粉末來制備。在一些實施方案中，在包含約50mg KW-0761的玻璃小瓶中提供包含KW-0761的藥物。
本發明還提供了包含4-1BB激發型抗體和藥學上可接受的賦形劑的藥物。4-1BB激發型抗體可以如美國專利號8,337,850中所述制備。
在一些實施方案中，4-1BB激發型抗體可以以10mg/mL的濃度配制以允許靜脈內(IV)。商業制劑可以包含pH5.5的具有α,α-海藻糖二水合物、乙二胺四乙酸二鈉二水合物和聚山梨醇酯80的L-組氨酸緩沖液。
本文所述的抗CCR4和4-1BB藥物可以作為試劑盒提供，所述試劑盒包括第一容器和第二容器以及包裝插頁。第一容器含有至少一個劑量的包含抗CCR4抗體的藥物，第二容器含有至少一個劑量的包含4-1BB激動劑的藥物，以及包裝插頁或標簽(其包括用于使用藥物治療患者的癌癥的說明書)。第一和第二容器可以包括相同或不同的形狀(例如，小瓶，注射器和瓶)和/或材料(例如塑料或玻璃)。試劑盒可以進一步包含可用于施用藥物的其它材料，例如稀釋劑，過濾器，IV袋和線，針和注射器。在試劑盒的一些實施方案中，抗CCR4抗體是KW-0761，并且說明書指出，所述藥物旨在用于治療患有對CCR4表達測試為陽性的癌癥的患者。
本發明的這些和其它方面，包括下面列出的示例性具體實施方案，根據本文所包含的教導將是明顯的。
本發明的示例性具體實施方案
1.一種治療個體中的癌癥的方法，包括向所述個體施用包含抗CCR4抗體和4-1BB激動劑的組合療法。
2.包含抗CCR4抗體的藥物，用于與4-1BB激動劑組合用于治療個體中的癌癥。
3.包含4-1BB激動劑的藥物，用于與抗CCR4抗體組合用于治療個體中的癌癥。
4.實施方案3或4的藥物，其還包含藥學上可接受的賦形劑。
5.抗CCR4抗體在制備用于當與4-1BB激動劑組合施用時治療個體中的癌癥的藥物中的用途。
6.4-1BB激動劑化合物在制備用于當與抗CCR4抗體組合施用時治療個體中的癌癥的藥物中的用途。
7.抗CCR4抗體和4-1BB激動劑在制備用于治療個體中的癌癥的藥物中的用途。
8.一種試劑盒，其包括第一容器、第二容器和包裝插頁，其中所述第一容器包含至少一個劑量的包含抗CCR4抗體的藥物，所述第二容器包含至少一個劑量的包含4-1BB激動劑的藥物，并且所述包裝插頁包含用于使用所述藥物治療個體的癌癥的說明書。
9.根據實施方案8所述的試劑盒，其中所述說明書指出，所述藥物旨在用于治療具有對CCR4表達測試為陽性(通過例如免疫組織化學(IHC)測定)的癌癥的個體。
10.實施方案1至9中任一項的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述個體是人，并且所述抗CCR4抗體是特異性結合人CCR4并耗竭CD4+細胞的單克隆抗體。
11.實施方案9的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體是KW-0761或huCCR4。
12.實施方案1至9中任一項的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述個體是人，并且所述抗CCR4抗體是特異性結合人CCR4的單克隆抗體。
13.實施方案12的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體耗竭CD4+細胞。
14.實施方案13的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述單克隆抗體或其抗原結合片段包含：(a)SEQ ID NO：1、2和3的輕鏈CDR和SEQ ID NO：4、5和6的重鏈CDR；或(b)SEQ ID NO：7、8和9的輕鏈CDR和SEQ ID NO：10、11和12的重鏈CDR。
15.實施方案13的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述單克隆抗體或其抗原結合片段包含SEQ ID NO：7、8和9的輕鏈CDR和SEQ ID NO：10，11和12的重鏈CDR。
16.實施方案13的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體包含重鏈和輕鏈，并且其中所述重鏈包含SEQ ID NO：15，所述輕鏈包含SEQ ID NO：16。
17.實施方案13的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體包含重鏈和輕鏈可變區，并且其中所述重鏈可變區包含SEQ ID NO：17，所述輕鏈可變區包含SEQ ID NO：18。
18.實施方案10-17中任一項的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述癌癥是實體瘤。
19.實施方案10-17中任一項的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述癌癥是膀胱癌，乳腺癌，透明細胞腎癌，頭/頸鱗狀細胞癌，直腸癌，肺鱗狀細胞癌，惡性黑素瘤，非小細胞肺癌(NSCLC)，卵巢癌，胰腺癌，前列腺癌，腎細胞癌，小細胞肺癌(SCLC)或三陰性乳腺癌。
20.實施方案10-17中任一項的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述個體先前未曾針對晚期實體惡性腫瘤進行治療。
21.實施方案10-17中任一項的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述癌癥是急性成淋巴細胞白血病(ALL)，急性髓性白血病(AML)，慢性成淋巴細胞性白血病(CLL)，慢性髓性白血病(CML)，彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)，濾泡性淋巴瘤，霍奇金淋巴瘤(HL)，套細胞淋巴瘤(MCL)，多發性骨髓瘤(MM)，骨髓細胞白血病-1蛋白(Mcl-1)，骨髓增生異常綜合征(MDS)，非霍奇金淋巴瘤(NHL)或小淋巴細胞淋巴瘤(SLL)。
22.實施方案10-21中任一個的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述4-1BB激動劑是單克隆抗體，其包含分別地SEQ ID NO：19和SEQ ID NO：20的重鏈和輕鏈可變區。
23.實施方案10-21的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述4-1BB激動劑是單克隆抗體，其包含SEQ ID NO：30、31和32的輕鏈CDR和SEQ ID NO：27、28和29的重鏈CDR。
24.實施方案10-21的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述4-1BB激動劑是包含重鏈和輕鏈的單克隆抗體，并且其中所述重鏈包含SEQ ID NO：21，輕鏈包含SEQ ID NO：22。
25.實施方案10-22中任一項的方法、藥物、用途或試劑盒，所述癌癥對人CCR4測試為陽性。
26.實施方案23的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述人CCR4表達升高。
27.實施方案14的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體是KW-0761或huCCR4。
28.實施方案25的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述KW-0761配制為液體藥物，其包含在pH 5.2-5.8的檸檬酸鹽緩沖液中的4mg/mL抗CCR4抗體，22.5mg/mL甘氨酸，0.02％(w/v)聚山梨醇酯80。
29.實施方案1至26中任一項的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述4-1BB激動劑是PF-05082566。
30.實施方案1至26中任一項的方法、藥物、用途或試劑盒，其中所述抗CCR4抗體以約0.5、1、2、3、5或10mg/kg的劑量施用。
31.實施方案1至26中任一項的試劑盒的方法、藥物、用途，其中所述抗CCR4抗體是KW-0761，所述4-1BB激動劑是PF-05082566，所述個體被診斷患有晚期惡性實體瘤，并且抗CCR4抗體和4-1BB激動劑的劑量選自下表中的組合之一：
表4
一般方法
分子生物學中的標準方法描述于Sambrook,Fritsch and Maniatis(1982&1989第2版,2001第3版)Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloning,3rd ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Wu(1993)Recombinant DNA,Vol.217,Academic Press,San Diego,CA)中。標準方法也出現在Ausbel,等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vols.1-4,John Wiley and Sons,Inc.New York,NY中，其描述了在細菌細胞中的克隆和DNA誘變(第1卷)，在哺乳動物細胞和酵母中的克隆(第2卷)，糖綴合物和蛋白質表達(第3卷)和生物信息學(第4卷)。
描述了蛋白質純化方法，包括免疫沉淀，層析，電泳，離心和結晶(Coligan,等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York)。描述了化學分析，化學修飾，翻譯后修飾，融合蛋白的產生，蛋白質的糖基化(參見例如Coligan,等人(2000)Current Protocols in Protein Science,Vol.2,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Ausubel,等人(2001)Current Protocols in Molecular Biology,Vol.3,John Wiley and Sons,Inc.,NY,NY,pp.16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich,Co.(2001)Products for Life Science Research,St.Louis,MO；pp.45-89；Amersham Pharmacia Biotech(2001)BioDirectory,Piscataway,N.J.,pp.384-391)。描述了多克隆和單克隆抗體的生產、純化和片段化(Coligan,等人(2001)Current Protcols in Immunology,Vol.1,John Wiley and Sons,Inc.,New York；Harlow and Lane(1999)Using Antibodies,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY；Harlow and Lane，同上)。用于表征配體/受體相互作用的標準技術是可獲得的(參見例如Coligan,等人(2001)Current Protocols in Immunology,Vol.4,John Wiley,Inc.,New York)。
可以制備單克隆、多克隆和人源化抗體(參見例如Sheperd and Dean(eds.)(2000)Monoclonal Antibodies,Oxford Univ.Press,New York,NY；Kontermann and Dubel(eds.)(2001)Antibody Engineering,Springer-Verlag,New York；Harlow and Lane(1988)Antibodies A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,pp.139-243；Carpenter,等人(2000)J.Immunol.165:6205；He,等人(1998)J.Immunol.160:1029；Tang等人(1999)J.Biol.Chem.274:27371-27378；Baca等人(1997)J.Biol.Chem.272:10678-10684；Chothia等人(1989)Nature 342:877-883；Foote and Winter(1992)J.Mol.Biol.224:487-499；美國專利號6、329、511)。
人源化的替代方案是使用在噬菌體上展示的人抗體文庫或在轉基因小鼠中的人抗體文庫(Vaughan等人(1996)Nature Biotechnol.14:309-314；Barbas(1995)Nature Medicine 1:837-839；Mendez等人(1997)Nature Genetics 15:146-156；Hoogenboom and Chames(2000)Immunol.Today 21:371-377；Barbas等人(2001)Phage Display:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York；Kay等人(1996)Phage Display of Peptides and Proteins:A Laboratory Manual,Academic Press,San Diego,CA；de Bruin等人(1999)Nature Biotechnol.17:397-399)。
抗原的純化對于產生抗體不是必需的。可以用攜帶目標抗原的細胞免疫動物。然后可以從免疫的動物中分離脾細胞，并且脾細胞可以與骨髓瘤細胞系融合以產生雜交瘤(參見例如Meyaard等人(1997)Immunity 7:283-290；Wright等人(2000)Immunity 13:233-242；Preston等人,同上；Kaithamana等人(1999)J.Immunol.163:5157-5164)。
抗體可以綴合至例如小藥物分子、酶、脂質體、聚乙二醇(PEG)。抗體可用于治療、診斷、試劑盒或其它目的，并且包括偶聯至例如染料、放射性同位素、酶或金屬(例如膠體金)的抗體(參見例如Le Doussal等人(1991)J.Immunol.146:169-175；Gibellini等人(1998)J.Immunol.160:3891-3898；Hsing and Bishop(1999)J.Immunol.162:2804-2811；Everts等人(2002)J.Immunol.168:883-889)。
用于流式細胞術的方法，包括熒光激活細胞分選(FACS)，是可獲得的(參見例如Owens,等人(1994)Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ；Givan(2001)Flow Cytometry,2nd ed.；Wiley-Liss,Hoboken,NJ；Shapiro(2003)Practical Flow Cytometry,John Wiley and Sons,Hoboken,NJ)。適用于修飾用于例如作為診斷試劑的核酸(包括核酸引物和探針)、多肽和抗體的熒光試劑是可獲得的(Molecular Probesy(2003)Catalog，Molecular Probes，Inc.，Eugene，-Aldrich(2003)Catalogue，St.Louis，MO)。
描述了免疫系統的標準組織學方法(參見例如Muller-Harmelink(ed.)(1986)Human Thymus:Histopathology and Pathology,Springer Verlag,New York,NY；Hiatt,等人(2000)Color Atlas of Histology,Lippincott,Williams,and Wilkins,Phila,PA；Louis,等人(2002)Basic Histology:Text and Atlas,McGraw-Hill,New York,NY)。
用于確定例如抗原片段、前導序列、蛋白質折疊、功能結構域、糖基化位點和序列比對的軟件包和數據庫是可獲得的(參見例如GenBank,VectorSuite(Informax,Inc,Bethesda,MD)；GCG Wisconsin Package(Accelrys,Inc.,San Diego,CA)；(TimeLogic Corp.,Crystal Bay,Nevada)；Menne,等人(2000)Bioinformatics 16:741-742；Menne,等人(2000)Bioinformatics Applications Note 16:741-742；Wren,等人(2002)Comput.Methods Programs Biomed.68:177-181；von Heijne(1983)Eur.J.Biochem.133:17-21；von Heijne(1986)Nucleic Acids Res.14:4683-4690)。
實施例
實施例1.組合治療
本實施例舉例說明了CD4+T細胞耗竭對4-1BB激發型抗體在動物癌癥模型中的抗腫瘤活性的影響。
為了評價組合免疫治療對建立的B16F10腫瘤的抗腫瘤功效，基于在CT26模型中顯示功效的先前研究選擇抗4-1BB給藥方案(Escuin-Ordinas等人，J Immunother Cancer，2013；1：14)和如先前報道選擇抗PD-1和抗LAG-3給藥方案(Woo等人，Cancer Research，2012；72：917-27；Curran等人，PloS One.2011；6：e19499)。與公開的結果一致，當這些單一藥劑治療在50-154mm3大小的腫瘤中開始時，單獨的抗4-1BB、抗PD-1或抗LAG-3不能一致地抑制B16F10腫瘤生長(數據未顯示)。組合抗PD-1與抗LAG-3相對于同種型對照導致54％的腫瘤生長抑制(TGI)(p<0.001)，盡管在該治療后沒有小鼠是無腫瘤的。相比之下，當動物同時施用抗4-1BB和抗PD-1抗體時，相對于同種型對照，產生85％TGI的顯著效力(p<0.0001)，并且10只治療的動物中有7只無腫瘤(數據未顯示)。這種顯著的組合效力是可重復的：在不同實驗者的獨立研究(腫瘤大小在64-209mm3之間)中，組合治療組中的平均腫瘤負荷降低，2/10只動物完全無腫瘤，4/10只動物在研究結束時具有正在進行的部分消退(數據未顯示)。此外，當對非常大的腫瘤(大小在126-350mm3之間)進行治療時，僅觀察到抗4-1BB/抗PD-1組合的顯著TGI(相對于對照組為51％，p<0.0001)，而抗PD-1/抗LAG-3組合無效(數據未顯示)。
同樣，在MC38結腸癌模型中觀察到抗4-1BB/抗PD-1組合的強健抗腫瘤效果(數據未顯示)。在研究結束時(腫瘤植入后第21天)，組合治療的TGI相對于PBS對照為63％。當與單一試劑單獨治療相比時，抑制也是顯著的(p<0.05相對于單獨的抗4-1BB，和p<0.001相對于單獨的抗-PD-1)。
為了測定抗4-1BB/抗-PD-1組合治療所需的免疫細胞亞群，使用抗體同時耗竭具有B16F10的小鼠中的CD4+T細胞、CD8+T細胞或CD4+和CD8+T細胞。在第0天，將C57BL/6小鼠皮下接種1×106B16F10。將小鼠隨機分成每組10只動物的組，平均腫瘤體積為約80mm3(第10天)。如先前所述(Butler等，Nature Immunology，2012；13：188-95)，具有B16F10的小鼠接受抗CD4(GK1.5，BioXcell)和/或抗CD8(53.5.8，BioXcell)。簡言之，在第11、16和21天腹膜內施用一百(100)μg同種型對照IgG或抗CD4和/或抗CD8mAb。在第12、17和22天給予抗4-1BB(1mg/kg)/抗PD-1(10mg/kg)mAb。每周2-3次測量腫瘤尺寸。
比較抗4-1BB激發型抗體+抗-PD-1拮抗型抗體組合治療后的腫瘤生長(圖9)。每個治療組的平均值±SEM顯示于圖9中。在不存在CD8+T細胞時，腫瘤抑制完全消除。有趣的是，CD4+T細胞的耗竭導致增強的抗腫瘤活性(p<0.05，相對于抗4-1BB/抗PD-1組)。這些數據表明Treg細胞耗竭增強4-1BB激動劑的抗腫瘤活性。
在單獨的實驗中，評估了在CT26結腸腫瘤模型中CD4+T細胞耗盡對抗4-1BB/抗PD-1組合治療的影響(圖10)。在不存在CD8+T細胞的情況下，腫瘤抑制被完全消除。如在B16黑素瘤模型中的，CD4+T細胞的耗竭導致增強的抗腫瘤活性。
這些結果證明4-1BB激發型抗體的抗腫瘤活性可以通過腫瘤模型中Treg細胞或CD4+T細胞的耗竭來增強。
材料和方法
小鼠。6至8周齡的雌性C57BL/6小鼠購自The Jackson Laboratories。根據由Institutional Animal Care and Use Committee of Rinat,South San Francisco和Worldwide Research and Development(WRD),La Jolla,Pfizer Inc.批準的方案批準的方案維持小鼠和進行所有動物實驗。
細胞系。B16F10黑素瘤細胞系購自美國典型培養物保藏中心(ATCC)。MC38結腸癌細胞系由UCLA,Los Angeles,California的Antoni Ribas博士友情提供。在37℃，在5％CO2的空氣氛圍中，在補充有10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺的DMEM培養基中培養細胞，并在Research Animal Diagnostic Laboratory(RADIL)(Columbia，MO)進行測試病原體的IMPACT。收獲在指數生長期生長的無病原體細胞并用于腫瘤接種。
用于免疫治療和流式細胞術的抗體。治療性大鼠抗小鼠4-1BB mAb(克隆MAB9371)購自R&D systems。大鼠抗小鼠PD-1mAb(克隆RMP1-14)和大鼠IgG2a同種型對照購自BioXcell。大鼠抗小鼠LAG-3 mAb(克隆eBioC9B7W)購自eBioscience。
用于細胞表面或細胞內染色的單克隆抗體購自BD Biosciences或eBioscience。用于表征T細胞的單克隆抗體是倉鼠抗小鼠CD3ε-Alexa Fluor 488(克隆145-2C11)，大鼠抗小鼠CD4-PerCP-Cy5.5(克隆RM4-5)，大鼠抗小鼠CD8α-APC-H7(克隆53-6.7)，大鼠抗小鼠CD25-BD Horizon V450(克隆PC61)，倉鼠抗小鼠CD137(4-1BB)-APC(克隆17B5)，倉鼠抗小鼠CD279(PD-1)-BD Horizon PE-CF594(克隆J43)，大鼠抗小鼠FoxP3-Alexa Fluor 700(克隆FJK-16s)，大鼠抗小鼠Eomes-PE(克隆：Dan11mag)，倉鼠抗小鼠KLRG1-PerCP-Cy5.5(克隆2F1)和大鼠抗小鼠NK-1.1-PE-Cy7(克隆PK136)。對于MDSC表征，mAb是大鼠抗小鼠CD45-APC-Cy7(克隆30-F11)，大鼠抗小鼠CD11b-Alexa Fluor 488(克隆M1/70)，大鼠抗小鼠Ly-6G(Gr-1)-PerCP-花青5.5(克隆RB6-8C5)和大鼠抗小鼠F4/80-PE(克隆BM8)。使用LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain試劑盒(Invitrogen)將活細胞與死細胞分離。
使用流式細胞術的免疫細胞分型。收獲來自荷瘤小鼠的脾，并在冰冷的PBS中機械解離為單細胞懸浮液。脾細胞用紅血細胞裂解緩沖液Hybri-Max(Sigma-Aldrich)處理以除去紅血細胞，用PBS洗滌兩次，并重懸浮于補充有2％FBS和0.9％NaN3的PBS中。將～1×106個脾細胞的等分試樣與10μg/mL的小鼠BD Fc Block(BD Biosciences)預溫育10分鐘，之后加入分型mAb混合物以特異性染色免疫細胞。
使用小鼠腫瘤解離試劑盒和GentleMACS Dissociator根據制造商的說明(Miltenyi Biotec)制備腫瘤浸潤淋巴細胞。
通過在4℃孵育細胞30分鐘來標記細胞表面抗原。使用根據制造商的方案(eBioscience)設定的FoxP3/轉錄因子染色緩沖液進行細胞內染色。使用LSR Fortessa(BD Biosciences)獲得流式細胞術數據并使用FlowJo(TreeStar Inc.)分析。
體內腫瘤功效研究。C57BL/6小鼠在右側皮下接種在0.1ml無血清DMEM培養基或PBS中的1×106個B16F10或MC38細胞。當腫瘤達到50-154mm3的尺寸時開始治療。單獨或組合的針對4-1BB(1mg/kg)、PD-1(10mg/kg)和LAG-3(10mg/kg)的抗體腹膜內(i.p.)施用兩次，間隔5天。在治療較大腫瘤(范圍為126-350mm3)的研究中，腹膜內給予抗體四次，間隔為3天。使用測徑器在二維中測量腫瘤大小，并且使用下式以mm3表示體積：V＝0.5L×W2其中L和W分別是腫瘤的長徑和短徑。
實施例2.基因表達分析：在人腫瘤中分析與FOXP3 mRNA相關的人基因
本實施例舉例說明人腫瘤中CCR4 mRNA與FOXP3 mRNA的相關性。
分析來自癌癥基因組集(TCGA)的RNA-Seq數據以鑒定人腫瘤中人基因和FOXP3 mRNA之間的相關性。下表5提供了人基因的列表，其按照在三種腫瘤類型中其與FOXP3 mRNA(腫瘤RNAseq數據)的平均相關系數的順序列出。更高的相關系數值表明在耗竭Treg中潛在更高的功效。黑體表示的基因是與活化的Treg細胞相關的公知基因。
基于來自TCGA的跨多個實體腫瘤RNA-Seq數據的與FOXP3的相關性分析，CCR4被鑒定為用于耗竭Treg細胞的有吸引力的靶標。CCR4在HNSC腫瘤、結腸腫瘤和直腸腫瘤中分別具有0.857、0.837和0.856的相對高的FOXP3相關系數值(表5)。在本研究中鑒定的用于耗竭Treg細胞的其它靶包括：CCR8,ICOS,TIGIT,CD4,CD28,ARHGEF6,IKZF1,PTPRC,DOCK2,CCR4,CCR5,IL21R,IL2RB,NCKAP1L,SLAMF1,ITGAL,IL10RA,P2RY10,IL2RA,FMNL1,DOCK10,ITK,SASH3,KIAA0748,LCP2,TNFRSF9(4-1BB,CD137),CYBB和CTLA4。
表5
實施例3.基因表達分析：適用于抗CCR4抗體的治療的癌癥類型的鑒定
本實施例舉例說明了人類腫瘤中人基因mRNA和FOXP3 mRNA的相關性。
分析來自癌癥基因組集(TCGA)的RNA-Seq數據以鑒定人腫瘤中CCR4 mRNA與FOXP3 mRNA以及CTLA4 mRNA與FOXP3 mRNA之間的相關性。下表6提供了在TCGA中可獲得的所有腫瘤類型中的相關系數。
基于該分析，指示用抗CCR4抗體和4-1BB激動劑治療的癌癥類型包括：頭/頸鱗狀細胞癌，直腸癌，結腸癌，鱗狀細胞肺癌，甲狀腺癌，膀胱癌，黑素瘤，宮頸癌，前列腺癌，乳腺癌，子宮/子宮內膜癌，胰腺癌，肺腺癌，卵巢癌和乳頭狀腎癌。
表6
實施例4.將抗CCR4抗體和4-1BB激動劑并行施用至荷瘤小鼠。
本實施例舉例說明在動物癌癥模型中與4-1BB激動劑組合的抗CCR4抗體治療。
在一項研究中，C57BL6小鼠皮下植入1×106個MC38鼠結腸癌細胞。監測腫瘤生長，當腫瘤達到150mm3的平均大小將動物隨機化至4個8只動物的組，并且腹膜內給予同種型對照、1mg/kg大鼠抗小鼠4-1BB激發型單克隆抗體(R&D Systems#MAB9371)、10mg/kg抗小鼠CCR4抗體或兩者的同時組合，每5天一次，共兩次劑量。使用卡尺在兩個維度上測量腫瘤大小，并且使用下式以mm3表示體積：V＝0.5L×W2其中L和W分別是腫瘤的長徑和短徑。當對照的腫瘤大小達到1000mm3時，終止研究。通過比較用4-1BB激發型單克隆抗體、抗小鼠CCR4抗體或兩者的同時組合治療的動物來評價組合治療的功效。
實施例5.優先指示：追求患者選擇策略
本實施例舉例說明了用于抗CCR4抗體/4-1BB激動劑組合治療的患者選擇的策略。
抗CCR4治療耗竭抑制抗腫瘤反應的Treg。4-1BB擴大抗腫瘤T細胞活性。基于上述實施例1證明的效果，抗CCR4抗體與4-1BB激動劑組合將導致比單一藥劑更強的反應。
這些研究優先考慮具有高Treg(FOXP3+)含量的腫瘤。通過在配對的給藥前和給藥后新鮮活檢中評估腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)來選擇患者。進行免疫組織化學分析以確定腫瘤浸潤性T細胞位置和活化狀態。在基線和治療后評估4-1BB/CCR4比率。平行評估CD4、CD8、FoxP3、PD-1和PD-L1。
表7提供了序列表中的序列的簡要描述。
表7
實施例6.組合治療
本實施例舉例說明了使用抗CCR4抗體/4-1BB激動劑的組合治療。
在每個周期的第1天，PF-05082566將作為1小時靜脈內(IV)輸注每4周(Q4W)施用。PF-05082566的起始劑量為1.2mg/kg。
KW-0761將作為1小時IV輸注每周(QW)施用，進行連續4周(第1、8、15和22天)，隨后每兩周一次給藥(第1和15天)，劑量為1mg/kg。
在其中共同施用藥物的每個給藥周期的第1天，KW-0761輸注將在PF-05082566輸注完成后30分鐘(±10分鐘)并且在抽取PF-05082566后和KW-0761前PK血液樣品后開始。
本文引用的所有參考文獻通過引用并入，其程度如同每個單獨的出版物、數據庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請或專利被具體地和單獨地指明通過引用并入。根據37C.F.R.§1.57(b)(1)，申請人旨在將此通過引用并入的聲明涉及每一個單獨的出版物、數據庫條目(例如Genbank序列或GeneID條目)、專利申請或專利，其每一個都按照37C.F.R.§1.57(b)(2)清楚指出，即使這種引用與通過引用并入的專門聲明不直接相鄰。在說明書中包括通過引用并入的專門聲明(如果有的話)不以任何方式削弱通過引用并入的該一般聲明。本文引用的參考文獻不意在承認該參考文獻是相關的現有技術，也不構成對這些出版物或文獻的內容或日期的任何承認。
序列
<110> PFIZER INC.
KYOWA HAKKO KIRIN, CO., LTD.
<120> 用于治療癌癥的抗CCR4抗體和4-1BB激動劑的組合
<130> PC72128A
<150> 62/001,534
<151> 2014-05-21
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
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<400> 10
Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 11
Trp Ile Asn Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 12
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 12
Ser Thr Tyr Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr
1 5
<210> 13
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 13
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ala Ser Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Met Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Gly Asn Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Thr Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Arg Pro Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 14
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Ile Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys His Gln
85 90 95
Tyr Leu Ser Ser Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 15
<211> 449
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys
210 215 220
Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro
225 230 235 240
Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser
245 250 255
Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp
260 265 270
Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn
275 280 285
Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val
290 295 300
Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu
305 310 315 320
Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys
325 330 335
Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr
340 345 350
Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr
355 360 365
Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu
370 375 380
Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu
385 390 395 400
Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys
405 410 415
Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu
420 425 430
Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
435 440 445
Lys
<210> 16
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 16
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 17
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 17
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ile Phe Ser Asn Tyr
20 25 30
Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Thr Ile Ser Ser Ala Ser Thr Tyr Ser Tyr Tyr Pro Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys
85 90 95
Gly Arg His Ser Asp Gly Asn Phe Ala Phe Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 18
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 18
Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Arg Asn Ile Val His Ile
20 25 30
Asn Gly Asp Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser Leu Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 19
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 19
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 20
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 20
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 21
<211> 442
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Ser Thr Tyr
20 25 30
Trp Ile Ser Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala
115 120 125
Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu
130 135 140
Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly
145 150 155 160
Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Asn Phe
180 185 190
Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr
195 200 205
Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro
210 215 220
Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
225 230 235 240
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
245 250 255
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp
260 265 270
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
275 280 285
Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val
290 295 300
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
305 310 315 320
Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly
325 330 335
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
340 345 350
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
355 360 365
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
370 375 380
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
385 390 395 400
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
405 410 415
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
420 425 430
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
435 440
<210> 22
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 22
Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln
1 5 10 15
Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Met
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu
85 90 95
Ala Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln Pro Lys
100 105 110
Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu Glu Leu Gln
115 120 125
Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr Pro Gly
130 135 140
Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys Ala Gly
145 150 155 160
Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr Ala Ala
165 170 175
Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His Arg Ser
180 185 190
Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys Thr Val
195 200 205
Ala Pro Thr Glu Cys Ser
210
<210> 23
<211> 440
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 23
Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Asp Cys Lys Ala Ser Gly Ile Thr Phe Ser Asn Ser
20 25 30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Lys Arg Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Phe
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Asn Asp Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser
115 120 125
Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp
130 135 140
Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr
145 150 155 160
Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr
165 170 175
Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys
180 185 190
Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp
195 200 205
Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala
210 215 220
Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
225 230 235 240
Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val
245 250 255
Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val
260 265 270
Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln
275 280 285
Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln
290 295 300
Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly
305 310 315 320
Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro
325 330 335
Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr
340 345 350
Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser
355 360 365
Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
370 375 380
Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr
385 390 395 400
Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe
405 410 415
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
420 425 430
Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 24
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 24
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Ser Asn Trp Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 25
<211> 360
<212> PRT
<213> 智人
<400> 25
Met Asn Pro Thr Asp Ile Ala Asp Thr Thr Leu Asp Glu Ser Ile Tyr
1 5 10 15
Ser Asn Tyr Tyr Leu Tyr Glu Ser Ile Pro Lys Pro Cys Thr Lys Glu
20 25 30
Gly Ile Lys Ala Phe Gly Glu Leu Phe Leu Pro Pro Leu Tyr Ser Leu
35 40 45
Val Phe Val Phe Gly Leu Leu Gly Asn Ser Val Val Val Leu Val Leu
50 55 60
Phe Lys Tyr Lys Arg Leu Arg Ser Met Thr Asp Val Tyr Leu Leu Asn
65 70 75 80
Leu Ala Ile Ser Asp Leu Leu Phe Val Phe Ser Leu Pro Phe Trp Gly
85 90 95
Tyr Tyr Ala Ala Asp Gln Trp Val Phe Gly Leu Gly Leu Cys Lys Met
100 105 110
Ile Ser Trp Met Tyr Leu Val Gly Phe Tyr Ser Gly Ile Phe Phe Val
115 120 125
Met Leu Met Ser Ile Asp Arg Tyr Leu Ala Ile Val His Ala Val Phe
130 135 140
Ser Leu Arg Ala Arg Thr Leu Thr Tyr Gly Val Ile Thr Ser Leu Ala
145 150 155 160
Thr Trp Ser Val Ala Val Phe Ala Ser Leu Pro Gly Phe Leu Phe Ser
165 170 175
Thr Cys Tyr Thr Glu Arg Asn His Thr Tyr Cys Lys Thr Lys Tyr Ser
180 185 190
Leu Asn Ser Thr Thr Trp Lys Val Leu Ser Ser Leu Glu Ile Asn Ile
195 200 205
Leu Gly Leu Val Ile Pro Leu Gly Ile Met Leu Phe Cys Tyr Ser Met
210 215 220
Ile Ile Arg Thr Leu Gln His Cys Lys Asn Glu Lys Lys Asn Lys Ala
225 230 235 240
Val Lys Met Ile Phe Ala Val Val Val Leu Phe Leu Gly Phe Trp Thr
245 250 255
Pro Tyr Asn Ile Val Leu Phe Leu Glu Thr Leu Val Glu Leu Glu Val
260 265 270
Leu Gln Asp Cys Thr Phe Glu Arg Tyr Leu Asp Tyr Ala Ile Gln Ala
275 280 285
Thr Glu Thr Leu Ala Phe Val His Cys Cys Leu Asn Pro Ile Ile Tyr
290 295 300
Phe Phe Leu Gly Glu Lys Phe Arg Lys Tyr Ile Leu Gln Leu Phe Lys
305 310 315 320
Thr Cys Arg Gly Leu Phe Val Leu Cys Gln Tyr Cys Gly Leu Leu Gln
325 330 335
Ile Tyr Ser Ala Asp Thr Pro Ser Ser Ser Tyr Thr Gln Ser Thr Met
340 345 350
Asp His Asp Leu His Asp Ala Leu
355 360
<210> 26
<211> 255
<212> PRT
<213> 智人
<400> 26
Met Gly Asn Ser Cys Tyr Asn Ile Val Ala Thr Leu Leu Leu Val Leu
1 5 10 15
Asn Phe Glu Arg Thr Arg Ser Leu Gln Asp Pro Cys Ser Asn Cys Pro
20 25 30
Ala Gly Thr Phe Cys Asp Asn Asn Arg Asn Gln Ile Cys Ser Pro Cys
35 40 45
Pro Pro Asn Ser Phe Ser Ser Ala Gly Gly Gln Arg Thr Cys Asp Ile
50 55 60
Cys Arg Gln Cys Lys Gly Val Phe Arg Thr Arg Lys Glu Cys Ser Ser
65 70 75 80
Thr Ser Asn Ala Glu Cys Asp Cys Thr Pro Gly Phe His Cys Leu Gly
85 90 95
Ala Gly Cys Ser Met Cys Glu Gln Asp Cys Lys Gln Gly Gln Glu Leu
100 105 110
Thr Lys Lys Gly Cys Lys Asp Cys Cys Phe Gly Thr Phe Asn Asp Gln
115 120 125
Lys Arg Gly Ile Cys Arg Pro Trp Thr Asn Cys Ser Leu Asp Gly Lys
130 135 140
Ser Val Leu Val Asn Gly Thr Lys Glu Arg Asp Val Val Cys Gly Pro
145 150 155 160
Ser Pro Ala Asp Leu Ser Pro Gly Ala Ser Ser Val Thr Pro Pro Ala
165 170 175
Pro Ala Arg Glu Pro Gly His Ser Pro Gln Ile Ile Ser Phe Phe Leu
180 185 190
Ala Leu Thr Ser Thr Ala Leu Leu Phe Leu Leu Phe Phe Leu Thr Leu
195 200 205
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
210 215 220
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
225 230 235 240
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
245 250 255
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 27
Ser Thr Tyr Trp Ile Ser
1 5
<210> 28
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 28
Lys Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Tyr Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 29
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223>合成的構建體
<400>29
Arg Gly Tyr Gly Ile Phe Asp Tyr
1 5
<210> 30
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 30
Ser Gly Asp Asn Ile Gly Asp Gln Tyr Ala His
1 5 10
<210> 31
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 31
Gln Asp Lys Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的構建體
<400> 32
Ala Thr Tyr Thr Gly Phe Gly Ser Leu Ala Val
1 5 10
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