專利名稱：：凍干甲型肝炎減毒活疫苗及其制備方法
技術領域：
：本發明涉及一種凍干甲型肝炎減毒活疫苗及其制備方法，屬于生物制品
技術領域：
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背景技術：
：甲肝疫苗是預防甲型肝炎的有效手段。目前國內外生產的甲肝疫苗(包括滅活疫苗和減毒活疫苗)都是液體劑型，其基本特點是在保存和運輸過程中必須依賴于冷鏈系統以保證其質量。我國作為一個人口眾多、經濟不發達、地理環境復雜、交通不方便的發展中國家，液體劑型的甲肝減毒活疫苗在保存和運輸過程中難于處于嚴格的冷鏈環境中，常因此而影響疫苗的質量。利用冷凍干燥技術將甲型肝炎減毒活疫苗制成凍干劑型，能夠更有效地保障疫苗的熱穩定性和免疫原性。但當采用現有技術對疫苗進行冷凍干燥時，由于甲型肝炎病毒對熱較為敏感，在凍干過程中疫苗的活性損失很大，凍干后病毒滴度很低。因此，有必要研究新的技術方案，以提高凍干后甲型肝炎減毒活疫苗的滴度，并且保證它的熱穩定性。
發明內容本發明的第一個目的是提供了一種凍干甲型肝炎減毒活疫苗。本發明的第二個目的在于提供一種凍干甲型肝炎減毒活疫苗的制備方法。本發明的第一個目的通過下列技術方案實現一種凍干甲型肝炎減毒活疫苗，由下列體積比的原料組成甲型肝炎減毒活疫苗凍干保護劑=1:o.5i.5，其特征在于所述凍干保護劑即海藻糖與甘氨酸的混合水溶液的組成為海藻糖210克/100毫升，甘氨酸3.216克/100毫升，溶劑為水，其中溶質甘氨酸與海藻糖的質量比即甘氨酸海藻糖》1.6。所述甲型肝炎減毒活疫苗為市購產品。所述海藻糖、甘氨酸均為市購產品。所述水為現有技術中常規的純水或者注射用水或者雙蒸水。本發明的第二個目的通過下列技術方案實現一種凍干甲型肝炎減毒活疫苗的制備方法，其特征在于經過下列工藝步驟A、將甲型肝炎減毒活疫苗與凍干保護劑按l:0.51.5的體積比進行混合，其中凍干保護劑即海藻糖與甘氨酸的混合水溶液的組成為海藻糖210克/100毫升，甘氨酸3.216克/100毫升，溶劑為水，其中溶質甘氨酸與海藻糖的質量比即甘氨酸海藻糖》1.6;B、將步驟A的混合物分裝至西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入凍干機腔體內，以0.40.6。C/min的速度將溫度降至-40土1°C,維持4~8小時；然后以0.81.2'C/min的速度升溫至-15土rC;再以0.040.06mbar真空度抽真空812小時，同時維持隔板溫度-15土rC;之后以1.ri.6。C/min的速度升溫至25土rC，維持610小時，即得凍干甲型肝炎減毒活疫苗。本發明與現有技術相比具有下列優點和效果1)凍干后疫苗的滴度不變；2)熱穩定性好，通常在37'C放置7天時，液體疫苗的感染性滴度平均要下降0.8logCCID50/ml，而本發明提供的凍干疫苗其感染性滴度則不變；3)凍干疫苗具有良好的安全性和免疫原性，本發明配方成分明確，配方簡單，制備方法簡單易行，易于實施，疫苗制備工藝步驟可操作性強，利于產品的標準化大規模生產。本發明解決了下列技術難點由于甲肝病毒對熱敏感，在凍干過程中疫苗的活性損失很大，凍干后感染性滴度很低。另經研究表明，甲型肝炎病毒在蔗糖基質中凍干后，病毒的活性大大下降。因此選擇凍干保護劑，這對凍干甲型肝炎減毒活疫苗起著至關重要的作用。又經研究表明，在干燥時海藻糖起著保護細胞與生物大分子的作用，例如，抗血清抗體在有海藻糖存在時，室溫或37'C下空氣干燥后，在室溫貯存幾年其生物活性仍不會發生明顯變化。海藻糖是由兩個葡萄糖分子通過半縮醛羥基縮合而成，無毒無害，化學性質非常穩定，在體內可被酶水解成葡萄糖而被利用。所以，本專利的發明人將海藻糖應用于甲型肝炎減毒活疫苗的凍干保護劑中，經過多年的潛心研究與實驗，并付出了創造性的勞動，篩選到一組最佳的凍干保護劑，并將保護劑與甲型肝炎減毒活疫苗混合后進行冷凍干燥，獲得的凍干疫苗感染性滴度(1ogCCID50/ml)與凍干前比較無明顯差異(P〉0.05)，具有較好的穩定性，凍干后疫苗的殘余水份含量<3.0%，達到生物制品規程要求，經小白鼠安全性試驗合格，經臨床研究證實該凍干甲型肝炎減毒活疫苗具有良好的臨床安全性和免疫原性。其結果如下-1、實施例2提供的凍干甲型肝炎減毒活疫苗的水分含量(W/W。)見表1.2、實施例2提供的凍干甲型肝炎減毒活疫苗與凍干前的相同甲型肝炎減毒活疫苗的感染性滴度變化見表2。從表2看出經過6批試驗，凍干前感染性滴度平均值為7.1151ogCCID5。/ml，凍干后感染性滴度平均值為7.0731ogCCID5。/ml，兩組無顯著差異(P〉0.05)。經反復驗證，凍干前、后兩組感染性滴度平均值無顯著差異(P〉0.05)。表明該保護劑組合對甲型肝炎減毒活疫苗(H2株)耐受凍干具有優良的保護作用。3、實施例2提供的凍干甲型肝炎減毒活疫苗在不同溫度下感染性滴度變化凍干甲型肝炎減毒活疫苗在45t:下感染性滴度變化，見表3。凍干甲型肝炎減毒活疫苗在37'C下感染性滴度變化，見表4。凍干甲型肝炎減毒活疫苗在室溫下穩定性，見表5。凍干甲型肝炎減毒活疫苗在28'C下穩定性研究，結果見表6。從表3表6可以看出，凍干甲型肝炎減毒活疫苗在28'C下24個月內其感染性滴度無顯著變化(P〉0.05)，說明其在28i:下具有較好的穩定性。而液體疫苗在6個月內無顯著變化，但6個月后其感染性滴度則逐漸下降。到18個月時其感染性滴度平均下降3.54.01ogCCID5。/ml。結果表明凍干甲型肝炎減毒活疫苗分別在45'C下1天、37'C下6天、室溫下28天感染性滴度維持不變，而液體劑型的甲肝減毒活疫苗在同等條件下感染性滴度明顯下降，說明其具有良好的熱穩定性。凍干甲型肝炎減毒活疫苗在28'C下24個月內其感染性滴度無顯著變化。說明其在28。C下保存2年內穩定，其感染性滴度無顯著變化。此外，在45'C下、37'C下及室溫下凍干甲型肝炎減毒活疫苗的穩定性明顯優于液體疫苗。4、凍干甲型肝炎減毒活疫苗安全性研究本安全性試驗使用實施例1、2、3共3批凍干甲型肝炎減毒活疫苗，每批成品用注射水溶解后混合均勻，每一批用5只1720g小白鼠，每只腹腔注射0.5ml進行安全試驗，每日觀察，共觀察7天。結果見表7。從表7可以看出，3批凍干甲型肝炎減毒活疫苗安全試驗合格，證明H2株凍干甲型肝炎減毒活疫苗具有很好的安全性。5、凍干甲型肝炎減毒活疫苗凍干保護劑急性毒理反應研究本試驗共使用實施例l、2、3的凍干保護劑及所制備的凍干疫苗，并各取2份作為樣品共6個樣品。凍干保護劑，系無色透明液體，人用劑量為lml/次。通過皮下注射，肌肉注射和靜脈注射三種給藥途徑，觀察凍干保護劑的急性毒性反應。試驗動物采用7周齡健康昆明種小鼠，每組20只。各組動物禁食不禁水12小時后，第一、二組以20ml/kg劑量在24小時內分別皮下注射和肌肉注射凍干保護劑3次，每次間隔8小時；第三組動物以20ml/kg劑量經尾靜脈注射給受試物一次。結果見表8。各組動物給藥后，其外觀、行為活動、精神狀態、食欲、大小便、被毛、膚色及呼吸等均無明顯毒性反應。觀察7天，無一動物死亡。處死解剖小鼠，肉眼觀察心、肝、脾、肺、腎臟內臟組織，也未見明顯異常。試驗結果表明(l)小鼠一日內以20ml/kg的劑量3次皮下注射和肌肉注射凍干保護劑，無明顯毒性反應發生。小鼠一日內皮下注射和肌肉注射凍干保護劑的最大耐受量為60ml/kg，此劑量相當于人用量的3000倍。(2)小鼠一次靜脈注射凍干保護劑的最大耐受量為20ml/kg。所選用的凍干保護劑是根據《中華人民共和國藥典》，并經急性毒理反應研究證明無毒副作用。6、凍干甲型肝炎減毒活疫苗的檢定按《凍干劑型的甲肝減毒活疫苗制造與檢定規程》進行檢定，各項指標均合格。(1)物理檢查為乳白色疏松體，溶解后為無色透明、澄清無異物液體。(2)殘余水份含量凍干疫苗殘余水份含量《3%。(3)病毒滴定及穩定性試驗每批凍干疫苗，取35支樣品混合進行病毒滴定，再取35支放37。C7天，與前者同時進行病毒滴定，方法同前。37'C放置7天后滴度下降不超過1個logCCID5。/ml。疫苗滴度不低于6.51ogCCID5。/ml。(4)安全試驗用1416g小白鼠4只，每只腹腔注射lml，注射后密切觀察，30分鐘內無異常反應，觀察3天均健存。(5)殘余牛血清蛋白含量測定用檢定所認可的方法測定，殘余牛血清白蛋白含量《50ng/mlo免疫原性以凍干疫苗和液體疫苗一人份劑量分別腹腔注射免疫小鼠，并設空白對照組，于免疫后1、2個月血清抗體檢測結果顯示凍干疫苗和液體疫苗抗體陽轉率及血清抗體滴度無明顯差異,見表9，表10。由上述一系列結果可以看出，凍干甲型肝炎減毒活疫苗具有良好的安全性和免疫原性。具體實施例方式下面結合實施例對本發明做進一步描述，但本發明之內容并不局限于此。實施例l凍干保護劑由下列成分組成海藻糖2克，甘氨酸3.5克，加純水溶解定容至IOO按甲型肝炎減毒活疫苗凍干保護劑=1:0.5的體積比，在甲型肝炎減毒活疫苗中加入上述凍干保護劑，混合后分裝于西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入凍干機腔體中，以0.4°C/min的速度將溫度降至-4(TC，維持4小時；然后以0.8°C/min的速度升溫至-15。C;再以0.04mbar真空度抽真空8小時，維持隔板溫度-15°C;隨后以1.4。C/min速度升溫至25'C，維持8小時，最后壓塞后出箱，即得凍干甲型肝炎減毒活疫苗。實施例2凍干保護劑由下列成分組成海藻糖5克，甘氨酸9克，加純水溶解定容至100毫升；按甲型肝炎減毒活疫苗凍干保護劑=1:1的體積比，在甲型肝炎減毒活疫苗中加入上述凍干保護劑，混合后分裝于西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入凍干機腔體中，以0.5°C/min的速度將溫度降至-40°C，維持6小時；然后以rc/min的速度升溫至-15。C;再以0.05mbar真空度抽真空10小時，隔板溫度維持-15'C;隨后以1.5°C/min速度升溫至25'C,維持8小時；最后壓塞后出箱，即得凍干甲型肝炎減毒活疫苗。實施例3凍干保護劑由下列成分組成海藻糖10克，甘氨酸16克，加純水溶解定容至IOO毫升；按甲型肝炎減毒活疫苗凍干保護劑=1:i的體積比，在甲型肝炎減毒活疫苗中加入上述凍干保護劑，混合后分裝于西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入凍干機腔體中，以0.5°C/min的速度將溫度降至-40°C，維持6小時；然后以rC/min的速度升溫至-15°C;再以0.05mbar真空度抽真空10小時，隔板溫度維持-15°C;隨后以1.5°C/min速度升溫至25i:，維持8小時；最后壓塞后出箱，即得凍干甲型肝炎減毒活疫苗。實施例4凍干保護劑由下列成分組成海藻糖2克，甘氨酸16克，加純水溶解定容至IOO毫升；按甲型肝炎減毒活疫苗凍干保護劑=1:1.5的體積比，在甲型肝炎減毒活疫苗中加入上述凍干保護劑，混合后分裝于西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入凍干機腔體中，以0.6。C/min的速度將溫度降至-4(TC，維持8小時；然后以1.2。C/min的速度升溫至-15";再以0.06mbar真空度抽真空12小時，隔板溫度維持-15。C;隨后以1.6°C/min速度升溫至25X:，維持10小時;最后壓塞后出箱，即得凍干甲型肝炎減毒活疫苗。表l甲型肝炎減毒活疫苗凍干后水分含量(w/w。)凍干后k分含罱200802011.83200802021.76200802031.69200802041.57200802051.72200802061.81平均值1.73表2甲型肝炎減毒活疫苗凍干前、后感染性滴度變化批號凍干前凍干后咸^'昨滴度咸幼#滴麼200802016.806.77200802027.07.0200802037.177.0200802047.57.5200802056.676.67200802067.557.5平均值7.1157.073表3凍干與液體劑型的甲肝減毒活疫苗在45t:下感染性滴度變化疫苗批號45°C0天logCCID50/ml45°C1天logCCID50/ml45°C3天logCCID50/ml凍干疫苗(20080202)6.776.75.71同批號液體疫苗6.85.16<4.0凍干疫苗(20080203)7.06.975.86同批號液體疫苗6.975.3<4.0凍干疫苗(20080205)7.06.986.2同批號液體疫苗7.056.25<4.0表4凍干與液體劑型甲肝減毒活疫苗在37'C下感染性滴度變化<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>_表5凍干與液體甲型肝炎減毒活疫苗在室溫下感染性滴度變化<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表6凍干疫苗與液體甲型肝炎減毒活疫苗28'C下感染性滴度變化，單位logCCID5。/ml<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>權利要求1、一種凍干甲型肝炎減毒活疫苗，由下列體積比的原料組成甲型肝炎減毒活疫苗∶凍干保護劑＝1∶0.5～1.5，其特征在于所述凍干保護劑即海藻糖與甘氨酸的混合水溶液的組成為海藻糖2～10克/100毫升，甘氨酸3.2～16克/100毫升，溶劑為水，其中溶質甘氨酸與海藻糖的質量比即甘氨酸∶海藻糖≥1.6。2、根據權利要求1所述的凍干甲型肝炎減毒活疫苗，其特征在于所述甲型肝炎減毒活疫苗為市購產品。3、根據權利要求1所述的凍干甲型肝炎減毒活疫苗，其特征在于所述海藻糖、甘氨酸均為市購產品。4、根據權利要求1所述的凍干甲型肝炎減毒活疫苗，其特征在于所述水為純水或者注射用水或者雙蒸水。5、一種如權利要求1所述的凍干甲型肝炎減毒活疫苗的制備方法，其特征在于經過下列工藝步驟A、將甲型肝炎減毒活疫苗與凍干保護劑按1:0.51.5的體積比進行混合，所述凍干保護劑即海藻糖與甘氨酸的混合水溶液的組成為海藻糖210克/100毫升，甘氨酸3.216克/100毫升，溶劑為水，其中溶質甘氨酸與海藻糖的質量比即甘氨酸海藻糖》1.6;B、將步驟A的混合物分裝至西林瓶中，每瓶0.5ml，半加塞后放入凍干機腔體內，以0.4~0.6°C/min的速度將溫度降至-40土1°C，維持48小時；然后以0.81.2°C/min的速度升溫至-15土rC;再以0.040.06mbar真空度抽真空812小時，同時維持隔板溫度-15土rC;之后以1.ri.6。C/min的速度升溫至25土rC，維持610小時，即得凍干甲型肝炎減毒活疫苗。全文摘要本發明涉及一種凍干甲型肝炎減毒活疫苗及其制備方法，所述疫苗由下列體積比的原料組成甲型肝炎減毒活疫苗∶凍干保護劑＝1∶0.5～1.5，其中凍干保護劑即海藻糖與甘氨酸的混合水溶液的組成為海藻糖2～10克/100毫升，甘氨酸3.2～16克/100毫升，溶劑為水，其中溶質甘氨酸與海藻糖的質量比即甘氨酸∶海藻糖≥1.6。將疫苗與凍干保護劑混合合，經過凍干工藝制得。本發明提供的凍干甲型肝炎減毒活疫苗與現有的液體疫苗相比，凍干后其感染性滴度無顯著變化，但其熱穩定性顯著提高，并且經動物實驗證實具有良好的安全性與免疫原性。凍干甲型肝炎減毒活疫苗的有效期可延長至18個月，而液體劑型只為6個月，具有重大經濟效益和應用價值。文檔編號A61P1/16GK101337070SQ20081005881公開日2009年1月7日申請日期2008年8月13日優先權日2008年8月13日發明者任萬軍,王海漩,胡云章,胡凝珠申請人:中國醫學科學院醫學生物學研究所